CN105542004B

CN105542004B - 一种抗破伤风毒素的中和性单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN105542004B
Application number: CN201610019326.8A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 于蕊; 徐俊杰; 侯利华; 于长明; 李建民; 房婷; 刘树玲; 宋小红; 付玲
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2016-01-12
Filing date: 2016-01-12
Publication date: 2019-02-19
Anticipated expiration: 2036-01-12
Also published as: CN105542004A

Abstract

本发明公开了一种抗破伤风毒素的中和性单克隆抗体，所述抗体通过由破伤风毒素重链C片段免疫小鼠获得杂交瘤细胞，调取抗体的轻重链可变区基因，构建人鼠嵌合全抗体表达载体，并转染CHO细胞，纯化获得。本发明公开的抗体具有特异性结合破伤风毒素的活性，单株抗体可以部分保护小鼠抵御破伤风毒素的攻击，四株抗体混合可以完全保护两倍致死剂量破伤风毒素的攻击。

Description

一种抗破伤风毒素的中和性单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗破伤风单克隆抗体多肽，以及所述基因和多肽在制备破伤风治疗药物中的应用，属于基因工程和免疫球蛋白技术领域。

背景技术

破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌（破伤风杆菌，Clostridium tetani）引起的感染性细菌性疾病。在厌氧条件下（如被污染的坏死性伤口），这种无所不在的杆菌可产生一种毒性极强的神经毒素—破伤风痉挛毒素。破伤风痉挛毒素可阻断中枢神经系统中的抑制性神经递质，引发肌肉强直和痉挛，亦即破伤风的典型表现。破伤风可在任何年龄发病，即便有了现代加强监护的条件，病例死亡率也非常高。一切开放性损伤，均有发生破伤风的可能。绝大多数破伤风病例与生育相关，多发于发展中国家，主要见于不洁分娩和产后卫生条件较差的新生儿和孕产妇。儿童和成人受伤后发生破伤风也是一个严重的公共卫生问题。近年来，地震、山体滑坡、泥石流、洪水、台风等自然灾害频发，极大地增加了受伤灾民和救灾人员感染破伤风导致死亡的危险性。据报道，印度洋海啸发生两周半以后，印尼亚齐发生了106例破伤风，其中20例死亡。2005年巴基斯坦地震后同样报告了破伤风病例。此外，由于破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素，约100ng的破伤风毒素便可以致人死亡，因此极有可能被用于生物战剂。1996年召开的生物武器公约缔约国政府专家特设小组第五次会议确定的生物战剂标准与战剂病原体清单中，破伤风毒素被列为用于攻击人的毒素。安全、有效的破伤风治疗药物对于普通民众和部队的平、战时均具有特殊意义，在进行野外作战、执行维和任务及抗震救灾时可作为药品储备及安全保障。

任何创伤都有发生破伤风的可能，破伤风抗体是治疗破伤风的快速有效药物，目前市场上的破伤风治疗药物有破伤风马抗毒素（TAT）和破伤风人免疫球蛋白（HIGT），但是它们在使用时均存在一定的缺点：

TAT的主要组成成分是经胃酶消化后的马破伤风免疫球蛋白，由于对人体来说TAT是异源蛋白，因此在应用中皮试阳性率高（高于50%），注射后过敏反应时常发生，常见的不良反应有：1.过敏休克：可在注射中或注射后数分钟至数十分钟内突然发生；患者突然表现沉郁或烦躁、脸色苍白或潮红、胸闷或气喘、出冷汗、恶心或腹痛、脉搏细速、血压下降、重者神志昏迷虚脱，如不及时抢救可以迅速死亡；轻者注射肾上腺素后即可缓解；重者需输液输氧，使用升压药维持血压，并使用抗过敏药物及肾上腺皮质激素等进行抢救。2.血清病：主要症状为荨麻疹、发热、淋巴结肿大、局部浮肿，偶有蛋白尿、呕吐、关节痛，注射部位可出现红斑、瘙痒及水肿；一般系在注射后7～14天发病，称为延缓型。亦有在注射后2～4天发病，称为加速型。HIGT由乙型肝炎疫苗免疫后再经破伤风类毒素免疫的献血员中采集破伤风抗体效价高的血浆或血清，经低温乙醇法提取的特异性免疫球蛋白制剂，含丙种球蛋白90%以上。HIGT使用时无需皮试，可直接注射，但由于其属于血液制品，存在感染丙肝、艾滋等传染病的潜在风险，而且受来源限制，产量较低，成本较高，市场上往往出现“一针难求”的现象。

基因工程破伤风中和抗体是通过哺乳动物细胞表达系统表达、纯化得到的具有中和破伤风毒素功能的重组产品，它具有成分明确、理化性质稳定、副作用低、可无限量大规模生产制备的优点。在作为军队战略储备时，可解决战争中由于使用TAT过敏反应引起的战斗减员和HIGT供应不足引起军队战斗力下降的问题；在国家抗震救灾及处置破伤风相关的突发公共卫生事件中，可作为急救药物，减少破伤风发生率，稳定民心。此外，随着家养宠物越来越多，被宠物咬伤的情况时有发生，基因工程破伤风中和抗体作为TAG和HIGT的更新换代产品，其市场前景是非常大的。发明专利CN102690789B、CN101220096B、CN1305904C、CN100391975C均曾公开过抗破伤风毒素的单克隆抗体，但是目前尚未出现一株具有优异的中和活性和保护效果的单克隆抗体，以至于目前还没有任何一个单抗发展到商业化和产业化的阶段。

破伤风毒素全长1315 个氨基酸，分子量为150 kDa，共由A、B、C 三部分组成，每部分分子量均为50 kDa。C片段是重链的C 端，具有结合神经细胞的作用。破伤风毒素天然C片段（TeNT-Hc）保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，免疫效价与毒素相当，无毒性，过敏原性低，是发展亚单位疫苗和基因工程疫苗的候选者, 也是筛选获得破伤风中和性单克隆抗体的理想抗原。CN200910135972.0公开了一种通过核苷酸序列优化使破伤风毒素受体结合区Hc在大肠杆菌中获得高效可溶性表达的方法，并获得了具有优异保护效果的基因重组Hc蛋白亚单位疫苗，本发明通过引用将该专利的公开内容并入到本申请的说明书内容之中。

基于现有技术存在的上述技术问题，本发明欲利用重组表达的破伤风无毒抗原TeNT-Hc （CN200910135972.0）免疫小鼠，制备可大量生产的高效价抗破伤风中和性和保护效果的单克隆抗体。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先筛选获得抗破伤风毒素重链C片段的，即破伤风毒素的受体结合区的单克隆抗体，所述抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区，以及重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列选自下述序列组合：

（1）SEQ ID NO：1第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：3第26-33、51-58、97-104位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为TY1；

（2）SEQ ID NO：5第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：7第26-33、51-58、97-104位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为TY5；

（3）SEQ ID NO：9第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：11第26-33、51-58、97-108位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为TY8；或者

（4）SEQ ID NO：13第27-32、50-52、89-97位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：15第26-34、52-58、97-107位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为TY11。

在一个优选的实施方案中，所述抗体的轻链可变区，以及重链可变区的氨基酸序列选自下述序列组合：

（1）SEQ ID NO：1，以及SEQ ID NO：3；

（2）SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7；

（3）SEQ ID NO：9，以及SEQ ID NO：11；或者

（4）SEQ ID NO：13，以及SEQ ID NO：15。

在一个更为优选的实施方案中，所述抗体的轻链恒定区，以及重链恒定区的氨基酸序列均为下述序列组合：SEQ ID NO：17，以及SEQ ID NO：19。

第二，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体轻链的核苷酸序列，编码所述抗体轻链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：18所示，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列选自下述序列：

（1）SEQ ID NO：2；

（2）SEQ ID NO：6；

（3）SEQ ID NO：10；或者

（4）SEQ ID NO：14。

第三，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体重链的核苷酸序列，编码所述抗体重链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：20所示，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列选自下述序列：

（1）SEQ ID NO：4；

（2）SEQ ID NO：8；

（3）SEQ ID NO：12；或者

（4）SEQ ID NO：16。

第四，本发明还提供了一种含有编码上述单克隆抗体重链和/或轻链的核苷酸序列的表达载体。

优选地，所述载体为pMH3S分泌型真核表达载体。

第五，本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。

优选地，所述细胞为CHO细胞。

第六，本发明提供了上述单克隆抗体在制备破伤风治疗药物中的应用。

最后，本发明为了克服目前单株抗体活性不高的技术难题，提供了一种药物组合物，所述组合物含有至少一种上述的单克隆抗体，以获得具有多株抗体协同效应的中和活性和保护率。

优选地，所述组合物含有四种单克隆抗体。所述四种单克隆抗体的轻链可变区，以及重链可变区的氨基酸序列为下述序列组合：

（1）SEQ ID NO：1，以及SEQ ID NO：3；

（2）SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7；

（3）SEQ ID NO：9，以及SEQ ID NO：11；和

（4）SEQ ID NO：13，以及SEQ ID NO：15；

具有上述（1）-（4）序列组合序列的单克隆抗体在本发明中分别被命名为TY1、TY5、TY8和TY11；所述抗体的轻链恒定区，以及重链恒定区的氨基酸序列均为下述序列组合：SEQID NO：17，以及SEQ ID NO：19。

本发明公开的四株单抗均具有良好的特异性，能够特异地与TeNT-Hc和TT蛋白结合，而与其他蛋白无结合活性。单株抗体对小鼠能够明显延长小鼠死亡时间，具有部分保护活性，TY1、TY5、TY8、TY11单株抗体对小鼠两倍致死剂量的毒素保护率分别为50%、30%、40%和40%。四株抗体各50μg联合使用时即可完全保护小鼠低于两倍致死剂量毒素的攻击，保护率达到100%。

附图说明

图1. Eco RI/Not I双酶切pMH3S-chimereic-L质粒图谱；

图2. Eco RI/Not I双酶切pMH3S-chimereic-H质粒图谱；

图3. 四株单克隆抗体纯化后的还原电泳图谱；

图4. 四株单克隆抗体的抗原结合特异性比较图；

图5. 单株抗体在小鼠体内的保护活性示意图；

图6. 不同浓度的混合抗体在小鼠体内的保护活性示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1：抗破伤风中和性单克隆抗体的制备

1. 鼠源单克隆抗体基因的克隆

1.1 鼠源单抗的制备

以重组破伤风TeNT-Hc蛋白（CN200910135972.0）为免疫原，采用常规单克隆抗体制备方法获得的4株高亲和力、高特异性的鼠源性抗破伤风单抗TY1、TY5、TY8和TY11杂交瘤细胞株，分泌的抗体分子亚型为IgG1，轻链为Kappa亚型。

1.2 单抗可变区基因的克隆

单抗由可变区和恒定区构成，因为鼠单抗的可变区基因变异大，而恒定区的基因序列非常保守，因此采用5′-RACE方法进行克隆，其基本原理是在未知序列的5′端添加引物序列，与3′端的保守序列进行PCR扩增。获得的鼠源单抗基因可用于构建表达载体，然后转染哺乳动物细胞，获得稳定表达的细胞株，最终获得表达产物。

操作包括如下步骤：

A：总RNA的提取；B：RNA的去磷酸化；C：去帽子反应；D：5ˊ-RACE 适配子连接；E：反转录反应；F：外引物PCR反应；G：内引物反应；H：琼脂糖凝胶电泳；I：切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定；J：BLAST检索分析序列的正确。具体参考说明书（TaKaRa，D315）。简单描述如下：

A：总RNA的提取：取处于对数生长期的5E11杂交瘤细胞（5×10⁶），采用Trizol一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1%琼脂糖凝胶电泳检测。

B： RNA的去磷酸化：使用CIAP（TaKaRa，D315），反应体系50μl，包括总RNA 2 μl（1μg/μl），NRAse抑制剂1μl（40Μ/ΜL），10×缓冲液 5μl， CIAP 0.6μl，（16Μ/μl），50℃反应1小时。

C：去帽子反应：CIAP处理过的RNA 7μl，NRAse抑制剂1μl（40Μ/μl），10×缓冲液 1μl， TAP 1μl，（0.5Μ/μl）,37℃反应1小时。

D：5ˊ-RACE 适配子连接:连接体系40μl，依次加入CIAP/TAP处理过的RNA5μl，5ˊRACE 适配子（15μM）1μl，NRAse的水4μl；65℃反应5分钟后，冰上放置2分钟，然后依次加入NRAse抑制剂1μl（40Μ/ΜL），5×连接缓冲液8μl，40%的PEG 6000 20 μl，T4 RNA连接酶1μl，16℃反应1小时。

E：反转录反应：反应体系包括连接后的RNA为6μl，随机引物0.5μl，55×缓冲液2μl，dNTP1μl，NRAse抑制剂0.25μl（40Μ/ΜL）,MMLV 0.25 μl(200Μ/μl)。混匀，30℃ 10min，50℃ 60min，5℃ 5min。反应产物置于-20℃备用。

F：外引物PCR反应：反应体系为Ex Taq聚合酶（5Μ/μL）0.25μL；10×Ex Taq Bμffer 5μL；dNTP Mixtμre （各2.5mM）4μL；模板cDNA 2.5μL；5´RACE外引物2μl，特异性外引物2μl，加灭菌蒸馏水至50μL，混匀，瞬时离心后，置PCR仪上反应。反应条件：94℃预变性3分钟，接着 94℃30s，52℃ 30s，72℃ 1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

G：内引物反应：除模板为外引物反应液，引物使用内引物外，其余反应液体同外引物PCR反应。

H：琼脂糖凝胶电泳：扩增产物H和L经琼脂糖凝胶（1%）电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒（BIO BASIC INC）回收纯化后，凝胶电泳鉴定。

I：切胶回收特异性PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定：将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体lμl，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3μl，去离子水lμl，连接缓冲液5μ1，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-mouse-VL和pMD-mouse –VH。

测序后，对获得的基因序列用Vector NTI软件进行分析，结果如下：

鼠源单抗TY1轻链可变区核苷酸编码序列全长为336个碱基，序列如SEQ ID NO:2所示，多肽序列112个氨基酸，序列如SEQ ID NO:1所示。可变区包括4个框架区（Fragmentregion，FR）和3个CDR（Complementary determinant region, CDR），其中SEQ ID NO:2的1-78位（SEQ ID NO:1的1-26位为相应的氨基酸序列）碱基编码FR1，79-111位碱基（27-37位）编码CDR1；112-162位碱基（38-54位）编码FR2，163-171位碱基（55-57位）编码CDR2；172-279位碱基（58-93位）编码FR3，280-306位碱基（94-102位）编碱基码CDR3；307-336位碱基（103-112位）编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为345个碱基，序列如SEQ ID NO:4所示，多肽序列115个氨基酸，序列如SEQ ID NO:3所示。其中1-75位（1-25位）碱基编码FR1，76-99位碱基（26-33位）编码CDR1；100-150位碱基（34-50位）编码FR2，151-174位碱基（51-58位）编码CDR2；175-288位碱基（59-96位）编码FR3，289-312位碱基（97-104）编码CDR3；313-345位碱基（105-115）编码FR4。

鼠源单抗TY5轻链可变区核苷酸编码序列全长为336个碱基，序列如SEQ ID NO:6所示，多肽序列112个氨基酸序列，如SEQ ID NO:5所示。可变区包括4个框架区(Fragmentregion，FR)和3个CDR(Complementary determinant region, CDR )，其中1-78位（1-26位）碱基编码FR1，79-111位碱基（27-37位）编码CDR1；112-162位碱基（38-54位）编码FR2，163-171位碱基（55-57位）编码CDR2；172-279位碱基（58-93位）编码FR3，280-306位碱基（94-102位）编码CDR3；307-336位碱基（103-112位）编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为345个碱基，序列如SEQ ID NO:8所示，多肽序列115个氨基酸，序列如SEQ ID NO:7所示。其中1-75位（1-25位）碱基编码FR1，76-99位碱基（26-33位）编码CDR1；100-150位碱基（34-50位）编码FR2，151-174位碱基（51-58位）编码CDR2；175-288位碱基（59-96位）编码FR3，289-312位碱基（97-104位）编码CDR3；313-345位碱基（105-115位）编码FR4。

鼠源单抗TY8轻链可变区核苷酸编码序列全长为336个碱基，序列如SEQ ID NO:10所示，多肽序列112个氨基酸，序列如SEQ ID NO:9所示。可变区包括4个框架区(Fragmentregion，FR)和3个CDR(Complementary determinant region, CDR )，其中1-78位（1-26位）碱基编码FR1，79-111位碱基（27-37位）编码CDR1；112-162位碱基（38-54位）编码FR2，163-171位碱基（55-57位）编码CDR2；172-279位碱基（58-93位）编码FR3，280-306位碱基（94-102位）编码CDR3；307-336位碱基（103-112位）编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为357个碱基，序列如SEQ ID NO:12所示，多肽序列119个氨基酸，序列如SEQ ID NO:11所示。其中1-75位（1-25位）碱基编码FR1，76-99位碱基（26-33位）编码CDR1；100-150位碱基（34-50位）编码FR2，151-174位碱基（51-58位）编码CDR2；175-288位碱基（59-96位）编码FR3，289-324位碱基（97-108位）编码CDR3；325-357位碱基（109-119位）编码FR4。

鼠源单抗TY11轻链可变区核苷酸编码序列全长为321个碱基，序列如SEQ ID NO:14所示，多肽序列107个氨基酸，序列如SEQ ID NO:13所示。可变区包括4个框架区(Fragment region，FR)和3个CDR(Complementary determinant region, CDR )，其中1-78位（1-26位）碱基编码FR1，79-96位碱基（27-32位）编码CDR1；97-147位碱基（33-49位）编码FR2，148-156位碱基（50-52位）编码CDR2；157-264位碱基（53-88位）编码FR3，265-291位碱基（89-97位）编码CDR3；292-321位碱基（98-107位）编码FR4。重链可变区核苷酸编码序列全长为354个碱基，序列如SEQ ID NO:16所示，多肽序列118个氨基酸，序列如SEQ ID NO:15所示。其中1-75位（1-25位）碱基编码FR1，76-112位碱基（26-34位）编码CDR1；113-153位碱基（35-51位）编码FR2，154-174位碱基（52-58位）编码CDR2；175-288位碱基（59-96位）编码FR3，289-321位碱基（97-107位）编码CDR3；322-354位碱基（108-118位）编码FR4。

2. 嵌合抗体基因的克隆

鼠源抗体相对于人体，属于异源蛋白应用于人体具有明显的抗宿主抗体反应，因此常采用人源化改造的策略降低免疫原性，简单方便的方法是进行恒定区的人源化，用人的恒定区替换鼠的恒定区，即构建嵌合抗体。

2.1 人恒定区密码子优化及全序列合成

采用优化的密码子可以提高蛋白的表达，首先采用软件对人IgG1重链恒定区（GenBank登录号:Z17370）和人Kappa轻链恒定区基因（GenBank登录号: GI341915149）按照鼠密码子偏好进行优化，优化后的两条基因序列（基因序列分别为SEQ ID NO:17（轻链恒定区）和SEQ ID NO:19（重链恒定区）所示，委托博迈德进行全基因合成，并克隆到T载体上（分别命名为T-OPTI-hu-IgG1-CH 和T-OPTI-hu-CKAPPA）进行序列测定。

2.2 嵌合抗体全分子的克隆

以TY1嵌合抗体分子克隆方法为例：

轻链全长基因的克隆：根据扩增获得基因序列和密码子优化后恒定区基因序列，设计引物：

VL1-up：5‘-GAATTCCACCATGAGTCCTGCCCAGTTCCT-3’

VL1-lower: 5’-GATGGTGCAGCCACCGTCCTTTTGATTTCCAGCTTGGTGC-3’

Op-kappa-up:5-‘ACCGTGGCCGCCCCCAGCGTGTTCATC-3’

0p-kappa-down:5-‘GCGGCCGCTTAGCACTCGCCCCTGTTGAAGCTCTTG-3’

其中，VL1-up和VL1-lower用于扩增轻链可变区，Op-kappa-up 和Op-kappa-down用于扩增人Kappa亚型轻链恒定区。VL1-up和Op-kappa-down用于扩增轻链全长。

重链全长基因的克隆：根据扩增获得基因序列和密码子优化后恒定区基因序列，设计引物：

VH1-up: 5’-GAATTCCACCATGGGATGGACCTGGATCTT-3’

VH1-lower: 5’-TGGGCCCTTGGTGGAGGCAGCAGAGACAGTGACCAGAGTC-3’

Op-IgG1-up: 5-′AGCCTGGCCGCCAGCACCAA-3′

Op-IgG1-down: 5- ′GCGGCC GCTTACTTGCCGGGGCTCAGGCTCAG-3′

其中，VH1-up和VH1-lower用于扩增可变区，Op-IgG1-up 和Op-IgG1-down用于扩增人IgG1重链恒定区。VH1-up和Op-IgG1-down用于扩增嵌合抗体全长重链。GAATTC为EcoRI的酶切位点，GCGGCCGC为Not I的酶切位点。

PCR反应体系：50 μl反应体系中含有：10×buffer 5 μl；dNTP(0.2mM) 4 μl；Pyrobest Taq酶0.25 μl；上下游引物各0.5 μl；轻重链可变区基因的扩增使用模板为pMD-mouse-VL 和pMD-mouse -VH，恒定区的扩增使用模板为T-OPTI-hu-IgG1-CH 和T-OPTI-hu-CKappa，各取0.1μl 质粒作为模板；用纯水补足到50 μl。PCR反应参数：预变性94 ℃ 5min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 20 s；25循环。最后72 ℃ 5 min。

PCR产物回收纯化：PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶并用BBI公司的回收试剂盒回收。

嵌合抗体L、H链基因的扩增：将TY1 VL和人KAPPA型基因的PCR扩增产物50 μl进行纯化，回收后备用进行嵌合抗体L链基因的扩增；将TY1VH和人IgGl亚类CH基因的PCR扩增产物50 μl进行纯化，回收后备用。取纯化后产物各l μl为模板，以扩增嵌合抗体重链基因。PCR反应参数：94℃预变性3 min，接着扩增25个循环，每个循环包括94℃变性25 s，50℃复性25 s，72℃延伸60 s，最后72℃延伸5 min。

嵌合抗体L、H链基因PCR产物连接到T载体上进行DNA序列测定：将回收后的PCR产物连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体lμl，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3μl，去离子水lμl，连接缓冲液5μ1，混匀后16℃过夜，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。获得的质粒命名为pMD-chimeric-TY1H 和pMD-chimeric-TY1L。

TY5、TY8和TY11嵌合抗体轻重链可变区基因的克隆方法同TY1，所需特异性引物如下：

用于扩增TY5轻链可变区引物为：

VL5-up: 5’-GAATTCCACCATGAGTCCTGCCCAGTTCCT-3’

VL5-lower: 5’-GATGGTGCAGCCACCGTCCTTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCC-3

用于扩增TY5重链可变区引物为：

VH5-up: 5’-GAATTCCACCATGGGATGGACCTGGATCTTTA-3’

VH5-lower: 5’-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC-3’

用于扩增TY8轻链可变区引物为：

VL8-up:5’-GAATTCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTT-3’

VL8-lower：5’-GATGGTGCAGCCACCGTCCTTATCAGCTCCAGCTTGGTCC-3’

用于扩增TY8重链可变区引物为：

VH8-up：5’-GAATTCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCTT-3’

VH8-lower：5’-TGGGCCCTTGGTGGAGGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTC-3’

用于扩增TY11轻链可变区引物为：

VL11-up：5’-GAATTCCACCATGAAGTTTCCTTCTCAACTTC-3’

VL11-lower：

5’-‘GACAGATGGTGCAGCCACCGTCCTTTTTATTTCCAACTCTGTCCCCGA-3‘

用于扩增TY11重链可变区引物为：

VH11-up：5’-GAATTCCACCATGAGAGTGCTGATTCTTTTG-3’

VH11-lower: 5’-CCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGTG-3’

3. 人鼠嵌合抗体表达载体的构建

构建策略: 不管是轻链还是重链，在5′端设计引物时引入EcoR I的酶切位点，在3′端引入Not I酶切位点，克隆到pMD18-T 载体上，经过DNA序列测定正确后，用EcoR I/NotI酶切pMD-Chimeric-H得到约1.4 kb的片段，亚克隆到pMH3S的相应位点，得到嵌合抗体的重链表达质粒pMH3S-Chimeric-H；同样的方法，用Eco RI/Not I酶切pMD-Chimeric-L得到约0.7片段,亚克隆到pMH3S的相应位点，得到嵌合抗体轻链的表达质粒pMH3S-Chimeric-L。pMH3S载体为分泌型真核表达载体，其具体构建过程见发明专利CN102936286B，该专利的说明书内容也通过引用被并入到本申请的说明书内容之中。

3.1 轻链表达载体的构建

用EcoRI和Not I（NEB公司）酶切pMD-chimereic-L，用胶回收试剂盒（中国，BBI公司）回收L片段（长度约0.7 kb）连接到用EcoR I和Not I双酶切的pMH3S上，转化大肠杆菌DH5α感受态，在100 μg/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进行PCR检测（PCR条件同实施例2中的嵌合抗体L、H链基因的扩增），PCR产物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试剂盒（中国，OMEGA公司）提取质粒，对提取的质粒进行双酶切（EcoRI/Not I）鉴定，鉴定结果见图1。图1中，M泳道为分子量标记，2-5泳道为EcoR I/Not I双酶切后的结果。构建好的质粒命名为pMH3S-chimereic-L。

3.2 重链表达载体的构建

用EcoR I和Not I（NEB公司）双酶切pMD-chimereic-H，用胶回收试剂盒（中国，BBI公司）回收H片段（长度约1.4 kb）连接到用EcoRI和Not I双酶切的pMH3S上，转化大肠杆菌DH5α感受态，在100 μg/ml的氨苄青霉素LB平板上培养，挑选抗性克隆进行PCR检测（PCR条件同实施例2中PCR条件同实施例2中的嵌合抗体L、H链基因的扩增），PCR产物电泳检测阳性后，随机挑选阳性克隆接种到LB培养基中培养过夜，次日用质粒提取试剂盒（中国，OMEGA公司）提取质粒，对提取的质粒进行双酶切（Eco RI/Not I）鉴定，鉴定结果见图2。图2中，M泳道为分子量标记，2-5泳道为EcoR I/Not I双酶切后的结果。构建好的质粒命名为pMH3S-chimereic-H。

4. 单克隆抗体在真核细胞中的表达

从液氮中取CHO-S细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为DMEM/F12 +10% FBS，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱（Forma）中培养，长满后传入T75方瓶中。在T75方瓶中长满后，加入3 ml胰酶消化30s，吸弃胰酶，用PBS洗细胞两次离心后，取1.5×10⁷细胞用0.5 ml PBS（pH7.2）重悬，取10 µl鲑精，线性化的表达质粒10 µɡ(轻链质粒pMH3S-chimereic-L 3.3µɡ和的重链质粒pMH3S-chimereic-H 6.7µɡ二者比例为1:2)，加入到准备好的细胞当中，混匀后加入到预冷的2 mm电转杯中冰浴，用电转仪160 V电击。

电转后的细胞分成两份置于直径10 cm的塑料培养皿中，分别加入10 ml的含有10% FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。置于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。次日换新鲜的10ml的含有10% FBS、无双抗的DMEM/F12培养基。待细胞长至50～60%满时，加入1.8 mg/ml的G418，隔天换液，洗掉死细胞，G418浓度始终维持在1.8 mg/ml，直至细胞不再死亡，克隆形成。将形成的克隆转移至96孔板中，用含有10% FBS、无双抗的DMEM/F12培养基，G418浓度为0.6 mg/ml，置于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养。检测表达量，筛选高表达的细胞克隆，分别命名为cTY1、cTY5、cTY8、cTY11。

5. 单克隆抗体的发酵和纯化

从液氮中取出cTY1（或cTY5、cTY8、cTY11）工程细胞复苏，在T25方瓶中培养，培养基为DMEM/F12+10%FBS，长满后传入T75方瓶中，置于5% CO₂细胞培养箱（Forma）中悬浮培养。

在T75方瓶中长满后，用胰酶消化，换自制悬浮培养基重悬，开始悬浮培养，每天监测细胞密度及状态，根据细胞密度及状态补加培养基，不断增加培养体积。当培养体积达到30 ml时，将其转入150 ml摇瓶中，摇瓶置于37 ℃的培养箱内，转动速度为100 rpm。继续增加培养体积，使细胞密度维持在2-3×10⁶/ml。当培养体积达到150 ml时，将其转入3 L摇瓶中，摇瓶置于37 ℃的培养箱内，转动速度为100 rpm。继续增加培养体积，使细胞密度维持在2-4×10⁶/ml。

当培养体积达到4 L，将其转入10 L的Wave反应器中。温度控制在36.5 ℃，10 L的Wave反应器的摇速为10转/分。当Wave反应器中的培养体积达到7 L，不再补加细胞基础培养液，根据葡萄糖消耗情况，细胞采用流加（Fed-batch）方式培养，每日添加浓缩培养基，根据pH值情况随时补充Na₂CO₃，使pH值维持在7.2左右，并将温度降低至34℃，使细胞能够持续高密度生长。发酵完毕，使用Mab select sure介质进行纯化，装填的层析柱体积为40 ml，结合容量为30～50 mg/ml。平衡缓冲液20 mmPBS，pH7.2；洗脱缓冲液0.1 M柠檬酸缓冲液pH3.0。纯化后的四株单抗SDS-PAGE还原电泳结果如图3所示，均可见分子量约为25KD的轻链和约50KD的重链。

实施例2：ELISA法检测单抗与TeNT-Hc、TT蛋白的结合活性

重组TeNT-Hc蛋白或破伤风类毒素TT稀释成2 μg/ml，100ul/孔包被酶联板，4℃过夜，次日用封闭液（20 mM PB，0.15M NaCl，5%的奶粉）37℃封闭1 h后洗板，加入样品后37℃孵育1 h洗板，加入1:1 000稀释的HRP标记的羊抗人Fc（Sigma，A0170），37℃孵育1 h后洗板，TMB显色，酶标仪测OD₄₅₀。实验结果显示四株单抗均具有良好的特异性，能够特异地与TeNT-Hc和TT蛋白结合，而与其他蛋白无结合活性，见图4。

实施例3：单抗在小鼠体内的保护活性

采用BALB/c小鼠，雌性，18-20g/只，10只/组，将不同浓度的TY1、TY5、TY8和TY11单克隆抗体及混合物，与2倍致死剂量的破伤风毒素混合，37℃孵育1 h后注射到小鼠腹腔，连续10天观察小鼠的发病及存活情况。从图5的实验结果可以看出，单株抗体能够明显延长小鼠死亡时间，具有部分保护活性，TY1、TY5、TY8、TY11单株抗体对小鼠两倍致死剂量的毒素保护率分别为50%、30%、40%和40%。从图6的实验结果可以看出，四株抗体各50μg以上剂量联合使用时即可完全保护小鼠低于两倍致死剂量毒素的攻击。四株抗体联合使用所显示出的高保护率的协同效应，究其原因，可能是由于破伤风毒素与神经细胞结合的受体并不唯一，除神经节苷酯外，还存在多个尚未明确的受体，因此单一抗体并不能完全阻止其与受体细胞的结合，需要多株针对不同抗原表位的抗体联合使用才能发挥更好的中和活性。而本发明筛选出的这四株抗体联合使用则充分发挥了互补和协同作用，使抗体的保护率达到最大化。

Claims

1.一种抗破伤风毒素重链C片段的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区，以及重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列选自下述序列组合：

（1）SEQ ID NO：1第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：3第26-33、51-58、97-104位氨基酸序列；

（2）SEQ ID NO：5第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：7第26-33、51-58、97-104位氨基酸序列；

（3）SEQ ID NO：9第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：11第26-33、51-58、97-108位氨基酸序列；或者

（4）SEQ ID NO：13第27-32、50-52、89-97位氨基酸序列，以及SEQ ID NO：15第26-34、52-58、97-107位氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区，以及重链可变区的氨基酸序列选自下述序列组合：

（1）SEQ ID NO：1，以及SEQ ID NO：3；

（2）SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7；

（3）SEQ ID NO：9，以及SEQ ID NO：11；或者

（4）SEQ ID NO：13，以及SEQ ID NO：15。

3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链恒定区，以及重链恒定区的氨基酸序列均为下述序列组合：SEQ ID NO：17，以及SEQ ID NO：19。

4.一种编码权利要求2所述单克隆抗体的核苷酸序列，其特征在于，编码所述抗体轻链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID NO：18所示，编码所述抗体重链恒定区的核苷酸序列由SEQID NO：20所示，编码所述抗体轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列选自下述序列：

（1）SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4；

（2）SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8；

（3）SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12；或者

（4）SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16。

5.一种含有权利要求4所述编码单克隆抗体的核苷酸序列的表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pMH3S分泌型真核表达载体。

7.一种含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述细胞为CHO细胞。

8.权利要求1-3中任一所述的单克隆抗体在制备破伤风治疗药物中的应用。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物含有至少一种权利要求1-3任一所述的单克隆抗体。

10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物含有四种单克隆抗体，所述四种单克隆抗体的轻链可变区，以及重链可变区的氨基酸序列为下述序列组合：

（1）SEQ ID NO：1，以及SEQ ID NO：3；

（2）SEQ ID NO：5，以及SEQ ID NO：7；

（3）SEQ ID NO：9，以及SEQ ID NO：11；和

（4）SEQ ID NO：13，以及SEQ ID NO：15；

所述四种抗体的轻链恒定区，以及重链恒定区的氨基酸序列均为下述序列组合：SEQID NO：17，以及SEQ ID NO：19。