CN104603150A - 与CH4和CεmX结构域之间的连接处结合的抗mIgE抗体 - Google Patents

与CH4和CεmX结构域之间的连接处结合的抗mIgE抗体 Download PDF

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Abstract

与膜结合IgE的CH4和CεmX结构域之间连接区结合的抗体及其在IgE介导的疾病，例如过敏性疾病中的应用。

Description

与CH4和CεmX结构域之间的连接处结合的抗mIgE抗体
相关申请
本PCT申请要求在2012年4月20日申请的美国临时申请号61/636,618的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
本发明的背景技术
免疫球蛋白E(IgE)在介导造成过敏性疾病的I型超敏反应中起着主导作用,而过敏性疾病包括过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎，花生过敏，乳胶过敏及其他过敏性疾病。过敏性反应是免疫系统对无害的环境物质例如灰尘，螨虫，树和草花粉，某些食物和药物，和蜜蜂和火蚁叮咬的反应。在这样的反应中，过敏原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的IgE结合引起IgE的交联和IgE.Fc的潜在受体，I型IgE.Fc受体或FcεRI的聚集。该受体聚集随后激活信号传导途径，导致颗粒的胞吐作用和药理介质如组胺，白三烯，胰蛋白酶，细胞因子和趋化因子的释放。肥大细胞和嗜碱性粒细胞的介质的释放引起过敏的各种病理学表现。
抗IgE抗体，例如，奥马佐单抗和TNX-901结合血液和间质液中游离的IgE和B细胞上的mIgE但不结合与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上FcεRI结合的IgE，这类抗IgE抗体已被开发用于治疗IgE介导的过敏性疾病。这些抗体在Fc的CH3结构域内的位点与IgE以高亲和性结合，该位点与FcεRI的结合位点重叠。因此，这些抗体的预期疗效是基于抗体与游离的IgE和B淋巴母细胞和记忆B细胞上的mIgE结合，这导致血液和间质液中游离IgE的总水平降低。
奥马佐单抗(商品名Xolair)的临床开发已显示了在各种过敏适应症中减轻I型超敏反应的附加多种药理作用。抗IgE与游离IgE的结合进一步阻止了IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面上FcεRI的结合。由于没有被IgE结合的FcεRI是不稳定而接着被内在化和降解，用抗IgE结合来消耗游离IgE还逐渐下调嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI。已发现抗体治疗的其它效果的证据，包括细胞因子活性的中和，总体炎症反应的减轻和通过IgE-抗IgE免疫复合物的聚积可能清除过敏原。
CεmX是位于人膜结合ε链(mε)的CH4结构域和C末端膜锚定区段之间的52个氨基酸区段。在大多数研究的人类对象中，无CεmX的mε(mεS)已经显示占极小的比重，而有CεmX的mε链(mεL)显著表达。游离的、分泌的IgE的ε链和mIgE的mεS和mεL的mRNA都来自于εRNA转录产物的选择性剪切。CεmX的氨基酸和核苷酸序列在整个蛋白质和DNA数据库中是独特的。因此，CεmX为靶向mIgE和表达mIgE的B细胞提供了一个独特的抗原位点。为靶向表达mIgE的B淋巴细胞，与存在于人mIgE上的CεmX(也被称作M1'区)结合的抗IgE抗体也已得到开发，例如,a20.Chen等人,J.Immunol.2010；184；1748-1756,美国专利号8,071,097和国际公布号WO2010/097012。
鉴定涉及CεmX结构域的新抗原表位和开发与这样的抗原表位结合的新治疗抗体是具有极大兴趣的。
发明概述
本发明涉及抗体的开发和鉴定，该抗体对人B淋巴细胞上的人mIgE的长同种型CH4结构域和CεmX结构域之间的连接区(junction region)具有特异性。mε链的长同种型在CH4结构域和膜锚定区段之间包含一52个氨基酸的CεmX结构域，该长同种型在表达mIgE的人B淋巴细胞上比不含CεmX结构域的短或常规mε链同种型更为丰富。本发明还涉及这类抗体在治疗IgE介导的过敏性疾病和其它疾病中的应用。
因此，本发明的一方面描述了与膜结合的IgE(mIgE)的表位结合的分离的抗IgE抗体。该表位由第一部分和第二部分组成，第一部分位于mIgE的CH4结构域，例如，TVQRAVSVNP(SEQ ID NO:12)或其片段，第二部分位于mIgE的CεmX结构域，例如，GLAGGSAQSQ(SEQ ID NO:13)或其片段。在某些实施例中，本文所述的抗IgE抗体与SVNPGLAGGSAQS(序列表：第11)结合。
在某些实施例中，抗IgE抗体包含含有GYTFTNYNVH(SEQ ID NO:8)所示VH互补性决定区(CDR)1，GMYPGNDDILYNQNFKD(SEQ ID NO:9)所示VH CDR2和SGLQGPWFDY(SEQ ID NO:10)所示VH CDR3的重链可变区(VH)。备选地或另外地，抗IgE抗体包含含有RASDHINNWLA(SEQ ID NO:5)所示VL CDR1，SATSLET(SEQID NO:6)所示VL CDR2和QQCWITPFT(SEQ ID NO:7)所示VL CDR3的轻链可变区(VL)。
备选地或另外地，抗IgE抗体包含与SEQ ID NO:3至少85％相同(例如.,90％,95％,97％,98％,或99％)的重链可变区，和/或与SEQ ID NO:4至少85％相同(例如.,90％,95％,97％,98％,或99％)的轻链可变区。抗IgE抗体可包含如SEQ ID NO:3所述的重链可变区和如SEQ ID NO:4所述的轻链可变区。或者，抗体结合与包含如SEQID NO:3所述的重链可变区和如SEQ ID NO:4所述的轻链可变区的抗体相同的表位，例如，单克隆抗体2H9。
在有些实施例中，抗IgE抗体包含含有GFSLTDYGVN(SEQ ID NO:19)所示VHCDR1，MIWGDGSTDYNSTL(SEQ ID NO:20)所示VH CDR2和NWFAY(SEQ ID NO:21)所示VH CDR3的重链可变区。备选地或另外地，这样的抗IgE抗体包含含有SSSVNYMH(SEQ ID NO:22)所示VL CDR1，DTSKLAS(SEQ ID NO:23)所示VL CDR2和QQWSSNPW(SEQ ID NO:24)所示VL CDR3的轻链可变区。
备选地或另外地，抗IgE抗体包含与SEQ ID NO:17至少85％相同(例如.,90％,95％,97％,98％,或99％)的重链可变区，和/或与SEQ ID NO:18至少85％相同(例如.,90％,95％,97％,98％,或99％)相同的轻链可变区。抗IgE抗体可包含如SEQ IDNO:17所述的重链可变区和如SEQ ID NO:18所述的轻链可变区。或者，抗体结合与包含如SEQ ID NO:17所述的重链可变区和如SEQ ID NO:18所述的轻链可变区的抗体相同的表位，例如，单克隆抗体5A8。
在此所述的任一抗IgE抗体可以是一种全长抗体或其抗原结合片段。在有些实施例中，抗体是人抗体或人源化抗体。
本发明的另一方面描述了用于治疗IgE-相关疾病的方法，该方法包括给与有此需要的对象任一如上所述的抗IgE抗体，例如，与SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11)结合或与如mAb 2H9那样或mAb 2H9那样结合相同表位的抗IgE抗体，mAb 2H9包含如SEQ ID NO:3所述的重链可变区和如SEQ ID NO:4所述的轻链可变区，mAb2H9包含如SEQ ID NO:17所述的重链可变区和如SEQ ID NO:18所述的轻链可变区。
在有些实施例中，需要治疗的对象(例如人患者)被诊断为，怀疑有IgE介导的疾病，或处于IgE介导的疾病风险中。IgE介导的疾病可以是过敏性疾病。例子包括但不限于，过敏反应，过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎(湿疹)，灰尘过敏，昆虫或爬虫毒液过敏，食物过敏，花粉过敏和乳胶过敏。
在还有另一方面，本发明描述了编码本文所述的重链和/或轻链的分离的核酸。在一实施例中，分离的核酸包含编码含有GYTFTNYNVH(SEQ ID NO:8)所示VH CDR1，GMYPGNDDILYNQNFKD(SEQ ID NO:9)所示VH CDR2和SGLQGPWFDY(SEQ IDNO:10)所示VH CDR3的抗体重链可变区的核苷酸序列。这样的核苷酸序列(例如SEQID NO:1)可以编码SEQ ID NO:3的抗体重链可变区。
在另一实施例中，分离的核酸包含编码含有GFSLTDYGVN(SEQ ID NO:19)所示VH CDR 1，MIWGDGSTDYNSTL(SEQ ID NO:20)所示VH CDR2和NWFAY(SEQ IDNO:21)所示VH CDR3的抗体重链可变区的核苷酸序列。这样的核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:17的抗体重链可变区。
备选地或另外地，分离的核酸包含编码含有RASDHINNWLA(SEQ ID NO:5)所示VL CDR1，SATSLET(SEQ ID NO:6)所示VL CDR2和QQCWITPFT(SEQ ID NO:7)所示VL CDR3的抗体VL链的核苷酸序列。
在另一些实施列中，分离的核酸包含编码含有SSSVNYMH(SEQ ID NO:22)所示VL CDR1，DTSKLAS(SEQ ID NO:23)所示VL CDR2和QQWSSNPW(SEQ ID NO:24)所示VL CDR3的抗体VL链的核苷酸序列。这样的核苷酸序列可编码SEQ ID NO:18的抗体轻链可变区。
在另一方面，本发明描述了包含一种或多种本文所述核酸的载体(例如，表达载体)，例如编码本文所述的抗体重链可变区的核酸和/或编码本文所述的抗体轻链可变区的核酸。包含本文所述载体的宿主细胞同样落入本发明的范围。
此外，本发明提供了包含肽和辅佐剂的免疫组合物，其中，所述的肽包含SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11)所示氨基酸序列或其中的免疫原性表位，和所述免疫组合物诱导SEQ ID NO:11的特异性免疫反应的应用，例如，抗体生产。
落入本发明范围的还有用于治疗IgE介导的疾病比如过敏性疾病(过敏反应，过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎(湿疹)，灰尘过敏，昆虫或爬虫毒液过敏，食物过敏，花粉过敏和乳胶过敏)的药物组合物，所述药物组合物含有任一所述的抗IgE抗体或编码此类抗体的核酸和药学上可接受的载体，以及所述药物组合物在生产治疗IgE介导的疾病的药物中的应用。
本发明的一个或多个实施例的细节在以下作具体描述。本发明的其它特征或优势从以下的附图和几个实施例的详细描述中得以明了，从附加的权利要求中也将是显然的。
附图简要说明
以下附图形成本发明说明书的一部分，包括这些附图用以进一步阐述本发明的某些方面，参考这些附图中的一张或多张并结合本文所述具体实施例的详述可以更好地理解本发明的这些方面。
图1是人ε-链，mε链的长，短同种型和mε的长型的CH4结构域与CεmX结构域之间的连接处残基(灰色阴影)的示意图。TVQRAVSVNP(SEQ ID NO:12)是CH4的C末端区段和GLAGGSAQSQ(SEQ ID NO:13)是CεmX的N末端区段。
图2显示了单克隆抗IgE抗体mAb 2H9的表位作图。A:代表CH4-CεmX的连接处的合成肽。P1:SEQ ID NO:25；P1.15:SEQ ID NO:11；P1.17:SEQ ID NO:36；P1.18:SEQID NO:27；和P1.19:SEQ ID NO:28。B:各种CεmX-融合蛋白和连接残基的氨基酸序列。IgE.Fc-εm67连接序列:SEQ ID NO:11；IgG.Fc-εm67连接序列:SEQ ID NO:29；HBcAg-P1连接序列:SEQ ID NO:11；和HBcAg-CεmX:SEQ ID NO:30。C:显示了的单克隆抗体2H9,h4B12,和h47H4与各种连接肽和重组蛋白的结合活性的图。
图3是显示mAb 2H9与表达mIgE.FcL(红线)，但不表达mIgE.FcS(着色的柱状图)的Ramos细胞结合的图。Ramos细胞与20,10,1,和0.1μg/ml浓度的抗体在冰上孵育20分钟，然后用小鼠IgG的特异性FITC-标记的兔F(ab￠)2染色。
图4是显示用mAb 2H9诱导表达mIgE的Ramos细胞凋亡的图。此处使用migis-α(IgA的膜结合α链的C末端膜锚定多肽的胞外区段)特异性的单克隆抗体mAbs 7C3作为同种型mAb的对照，和单克隆抗体4B12(参见WO2010/097012)用作为阳性对照。结果表示为两个独立实验的一式三份的平均值±标准差。
图5是显示用各种浓度的mAb 2H9诱导表达mIgE.FcL的A20细胞的NK细胞介导ADCC的图。CFSE阳性细胞用不同浓度的2H9处理，然后以E:T比例为10加入新鲜分离的鼠NK细胞。数据是一式三份样品的平均值±标准差。用4B12和7C3作为对照mAb。
图6显示了mAb 2H9的氨基酸序列和鼠类重链亚类1(HV1)和轻链k亚类13(KV13)的序列。每条链的三个CDR下面划线。2H9重链可变区：SEQ ID NO:3；2H9轻链可变区：SEQ ID NO:4；HV1:SEQ ID NO:31；和KV13:SEQ ID NO:32。
图7显示了mAb 5A8(SEQ ID NO:17)的VH和重链亚类1(HV2；SEQ ID NO:33)的鼠类共有序列之间和mAb 5A8(SEQ ID NO:18)的VL和轻链k亚类13(HV2；SEQ IDNO:34)之间的序列比对。每条链的三个CDRs下面划线。
图8显示了mAb 5A8与表达mIgE.FcL的Ramos细胞结合，但不与表达mIgE.FcS(着色柱状图)的Ramos细胞结合。Ramos细胞与10,5,2.5,1.25,和0.625μg/ml浓度的所述抗体在冰上孵育20分钟，然后用小鼠IgG的特异性FITC-标记的兔F(ab￠)2染色。使用4B12作为阳性对照。
图9是显示用mAb 5A8诱导表达mIgE的Ramos细胞凋亡的图。使用migis-α(IgA的膜结合α链的C末端膜锚定肽的胞外区段)的特异性mAbs 7C3在此作为同种型mAb的对照，和使用4B12作为阳性对照。结果表示为三个独立实验的一式三份的平均值±标准差。
图10是显示用5A8诱导表达mIgE.FcL的A20细胞的NK细胞介导ADCC的图。CFSE阳性细胞用所示的不同浓度的5A8处理，然后以E:T比例为2.5加入新鲜分离的鼠NK细胞。数据是一式三份样品的平均值±标准差。用4B12和7C3作为对照mAbs。
发明详述
已开发了几种抗IgE抗体，也确定了它们在mIgE中的结合表位。参见，例如，US2009/0010924,WO2010/097012,美国专利号.8,071,097,Brightbill等Journal ofClinical Investigation 120:2218-29(2010),Chen等,Journal of Immunology,184:1748-56(2010)。发现所有这些抗IgE抗体与完全位于CεmX结构域内的表位结合。
本发明是基于开发出与位于CH4和CemX结构域连接处新鉴定的抗原性表位结合的抗IgE抗体和出乎意料的发现这些抗体能够诱导表达mIgE的B细胞诱导和抗体依赖性细胞毒性。这些结果表明通过至少清除表达mIgE的B细胞，与CH4和CemX结构域之间的这类结合区结合的抗体能有效治疗IgE介导的疾病。
因此，本发明涉及开发这样一种抗体，其能与位于表达在人B淋巴细胞上的人mIgE的ε链长同种型的CH4结构域和CεmX结构域之间(例如，在两个结构域的连接处)的表位结合(例如，特异性结合)。具体地说，这类抗体识别由第一部分和第二部分组成的表位，其中所述的第一部分包含部分CH4结构域(例如CH结构域的C末端)和所述的第二部分包含部分CεmX结构域(例如CεmX结构域的N末端)。本发明还提供了本文所述抗IgE抗体治疗IgE介导的疾病例如过敏性疾病的应用，编码所述抗IgE抗体的核酸分子，包含所述核酸的载体(例如表达载体)，包含所述载体(例如生产所述抗IgE抗体)的宿主细胞。本发明的范围还涉及包含新鉴定的连接处抗原性表位的免疫肽及其在诱导对这类表位的特异性免疫反应中的应用。
抗IgE抗体
抗体(可与复数形式互换使用)是通过位于免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原识别位点，能够与靶抗原，例如碳水化合物，多核苷酸，脂类，多肽等结合的免疫球蛋白分子。在此所用的术语“抗体”不仅涵盖完整(即全长)多克隆或单克隆抗体，还涵盖其抗原结合片段(例如Fab,Fab',F(ab')2,Fv)，单链(scFv),其突变体，包含抗体部分的融合蛋白，人源化抗体，嵌合抗体，双抗体，线性抗体，单链抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它修饰构型，包括抗体的糖基化变体，抗体的氨基酸序列变体和共价键修饰的抗体。抗体包括任一种类的抗体，例如IgD,IgE,IgG,IgA,或IgM(或其亚类)，所述抗体无需是任何特定的类别。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以归入不同的类别。有5种主要免疫球蛋白类型：IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,和这些抗体的其中几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。对应于免疫球蛋白不同亚类的重链恒定区被分别称作α,δ,ε,λ和μ。免疫球蛋白不同亚类的亚单元结构和三位构型是众所周知的。
在此所述的分离抗IgE抗体能够与含有膜结合IgE分子的CH4结构域内和CεmX结构域内的残基的表位结合，所述的IgE分子表达在B细胞表面(例如，人B细胞)。在此使用的术语“分离的抗体”指基本上不含天然结合分子，即，天然结合分子在含有抗体的制备物中最多占20％的干重。用任何合适的方法可测定纯度，例如，柱状色谱分离法，聚丙烯酰胺凝胶电泳和HPLC。
人mIgE的CH4-CεmX结构域的氨基酸序列(SEQ ID NO:16)提供如下：
GPRAAPEVYA FATPEWPGSR DKRTLACLIQ NFMPEDISVQ WLHNEVQLPDARHSTTQPRK TKGSGFFVFS RLEVTRAEWE QKDEFICRAV HEAASPSQTV QRAVSVNP
粗体字的氨基酸残基代表CεmX结构域的序列。
在有些实施例中，所述的抗IgE抗体与线性表位结合，该线性表位由源自CH4结构域的一部分(例如CH4结构域的C末端)和源自CεmX结构域的另一部分(例如CεmX结构域的N末端)组成。线性表位由蛋白分子中通常6-15个氨基酸长度的肽延伸区内的氨基酸残基呈递。线性表位的长度很少超过15个氨基酸。短到30-50个氨基酸长度的肽区段可能包含几个或很多个不连续的表位，每个表位用与单克隆抗体或一组多克隆抗体的特异性反应活性来限定。
在有些实施例中，本文所述的抗IgE抗体能够与由两个区段组成的线性表位结合，第一区段衍生于CH4结构域的C末端和第二区段衍生于CεmX结构域的N末端。线性表位可由位于CH4和CεmX结构域连接处的6-15个氨基酸残基(例如，6-12个氨基酸,6-10个氨基酸,8-15个氨基酸,或8-10个氨基酸)组成。在有些实施例中，线性表位长度为6,7,8,9,10,11,12,13,14,或15个氨基酸。
第一区段可包含氨基酸序列TVQRAVSVNP(SEQ ID NO:12)或其片段(例如，在N末端缺失1,2,3,4,5,6或更多个残基)，所述的第一区段位于CH4结构域的C末端。在一个实施例中，来自CH4结构域C末端的第一区段包含序列SVNP(SEQ ID NO:14)或其片段(例如，在N-末端缺失1,2,或3个残基)。
第二区段可包含氨基酸序列GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:35)或其片段(例如，在C末端缺失1,2,3,4,5,6，7,8,9,10或更多个残基)。在一个实施例中，第二区段包含氨基酸序列GLAGGSAQS(SEQ ID NO:15)或其片段(例如，在C-末端缺失1,2或3个残基)。
在有些实施例中，本文所述的抗IgE抗体与肽SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11)或其片段结合，例如，VNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:26)或NPGLAGGSAQS(SEQ IDNO:27)。
或者，本文所述的抗IgE抗体能与含有位于CH4和CεmX结构域中的氨基酸残基的构象表位结合。构象表位由居于蛋白分子的多肽链上的2个或多于2个部分的氨基酸残基形成。
本文所述的抗IgE抗体是小鼠，大鼠，人或任何其他来源(包括嵌合或人源化抗体)。在有些实施例中，抗体包含修饰的恒定区，比如免疫惰性的恒定区，例如，不会激发补体介导的溶解或不会刺激抗体依赖性细胞介导毒性(ADCC)。ADCC活性可用美国专利号5,500,362公开的方法评估。在另一些实施例中，用Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624；PCT申请号PCT/GB99/01441和/或英国专利申请号9809951.8中所描述的方法修饰恒定区。
本文所述的任一抗IgE抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。“单克隆抗体”指均质的抗体群和“多克隆抗体”指异质的抗体群。这两种术语不限制抗体的来源或生产抗体的方式。
在一个实施例中，本文所述的抗IgE抗体是人源化抗体。人源化抗体指非人(例如，鼠类)抗体形式，它们是特异性嵌入型免疫球蛋白，免疫球蛋白链或其包含来自非人免疫球蛋白最短序列的抗原结合片段。绝大多数而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补性决定区(CDR)的残基被具有所需的特异性，亲和性和性能的来自非人类(供体抗体)例如小鼠，大鼠或兔的CDR残基替代。有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被相应的非人类残基替换。另外，人源化抗体可包含既不在受体抗体也不在引入的CDR或框架序列中存在的残基，但包含这些残基以进一步改善和优化抗体性能。总体而言，人源化抗体大体上包含至少一种和通常两种的可变区，其中，所有或大体上所有的CDR区对应于那些非人免疫球蛋白的CDR区和所有或大体上所有的FR区是那些非人免疫球蛋白共有序列的FR区。理想地，人源化抗体至少包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。抗体可具有如在WO 99/58572中所述修饰的Fc区。人源化抗体的其它形式具有一个或多个相对于原始抗体被改变的CDR(1,2,3,4,5,6)，该CDR也被称为源自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗体也可涉及亲和性成熟。
在另一实施例中，本文所述的抗体是可包括来自人抗体的重链恒变区和轻链恒变区的嵌合型抗体。嵌合型抗体指具有来自第一物种的可变区或可变区部分和来自第二物种的恒定区的抗体。通常，在这些嵌合型抗体中，轻链和重链的可变区模拟来自一种哺乳动物(例如，非人类哺乳动物，比如小鼠，兔和大鼠)抗体的可变区，而恒定部分与来自另一种哺乳动物例如人的抗体的序列同源。在有些实施例中，可在可变区和/或恒定区中作氨基酸修饰。
在有些实施例中，本文公开的抗IgE抗体与本文所述的任一CH4/CεmX表位特异性结合，例如上述的和在本说明书中其它地方所述的线性表位。与靶标或表位“特异性结合”抗体在本领域中是众所周知的术语，确定这样的特异性结合的方法在本领域中也是众所周知的。如果相比于其它靶标或表位，某种分子与某种特定的靶抗原或表位更频繁，更迅速，更长时间和/或更高亲和性地反应或结合，称该分子显示“特异性结合”。如果一种抗体与靶抗原的结合相比于与其他物质的结合具有更高亲和性，亲和力，更容易和/或具有更长时间，则该抗体与靶抗原“特异性结合”。举例说明，与IgE表位特异性地(或优先性地)结合的抗体是这样一种抗体，其与该IgE表位的结合，相比于其它IgE表位或非IgE表位结合具有更高亲和性，亲和力，更容易，和/或具有更长时间。通过阅读此定义还能理解为，例如，与第一靶抗原特异性结合的抗体可能或也许不能与第二靶抗原特异性或优先性结合。因此，“特异性结合”或“优先性结合”并不一定要求(尽管它可以包括)排它性结合。通常，但不是必须，提到结合意味优先性结合。
本文所述的抗IgE抗体可包括在表达mIgE的B细胞中诱导凋亡和/或ADCC效应，因此，对于清除这类B细胞和治疗IgE介导的疾病例如过敏性疾病有效。在有些实施例中，本文所述的抗IgE抗体在对象(例如人患者)中能清除至少20％,至少40％,至少50％,至少75％,至少90％,或至少95％的表达mIgE的B细胞。
本文所述的抗IgE抗体与其同源表位或在B细胞上表达mIgE分子的结合亲和性可能低于以下任一：约100nM,约50nM,约10nM,约1nM,约500pM,约100pM,或约50pM至任一约2pM。可用KD或离解常数表达结合亲和性，结合亲和性升高对应于KD降低。确定抗体与IgE表位结合亲和性的一种方法是测定抗体的单功能Fab片段的结合亲和性。为了获得单功能Fab片段，用木瓜蛋白酶裂解抗体(例如，IgG)或重组性表达该抗体。用表面等离子体共振(BIAcore3000TM surface plasmon resonance(SPR)system,BIAcore,INC,Piscaway N.J.).确定抗体的抗IgE Fab片段亲和性。获得动力学结合率(kon)和离解率(koff)(通常在25℃作测试.)，平衡离解常数(KD)值用koff/kon计算。
在有些实施例中，抗体与人IgE结合，不与来自另一种哺乳动物种类的IgE分子明显结合。在有些实施例中，抗体与人IgE结合，也与来自另一种哺乳动物种类的一种或多种IgE分子结合。
以下提供的是本文所述抗IgE抗体的一个具体实施例。
抗IgE抗体2H9和5A8及其功能性变体
本文所述的抗IgE抗体与表位SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11)或其片段(例如，在SEQ ID NO:11中含有至少6个连续氨基酸残基，位于CH4和CεmX结构域内)结合，例如，在图2中所描述的P1.17或P1.18。这样的抗体可以是如下实施例1中所描述的单克隆抗体2H9或5A8。这些抗体的VH和VL链，及其重链和轻链互补决定区(CDRs)的氨基酸序列见在下表1和图6和图7中。
表1.抗体2H9的氨基酸和核酸序列及其结合表位
在此所述的抗-IgE抗体能结合与2H9或5A8相同的表位。在有些实施例中，这类抗体包含与抗体2H9或5A8相同的VH和VL链，或其中相同的CDR。见如上表1和图6和7。
在此还提供了抗体2H9或5A81的功能性变体。这些功能性变体基本上具有和mAb2H9或5A8相同的表位结合特异性，在表达mIge的B细胞中显示至少20％(例如,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,或更高)的诱导凋亡和/或ADCC活性。在有些实施例中，2H9或5A8的功能变体包含和2H9或5A8相同的负责抗原结合的区/残基，例如在CDR或整个CDR中相同的特异性决定残基。用本领域公知方法从2H9或5A8的重链/轻链序列的氨基酸序列中鉴定负责抗原结合的区/残基。参见，例如，www.bioinf.org.uk/abs；Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)；和Chothia等,J.Mol.Biol.227:799-817(1987)。
此外，本领域技术人员熟知如何测定抗体中的CDR区。至少有两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种的序列变异(即Kabat等，《免疫学兴趣的蛋白质序列》(Sequencesof Proteins of Immunological Interest),(第5版,1991,国家卫生研究院,贝塞斯达，马里兰州))的方法；和(2)基于抗原－抗体复合物的晶体学研究(Chothia等.(1989)Nature342:877；Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))的方法。如本文中所使用的，CDR指用任一种方法或两种方法组合所测定的CDR。
在有些实施例中，2H9或5A8的功能性变体包含VH链和VL链，所述VH链含有与2H9或5A8的相应VH CDR至少75％(例如80％,85％,90％,95％,或98％)相同的VHCDR1,VH CDR2和VH CDR3，所述和VL链含有与2H9或5A8的相应VL CDR至少75％(例如80％,85％,90％,95％,或98％)相同的VL CDR1,VL CDR2和VL CDR3。在另外一些实施例中，2H9或5A8的功能性变体包含与2H9或5A8相同的VH和VL CDR。
或者，2H9或5A8的功能性变体包含与2H9或5A8的VH链至少75％(例如80％,85％,90％,95％,或98％)相同的VH链和与2H9或5A8的VL链至少75％(例如80％,85％,90％,95％,或98％)相同的VL链。
两条氨基酸序列的“同一性百分比”用Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990中的算法确定，如Karlin和Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中所描述的进行修饰。把这样的演算纳入Altschul等.在J.Mol.Biol.215:403-10,1990中的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)。BLAST蛋白检索用XBLAST程序进行，分值＝50，字长＝3以获取与感兴趣的蛋白分子同源的氨基酸序列。当两个序列之间存在空隙，可用Altschul等,Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402,1997中所描述的Gapped BLAST。当运用BLAST和Gapped BLAST程序时，可使用各自的系统默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。
在另一些实施例中，2H9或5A8的功能性变体包括VH链和/或VL链，与2H9或5A8的VH CDR相比，所述VH链在VH CDR区(VH CDR1,CDR2,和/或CDR3)含有至多5个(比如,1,2,3,4,或5)氨基酸残基变异，与2H9或5A8的VH CDR相比，所述VL链在VL CDR区(VL CDR1,CDR2和/或CDR3)含有至多5个(比如,1,2,3,4,或5)氨基酸残基变异。
抗体制备
与本文所述的mIgE连接处表位结合的抗体可用本领任何已知方法制备。例如参见，Harlow和Lane,(1988)《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约。
(i)宿主动物免疫和杂交瘤技术
通过采集检查出血清中所需抗体增加的被免疫哺乳动物的血液和通过用任何常规方法从血液中分离血清来制备抗IgE表位的多克隆抗体。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及可从血清中分离含有多克隆抗体的部分。
通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂，多克隆抗体通常在宿主动物(例如，兔，小鼠，马或山羊)中升高。用双功能或衍生试剂，例如，马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酸酯(通过胱氨酸残基偶联)、羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2等把相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白，例如，把匙孔戚血蓝素，血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联是有用的。
用抗原可以免疫任何哺乳动物以产生所需的抗体。通常，可用啮齿类，兔类或灵长类动物。啮齿类动物包括，例如，小鼠，大鼠和仓鼠。兔类动物包括，例如，兔子。灵长类动物包括，例如，像食蟹猴，猕猴，狒狒和黑猩猩。
用抗原免疫动物的方法在本领域是公知的。腹腔内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体地说，把抗原稀释并悬浮于适当量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，生理盐水等。如果需要，把抗原悬浮液与适量标准佐剂混合，例如，弗氏完全佐剂，制成乳剂，然后施用于哺乳动物。用1mg或1μg的肽或偶联物(分别对家兔或小鼠)和3倍体积的弗氏不完全佐剂组合，用抗原、免疫原性偶联物或衍生物免疫动物。
每4到21天，几次施用混合有适量弗氏不完全佐剂的抗原来加强动物免疫直到滴度达到平稳状态。通过在多个部位皮下注射原始量的1/5至1/10的弗氏完全佐剂配制的肽或偶联物来加强动物。7至14天后动物被抽血，血清用于测试抗体滴度。合适的载体也可用于免疫。如上的免疫完毕后，用标准方法检验血清中所需抗体量的增加。优选地，用与不同的蛋白和/或通过不同的交联试剂偶联的相同抗原的偶联物加强动物免疫。偶联物还可在重组细胞培养物中作为蛋白融合物制成。此外，聚集剂如明矾适用于增强免疫应答。
在过去二三十年来，已经开发了一些方法以制备嵌合抗体，人源化抗体或人抗体用以人类体内治疗。最常用的和成熟的方法是使用杂交瘤方法来制备小鼠单抗，然后通过将VH和VL结构域的框架区和单抗的恒定域转化成人类VH和VL结构域的最同源人框架区和所需的人γ球蛋白同型和亚类的恒定区使得单克隆抗体人源化。许多临床上使用的单抗，如Xolair，是人γ1,κ同种型和亚类的人源化单抗，并使用该方法制备。
在一些实施例中，靶表位的特异性抗体(例如，mIgE的CH4和CεmX结构域之间的连接处表位)可通过常规的杂交瘤技术制得(Kohler等,Nature,256:495(1975))。在杂交瘤方法中，如以上所描述的，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠或兔，以引发生成或能够生成与用于免疫的蛋白特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，淋巴细胞可在体外进行免疫。
为了制备单抗，从被抗原免疫过的哺乳动物收集免疫细胞，并如上所述，在血清中检查所需抗体的水平增加，以进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选地从脾脏获得。其它优选的与上述免疫细胞融合的亲本细胞包括，例如，哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选的具有获得通过药物用于选择融合细胞特性的骨髓瘤细胞。
优选的骨髓瘤细胞是高效融合，支持由所选择的抗体生成细胞稳定高水平的抗体生成，并且对培养基，诸如HAT培养基敏感的那些。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，诸如可从美国加州圣地亚哥索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,Calif.USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤衍生的那些，和可从美国马里兰州罗克威尔美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,Md.USA)获得的SP-2细胞系。人骨髓瘤和小鼠－人异源骨髓瘤细胞系也已被描述用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体生产技术和应用(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications)，第51-63页(马塞尔·德克尔公司，纽约，1987))。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞，可根据已知方法融合，例如，Milstein等(Galfre等，Methods Enzymol，73：3-46，1981)的方法。用适合的融合剂，例如聚乙二醇，使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，第59-103页(科学出版社，1986))。从细胞融合所获得的杂交瘤通过把它们在标准选择培养基，例如HAT培养基(含有次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基)中培养来选择。细胞培养通常在HAT培养基中持续培养数天至数周的时间以足以让除了所需杂交瘤的所有其它细胞死亡(非融合细胞)。然后，进行标准的有限稀释来筛选和克隆产生所需抗体的杂交瘤细胞。
如此制备的杂交瘤细胞接种并在优选含有一种或多种抑制非融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质的适合培养基中生长。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶(HGPRT或HPRT)，用于杂交瘤的培养基通常包括次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
测定杂交瘤细胞正在其中生长的培养基中抗所述抗原的单抗产生情况。优选地，杂交瘤细胞产生的单抗的结合特异性结合通过免疫沉淀或体外结合测定法来确定。可利用酶联免疫吸附试验(ELISA)，酶免疫测定(EIA)，放射免疫测定(RIA)和/或免疫荧光中的吸光度检测值来测试本发明的抗体的抗原结合活性。在ELISA中，本发明的抗体固定于平板上，本发明的蛋白施加于平板，然后施加含有所需抗体的样品，例如产生抗体的细胞的培养液上清液或纯化的抗体。然后，使用识别第一抗体并用酶，例如碱性磷酸酶标记的第二抗体，并且温育平板。接着，水洗后，酶底物，如对硝基苯基磷酸酯，被添加到板，并测量吸光度以评价样品的抗原结合活性。蛋白片段，如C末端或N末端片段可以在本方法中使用。BIAcore(Pharmacia)可用于评估本发明抗体的活性。单克隆抗体的结合亲和力可以，例如，可以通过Munson等，Anal.Biochem.,107:220(1980)中所描述的Scatchard分析来测定。
应用任何的常规方法，包括上述的那些，可以鉴定产生与含有在CH4和mXεC结构域内残基的表位结合的抗IgE抗体的杂交瘤细胞。例如，能够与CH4和CεmX结构域之间的连接区结合但不与CH4结构域和/或CεmX结构域的区段结合的抗体可以被选择用于进一步表征。
鉴定产生具有所需特异性，亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤之后，该克隆可通过有限稀释方法进行亚克隆，并通过标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体：原理与实践，第59-103页(科学出版社，1986))。用于此目的合适的培养基，包括，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地从培养基、腹水或血清中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，例如，蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、亲和层析。
此外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。例如，获得的杂交瘤可随后移植到小鼠的腹腔内并收取腹水。
所获得的单克隆抗体可以通过以下方法纯化，例如，硫酸铵沉淀，A蛋白或G蛋白柱，DEAE离子交换层析或偶联有本发明蛋白的亲和层析柱。本发明的抗体不仅可用于纯化和检测本发明的蛋白，也可作为本发明的蛋白的激动剂和拮抗剂的候选物。另外，该抗体可应用于对本发明蛋白相关疾病的抗体治疗。
(ii)重组技术
这样获得的单克隆抗体使用基因工程技术也可以重组制备(参见,例如,Borrebaeck C.A.K.和Larrick J.W.治疗性单克隆抗体(Therapeutic MonoclonalAntibodies)，由麦克米伦出版公司，1990年发表在英国，1990)。编码抗体的DNA可以从免疫细胞克隆，如杂交瘤或产生抗体的经免疫的淋巴细胞，插入到适当的载体中，并导入宿主细胞来制备重组抗体。本发明还提供了如上所述方法制备的重组抗体。
当对人体施用所获得的抗体(抗体治疗)，为降低免疫原性，人抗体或人源化抗体是优选的。例如，具有人抗体基因库的转基因动物可用选自蛋白，蛋白表达细胞，或其裂解物的抗原进行免疫。然后从动物中收集产生抗体的细胞，并与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从该杂交瘤制备抗蛋白的人抗体。备选地，产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞，可以通过致癌基因使其永生化，并用于制备单克隆抗体。
用常规方法(例如，使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链基因特异性结合的寡核苷酸探针)可容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞充当此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞中，诸如不产生免疫球蛋白的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。对在细菌中重组表达编码抗体DNA的综述性论文包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pluckthun，Immunol.Rev.,130:151-188(1992)。
由上述杂交瘤细胞产生的编码抗体的DNAs，通过常规的技术可遗传修饰，以生产基因工程化的抗体。基因工程化的抗体，如人源化抗体，嵌合抗体，单链抗体，和双特异性抗体，可以通过，例如，常规的重组技术来生产。然后该DNA可被修饰，例如，通过把人重链和轻链恒定结构域的编码序列替换同源鼠序列，Morrison等，(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,或通过共价接合于免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列。用该方式，把基因工程化的抗体，如“嵌合”或“杂交”抗体可制备成具有靶抗原的结合特异性。
生产“嵌合抗体”而开发的技术是本领域公知的现有技术。参见，例如，Morrison等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等.(1984)Nature312,604；和Takeda等(1984)自然314:452。
通常，这类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，其包含对某抗原具有特异性的一个抗原结合点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。
嵌合或杂交抗体也可以在体外用合成蛋白质化学的已知方法制备，包括那些涉及交联剂的方法。例如，用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键可构建免疫毒素。用于此目的合适试剂的例子包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲基-4-巯基丁酰亚胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
用于人源化非人抗体的方法是公知的现有技术。通常，人源化抗体具有引入其内的一个或多个非人类来源的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变结构域。用啮齿动物CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列，遵循Winter及其同事的方法(Jones等.,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988))基本上可进行人源化。因此，这类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中大体上小于一个完整的人可变结构域被非人物种的相应序列替代。实际上，人源化抗体通常是人抗体中的有些CDR残基和可能有些FR残基被来自啮齿动物中类似位点的残基替代。
为减少抗原性，用于制备人源化抗体的人可变区，轻链和重链的选择是非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体可变区的序列。然后与啮齿动物相应序列最接近的人序列接受作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等.,J.Mol.Biol.，196:901(1987))。另一种方法使用由轻链或重链特定亚类的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等.,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:4285(1992)；Prestaetal,J.Immunol.,151:2623(1993))。
更为重要的是经人源化的抗体保留与抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。通常有三维免疫球蛋白模型可用，并且是本领域技术人员所熟知的。有计算机程序可用来图解和展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检测这些展示结果，允许对残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能角色进行分析，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。用这种方式，从受体和输入序列选择并结合FR残基，以致达到所需的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
或者，现在有可能生产的转基因动物(如小鼠)，所述转基因动物缺乏内源免疫球蛋白生成，在经免疫后，产生人类抗体完整文库。例如，已经描述了在嵌合性和胚系突变小鼠中抗体重链连接区(J.sub.H)基因的纯合子缺失导致内源抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列在此类胚系突变小鼠中转移将导致在抗原攻击后产生人类抗体。参见,例如.,Jakobovits等.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993)；Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993)；Bruggermann等,Year inImmuno.,7:33(1993)。人抗体也可源自噬菌体展示文库(Hoogenboom等,J.Mol.Biol.，227:381(1991)；Marks等,J.Mol.Biol.，222:581-597(1991))。
编码本文中描述的抗IgE抗体(包括重链，轻链，或两者)的任何核酸，载体，如包含一种或多种核酸的表达载体，和包含一种或多种载体的宿主细胞亦落入本公开的范围。在一些实例中，一种包含核酸的载体含有编码如本文中所描述的抗IgE抗体重链可变区或轻链可变区的核苷酸序列。在其它实施例中，所述载体包含的核苷酸序列编码重链可变区和轻链可变区，其表达可以通过单个启动子或两个分开的启动子来控制。在此还提供了用于生产如本文中所描述的任何抗IgE抗体的方法，例如，通过在本部分中描述的重组技术。
(iii)用于制备抗体的其他技术
在其它实施例中，全人抗体可以通过使用已经被工程化以表达特定的人免疫球蛋白的蛋白的商购小鼠而获得。被设计成产生一种更令人满意的(例如，全人抗体)，或更强大的免疫应答的转基因动物也可用于产生人源化或人抗体。这种技术的例子是安进公司(加利福尼亚州弗里蒙特的)的XenomouseRTM和Medarex,Inc.(普林斯顿，新泽西州)的HuMAb-MouseRTM和TC MouseTM。在另一个替代方案中，抗体可以用噬菌体展示技术重组制成。参见，例如，美国专利号5,565,332；5,580,717；5,733,743；和6,265,150；和Winter等,(1994)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。备选地，噬菌体展示技术(McCafferty等，(1990)Nature 348:552-553)可用于从由未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集体外生产人抗体和抗体片段。
完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段可以通过常规方法来制备。例如，通过胃蛋白酶消化抗体分子可生产F(ab')2片段，和通过还原F(ab')2片段的二硫键可产生Fab片段。
或者，本文所描述的抗IgE抗体可以从使用McCafferty等，Nature,348:552-554(1990)，Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等.,J.Mol Biol.,222:581-597(1991)所描述的技术而产生的噬菌体抗体文库(例如，单链抗体噬菌体文库)中分离。随后的出版物描述了通过链改组(Marks等人Bio/Technology,10:779-783(1992)),以及组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等,Nuc.Acids.Res.,21:2265-2266(1993))来制备高亲和力(nM范围)的人抗体。因此，这些技术是传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案以便分离单克隆抗体。
如本文所述获得的抗体可被纯化至均质。例如，抗体的分离和纯化可以根据用于普通蛋白的分离和纯化方法进行。例如，抗体可并通过适当选择和组合使用柱色谱法，如亲和层析，过滤，超滤，盐析，透析，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点的聚焦，和其他技术(抗体：实验室手册，Harlow和大卫·里编，冷泉港实验室，1988)得以分离，但不限于此。如上述得到的抗体的浓度可通过吸光度的测定，酶联免疫吸附测定(ELISA)等来确定。除亲和色谱外，示例性色谱法包括，例如，离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(蛋白纯化和表征策略：实验室课程手册(Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory CourseManual)，丹尼尔R·马沙克等编，冷泉港实验室出版社，1996年)。色谱程序，可以用液相层析，例如HPLC，FPLC进行。
抗体可以使用本领域中公知的方法进行表征。例如，一种方法是识别抗原与其结合的表位，或“表位作图”。本领域有很多已知的方法用于对蛋白上表位的位置作图和表征，包括解析抗体-抗原复合物的晶体结构，竞争测定法，基因片段表达测定法和基于合成肽的测定法，如上所述，例如，刊于Harlow和Lane，使用抗体，实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1999年第11章。在一额外实例中，表位作图可用于确定其中抗体结合的序列。表位可以是线性表位，即包含在氨基酸段的单一延伸段，或通过氨基酸的三维相互作用形成的构象表位，该构象表位可能不一定包含在一个单一延伸段中(主结构为线性序列)。可以分离或合成的(例如，重组)不同长度的肽(例如，至少4-6个氨基酸长)，并用于与抗体的结合测定。在另一个例子中，抗体结合的表位可以通过使用源自目标抗原序列的重叠肽并确定由该抗体的结合情况，在一系统性筛选中确定。根据基因片段表达测定法，编码靶抗原的开放读码框是随机地或者通过特定的遗传结构被片段化，并确定待测抗体与抗原表达片段的反应性。基因片段可以是，例如，通过PCR制备，在放射性氨基酸的存在的情形下，然后在体外转录并翻译成蛋白。再通过免疫沉淀和凝胶电泳确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。某些表位还可通过利用噬菌体颗粒(噬菌体文库)的表面上展示的随机肽序列的大文库鉴定。或者，可在一个简单的结合测试中测定重叠肽片段的所定义文库与测试抗体的结合。
在另一实施例中，可进行抗原结合结构域的诱变，结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变来鉴定表位结合所需的，足够的，和/或必需的残基。例如，可用靶标抗原的突变体进行结构域交换实验，该突变体中候选抗体的结合表位内的各种残基已被来自一个密切相关的，但抗原性不同的蛋白(例如神经营养因子蛋白家族的另一成员蛋白)的序列替换(交换)。通过评估抗体与靶蛋白突变体的结合，可评估特定抗原片段对于抗体结合的重要性。
或者，可以利用已知与同一抗原结合的其它抗体进行竞争测定，以确定某抗体是否与其它抗体一样与相同的表位结合(例如，本文所述的2H9抗体)。竞争测定法对本领域技术人员是公知的。
此外，可依照本领域已知的以下方法，例如，在以下实施例3和4中所描述的方法，研究用本领域已知的和本文所描述的方法获得的任何抗IgE抗体，以确认其诱导表达mIgE的B细胞的凋亡和/或ADCC的能力。
药物组合物和制剂
制备所述的抗IgE抗体后，生产“预冻干制剂”。用于制备制剂的抗体优选基本上纯的和最好基本上均匀的(即，不含污染性蛋白)。“基本上纯的”蛋白意指，基于组合物的总重量，包含至少约90重量％的蛋白的组合物，优选至少95重量％。基于组合物总重量，“基本上均匀的”蛋白意指包含至少约99重量％的蛋白的组合物。在某些实施例中，蛋白质是抗体。
考虑最佳剂量容量，施药方式等来确定预冻干配方中抗体数量。如果选择的蛋白是完整的抗体(全长抗体)，约2mg/mL至50mg/mL,较佳的约5mg/mL至40mg/mL和最佳的约20-30mg/mL是示范性的起始蛋白浓度。蛋白通常在溶液中。例如，蛋白可以存在于约4-8，较佳的约5-7的pH-缓冲液中。示范性的缓冲液包括组氨酸，磷酸，Tris，柠檬酸，琥珀酸和其它有机酸。缓冲液浓度从约1mM至20mM,或从约3mM至15mM，取决于，例如缓冲液和制剂的所需等渗性(例如重建制剂)。优选的缓冲液是组氨酸，因为，正如以下显示的，它有低温保护特性。琥珀酸显示是另一种有用的缓冲液。
把低温保护剂加入预冻干制剂。在优选例中，低温保护剂是非还原糖，例如蔗糖或海藻糖。预冻干制剂中的低温保护剂含量通常在重建制剂后，使得得到的制剂是等渗的。然而，高渗的再重建制剂也是适用的。此外，低温保护剂含量必须不能太低以致在冻干后产生不可接受量的蛋白降解/聚集。如果低温保护剂是糖(例如蔗糖或海藻糖)和蛋白是抗体，在预冻干制剂中示范性低温保护剂浓度是约10mM至400mM,较佳的约30mM至300mM,更佳的约50mM至100mM.。
为各蛋白和低温保护剂组合选择蛋白与低温保护剂的比例。在抗体作为选择的蛋白和糖(例如蔗糖或海藻糖)作为低温保护剂以产生具有高蛋白浓度的等渗重建制剂的情形下，低温保护剂对抗体的摩尔比可以从约100至1500摩尔的低温保护剂对1摩尔抗体，较佳的约200至1000摩尔的低温保护剂对1摩尔抗体，例如约200至600摩尔的低温保护剂对1摩尔抗体。
在本发明的优选例中，已发现把表面活性剂加入预冻干制剂是令人满意的。备选地，或另外地，表面活性剂可加入冻干制剂和/或重建制剂。示范性的表面活性剂包括非离子表面活性剂，例如聚山梨酸酯(例如聚山梨酸酯20或80)，聚羟亚烃(例如聚羟亚烃188)，Triton，十二烷基硫酸钠(SDS)，十二醇硫酸钠，钠辛基糖苷，十二烷基-，十四烷基-，亚油醇酯-，或十八烷基磺基甜菜碱，十二烷基-，十四烷基-，亚油醇酯-，或硬脂酰肌氨酸，十二烷基-，十四烷基-，或十六烷基甜菜碱，十二酰胺丙基-，椰子酰胺丙基-，亚油酰胺丙基-，肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酸酰丙基-，或异硬脂酰胺丙基甜菜碱(例如十二酰胺丙基)，肉豆蔻酰胺丙基-，棕榈酸酰丙基-，或异硬脂酰胺丙基二甲胺，甲基椰油酸钠-，或二甲基甲基牛磺酸钠和MONAQUATTM系列(Mona工业公司，帕特森，新泽西州),聚乙二醇，聚丙二醇和乙烯和丙二醇的共聚合物(例如，Pluronics,PF68etc)。表面活性剂的加入量应是减少重建蛋白的聚集和减少重建后微粒物质的形成。例如，预冻干制剂中，表面活性剂的存在量可以是约0.001-0.5％，优选的，约0.005-0.05％。
在本发明的某些实施例中，用低温保护剂(例如蔗糖或海藻糖)和填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)的混合物制备预冻干制剂。填充剂能产生均匀的冻干块状物而其中没有过多的空腔。
预冻干制剂(和/或冻干制剂和/或重建制剂)中可包括其它药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A编.(1980)中描述的那些，只要它们对制剂的理想特征不产生不利影响。可接受的载体，赋性剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接收者是无毒的，并包括其它的缓冲剂，防腐剂，共溶剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸在内的抗氧化剂，螯合剂例如EDTA，金属复合物(例如Zn-蛋白复合物)，生物可降解的聚合物例如聚酯纤维，和/或成盐抗衡离子例如钠离子。
本文所述的药物组合物和制剂最好是稳定的。“稳定的”制剂/组合物是储存后，其中的抗体基本上保留其物理和化学的稳定性和完整性的制剂/组合物。本领域有用于测定蛋白稳定性的各种分析技术可用，综述见Vincent Lee编.,Marcel Dekker,Inc.,纽约,纽约.,Pubs.(1991)和Jones,A..Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中。可在选择的温度、选择的时间下测定稳定性。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。冻干和重建之前或之后，通过无菌过滤膜过滤不难达到此目的。或者，例如，除了蛋白，整个混合物的无菌性可在120℃左右用高压灭菌主要成分约30分钟获得。
在蛋白，低温保护剂和其它任选成分混合后，冻干制剂。有很多不同的冷冻干燥设备可达到此目的例如(Hull,美国)或(Leybold-Heraeus,德国)冷冻干燥机。通过冷冻制剂接着在适合初步干燥的温度从冰冻内含物升华冰达到冷冻干燥。在这种条件下，产物温度低于制剂的共熔点或塌陷温度(collapse temperature)。通常，在合适压力下(压力波动范围通常在50to 250mTorr)，用于初步干燥的搁板温度大约在-30to 25℃(只要在初步干燥过程中产物保持冰冻)范围内波动。制剂，容纳样品的容器大小和类型(例如玻璃瓶)和液体的容量主要决定干燥所需的时间，该时间范围变化可从几小时到几天(例如.40-60小时)。二次干燥阶段可在0-40℃进行，主要取决于容器的类型和大小和使用的蛋白类型。然而本文发现二次干燥步骤不是必需的。例如，冻干的整个脱水阶段全程的搁板温度大约15-30℃(例如约20℃)。用于二次干燥所需的时间和压力将是能产生适合的冻干块状物，取决于，例如温度和其它参数。二次干燥的时间由产品中所需的残留湿度水平决定，并且需要至少约5小时(例如10-15小时)。压力可能与初步干燥步骤过程中采用的相同。取决于配方和瓶子大小，冰冻干燥条件可以变化。
在某些情况下，在容器中冻干蛋白制剂是最佳的，其中进行蛋白重建以免转换步骤。在这种情况下，容器可以是，例如3,5,10,20,50或100cc的小瓶。作为总体建议，冻干将产生其中的含水量约小于5％，较佳的约小于3％的冻干制剂。
在理想阶段，通常当要对患者施用蛋白的时候，用稀释液重建冻干制剂以致在重建制剂中的蛋白浓度至少是50mg/mL，例如约50mg/mL至约400mg/mL,更佳的约80mg/mL至约300mg/mL，最佳的约90mg/mL至约150mg/mL。如果意在皮下递送重建制剂，重建制剂中如此高的蛋白浓度认为是特别有效的。然而，对于其它施用途径，比如静脉施用，重建制剂中较低的蛋白浓度是理想的(例如重建制剂中蛋白浓度从约5-50mg/mL，或约10-40mg/mL)。在某些实施例中，重建制剂中蛋白浓度显著高于预冻干制剂中的。例如，重建制剂中蛋白浓度可能是预冻干制剂中蛋白浓度的2-40倍，较佳的3-10倍，最佳的3-6倍(例如至少3倍或至少4倍)。
尽管可视需要采用其它温度，但重建通常在25℃左右进行以确保完全水化。重建所需的时间取决于，例如稀释液类型，赋形剂和蛋白的量。典型的稀释液包括用于注射的无菌水，抑菌水(BWFI)，pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)，灭菌水溶液，林格氏溶液或葡萄糖溶液。稀释液任选包含防腐剂。示范性防腐剂已如上所述，其中芳香族醇，比如苄基或酚醇是优选的防腐剂。通过评估与蛋白相容性的不同防腐剂浓度和防腐剂效果测试确定采用的防腐剂量。举例说明，如果防腐剂是芳香族醇(例如苄醇)，它的存在量可以是0.1-2.0％，较佳的0.5-1.5％，但最佳的1.0-1.2％。优选的，重建制剂有每瓶小于6000微粒，所述微粒>10μm m大小。
治疗IgE介导的疾病的抗IgE抗体的应用
为了实施在此公开的方法，可将包含至少一种本文所述的抗IgE抗体的有效量上述药物组合物/制剂通过适当途径施用于需要治疗的对象(例如人)，所述途径是比如静脉施用，比如作为大丸剂或通过连续滴注一段时间，通过肌内，腹内，皮下，动脉内，滑模内，鞘内，口服，吸入或局部外用途径。商业获得的液体制剂雾化器包括喷射雾化器和超声式雾化器使用方便。液体制剂可以直接雾状化，重建后后，冻干粉可以雾状化。或者，可以用氟碳制剂和定量吸入器雾化吸入抗IgE抗体，或作为冻干和粉碎的粉末吸入。
用所述方法治疗的受体可以是哺乳动物，更佳的是人。哺乳动物包括但不限于农场动物，体育动物，宠物，灵长类动物，马，狗，猫，小鼠和大鼠。需要治疗的人对象可以是有IgE介导的疾病，具有其风险或怀疑有IgE介导的疾病的人患者，所述IgE介导的疾病例如包括但不限于过敏反应，过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎(湿疹)，灰尘过敏，昆虫或爬虫毒液过敏，食物过敏，花粉过敏和乳胶过敏的过敏性疾病。可以用常规医学检查，例如实验室测试鉴定患有IgE介导的疾病的对象。疑有IgE介导的疾病的对象可能显示一种或多种疾病症状，例如过敏反应比如鼻子刺激，打喷嚏，瘙痒和眼睛红肿，腹痛，腹胀，呕吐，腹泻，皮肤瘙痒和/或红肿，呼吸道反应(哮喘反应)，鼻炎，和/或过敏反应。有IgE介导的疾病风险，比如过敏反应的患者可能是具有一种或多种该疾病的风险因子的对象。过敏反应的风险因子包括但不限于家族史，性别，年龄，免疫系统，饮食习惯，和/或生活环境。
在此所用的“有效量”指对患者产生治疗效果所需的每种活性剂的剂量，可以是单独的活性剂或与一种或多种其它活性剂组合。本领域技术人员认可，有效量根据治疗的具体情况，病情的严重性，各患者参数，包括年龄，身体条件，身体大小，性别和体重，治疗时间，同时进行的其它治疗(如果有的话)，特定的给药途径和保健工作者的知识和专业机能内所了解的类似因素而变化。这些因素对于本领域普通技术人员是公知的，可以仅用常规试验得以解决。通常优选使用单个组分或其组合的最大剂量，就是说，根据合理医学判断的最高安全剂量。然而本领域普通技术人员会理解，由于医疗上的理由，心理理由或实际上任何其它理由，病人可能坚持要求较低剂量或可承受剂量。
经验性考虑，比如像半衰期，通常有助于决定剂量大小。举例来说，与人免疫系统相容的抗体，比如人源化抗体或全人抗体，可用来延长抗体的半衰期和防止抗体受到宿主免疫系统的攻击。可以决定给药频率并在治疗期间作出调整，通常是但不一定是基于治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟IgE介导的疾病。或者，抗IgE抗体的持续释放制剂是合适的。各种制剂和用于达到持续释放的设备在本领域是公知的。
在一个实施例中，可以凭经验决定本文所述的抗IgE抗体在已经被施用一种或多种抗体的个体中的剂量。对个体给与剂量渐增的抗体。为了评估抗体的疗效，根据常规实践可以跟踪疾病(例如过敏反应)的指标。
通常，为施用本文所述的任一抗体，起始候选剂量可为2mg/kg.。为本发明的目的，根据上面提到的因素，典型的每日剂量可能在约0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg,至30mg/kg至100mg/kg或更高范围内。针对重复施用几天或更长时间，根据情况，维持治疗直到期望的症状抑制出现或直到达到充分的治疗水平以减轻IgE介导的疾病或其症状。示范性给药方案包含施用2mg/kg的起始剂量，接着每周用1mg/kg的抗体维持剂量，或接着每隔一周用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据医务人员想获得的药代动力学衰减模式，其它给药方案也可行。例如，预期每周给药1到4次。在有些实施例中，给药量可在约3μg/mg至约2mg/kg(例如约3μg/mg,约10μg/mg,约30μg/mg,约100μg/mg,约300μg/mg,约1mg/kg,和约2mg/kg)范围内。在有些实施例中，给药频率是每周1次，每2周1次，每4周1次，每5周1次，每6周1次，每7周1次，每8周1次，每9周1次，每10周1次，每2个月1次，或每3个月1次，或更长。用常规技术和测试很容易监视这种治疗的进展。给药方案(包括使用的抗体)随着时间可以改变。
为本发明的目的，抗-IgE抗体的合适剂量将根据利用的特定抗体(或其组合物)，IgE介导的疾病的类型和严重性，施用抗体是否为了防止或治疗目的，以往的治疗，患者的临床病史和对抗体的反应，和主治医生的自主判断。通常临床医生施用抗-IgE抗体的剂量，例如2H9，直到达到预期效果的剂量。施用抗IgE抗体可以是持续性或间歇性的，例如，根据受者的生理情况，施用的目的是否是治疗性或预防性的，和其它专业从业者已知的因素。施用抗IgE抗体可以基本上持续一段指定时间或用间隔剂量，例如，在IgE介导的疾病发生之前，期间或之后。
在此所述的术语“治疗”指对患有IgE介导的疾病，比如过敏性疾病，疾病的症状，或对疾病易感的患者，应用或施用包含一种或多种活性剂的组合物，意在治愈，治疗，缓解，解除，改变，减轻，改善或影响该疾病，疾病的症状，或疾病的易感性。
IgE介导的疾病例子包括但不限于寒冷性荨麻疹，慢性荨麻疹，胆碱能性荨麻疹，慢性鼻窦炎，系统性肥大细胞增多症，皮肤肥大细胞增多症，过敏性支气管肺曲菌症，复发性特发性血管性水肿，间质性膀胱炎，嗜酸性粒细胞相关性胃肠道疾病，过敏性哮喘，过敏性鼻炎或特应性皮炎。在有些实施例中，IgE介导的疾病是过敏性疾病，例如过敏反应，过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎(湿疹)，灰尘过敏，昆虫或爬虫毒液过敏，食物过敏，花粉过敏和乳胶过敏。
缓解IgE介导的疾病包括延缓疾病的发生或进展，或减轻疾病的严重性。缓解疾病未必要求治愈结果。作为用于其中，“延缓”疾病(比如过敏反应)的发生意指推迟，阻碍，放慢，减慢，稳定，和/或延缓疾病的进展。根据病史和/或被治疗的个体，这种延缓可以是改变时间长度。“延缓”或缓解疾病发生，或延缓疾病发作的方法是当与不采用该方法相比，在给定时间段内降低疾病的一种或多种症状产生的可能性(风险)和/或降低给定时间段内症状的程度的方法。这样的比较通常基于运用足够数量的患者的临床研究得到在统计学上具有显著效果的。
疾病的“发生”或“进展”意指疾病的最初表现和/或随后进展。疾病的发生用本领域的公知常规临床技术可以检测和评估。然而，发生也指可能检测不到的进展。为本发明的目的，发生或进展指症状的生物学过程。发生包括出现，复发和发作。在此所述的IgE介导的疾病的“发作”或“出现”包括最初发作和/或复发。
在有些实施例中，在此所述的抗IgE抗体(例如2H9,5A8,或其变体)施用于需要治疗的对象，给与剂量足以在该对象中诱导表达mIgE的B细胞的凋亡和/或ADCC效应，因而清除至少20％,40％,60％,80％,90％,或更高水平的这种B细胞。
根据要治疗的疾病类型或疾病部位，可以用本医学领域普通技术人员公知的常规方法对患者施用药物组合物。该组合物也可通过其它常规途径施用，例如，口服，胃肠外给药，吸入喷雾，局部用药，直肠给药，鼻腔给药，含服，阴道给药或通过植入性药盒。此在所用的术语“胃肠外”包括皮下，皮内，静脉内，关节内，肌内，滑膜内，胸骨内，鞘膜内，病灶内，和颅内注射或输注方法。此外，对患者可以施用经长效注射给药途径，比如用1-,3-,或6-月长效注射或生物性可降解物质和方法。
可注射的组合物包含各种载体，例如植物油，二甲基乙酰胺，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸异丙酯，乙醇和多元醇(丙三醇，丙二醇，液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，水溶性抗体可用滴注法施用，借此输入含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物制剂。生理学上可接受的赋形剂包括，例如，5％葡萄糖,0.9％生理盐水,林格氏溶液或其它合适的赋形剂。肌内制剂，例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂，可在像注射用水，0.9％生理盐水,或5％葡萄糖溶液等药用赋形剂中溶解和施用。
在一个实施例中，经位点特异性或局部靶向递送方法施用抗-IgE抗体。位点特异性或局部靶向递送方法的例子包括各种抗IgE抗体的植入性长效药物来源或局部递送导管，例如输液导管，留置导管，或导管针，合成移植物，外膜包裹，分流器和支架或植入性装置，位点特异性载体，直接注射或直接应用。比如，参见WO 00/53211和美国专利号5,981,568。
免疫肽及包含其的免疫组合物
本文还描述了由mIgE，特别是mIgE的CH4和CεmX结构域之间的连接处衍生而来免疫原性肽。术语“肽”意指氨基酸通过肽键彼此连接的化合物。优选地，肽包含最多200个氨基酸残基，例如最多150个氨基酸，100个氨基酸，80个氨基酸，50个氨基酸或25个氨基酸。或者，所述肽可具有约15-20kD或更小的分子量。
在此所描述的免疫原性肽包括至少两个区段，第一区段从CH4结构域的C-末端衍生而来和第二区段从CεmX结构域的N-末端衍生而来。所述第一和第二区段，总共可以由位于CH4和CεmX结构域连接处的6-15个氨基酸残基(例如，6-12个氨基酸，6-10个氨基酸，8-15个氨基酸，或8-10个氨基酸)组成。在有些实施例中，第一和第二区段，总共有6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15个氨基酸长。
第一区段可包括氨基酸序列TVQRAVSVNP(SEQ ID NO：12)或其片段(例如，在N-末端缺失1，2，3，4，5或更多个残基)，该片段位于CH4结构域的C末端。在一个实施例中，来自CH4结构域C末端的第一个区段包含序列SVNP(SEQ ID NO：14)或其片段(例如，在N末端缺失的1，2或3个残基)。
第二区段可以包括氨基酸序列GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO：35)，或其片段(例如，在C末端缺失1，2，3，4，5或更多个残基)。在一个实施例中，第二区段包括氨基酸序列GLAGGSAQS(SEQ ID NO：15)，或其片段(例如，在C末端缺失1个，2个或3个残基)。
在有些实施例中，免疫原性肽包括氨基酸序列SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11),或其片段，其中所述片段包含来自从CH4结构域的残基和来自CεmX结构域的残基。
必要时，本文中所描述的免疫原性肽可进一步包括和第一和第二区段异源的第三区段。例如，第三区段是由非mIgE蛋白或第一和第二链区段不连续的mIgE的区域衍生而来。
本文所述的免疫原性肽可通过常规方法，例如，化学合成或重组技术来制备。所述肽可能首先需要化学修饰以改善其在体内的半衰期。就本发明实施而言，一种化学修饰的肽或肽类似物包括通过体内或体外增加的稳定性和/或效力得以表征的肽的任何功能性化学等同物。术语肽类似物还指如本文所述肽的任何氨基酸衍生物。肽类似物可通过以下方法，包括但不限于侧链修饰，在肽合成过程中非天然氨基酸和/或其衍生物的掺入和交联剂的使用和对肽或其类似物施加构象约束的其它方法来制备。侧链修饰的例子包括氨基修饰，如通过用与醛反应的还原性烷基化接着用硼氢化钠进行还原；用甲基乙酰胺进行酰胺化；用乙酸酐乙酰化；用氰酸盐氨甲酰化氨基；用2,4,6,三硝基苯磺酸(TNBS)三硝基苄基化氨基；用琥珀酸酐和四氢邻苯二甲酸酐烷基化氨基；和用吡哆醛-5'-磷酸吡哆酰基化赖氨酸，接着用NaBH4还原。精氨酸残基的胍基可以通过与试剂如2，3-丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛形成杂环缩合产物进行修饰。羧基可通过邻酰基异脲的形成作碳化二亚胺活化，接着衍生化成例如，相应的酰胺而被修饰。巯基可通过以下方法进行修饰，例如用碘乙酸或碘乙酰胺作羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；和其他硫醇化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺，马来酐或其它替代的马来酰亚胺的反应；用4-氯汞苯甲酸，4-氯汞苯磺酸，氯化苯汞，2-氯汞-4-硝基酚和其它汞制剂形成汞制剂衍生物；与氰酸在碱性pH下氨甲酰化。色氨酸残基可通过，例如，用N-溴代琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤烷基化吲哚环得以修饰。酪氨酸残基可通过与四硝基甲烷硝化以形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。修饰组氨酸残基的咪唑环可通过与碘乙酸衍生物的烷基化或与焦碳酸二乙酯的N-乙酯基化作用来完成。在肽合成多城中掺入非天然氨基酸和衍生物的例子包括，但不限于，利用正亮氨酸，4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，6-氨基己酸，叔丁基甘氨酸，正缬氨酸，苯基甘氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。
免疫原性肽可被用于形成免疫原性组合物(例如，疫苗)用于引发对肽的特异性免疫应答，例如，抗体应答。用于制备免疫原性组合物的方法在本领域中是公知的，例如，上述的那些。
例如，用于制备疫苗的方法一般是本领域所熟知的，例如美国专利号4601903，4599231，4599230和4596792所示例的。疫苗可制备为注射剂，液体溶液或乳剂。本发明的免疫原性肽可以与生理上可接受的和相容的赋形剂混合。赋形剂可包括水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇，及其组合。该疫苗还可进一步含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，或以增强疫苗有效性的佐剂。实现疫苗的佐剂效应的方法，包括使用诸如氢氧化铝或磷酸(明矾)等试剂，常用的如在磷酸缓冲盐水中0.05～0.1％的溶液。疫苗可以通过皮下或肌肉内注射作胃肠外给药。备选地，其它施用方式包括栓剂和口服制剂可以是满足需要的。对于栓剂，粘合剂和载体可包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酸酯。口服制剂可以包括通常使用的赋形剂，例如，药物级的糖精，纤维素，碳酸镁等。这些组合物可以是溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，缓释制剂或粉剂的形式，并包含10-95％的本文所述的免疫原性肽。
制备品
在本发明的另一个实施例中，提供了一种制备品，该制备品包含本文所述的任何药物组合物和制剂(例如，包括抗IgE抗体或免疫肽)，并提供了它们重建和/或使用的说明书。所述制备品包括容器。合适的容器包括，例如瓶，小瓶(例如，双室小瓶)，注射器(如双室注射器)和试管。所述容器可以由各种材料如玻璃或塑料制成。该容器装有制剂以及在该容器上或与之相联的标签，可能指示重建和/或使用的用法说明。例如，标签可能指示，制剂被重建成如上所述的蛋白浓度。该标签可进一步表明制剂是有益的或预期用于皮下施用。装有制剂的容器可以是多用途的小瓶，允许重复施用(例如，2-6次施用)重建制剂。制备品可进一步包括第二容器，其包含合适的稀释剂(如BWFI)。稀释剂和冻干制剂混合后，在重建的制剂中的最终蛋白质浓度一般为至少50毫克/毫升。制备品可进一步包括从商业和用户立场出发满足需要的其它材料，包括其它缓冲剂，稀释剂，滤器，针头，注射器，和带有使用说明的包装说明书。
通用技术
本发明的实施将采用，除非另有说明，本领域的技术范围内的分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术。这些技术在文献中充分说明，例如，分子克隆：实验室手册，第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社，寡核苷酸合成(M.J.Gait编.,1984)，分子生物学方法，Humana Press；细胞生物学：实验室笔记本(J.E.Cellis编.,1998)学术出版社；动物细胞培养(R.I.Freshney编.,1987)；细胞与组织培养介绍(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；细胞和组织培养：实验室步骤(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编.,1993-8)J.Wiley和Sons；酶学方法(学术出版公司)；实验免疫学手册(D.M.Weir和C.C.Blackwell编,)；哺乳动物细胞的基因转移载体(J.M.Miller和M.P.Calos编.,1987)；最新分子生物学方法(Current Protocols in MolecularBiology(F.M.Ausubel等编.,1987))；PCR：聚合酶链式反应((Mullis等编.,1994)；最新免疫学方法(Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编.,1991))；分子生物学简易方法(Short Protocols in Molecular Biology(Wiley和Sons,1999))；免疫生物学(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；抗体(P.Finch,1997)；抗体：一种实用方法(D.Catty编.,IRL Press,1988-1989)；单克隆抗体：一种实用方法(P.Shepherd和C.Dean编.,牛津大学出版社,2000)；使用抗体：实验室手册(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(M.Zanetti和J.D.Capra编.,Harwood Academic Publishers,1995)。
在本说明书中使用的术语在本发明情形内和每个术语使用在特定情形下通常在本领域中具有其普通意义。在本发明中所述的和在此所讨论的某些术语是用于对实践者针对本发明的具体描述提供额外指导。为方便起见，某些术语可以被重点强调，例如使用斜体字和/或引号。采用重点强调对术语的范围和含义没有影响，在同样的背景下，术语是否被重点强调，术语的范围和含义是一样的。可以理解，同样的东西可以以一种以上的方式来表示。因此，替代性的语言和同义词可用于任何一个或更多在此所讨论的术语，也不是任何特殊的意义被放置在一个术语是否在本文中被阐述或所论述不会被放置任何特殊的意义。某些术语的同义词被提供。一个或多个同义词的列举不排除使用其他同义词的使用。包括在此所讨论的任何术语的例子在本说明书中任何地方的使用，仅是说明性的，而绝不是限制了本发明的范围和含义或任何示例的术语。同样地，本发明并不限定于在本说明书中给出的各种实施例。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与涉及本发明的本领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。在冲突的情况下，以本文件包括定义为准。
无需进一步详尽说明，相信本领域的技术人员可根据上面的描述中，将本发明利用至最大限度。下面的具体实施方式，因此，应当被解释为仅仅是说明性的，并且以任何方式都不限制本公开的其余部分。本文引用的所有出版物对在此引用的目的或主题被作为一个整体内容参考。
实施例1:人膜结合ε链的长同种型的CH4-CεmX连接处的特异性mAb的制备
杂交瘤方法被用于开发CH4-CεmX的连接肽特异性的mAb。用于免疫接种BALB/c小鼠的抗原是重组融合蛋白，其含有乙型肝炎核心抗原(HBcAg)，插入了具有SVNPGLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:25；P1)氨基酸序列的连接肽。SEQ ID NO：25含有来自CH4结构域C末端的4个氨基酸残基，SVNP(SEQ ID NO:14),和来自CεmX结构域N末端的17个氨基酸残基，GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:35)。本研究的目标是开发能识别SVNP和作为抗原性表位的实质性部分的GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQID NO：35)的mAb。
简要的，从质粒p3224-3-HBV-核心(编码全长的HBcAg)扩增的截短HBcAg(残基1-149)的编码序列克隆到pET-28A载体(Novagen)。通过用P1在MIR替换Pro79和Ala80，在DNA水平制备HbcAg-P1构建体。N末端接头是GGGGT(SEQ ID NO：36)和C-末端接头是GG。HbcAg-P1构建体含有N末端的六组氨酸标签用于纯化(45)，表达于大肠杆菌菌株BL21。
IPTG诱导的大规模表达融合蛋白进行如下。由上面提到的表达构建体转化的大肠杆菌细胞在补充有卡那霉素(50微克/毫升)的0.6升Luria Bertani培养基(pH值为7.0)中过夜培养。用6升Luria Bertani培养基稀释过夜培养物，并以220rpm在30℃振荡仪中温育。当培养物的OD 600达到0.6-0.8，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(0.1mM)诱导蛋白表达并将培养物进一步培养16-18小时。然后以10,000×g在4℃下收获细胞10分钟。弃去上清液，通过在冰冷的水浴中搅拌，将沉淀物重新悬浮在60ml的裂解缓冲液(1×PBS，pH7.4的0.1％NP-40，5mM EDTA，0.5mg/ml溶菌酶)，通过马萨诸塞州沃尔瑟姆TS公司的弗氏细胞压碎器(French pressure cell,Thermo Scientific,Waltham,MA)，将细胞由单个通道以12,000lb/in2裂解。离心后，用硫酸铵沉淀上清液中的蛋白质，将沉淀物重新悬浮于20ml的1×平衡缓冲液，用相同的缓冲液作透析，离心，回收上清液。在室温下通过Ni-NTA琼脂糖凝胶纯化His-标记的HBcAg。重组蛋白的纯度通过SDS-PAGE分析，使用抗HbcAg mAb,克隆13A9(1:1000稀释,圣克鲁斯生物技术公司)通过免疫印迹进一步测定相同迁移率的谱带。
以2周的间隔，用如上所述制备的HbcAg-P1融合蛋白(无佐剂)皮下免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠3次。在不存在佐剂的情形下，腹膜内给予50μg的HBcAg-P1做最后加强，3天后，用来自免疫小鼠的脾细胞产生杂交瘤。
如下所述筛选分泌具有所需抗原结合活性的抗体的杂交瘤细胞。用0.1M，pH 9.6的碳酸盐缓冲液配制的10μg/mL P1肽和各种其它肽或1μg/mL的各种重组CεmX融合蛋白温育包被微量滴定板，4℃过夜。将孔用PBS(pH＝7.3)配制的1％BSA阻断1小时，并在37℃与各种稀释液浓度的抗血清或对照抗体温育1小时。洗涤后，利用HRP偶联的山羊抗小鼠IgG，Fcγ片段特异性(杰克逊免疫研究公司)，以1:10,000并在37℃温育1小时来测定配体结合的抗体在，随后用TMB底物(临床科学产品公司)温育。在450nm处测定OD值。选择阳性克隆用于进一步表征。
许多示例性的克隆，包括mAb 2H9和5A8，在本研究中被确定能结合P1。
上述抗体克隆的VH和VL基因区段通过PCR从分泌抗体的杂交瘤克隆扩增。这样获得的基因区段进行测序，以确定mAb 2H9和mAb5A8的VH和VL序列，其示于图6和7。VH和VL区的互补性决定的区以下划线表示。
实施例2:mAb 2H9的表位作图.
如下所述对mAb 2H9进行表位作图研究。合成代表P1肽诸片段的几种肽，分析其对mAb2H9的反应性。这些肽的氨基酸序列示于图2，A部分中。还分析各种重组蛋白对mAb 2H9的反应性，包括IgE.CH3-CH4，IgE.Fc-εm67，IgG.Fc-εm67，HbcAg-P1,和HbcAg-CεmX。εm67区段包含CεmX(含有52个氨基酸残基的长度；参见WO2010/097012)和migis-ε肽(含有15个氨基酸残基的长度)，这表示εm链的膜锚定肽的细胞外区段。这些重组蛋白的连接序列示于图2，B部分中。
为比较目的，在本项研究中比较了分别在US2009/0010924和WO2010/097012中描述的mAbs 47H2和4B12。
从这项研究中获得的结果示于图2，C部分中。结果发现，通过从P1的N末端除去CH4结构域衍生的残基，即S,V,N,和P,mAb 2H92H9与代表CH 4-CεmX连接的肽的结合逐渐削弱。从P1肽去除的QRAPDRVL(SEQ ID NO:37)不影响反应性。这些结果表明，mAb 2H9的抗原表位存在于SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO：11)。
如图2，C部分所示，mAb 2H92H9不与IgE.CH3-CH4结合，它与IgG.Fc-εm67的结合比与IgE.Fc-εm67的结合更弱。这些结果表明，mAb 2H9的抗原性表位不单独存在于CH4结构域内，CH4内的SVNP残基对于mAb2H9与其同源抗原性表位的结合是至关重要的。
在图2中所示的数据还表明，mAbs 47H2和4B12不与2H9的抗原性表位居于其中的SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO：11)结合。
实施例3:mAb 2H9和5A8与表达mIgE的Ramos转染子的结合
如下所示研究2H9和5A8对表达mIgE的B细胞的结合及随后的效应。利用分别被转染了人mIgE的长或短同种型的人B细胞系Ramos和A20。这些细胞与mAb 2H9以各种浓度(20，10，1，和0.1μg/ml)或mAb 5A8以各种浓度(105，2.5，1.25，和0.625μg/ml)在冰上孵育20分钟，然后进行流式细胞术分析。如图3和图8所示，这项研究中获得的结果说明2H9和5A8都可以与表达mIgE的Ramos细胞结合。
实施例4:mAb 2H9和5A8诱导表达mIgE的Ramos转染子凋亡
mAb 2H9和mAb 5A8诱导表达mIgE的B细胞凋亡的能力进行了研究。37℃，表达mIgE,mIgE.FcL或mIgE.FcS的稳定Ramos转染子(5x 105/ml)与纯化的mAb 2H9或mAb 5A8在完整的RPMI1640培养基中孵育1小时。mAbs 4B12和7C3在本研究中作为对照使用。将人IgG的Fc的特异性二抗，山羊F(ab')2(杰克逊免疫研究实验室，West Grove,宾夕法尼亚州)，以25μg/ml的最终浓度加入培养基中，并将培养物在37℃再培养20或24小时。通过检测磷脂酰丝氨酸(PS)暴露(20小时)，胱冬酶-3和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割(24小时)来测定经处理细胞中的凋亡水平。如图4和图9中所显示，mAb 2H9和mAb5A8都能在表达mIgE的Ramos细胞中成功诱导凋亡。
实施例5:mAb 2H9和mAb 5A8对表达mIgE的A20转染子诱导抗体依赖性细胞毒性
根据制造商的说明书，用抗CD49(DX5)微珠(美天旎生物技术-Miltenyi Biotech)，通过MACS纯化来自脾细胞的小鼠NK细胞。表达mIgE.FcL的Ramos细胞在37℃下在PBS/0.1％BSA中用CFSE标记(英杰公司-Invitrogen)10分钟。用冷的完全RPMI1640培养基洗涤三轮后，将细胞调节到105个细胞/ml。在200μl完全RPMI1640培养基中20000标记细胞的等分试样用待测的mAb(包括mAb 2H9，5A8，4B12和7C3)在37℃包被30分钟，然后用纯化的小鼠NK细胞以E/T比值为10混合。孵育24小时后，总细胞用2.5μg/ml的7-氨基放线菌素D(英杰公司)在冰上染色15分钟，然后用FACSCanto II流式细胞仪(BDB公司-Becton Dickinson Biosciences)进行分析。在点图分析中活的靶细胞被定义为CFSE阳性和PI-阴性。给定E/T比例下的裂解靶细胞的百分比为：100×[(抗体非依赖性对照中活的靶细胞％－样本中活的靶细胞％)/抗体非依赖性的对照中活的靶细胞％]。图5和图10所示的结果表明，2H9和5A8都能在表达mIgE的Ramos转染子中诱导抗体依赖性细胞毒作用。
其它实施例
所有在本说明书中公开的特征可以以任何组合进行组合。在本说明书中公开的每个特征可以被用于相同，等效或类似目的的备选特征所替代。因此，除非另有说明，否则所公开的每个特征仅是一般系列的等效或类似特征的一个例子。
从上面的描述，本领域的技术人员可以容易地确定本发明的本质特征，在不脱离其精髓和范围的情形下，对本发明可以进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求书内。
在本发明中引用的所有出版物和专利申请都作为整体内容参考，就如同每一篇出版物或专利申请被特别地及单独地指示作为整体内容参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
以清楚理解为目的，虽然本发明通过用阐述和实例的方式对前面提到的发明作了具体描述，根据本发明中某些变化和修改的教导，在不脱离所附权利要求的精髓或范围，对本领域的普通技术人员将是容易明白。

Claims (32)

1.一种分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体与膜结合IgE(mIgE)的表位结合，其中所述的表位由括第一部分和第二部分构成，所述第一部分位于mIgE的CH4区域内，所述第二部分位于mIgE的CεmX结构域内。
2.如权利要求1所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述第一部分包含TVQRAVSVNP(SEQ ID NO:12)所示氨基酸序列，或其片段。
3.如权利要求1或2所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述第二部分包含GLAGGSAQSQ(SEQ ID NO:13)所示氨基酸序列，或其片段。
4.如权利要求1所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体与SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11)结合。
5.如权利要求1－4中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体包含重链可变区(VH)，所述重链可变区包含：
(i)GYTFTNYNVH(SEQ ID NO:10)所示VH互补性决定区(CDR)1，GMYPGNDDILYNQNFKD(SEQ ID NO:9)所示VH CDR2，和SGLQGPWFDY(SEQ ID NO:10)所示VH CDR3，或
(ii)GFSLTDYGVN(SEQ ID NO:19)所示VH CDR1，MIWGDGSTDYNSTL(SEQ IDNO:20)所示VH CDR2，和NWFAY(SEQ ID NO:21)所示VH CDR3。
6.如权利要求1－5中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体包含轻链可变区(VL)，所示轻链可变区包含：
(i)RASDHINNWLA(SEQ ID NO:5)所示VL CDR1，SATSLET(SEQ ID NO:6)所示VL CDR2，和QQCWITPFT(SEQ ID NO:7)所示VL CDR3；或
(ii)SSSVNYMH(SEQ ID NO:22)所示VL CDR1，DTSKLAS(SEQ ID NO:23)所示VL CDR2，和QQWSSNPW(SEQ ID NO:24)所示VL CDR3。
7.如权利要求1－6中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:17至少85％相同的重链可变区。
8.如权利要求1－7中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体包含与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:18至少85％相同的轻链可变区。
9.如权利要求7中所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体包含：
与SEQ ID NO:3至少90％相同的重链可变区和与SEQ ID NO:4至少90％相同的轻链可变区；或
与SEQ ID NO:17至少90％相同的重链可变区和与SEQ ID NO:18至少90％相同的轻链可变区。
10.如权利要求9中所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体包含：
如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:17所示的重链可变区
和如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区。
11.如权利要求1－10中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述抗体与包含以下的抗体结合相同的表位：
如SEQ ID NO:3所示的重链可变区和如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:17所示的重链可变区和如SEQ ID NO:18所示的轻链可变区。
12.如权利要求1－11中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
13.如权利要求1－12中任一所述的分离的抗-IgE抗体，其特征在于，所述的抗体是人抗体或人源化抗体。
14.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸包含编码抗体重链可变区的核苷酸序列，所述的重链可变区包含：
(i)含有GYTFTNYNVH(SEQ ID NO:8)所示VH互补性决定区(CDR)1，GMYPGNDDILYNQNFKD(SEQ ID NO:9)所示VH CDR2，和SGLQGPWFDY(SEQ ID NO:10)所示VH CDR3的重链可变区；或
(ii)GFSLTDYGVN(SEQ ID NO:19)所示VH CDR1，MIWGDGSTDYNSTL(SEQ IDNO:20)所示VH CDR2，和NWFAY(SEQ ID NO:21)所示VH CDR3的重链可变区(VH)。
15.如权利要求14中所述的分离的核酸，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:17所示抗体重链可变区。
16.如权利要求15中所述的分离的核酸，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
17.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸包含编码抗体轻链可变区的核苷酸序列，所述的轻链可变区包含：
RASDHINNWLA(SEQ ID NO:5)所示VL CDR1，SATSLET(SEQ ID NO:6)所示VL CDR2，和QQCWITPFT(SEQ ID NO:7)所示VL CDR3；或
SSSVNYMH(SEQ ID NO:22)所示VL CDR1，DTSKLAS(SEQ ID NO:23)所示VL CDR2，和QQWSSNPW(SEQ ID NO:24)所示VL CDR3。
18.如权利要求17中所述的分离的核酸，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:18所示抗体轻链可变区。
19.如权利要求18中所述的分离的核酸，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
20.一种载体，其特征在于，所述的载体包含如权利要求14-19中任一所述的核酸。
21.如权利要求20中所述的载体，其特征在于，所述的载体是表达载体。
22.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含如权利要求20或21所述的载体。
23.一种免疫组合物，其特征在于，所述的组合物包含免疫原性肽和佐剂，其中，所述的肽包含SVNPGLAGGSAQS(SEQ ID NO:11)所示氨基酸序列或其中的免疫原性表位。
24.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物包含如权利要求1-13中任一所述的抗-IgE抗体，如权利要求14-19中任一所述的核酸，如权利要求20或21中所述的载体，或权利要求23中所述的免疫原性肽，和药学上可接受的载体。
25.一种用于治疗IgE介导的疾病的药物组合物，其特征在于，所述的组合物包含如权利要求1-13中任一所述的抗-IgE抗体，如权利要求14-19中任一所述的核酸，如权利要求20或21中所述的载体，或权利要求23中所述的免疫原性肽，和药学上可接受的载体。
26.如权利要求25中所述用途的药物组合物，其特征在于，其中，所述的IgE介导的疾病是过敏性疾病。
27.如权利要求26中所述用途的药物组合物，其特征在于，所述的过敏性疾病选自下组：过敏反应，过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎(湿疹)，灰尘过敏，昆虫或爬虫毒液过敏，食物过敏，花粉过敏和乳胶过敏。
28.如权利要求1-13中任一所述的抗-IgE抗体，如权利要求14-19中任一所述的核酸，如权利要求20或21中所述的载体，或权利要求23中所述的免疫原性肽，在制备治疗IgE介导的疾病的药物中的用途。
29.一种治疗IgE相关性疾病的方法，其特征在于，所述的方法包括对需要治疗的对象施用有效量的如权利要求24中所述的药物组合物。
30.如权利要求29中所述的方法，其特征在于，所述的对象诊断到患有IgE介导的疾病，怀疑患有IgE介导的疾病，或处于IgE介导的疾病的风险中。
31.如权利要求29中所述的方法，其特征在于，所述的IgE介导的疾病是过敏性疾病。
32.如权利要求31中所述的方法，其特征在于，所述的过敏性疾病选自下组：过敏反应，过敏性哮喘，过敏性鼻炎，特应性皮炎(湿疹)，灰尘过敏，昆虫或爬虫毒液过敏，食物过敏，花粉过敏和乳胶过敏。
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