CN107417788A - 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体 - Google Patents

抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN107417788A
CN107417788A CN201610345756.9A CN201610345756A CN107417788A CN 107417788 A CN107417788 A CN 107417788A CN 201610345756 A CN201610345756 A CN 201610345756A CN 107417788 A CN107417788 A CN 107417788A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
light chain
chain variable
variable district
zaire
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610345756.9A
Other languages
English (en)
Inventor
孙兵
赵磊
凌志洋
伊春艳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Original Assignee
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur of Shanghai of CAS filed Critical Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority to CN201610345756.9A priority Critical patent/CN107417788A/zh
Publication of CN107417788A publication Critical patent/CN107417788A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体,具体地本发明公开了一株针对埃博拉病毒的单克隆抗体，该抗体对埃博拉病毒抗原具有显著的结合活性，而且对Zaire亚型和Sudan亚型具有交叉中和活性。

Description

抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体。
背景技术
2014年3月23日，世界卫生组织(WHO)报告了埃博拉病毒(EBOV)新的爆发疫情。本次埃博拉疫情最早开始于2013年12月的几内亚，此后不久蔓延到其他西非国家，包括尼日利亚、塞拉利昂、利比里亚和塞内加尔等国家。此后，随着人员流动，疫情又被带入美国、西班牙、马里等国家。2014年2月埃博拉病毒感染开始在几内亚有小规模的爆发，4月开始利比里亚有疫情被报道，之后蔓延至塞拉利昂。不久，2014年7月尼日利亚首次报道埃博拉感染死亡病例，2014年8月传入塞内加尔，2014年9月和10月分别在美国和西班牙发现感染埃博拉病毒的患者。截止到2014年12月，埃博拉感染已经达到1,9031人，其中死亡人数达到7,373人。2016年1月，WHO宣布埃博拉疫情在宣告结束。但是，2016年1月又有小规模的疫情在塞拉利昂死灰复燃，不过在2016年3月宣布疫情得到遏制，已经结束。截止2016年3月13日，埃博拉疫情已经造成了28,639人感染，其中11,316人已经死亡，死亡率高达39.5％。
埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)最早于1976年在苏丹南部和刚果(金)(旧称扎伊尔)的埃博拉河地区发现，因此被命名为埃博拉病毒。埃博拉病毒和马尔堡病毒(MARV)同属于丝状病毒科，分为五个亚型：扎伊尔亚型(Zaire,EBOV-Z)，苏丹亚型(Sudan,EBOV-S)，雷斯顿亚型(Reston,EBOV-R)，科特迪瓦亚型(d’Ivoire,EBOV-CI)以及2010年才发现的本迪布焦亚型(Bundibugyo,EBOV-B)[4]。2014年西非爆发的为EBOV-Z和EBOV-S两个亚型，主要是EBOV-Z。EBOV-R只会对非人类灵长类动物造成致命的感染，而EBOV-TF仅仅对人类造成一种非致死性的感染。而EBOV-Z、EBOV-S和EBOV-B三种亚型，常常引起严重的埃博拉出血热，最后导致中风、心肌梗塞、失血休克或多器官衰竭，致死率高达40-90％。埃博拉出血热的早期病征与普通感冒相似，包括肌肉酸痛、腹部及关节疼痛、发烧和头痛、腹泻、呕吐及食欲不振等，病人多在受感染后的8-10天内发病，约五成患者在病发时会出现斑丘疹等皮肤表征。此阶段的埃博拉病征与疟疾、登革热及其他一些热带疾病症状类似。直到症状发展到出血阶段，病人会出现大规模体内外出血的症状，并可能在第6-16天内因失血或多器官衰竭而死亡。由于埃博拉病毒的高危险性和强致死性，被列为生物安全等级4级(BSL-4)病原体。
感染埃博拉病毒的患者一般由于两方面的原因导致最后的死亡：(1)典型出血热症状，包括皮肤、血管以及肝、脾、肾等内脏器官的严重损伤进而引起弥散性血管内凝血(Disseminated or diffuse intravascular coagulation，DIC)，最终导致死亡。病毒进入机体后，首先感染单核细胞使得其被激活，细胞因子和趋化因子被大量释放，血管内皮细胞的通透性增强，介导产生表面黏附因子；当细胞坏死将病毒释放到淋巴或血液中时，最终导致弥散性血管内凝血，使患者迅速死亡。(2)埃博拉病毒感染单核细胞后释放出的过量的细胞因子和趋化因子，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)等等，引起包括B细胞、T细胞、DC细胞和巨噬细胞等在内的免疫细胞的过激反应，导致全身系统的免疫炎症反应，最终导致死亡。
针对这样一种具有极高的传染性和致病性的烈性病毒，目前仍没有批准上市的疫苗和药物，WHO允许部分药物和疫苗在紧急情况下使用。目前在研的治疗手段主要包括以下几个部分：1、疫苗；2、RNA抑制剂等小分子药物；3、治疗性抗体药物等。因此，领域迫切需要开发能够有效应对埃博拉病毒的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的CDR1，
SEQ ID NO.6所示的CDR2，和
SEQ ID NO.8所示的CDR3。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.14所示的CDR1’，
SEQ ID NO.16所示的CDR2’，和
SEQ ID NO.18所示的CDR3’。
在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。
本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗埃博拉病毒GP蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。
本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合埃博拉病毒GP蛋白。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
(1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.3、5、7、9、13、15、17、或11所示的序列。
本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗埃博拉病毒感染的药物。
本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；
所述药剂用于治疗或预防表达埃博拉病毒感染。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中埃博拉病毒GP蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在埃博拉病毒GP蛋白。
本发明的第十四方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1 GP基因的获得；M：Marker IV；1-4：Zaire GP；5：Zaire阴性(Zaire引物，模板H2O)；6-9：Sudan GP；10：Sudan阴性(Sudan引物，模板H2O)。
图2 Western blot检测埃博拉DNA疫苗GP蛋白表达情况(HA)；1：HcoV-OC43N蛋白(HA-Tag蛋白)；2：空白上清；3：pCAGGS-3’HA转染；4：pCAGGS-NS5a(阳性对照)；5：pCAGGS:Sudan GP-5’3’HA；6-7：pCAGGS-Sudan GP-5’HA；8：pCAGGS-Sudan GP-3’HA；9-10：pCAGGS-Zaire GP-5’3’HA；11：pCAGGS-Zaire GP-5’HA；12：pCAGGS-Zaire GP-3’HA。
图3生物素化酶切位点的GP基因的获得；M：Marker；1：Zaire GP(NheI/XbaI)；2：Zaire GP(去除SP，EcorI/XbaI)；3：Zaire GP(EcorI/XbaI)；4：Sudan GP(NheI/XbaI)；5：Sudan GP(去除SP，EcorI/XbaI)；6：Sudan GP(EcorI/XbaI)；7：阴性对照。
图4 Western blot检测细胞裂解液中GP蛋白表达情况(FLAG)。1：pIRES-ZaireGP-BirA-FLAG SP-；2-4：pIRES-Zaire GP-BirA-FLAG；5-6：pIRES-Sudan GP-BirA-FLAGSP-；7：pIRES-Sudan GP-BirA-FLAG；8：pIRES-BirA-NGAL(阳性对照)；9：pIRES-BirA-Hantaan(阳性对照)；10：HCV-E2-Biotin(Biotin蛋白)；11：空白对照。
图5 Western blot检测GP蛋白表达情况(FLAG)。1-2：pIRES-BirA-Zaire GP SP-；3-4：pIRES-BirA-Zaire GP SP-和pIRES-BirA共转染；5-6：pIRES-BirA-Sudan GP SP-；7-8：pIRES-BirA-Sudan GP SP-和pIRES-BirA共转染；9：pIRES-BirA-NGAL(阳性对照)；10：pIRES-BirA-NGAL和pIRES-BirA共转染(阳性对照，共转染)；11：NGAL-Biotin蛋白(Biotin蛋白)；12：阴性对照。
图6 Western blot检测GP蛋白生物素化效果(Biotin)。1：阴性对照；2：NGAL-Biotin蛋白(Biotin蛋白)；3：pIRES-BirA-NGAL和pIRES-BirA共转染(阳性对照，共转染)；4：pIRES-BirA-NGAL(阳性对照)；5-6：pIRES-BirA-Sudan GP SP-和pIRES-BirA共转染；7-8：pIRES-BirA-Sudan GP SP-；9-10：pIRES-BirA-Zaire GP SP-和pIRES-BirA共转染；11-12：pIRES-BirA-Zaire GP SP-。
图7生物素化GP蛋白细胞裂解液的最佳稀释度摸索。Zaire-GP-Biotin稀释101、101.5、102、102.5、103、103.5、104、104.5倍共8个梯度，并与Zaire GP DNA疫苗免疫后血清反应；Sudan-GP-Biotin稀释101、101.5、102、102.5、103、103.5、104、104.5倍共8个梯度，与Sudan GP DNA疫苗免疫后血清反应。
图8利用纯化后的GP蛋白检测小鼠血清中抗体滴度。左侧为包被Zaire，检测Zaire和Sudan免疫的小鼠血清；右侧为包被Sudan蛋白，同样检测Zaire和Sudan免疫的小鼠血清。
图9 Zaire组小鼠血清中抗体滴度检测。Zaire组5只小鼠分别编号为Zaire 1-5，稀释500、2,000、8,000、32,000、128,000、512,000、2,048,000、8,192,000共8个梯度进行血清中抗体滴度检测。
图10 Sudan组小鼠血清中抗体滴度检测。Sudan组5只小鼠分别编号为Sudan 1-5，稀释500、2,000、8,000、32,000、128,000、512,000、2,048,000、8,192,000共8个梯度进行血清中抗体滴度检测。
图11 Zaire 3小鼠回忆刺激后血清中抗体滴度检测。红色表示包被Zaire亚型生物素化蛋白，绿色表示包被Sudan亚型生物素化蛋白。
图12以293T为靶细胞检测假病毒包装效果。分别包装Zaire亚型、Sudan亚型假病毒，并以VSVG作为阳性对照，只转染骨架质粒pNL4-3-Luc+enp-vrp-作为阴性对照(Mock)。
图13以293T为靶细胞检测Zaire 3小鼠回忆刺激后血清中和效果。分别将Zaire 3小鼠回忆刺激后血清与Zaire亚型和Sudan亚型的假病毒孵育后感染293T靶细胞。
图14以HUVEC为靶细胞检测Zaire 3小鼠回忆刺激后血清中和效果。分别将Zaire3小鼠回忆刺激后血清与Zaire亚型和Sudan亚型的假病毒孵育后感染HUVEC靶细胞。
图15杂交瘤上清抗体效价检测。6株单克隆抗体上清OD450值显著高于阴性对照，为阳性埃博拉单克隆抗体。
图16以293T为靶细胞检测杂交瘤单克隆上清中和效果。分别将6株单克隆抗体上清与Zaire亚型和Sudan亚型的假病毒孵育后感染293T细胞。
图17以293A为靶细胞检测杂交瘤单克隆上清中和效果。分别将6株单克隆抗体上清与Zaire亚型和Sudan亚型的假病毒孵育后感染293A细胞。
图18以HUVEC为靶细胞检测杂交瘤单克隆上清中和效果。分别将6株单克隆抗体上清与Zaire亚型和Sudan亚型的假病毒孵育后感染HUVEC细胞。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地的获得一株针对埃博拉病毒的单克隆抗体，该抗体对埃博拉病毒抗原具有显著的结合活性，而且对Zaire亚型和Sudan亚型具有交叉中和活性。在此基础上，完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
本发明中，为了高效、快速和安全地制备抗Ebola病毒中和抗体，采用DNA疫苗免疫的策略，免疫Balb/c小鼠，并利用实验室建立的生物素化GP蛋白系统进行单克隆抗体细胞株的筛选，获得了6株有中和活性的IgM亚型鼠源抗体，分别为S37-3、S128-3、S372-5、S526-8、S526-11和S529-11，其中S37-3、S128-3和S529-11在两个细胞系上都表现出对Zaire和Sudan亚型的交叉中和活性，而且S37-3抗体的中和活性显著优于其它株抗体。
埃博拉病毒
埃博拉病毒颗粒为长丝状，呈“6”或“U”字状，有时亦会卷曲成环状，并带分支。这类病毒的平均宽度为80纳米，长度参差甚大——从974到14,000纳米均有记录。埃博拉病毒粒子由包膜、基质和核衣壳组成，脂质双层结构的病毒包膜表面有许多由GP糖蛋白形成的7-10纳米长的三聚体刺突。
埃博拉的单股负链RNA基因组约有18,959-18,961个核苷酸，具有线性、非结段性、非散播性的特点。其5'端不含帽子结构，3'端不具PolyA尾结构，不会以共价键与蛋白质结合。基因组内7个蛋白基因以“3'-UTR-核蛋白(NP)-病毒蛋白35(VP35)-病毒蛋白40(VP40)-糖蛋白GP-病毒蛋白30(VP30)-病毒蛋白24(VP24)-RNA聚合酶蛋白(L)-5'-UTR”次序进行排列，这一点是所有丝状病毒的共性。
丝状病毒在进入宿主细胞的细胞质后，其基因组会转录翻译成对应的蛋白。其中，NP、VP30、VP35和L蛋白与病毒基因组相关联形成核糖核蛋白复合体，其中VP35主要起聚合酶辅助因子的作用，而VP30是转录激活剂。此外，马尔堡病毒的NP、VP35和L对病毒复制和转录而言是必不可少的，而EBOV的转录也取决于VP30的存在。其余三个结构蛋白为膜蛋白，其中VP24和VP40是非糖基化蛋白，在病毒出胞的时候非常重要，负责把RNP包裹起来成为完整的子代病毒。
第三个膜蛋白GP是一种I型跨膜蛋白，全长676个氨基酸(amino acid,aa)，形成了病毒颗粒表面的刺突结构。在翻译过程中，它首先形成一个前体GP蛋白(preGP)，之后在第501aa位点被弗林蛋白酶或类弗林内切蛋白酶切割成一个由二硫键连接的GP1-GP2片段。三个GP1-GP2片段聚集形成的三聚体复合物是埃博拉病毒与宿主细胞受体结合与融合的位点，也是中和性抗体研究的主要靶点。GP蛋白的粘蛋白类似区(Mucin-like domain)处于GP1外侧，结构类似一个帽子。此外，埃博拉病毒的GP基因(未编辑的mRNA)会翻译形成一类非结构的分泌型糖蛋白，称为分泌型GP蛋白(secretory GP，sGP)。sGP是GP基因通过转录编辑的形式翻译得到的蛋白形式，大小为364个氨基酸，包含和GP蛋白共有的N端295个氨基酸以及C端额外的69个氨基酸，最终由二硫键连接成反向平行的二聚体。据文献报告，在细胞中检测到的sGP和GP蛋白的表达比例为71：24，约80％的GP基因产物都是sGP。此外，仍有5％的小型分泌型GP蛋白(ssGP)形式，本文不赘述。sGP在埃博拉病毒感染宿主细胞中主要发挥以下几点作用：(1)作为诱饵抗原，清除机体产生的保护性抗体；(2)参与抗原反转(Antigenic Subversion)，使得B细胞表达针对其他靶点的抗体；(3)恢复内皮细胞的屏障功能；(4)其他：如诱导中性粒细胞失活、细胞凋亡、直接参与感染细胞等。
抗体
抗体(Antibody，Ab)是B细胞在细菌、病毒等外来物质(一般称之为抗原)刺激后分化为浆细胞后所产生的糖蛋白，主要存在于血清等细胞外液中，通过与抗原-抗体的特异性结合发挥体液免疫作用。19世纪后期von Behring等人就已经发现了抗体的存在，当时被命名为抗毒素；1968年WHO将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。
抗体单体形式一般呈现“Y”字型，由两条相同的重链和两条相同的轻链借助二硫键连接而成。重链大小为50-75kDa左右，由450-550个氨基酸组成。根据抗体重链恒定区的氨基酸组成和排列结构的不同，可以将抗体分成5类，分别为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。轻链的分子量约为25kDa，由214个氨基酸组成，轻链也可以分为κ链和λ链两种，正常人中κ链:λ链约为2:1，而小鼠中则为20:1。重链近氨基端的1/4和轻链近氨基端的1/2在不同抗体中差异很大，为可变区(VH和VL)；其他部分氨基酸序列则相对恒定，为恒定区(CH和CL)。在恒定区的CH1-CH2之间的富含脯氨酸的区域为铰链区。可变区中，又分为高度可变的高可变区(HVR)/互补决定区(CDR)，其余为骨架区FR1-FR4。抗体经过木瓜水解酶水解后，可以分为两个片段，一个为结合抗原的Fab段，相当于轻链、VH和CH1区域；一个为可结晶的Fc段，相当于CH2-CH3片段，是Ig与效应分子或者细胞相互作用的部位。
IgG是血清中含量最高的Ig，约占到75％-80％。它是产生再次免疫应答的主要抗体，其亲和力高，在体内的分布广泛，是机构抗感染发挥作用的主要成分。IgM占血清比例的5％-10％，呈现五聚体的分泌形式，是分子量最大的Ig，具备很强的抗原结合能力，也更易激活补体，是初次体液应答免疫反应中最早出现的抗体。而IgA可以由母亲经过初乳传给婴儿，是自然被动免疫的重要成分。IgD在正常人中很少，在个体发育的各个阶段都会产生。IgE是血清中含量最少的抗体，一般介导Ⅰ型过敏反应(图9)。
抗体在疾病治疗和诊断中发挥着重要作用，因此人们开始人工制备抗体。从最开始的以特异性抗原免疫动物制备抗血清到现在通过抗体工程技术制备单克隆抗体，目前抗体制备已经可以达到高度特异性、均一性。基因工程抗体包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、小分子抗体及全人抗体等多种类型。其基本思路是将部分或者全部人源抗体的编码基因，克隆到真核或原核表达系统中，体外表达抗体；或者敲除小鼠体内的自身抗体编码基因，导入人Ig基因，通过抗原免疫使得小鼠直接表达人源抗体。其中，抗原免疫的方式包括构建DNA免疫、蛋白免疫和病毒免疫等。从鼠源抗体-嵌合抗体-人源化抗体-全人抗体，抗体的鼠源序列越来越少，产生的人抗鼠反应(HAMA)越低，但是同时也会造成抗体亲和力的下降。其中，嵌合抗体及人源化抗体是目前制备工艺最为成熟的抗体类别，制备效率较高，也较大程度保留了抗原的亲和力，近20年来上市的大部分抗体均为嵌合抗体或人源抗体。
免疫方法的好坏决定了是否能够成功获得高亲和力的具备中和活性的单克隆抗体。本发明采用了DNA疫苗的方法，通过克隆所需的抗原基因到质粒中，在真核细胞中表达抗原蛋白，进而刺激机体产生特异性免疫反应。与其他免疫方法相比，DNA疫苗无需进行蛋白纯化、不存在感染风险、稳定性高，可以进行简单快速的制备，在科学研究中使用十分广泛。DNA疫苗使用中的一个关键问题是确保DNA疫苗的免疫原性以及增强体液免疫反应强度，方法包括使用佐剂、具备强免疫性的载体、采用不同的免疫途径等。
此外，在对DNA疫苗制备后的杂交瘤进行筛选和评估时必须使用对应于DNA疫苗免疫原的抗原蛋白。而采用原核系统或哺乳动物细胞系统表达抗原均存在不足，前者表达的抗原不能被正确修饰和折叠，往往不存在糖基化修饰等天然结构；而后者表达周期长，产量低，存在较大的表达难度。2010年R.Kimura等人建立起基于生物素化蛋白的酶联免疫法筛选系统，将一段17个氨基酸残基的AVI短肽标签以及BirA酶与抗原连接表达，这样生物素连接酶BirA可以将抗原进行生物素化。细胞裂解后生物素化的蛋白可直接被预包被的链霉亲和素(SA)捕捉到96孔微孔板上，大大简化筛选流程。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
CDR1，其氨基酸序列为GYSFTGYF(SEQ ID NO.4)，其编码核苷酸序列为，Ggttactcatttactggctacttt(SEQ ID NO.3)；
CDR2，其氨基酸序列为INPYNGDT(SEQ ID NO.6)，其编码核苷酸序列为，attaatccttacaatggtgatact(SEQ ID NO.5)；
CDR3，其氨基酸序列为GRGLRAFLDY(SEQ ID NO.8)，其编码核苷酸序列为，ggaagaggactaagggccttccttgactac(SEQ ID NO.7)。
在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：
MEWSWVILFLLSVTVGVFSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYFMNWVKQSHGKSLEWIGRINPYNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSSTAHMELLSLTSEDSAVYYCGRGLRAFLDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO.10)；
其编码核苷酸序列为：
gaggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcatttactggctactttatgaactgggtgaagcagagccatggaaagagccttgagtggattggacgtattaatccttacaatggtgatactttctacaaccagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctctagcacagcccacatggagctcctgagcctgacatctgaggactctgcagtctattattgtggaagaggactaagggccttccttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca(SEQ ID NO.9)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明的一个优选的实施方式中，重链恒定区氨基酸序列如下：
RSTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.1)
如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
CDR1’，其氨基酸序列为QSISNY(SEQ ID NO.14)，其编码核苷酸序列为，caaagtattagcaactac(SEQ ID NO.13)；
CDR2’，其氨基酸序列为YAS(SEQ ID NO.16)，其编码核苷酸序列为，tatgcttcc(SEQ ID NO.15)
CDR3’，其氨基酸序列为QQSNSWPHT(SEQ ID NO.18)，其编码核苷酸序列为，caacagagtaacagctggcctcacacg(SEQ ID NO.17)
在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：
MVFTPQILGLMLFWISASRGDIVLTQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPHTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO.12)，
其编码核苷酸序列为：
Gatattgtgctaactcagtctccagccaccctgtctgtgactccaggagatagagtcagtctttcctgcagggccagtcaaagtattagcaactacctacactggtatcaacaaaaatcacatgagtctccaaggcttctcatcaagtatgcttcccagtccatctctgggatcccctccaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcactctcagtatcaacagtgtggagactgaagattttggaatgtatttctgtcaacagagtaacagctggcctcacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa(SEQ IDNO.11)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明的一个优选的实施方式中，氢链恒定区氨基酸序列如下：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.2)
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合埃博拉病毒GP蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.10的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.12的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗埃博拉病毒GP蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有埃博拉病毒GP蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQID NO.3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.10和/或SEQ ID NO.12所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology andImmunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancerresearch)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合埃博拉病毒GP蛋白分子，因而可用于预防和治疗埃博拉感染。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
杂交瘤细胞株
本发明还提供了可生产本发明针对埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
在获得生产本发明的埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodiesand T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自SalkInstitute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(MonoclonalAntibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(MonoclonalAntibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
本发明提供了一种针对埃博拉病毒的单克隆抗体，特别是针对埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明提供了一种能够与埃博拉病毒GP蛋白特异性结合的单克隆抗体S37-3；
(2)本发明的单克隆抗体S37-3表出了对埃博拉病毒的良好的中和活性，而且对Zaire亚型和Sudan亚型具备交叉中和活性。
(3)本发明的单克隆抗体S37-3易于表达纯化。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得，其中，实验中使用的菌株如E.coli DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；使用的细胞株如293T、293A、HUVEC、Sp2/0购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。
实施例1埃博拉DNA疫苗的构建
1.1 GP基因的获得
埃博拉病毒共有5种亚型，2014年西非大部分地区爆发的为Zaire亚型，少数为Sudan亚型，因此本发明希望可以得到一株针对Zaire亚型以及Sudan亚型具备交叉中和活性的抗体。首先，从北京义翘神州生物技术有限公司(Sino Biological Inc.)购买了Ebola病毒EBOV亚型Zaire(Ref ID：gb|U23187.1)和Ebola病毒EBOV亚型Sudan(Ref ID：lcl|Query_182515)的基因克隆。根据NCBI上对应序列信息设计引物，通过PCR扩增获得两个亚型的GP基因全长，GP基因全长2031bp(图1)，将大小正确的基因回收后测序。
1.2 埃博拉DNA疫苗的构建
因为GP蛋白上存在1-32aa的信号肽区域，本发明使用的pCAGGS-5’HA(参考Miyazaki Jun-ichi,a,Takaki Satoshib,Araki Kimia,Tashiro Fumia,TominagaAkirab,Takatsu Kiyoshi,Yamamura Ken-ichia.Expression vector system based onthe chickenβ-actin promoter directs efficient production of interleukin-5.Gene.1989Jul 15；79(2):269-77)是在5’加入Tag，信号肽剪切对于Tag及后续表达验证都可能存在影响，所以同时构建了3’HA、5’HA以及5’3’HA的克隆，包括pCAGGS-Zaire/SudanGP-5’HA、pCAGGS-Zaire/Sudan GP-3’HA以及pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA克隆。设计引物，为GP基因加入酶切位点或同时加入5’HA序列；同时对GP基因和pCAGGS-3’HA载体进行双酶切，回收后连接、转化、阳性克隆测序。成功获得pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’HA、pCAGGS-Zaire/Sudan GP-3’HA以及pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA阳性克隆。脂质体瞬时转染测序正确克隆质粒、pCAGGS-NS5a质粒(阳性对照)于293T细胞，72h后收集细胞裂解液(GP蛋白为跨膜蛋白)，进行Anti-HA Western blot(非还原胶)检测蛋白表达情况。同时以HcoV-OC43 N蛋白作为Western blot系统的阳性对照。
结果如图2所示，pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA成功表达，在170kDa和140kDa对应位置有条带，对应GP蛋白和GP1蛋白；而只转染了pCAGGS-3’HA质粒的细胞则没有显示出条带。
实施例2哺乳动物生物素化GP蛋白筛选系统的建立
2.1 生物素化GP蛋白质粒的构建
因为GP蛋白上存在1-32aa的信号肽(SP)区域，而生物素化使用的pIRES-BirA-FLAG载体(购自Clonetech)上也自带了IgE分泌信号肽，不能保证两者同时存在是否会影响GP蛋白表达，于是同时构建了pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-和pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG克隆。利用1.1获得的GP基因，设计引物，为GP基因加入酶切位点，获得大小约为2000bp的目的条带(图3)，回收。
同时对GP基因和pIRES-BirA-FLAG载体进行双酶切，回收后连接、转化、阳性克隆测序。成功获得pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-和pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG阳性克隆。
2.2 生物素化GP蛋白质粒的表达验证
脂质体瞬时转染测序正确克隆质粒于293T细胞，转染后4h更换含终浓度为200μMBiotin和双抗的DMEM。72h后收集细胞裂解液，进行Anti-FLAG检测蛋白表达情况。结果如图4所示，pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-成功表达，在140kDa对应位置有条带，对应GP1蛋白；而保留GP蛋白上的信号肽区域(SP)则会影响GP蛋白的生物素化，没有对应目的条带。因此选择pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-质粒进行后续生物素化蛋白表达。
2.3 生物素化GP蛋白质粒的表达量优化
同时，为了增强GP蛋白生物素化的效果，考虑在每个孔中同时转染目的蛋白质粒和pIRES-BirA-FLAG载体。如图5和6所示，在上样量相同、蛋白表达正常的情况下，同时转染pIRES-BirA-FLAG载体和pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-并没有增强GP蛋白生物素化的效果，决定采用转染pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-生物素化获得GP-Biotin的策略。
选择pIRES-Zaire/Sudan GP-BirA-FLAG SP-克隆进行6cm dish表达，使用1.5mL的RIPA裂解细胞获得细胞裂解液做后续筛选用。
2.4 确定生物素化GP蛋白裂解液的工作浓度
制备Zaire GP和Sudan GP细胞裂解液。4℃过夜包被链酶亲和素，包被浓度20μg/mL，100μL/孔，洗涤后用2％BSA(PBST溶液稀释)封闭，两种亚型的生物素化蛋白的细胞裂解原液用2％BSA稀释，稀释倍数从高到低分别为101、101.5、102、102.5、103、103.5、104、104.5倍共8个梯度，加入到96孔板中，100μL/孔，孵育后，洗涤，加入稀释后的DNA疫苗免疫的小鼠血清，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，显色，读数。
结果如图7所示，细胞裂解液的饱和稀释倍数在102-102.5(100-316)倍之间。所以最终确定细胞裂解液的最佳稀释度为300倍，整个筛选的过程需要的细胞裂解液1.0mL左右，可以满足30块96孔板的需求。一个6cm dish的细胞裂解液可以完成后续单抗的筛选需求。
为了验证生物素化GP蛋白与纯化后的GP蛋白对血清中抗体的识别能力，本发明人同时做了包被5μg/mL的Zaire/Sudan蛋白，100μL/孔，洗涤后用5％脱脂牛奶(PBST溶液稀释)封闭，分别加入DNA疫苗免疫的小鼠血清(Zaire/Sudan亚型)以及未免疫小鼠的血清(阴性对照)，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG，显色，读数。图7与图8结果对比显示，生物素化GP蛋白与纯化后的GP蛋白检测小鼠血清中抗体滴度的结果相近，OD450都在2.8-3.0左右。生物素化的GP蛋白可以用于间接ELISA法测定抗原抗体结合能力。
实施例3埃博拉DNA疫苗免疫小鼠、筛选及血清中和活性评价
3.1 DNA疫苗免疫后小鼠血清免疫效果评价
利用pCAGGS-Zaire GP-5’3’HA质粒和pCAGGS-Sudan GP-5’3’HA质粒分别免疫小鼠。选取8周龄BALB/c雌性小鼠，分成Zaire实验组(编号为Zaire 1-5，免疫Zaire GP DNA疫苗)、Sudan实验组(编号为Sudan 1-5，免疫Sudan GP DNA疫苗)以及对照组(1只，免疫pCAGGS空质粒)。每只小鼠100μg/次肌肉注射，每隔两周免疫一次，共免疫三次。免疫完成10天后取小鼠血液，在37度放置1小时后再转移至4℃放置24小时后离心，取上层无色或淡黄色血清，储存于-20℃备用。
包被链酶亲和素浓度20μg/mL，分别将Zaire-GP-BirA细胞裂解液和Sudan-GP-BirA细胞裂解液稀释300倍孵育作为一抗，将Zaire组小鼠和Sudan组小鼠血清分别稀释500倍的4的梯度倍数(从高到低分别为：500、2,000、8,000、32,000、128,000、512,000、2,048,000、8,192,000共8个梯度)作为二抗孵育，ELISA检测小鼠血清抗体滴度。结果如图9和10所示，Zaire 3、Sudan 1和Sudan 3三只小鼠的免疫效果较好，在稀释32,000-64,000倍数左右OD450数值还是空白对照组2倍左右，认为仍然是阳性。一般只要血清抗体滴度达到10,000倍稀释后阳性就可以进行下一步筛选。
3.2 小鼠回忆刺激后检测血清中抗体中和活性
针对2014年西非埃博拉疫情大部分地区爆发的为Zaire亚型，少数为Sudan亚型，因此本发明的设想是在获得针对Zaire亚型的中和性抗体的基础上，获得具备对Sudan亚型的交叉中和活性的抗体。因此，选择Zaire 3小鼠进行后续试验。使用20μgSudan GP蛋白对Zaire 3小鼠进行回忆刺激，进行杂交瘤筛选。
在完成回忆刺激后，包被链酶亲和素浓度20μg/mL，分别将Zaire-GP-BirA细胞裂解液和Sudan-GP-BirA细胞裂解液稀释300倍孵育作为一抗，将Zaire 3血清分别稀释500倍的4的梯度倍数(从高到低分别为：500、2,000、8,000、32,000、128,000、512,000、2,048,000、8,192,000共8个梯度)作为二抗孵育，ELISA检测小鼠血清抗体滴度。同时选择Zaire对照组小鼠血清作为阴性对照。结果如图11所示，Zaire 3小鼠在回忆刺激以后免疫效果有一定的提升，在稀释128,000-512,000倍数左右OD450数值还是空白对照组的2倍左右。并且，Zaire 3小鼠血清也展现了对Sudan亚型蛋白的结合能力，在8,000-32,000稀释倍数间OD450值仍为阳性。因此，本发明人认为Zaire 3小鼠产生的血清具备对Zaire和Sudan两种亚型的蛋白的结合能力。
实施例4假病毒系统的构建及血清中和活性的评价
4.1 假病毒系统的构建
通过两质粒系统，pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA与pNL4-3-Luc+enp-vrp-(参考He J,Choe S,Walker R,Di Marzio P,Morgan DO,Landau NR.Human immunodeficiencyvirus type 1viral protein R(Vpr)arrests cells in the G2phase of the cellcycle by inhibiting p34cdc2
activity.J Virol 69:6705–6711,1995.)共转染293T细胞，表达埃博拉假病毒。根据实验用量决定包装假病毒的细胞量。以10cm dish为例，转染前一天铺293T细胞于10cmdish中，转染前换新的DMEM；用LipofectamineTM3000进行转染，10cm dish共可转染质粒24μg，根据骨架质粒：包装蛋白质粒＝10:1比例，质粒用量分别为pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA 2.2μg和pNL4-3-Luc+enp-vrp-21.8μg；转染后6h更换新的FreeStyleTM293Expression Medium；转染后48小时收病毒：取贴壁细胞上清，3,000rpm离心5min收集上清，再用0.45μm的滤膜过滤。同时包装VSVG作为阳性对照，只转染骨架质粒pNL4-3-Luc+enp-vrp-作为阴性对照。
以293T作为靶细胞感染假病毒。感染前一天用293T细胞铺24孔板，以12h后细胞长到80％-90％满底为准；感染时，每孔细胞用200μL假病毒加200μL培液；感染后24h，补加400μL/孔新鲜培液；感染后72h，测luciferase值确定假病毒感染力。
结果如图12所示，假病毒包装成功。以只转染骨架质粒pNL4-3-Luc+enp-vrp-的阴性对照的luciferase值为1标准化所有数据，Zaire亚型和Sudan亚型的假病毒的luciferase值分别约为Mock的300倍和200倍，显示病毒包装成功，具备较强的感染力。
4.2 利用假病毒系统检测血清中抗体的中和活性
利用假病毒系统检测Zaire 3小鼠血清中抗体的中和活性。同样的，本发明人通过两质粒系统，pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA与pNL4-3-Luc+enp-vrp-共转染293T细胞，表达埃博拉假病毒。以10cm dish为例，转染前一天铺293T细胞于10cm dish中，转染前换新的DMEM；用LipofectamineTM 3000进行转染，10cm dish共可转染质粒24μg，根据骨架质粒：包装蛋白质粒＝10:1比例，质粒用量分别为pCAGGS-Zaire/Sudan GP-5’3’HA 2.2μg和pNL4-3-Luc+enp-vrp-21.8μg；转染后6h更换新的FreeStyleTM 293Expression Medium；转染后48h收病毒：取贴壁细胞上清，3000rpm 5min离心收集上清，再用0.45μm的滤膜过滤。同时包装VSVG作为阳性对照，只转染骨架质粒pNL4-3-Luc+enp-vrp-作为阴性对照。
根据文献报道，感染的靶细胞分别采用293T和HUVEC。在感染时，每孔细胞用200μL假病毒加200μL培液，同时加入Zaire 3小鼠血清(血清：假病毒＝1:50)进行孵育，37℃，1h；之后将孵育好的混合液置于靶细胞上。感染后24h，补加400μL/孔新鲜培液；感染后72h，测luciferase值。
结果如图13和图14所示，同样以只转染骨架质粒pNL4-3-Luc+enp-vrp-的阴性对照的luciferase值为1标准化所有数据，Zaire 3小鼠回忆刺激后的血清内抗体在293T细胞和HUVEC细胞中都可以中和Zaire亚型的假病毒，且不加血清组(Zaire/Sudan)和血清组(Zaire/Sudan+sera)的luciferase值呈现极显著差异；并且，Zaire 3小鼠回忆刺激后的血清内抗体也显示出了对于Sudan亚型的交叉中和活性，不加血清组和血清组的luciferase值也呈现极显著差异。
实施例5抗埃博拉中和性抗体细胞株的获得与评价
5.1 Zaire 3小鼠脾脏细胞融合结果
结果如表1所示，Zaire 3小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞的融合率为99.65％，抗Ebola-GP抗体的阳性率为2.36％。
表1抗埃博拉GP杂交瘤制备组成
*表示检测的抗埃博拉GP抗体的所有微孔数目。
通过间接ELISA法，包被链酶亲和素浓度20μg/mL，将Zaire-GP-BirA细胞裂解液稀释300倍孵育作为一抗，将杂交瘤克隆上清作为二抗孵育，ELISA检测克隆是否为阳性。同时使用未用过的培养液作为阴性对照。经克隆化，获得了6个杂交瘤克隆，分别为S37-3、S128-3、S372-5、S526-8、S526-11和S529-11。扩增细胞，进行上清的收集。
5.2 Zaire 3小鼠脾脏细胞阳性克隆获得
表2抗埃博拉单克隆抗体效价检测及亚型鉴定
**ELISA结果，已扣除阴性对照值(约为0.1左右)。
5.4 抗埃博拉嵌合单克隆抗体中和活性评价
本次分别使用293T、HUVEC和293A细胞作为靶细胞。在感染时，每孔细胞用200μL假病毒加200μL培液，同时加入杂交瘤单克隆抗体上清(单克隆上清：假病毒＝1:50)进行孵育，37℃，1h；孵育后将混合液置于靶细胞上。感染后24h，每孔补加400μL新鲜的DMEM培液；感染后72h，检测luciferase值。
因293A细胞和293T细胞性质较为接近，推测埃博拉假病毒同样可以感染293A细胞。为保证实验准确性，此次实验增加293A细胞为靶细胞。结果如图16-18所示，同样以只转染骨架质粒pNL4-3-Luc+enp-vrp-的阴性对照(Mock)的luciferase值为1标准化所有数据。在293T细胞中，和只感染假病毒的细胞检测的luciferase值(PC)相比，S37-3、S128-3上清显示出了对Zaire亚型假病毒较好的中和效果，不加上清组和上清组达到显著差异；而对于Sudan亚型的假病毒，S37-3、S128-3和S529-11三株细胞上清的中和活性较好，不加上清组和上清组的luciferase值呈现极显著差异。在293A细胞中，和只感染假病毒的细胞检测的luciferase值(PC)相比，S37-3、S128-3、S372-5和S529-11上清显示出了对Zaire亚型假病毒较好的中和效果，不加上清组和上清组达到显著差异；而对于Sudan亚型的假病毒，S37-3、S128-3和S526-8三株细胞上清的中和活性较好，不加上清组和上清组的luciferase值呈现极显著差异并且。在HUVEC细胞中，6株细胞株都表现出对Zaire和Sudan亚型假病毒的良好中和活性，其中又以S37-3、S128-3、S372-5表现更为优异。综上，本发明人认为S37-3、S128-3、S529-11上清具备对于Zaire亚型假病毒较好的保护活性，同时对于Sudan亚型也具备一定的交叉中和活性，选择这三株中和活性较好的抗体进行后续人源化。
采用本领域常规方法对S37-3单克隆抗体进行测序，该抗体的重链可变区的三个互补决定区CDR分别如SEQ ID NO.4、6、8所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。轻链可变区的三个互补决定区CDR分别如SEQ ID NO.14、16、18所示：轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO.4所示的CDR1，
SEQ ID NO.6所示的CDR2，和
SEQ ID NO.8所示的CDR3；
优选地，所述重链可变区具有SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
SEQ ID NO.14所示的CDR1’，
SEQ ID NO.16所示的CDR2’，和
SEQ ID NO.18所示的CDR3’；
优选地，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3的轻链可变区。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区的序列、如权利要求2所述的重链的序列、如权利要求3所述的轻链可变区的序列、如权利要求4所述的轻链的序列、或如权利要求5所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
11.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
12.如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体、或如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求10所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中埃博拉病毒GP蛋白；
所述药剂用于治疗或预防埃博拉病毒感染。
13.一种检测样品中埃博拉病毒GP蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)将样品与权利要求5所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在埃博拉病毒GP蛋白。
14.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求5所述的抗体或权利要求6所述的重组蛋白。
CN201610345756.9A 2016-05-23 2016-05-23 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体 Pending CN107417788A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610345756.9A CN107417788A (zh) 2016-05-23 2016-05-23 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610345756.9A CN107417788A (zh) 2016-05-23 2016-05-23 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107417788A true CN107417788A (zh) 2017-12-01

Family

ID=60422392

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610345756.9A Pending CN107417788A (zh) 2016-05-23 2016-05-23 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107417788A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108424448A (zh) * 2018-02-11 2018-08-21 浙江大学 抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体f1b4及其应用
CN111518815A (zh) * 2020-02-26 2020-08-11 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108424448A (zh) * 2018-02-11 2018-08-21 浙江大学 抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体f1b4及其应用
CN108424448B (zh) * 2018-02-11 2020-07-24 浙江大学 抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体f1b4及其应用
CN111518815A (zh) * 2020-02-26 2020-08-11 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用
CN111518815B (zh) * 2020-02-26 2021-11-26 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220106364A1 (en) Complexes of cytomegalovirus proteins
Ren et al. Recombinant SARS-CoV-2 spike S1-Fc fusion protein induced high levels of neutralizing responses in nonhuman primates
CN106188281B (zh) 抗诺如病毒gii.4型鼠源单克隆抗体的制备和应用
CN105050622B (zh) 针对呼吸道融合病毒f蛋白质的人类抗体及其使用方法
CN107840891A (zh) 高亲和力的抗msln抗体及其应用
CN107814845A (zh) 新的抗pd‑1纳米抗体及其应用
CN106414496A (zh) 针对中东呼吸综合征‑冠状病毒刺突蛋白的人抗体
CN105622753B (zh) 一种pd-1单克隆抗体及其应用
CN102936284A (zh) 人抗狂犬病抗体及其用途
CN111606993B (zh) 抗呼吸道合胞病毒的全人广谱中和抗体4f1及其应用
CN102659945B (zh) 抗C5aR抗体及其应用
CN109776678A (zh) 一种人源化pd-l1单克隆抗体、其制备方法和应用
CN101257917A (zh) 针对黄病毒科病毒感染的嵌合多肽及其治疗应用
CN107840889A (zh) 高亲和力的抗cd123抗体及其应用
WO2015200522A2 (en) Monoclonal antibodies directed against envelope glycoproteins from multiple filovirus species
CN107428819A (zh) 强力地中和狂犬病毒和其它狂犬病毒属病毒的抗体和其用途
CN106459186A (zh) 针对hiv‑1 v1v2 env区域的广谱中和性单克隆抗体
CN108794624A (zh) 抗h7n9流感病毒的中和性单克隆抗体
CN106188282B (zh) 抗诺如病毒gi.1型鼠源单克隆抗体的制备和应用
CN102453091B (zh) 抗破伤风类毒素单克隆抗体及其制备方法和用途
WO2020186687A1 (zh) 一种特异性结合四种血清型登革病毒的人源抗体
CN109081868A (zh) 靶向寨卡病毒包膜蛋白保守表位的单克隆抗体及其应用
CN107417788A (zh) 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体
CN100519583C (zh) Sars中和性抗体及应用
CN115160433A (zh) 人源化hbv b和c基因型前s1蛋白抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171201

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication