CN111518815A - 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111518815A
CN111518815A CN202010121145.2A CN202010121145A CN111518815A CN 111518815 A CN111518815 A CN 111518815A CN 202010121145 A CN202010121145 A CN 202010121145A CN 111518815 A CN111518815 A CN 111518815A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
ebola virus
ebola
vaccinia virus
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010121145.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111518815B (zh
Inventor
赵永坤
赵忠鹏
张颖
杨松涛
高玉伟
闫飞虎
郑学星
王化磊
李敏
杨晓岚
夏咸柱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Original Assignee
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences filed Critical Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority to CN202010121145.2A priority Critical patent/CN111518815B/zh
Publication of CN111518815A publication Critical patent/CN111518815A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111518815B publication Critical patent/CN111518815B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
    • C12N2710/24241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14051—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2760/14052—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/103—Plasmid DNA for invertebrates
    • C12N2800/105—Plasmid DNA for invertebrates for insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用。本发明首先分析扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒基因组，优化埃博拉病毒GP和VP40基因序列，形成“嵌合类病毒颗粒”型序列，使其能全面覆盖三型病毒的主要抗原表位；然后，分别利用昆虫‑杆状病毒表达系统、痘苗病毒重组活载体疫苗系统表达、纯化和制备埃博拉嵌合病毒样颗粒疫苗抗原；最后，免疫动物获得高免血浆，经胃蛋白酶酶切、硫酸铵沉淀、层析柱纯化，获得高纯度的抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2，并对其进行安全性和有效性评价。本发明提供的通用埃博拉病毒病免疫球蛋白可预防和治疗三型埃博拉病毒感染所引起的出血热，为埃博拉疫情防控提供有力工具。

Description

通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地说，涉及一种通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
埃博拉出血热由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起，病死率可高达90％，属于生物安全Ⅳ级病毒。本病自1976年于非洲埃博拉河流域发现以来，每年都散发，WHO确认其为全球公共卫生紧急事件，呼吁全球加强药物研发。
EBOV包括五种亚型，埃博拉-扎伊尔(Ebola-Zaire，Z-EBOV)、埃博拉-苏丹(Ebola-Sudan，S-EBOV)、埃博拉-科特迪瓦(Ebola-Coted’Ivoire，C-EBOV)、埃博拉-莱斯顿(Ebola-Reston，R-EBOV)和埃博拉-本迪布焦(Ebola-bundibugyo，B-EBOLA)。其中以Z-EBOV的毒力最强，人感染后死亡率最高；S-EBOV次之；C-EBOV对黑猩猩有致病性，对人则毒力最弱；R、B-EBOV对人不致病，但对人以外的灵长类动物具有致死性，实验室研究表明五型病毒之间仅有较弱的交叉免疫保护性。目前该病尚无有效预防和救治药物。
抗血清用于抗病毒治疗已有100多年的历史，制备工艺经历了4个发展阶段，使安全性和有效性大大提升，在目前市场上各阶段产品均有流通。免疫异源动物后经新生产工艺制备的精制通用埃博拉病毒病免疫球蛋白安全性高、特异性强、效价高、作用快、制备周期短，生产量大，对日趋严峻的埃博拉疫情防控仍是最廉价、最有效的救命药。
发明内容
本发明的目的是提供一种通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种分离的聚核苷酸(GP)，所述聚核苷酸包含如下序列或由其组成：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第二方面，本发明提供一种分离的聚核苷酸(VP40)，所述聚核苷酸包含如下序列或由其组成：
i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供含有上述聚核苷酸GP和/或VP40的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第四方面，本发明提供一种免疫原性组合物，其包含上述聚核苷酸GP和/或VP40编码的蛋白质。
第五方面，本发明提供一种埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，其是利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备包含上述聚核苷酸GP和VP40的重组杆状病毒，将收获的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养转染的细胞，收集细胞培养上清，纯化后与佐剂混合得到的。
优选地，昆虫细胞-杆状病毒表达系统所使用的表达载体可以为pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B或pFastBacHT C等，更优选pFastBacDual。
昆虫细胞可以为Sf21、Sf9或Mimic Sf9等，更优选Sf9。
佐剂可以为206佐剂、弗氏完全或不完全佐剂等，更优选206佐剂。
第六方面，本发明提供埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)将埃博拉病毒基因GP和VP40克隆于同一昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDual上，转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9，拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞Sf9，27-30℃静止培养48-72h后，或27-30℃50-100rpm摇床振荡培养24-48h后收获细胞上清液，即得到埃博拉病毒样颗粒抗原原液；
(2)上述原液使用300kDa纤维柱浓缩后，采用蔗糖密度梯度离心(用20％、30％、60％蔗糖密度梯度离心)，在蔗糖密度30％和60％之间得到纯化的病毒样颗粒；
(3)将上述纯化的病毒样颗粒与206佐剂按1：1体积比混合均匀。
第七方面，本发明提供一种表达埃博拉病毒GP和VP40蛋白的重组痘苗病毒，其特征在于，其是将包含上述聚核苷酸GP和VP40的转移质粒载体与痘苗病毒载体共转染真核细胞，培养转染的细胞，收集细胞培养上清，纯化后得到的。
优选地，所述痘苗病毒载体可以为山羊痘疫苗、痘苗病毒安哥拉株或痘苗病毒天坛株等，更优选痘苗病毒天坛株。
转移质粒载体可以为pVAX1或pBluescipt等，更优选pBluescipt。
真核细胞可以为Vero、MRC-5或MDCK等，更优选Vero。
第八方面，本发明提供表达埃博拉病毒GP和VP40蛋白的重组痘苗病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)以TK基因上、下游同源臂为基础构建转移质粒载体，中间依次插入三个独立的以PE/L为启动子和以T5nT为终止子的外源基因表达盒，分别表达序列优化后的埃博拉病毒结构蛋白GP和VP40基因及两侧含有Loxp基因的筛选标记蛋白EGFP基因，转移质粒载体pBluescipt多克隆位点内核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；将转移质粒载体与痘苗病毒天坛株共转染真核细胞Vero，获得表达埃博拉病毒样颗粒和绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒；
2)将携带Cre酶编码基因的真核表达质粒pVAX1与步骤1)得到的重组痘苗病毒共转染真核细胞，培养转染的细胞，收集细胞上清液，蚀斑纯化获得表达埃博拉病毒GP和VP40蛋白的重组痘苗病毒纯品，用重组痘苗病毒纯品感染真核细胞，收集上清液，即得到埃博拉病毒样颗粒抗原原液；
3)上述原液使用300kDa纤维柱浓缩后，采用蔗糖密度梯度离心(用20％、30％、60％蔗糖密度梯度离心)，在蔗糖密度30％和60％之间得到纯化的重组痘苗病毒。
第九方面，本发明提供所述免疫原性组合物，或所述埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或按照上述方法制备得到的埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或所述重组痘苗病毒，或者按照上述方法构建得到的重组痘苗病毒在制备用于治疗或预防埃博拉病毒感染的药物中的应用；
本发明中，所述埃博拉病毒包括扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒。
第十方面，本发明提供通用埃博拉病毒病免疫球蛋白的制备方法，用所述埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或按照上述方法制备得到的埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或所述重组痘苗病毒，或者按照上述方法构建得到的重组痘苗病毒接种实验动物，采集血浆，从血浆中分离纯化IgG蛋白，经胃蛋白酶酶切，酶切产物纯化后即得通用埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2。
所得产品为液体或冻干粉剂型，具有高效价的中和三型(扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型)埃博拉病毒特性。
所述方法还包括对制备的免疫球蛋白F(ab’)2进行安全性评价的步骤。安全性评价可以是样品自检、送外检，优选送有资质机构进行外检；有效性评价可以是自检、送外检，优选使用假病毒进行自检测定抗体体外中和效力联合使用病毒实毒(送外检)测定抗体防治效果。
优选地，所述实验动物选自非人灵长类动物、马属动物等；所述马属动物包括马、驴及其杂交后代；更优选地，所述非人灵长类动物为猴。
本发明制得的精制通用埃博拉病毒病免疫球蛋白含量不低于总蛋白含量的95.0％。
第十一方面，本发明提供按照上述方法制备得到的通用埃博拉病毒病免疫球蛋白。
第十二方面，本发明提供所述通用埃博拉病毒病免疫球蛋白在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒病感染及其所致疾病的药物中的应用。
本发明首先分析扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒基因组，优化埃博拉病毒GP和VP40基因序列，形成“嵌合类病毒颗粒”型序列，使其能全面覆盖扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒的主要抗原表位并优化细胞偏爱密码子；然后，分别利用昆虫-杆状病毒表达系统、痘苗病毒重组活载体疫苗系统表达、纯化和制备嵌合埃博拉病毒样颗粒疫苗抗原；最后，免疫健康动物，获得高免血浆，经胃蛋白酶酶切、硫酸铵沉淀、层析柱纯化，获得高纯度的抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2，并对其进行安全性和有效性评价，证明其符合中国药典的要求，可预防和治疗三型埃博拉病毒感染所引起的出血热，是非常有商业开发价值的生物药，为埃博拉疫情防控提供有力工具。
具体实施方式
本发明提供一种安全、高效、可靠的精制通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法，尤其是提供一种用于生产精制通用埃博拉病毒病免疫球蛋白的成套免疫原。
本发明提供的用于精制通用埃博拉病毒病免疫球蛋白的成套免疫原由埃博拉病毒的病毒样颗粒疫苗抗原和/或痘苗病毒重组活载体疫苗抗原组成。
首先，分析扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒基因组和抗原表位，设计合成埃博拉病毒的GP和VP40两个基因并优化细胞偏爱密码子；其次，利用昆虫-杆状病毒表达系统和/或痘苗病毒重组活载体疫苗系统表达、纯化和制备嵌合埃博拉病毒样颗粒疫苗抗原；再次，免疫健康动物，获得高免血浆，酶切、纯化后获得高纯度的抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2；最后，对其进行安全性和有效性评价，证明其符合中国药典的要求，可预防和治疗三型埃博拉病毒感染所引起的出血热。
所述制备方法具体包括以下步骤：
1)从NCBI下载埃博拉病毒序列，利用DNAMAN等生物信息学软件优化埃博拉病毒GP和VP40基因序列，使其能全面覆盖扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒的主要抗原表位并优化细胞偏爱密码子，所述GP核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述VP40核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2)将GP和VP40克隆于同一昆虫细胞高效表达载体pFastBacDual上，转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，制备重组杆状病毒Bacmid质粒，用Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9，拯救获得重组杆状病毒；接种重组杆状病毒于昆虫细胞Sf9，收获上清，纯化即得到埃博拉病毒样颗粒。
3)以TK基因上(L)、下(R)游同源臂为基础构建转移质粒，中间依次插入三个独立的以PE/L为启动子和以T5nT为终止子的外源基因表达盒，分别表达序列优化后的埃博拉病毒结构蛋白GP和VP40基因及两侧含有Loxp基因的筛选标记蛋白EGFP基因，转移质粒载体pBluescipt多克隆位点内核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；将转移质粒与痘苗病毒天坛株共转染真核细胞Vero，筛选到的重组痘苗病毒能稳定存在，并表达埃博拉病毒样颗粒和绿色荧光蛋白；将Cre酶真核表达质粒如pVAX1-Cre质粒与带有外源筛选标记的重组痘苗病毒天坛株共转染真核细胞，筛选到的重组痘苗病毒能稳定全程高效产生埃博拉病毒样颗粒。
4)用纯化的重组痘苗病毒纯品和/或埃博拉病毒样颗粒佐剂抗原反复免疫健康动物，检测血浆效价达到1:10000以上时采血；采用不同纯化方案获得埃博拉病毒病精制免疫球蛋白。
5)经急性毒性试验、长期毒性试验等研究证明其符合中国药典的安全性要求；经体内、外药效学评价研究证明其可有效防治三型埃博拉病毒感染所引起的出血热。
步骤1)中所述方法是根据埃博拉病毒的结构特征，研究其中和性抗原表位组合，融合扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒的主要抗原表位并优化细胞偏爱密码子，使其能对三型病毒产生免疫交叉保护。设计原理可参见Rational design of a triple-typehuman papillomavirus vaccine by compromising viral-type specificity，NATURECOMMUNICATIONS，2018。根据交叉保护的具体数据择优选择了SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2序列。
步骤2)中使用的表达载体可以是pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C等，优选pFastBacDual；昆虫细胞可以是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9细胞系，优选Sf9。
步骤3)中使用的病毒载体可以是山羊痘疫苗、痘苗病毒安哥拉株、痘苗病毒天坛株等，优选痘苗病毒天坛株；转移质粒载体可以是pVAX1、pBluescipt等，优选pBluescipt；启动子和终止子可以是CMV早期启动子和BGH终止序列、PE/L和T5nT等，优选PE/L和T5nT，真核表达细胞可以是Vero、MRC-5、MDCK等，优选Vero。
步骤4)中动物可以为猴、马等，优选马，马的重量为300-1000kg；佐剂可以为206佐剂、弗氏完全/不完全佐剂等，优选206佐剂；纯化工艺可以选用凝胶过滤层析、离子交换层析、硫酸铵沉淀、亲和层析等，优选不同方法组合工艺使用，如采用饱和硫酸铵沉淀法，从血浆中分离纯化IgG蛋白，然后用胃蛋白酶进行酶切，酶切产物过DEAE离子交换层析柱，收集穿透峰、洗脱峰，最后过G-25脱盐凝胶柱，收集蛋白峰，过滤、冻干。
步骤2)、步骤3)中病毒样颗粒及重组痘苗病毒经蔗糖密度梯度离心(用20％、30％、60％蔗糖密度梯度离心)后，在30％和60％之间得到纯化病毒样颗粒或重组痘苗病毒。
步骤5)中安全性评价可以是样品自检、送外检，优选送有资质机构进行外检；有效性评价可以是自检、送外检，优选使用假病毒进行自检测定抗体体外中和效力联合使用病毒实毒(送外检)测定抗体防治效果。
本发明制备的精制通用埃博拉病毒病免疫球蛋白含量不低于总蛋白含量的95.0％。
本发明产品为液体或冻干粉剂型，具有高效价的中和三型埃博拉病毒的特性，可作为防治三型埃博拉病毒的有效药物。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1马抗埃博拉病毒免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
马抗埃博拉病毒免疫球蛋白F(ab’)2的制备方法包括以下步骤：
1、埃博拉病毒GP和VP40的设计及合成：从NCBI下载埃博拉病毒序列，利用DNAMAN等生物信息学软件分析基因同源性、抗原位点、偏爱密码子等生物信息；根据埃博拉病毒结构特征，优化埃博拉病毒GP和VP40基因序列，使其能全面覆盖扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒的主要抗原表位并根据表达系统优化细胞偏爱密码子，所述GP核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述VP40核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2、VLP蛋白免疫原的制备：
将埃博拉病毒两个基因GP和VP40克隆于同一昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDual上，转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9，拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞Sf9，27℃静止培养48-72h后收获细胞上清液，即得到埃博拉病毒样颗粒抗原原液。原液使用300kDa纤维柱浓缩后采用蔗糖密度梯度离心(用20％、30％、60％蔗糖密度梯度离心)后，在30％和60％之间得到纯化病毒样颗粒(VLP蛋白免疫原)。
3、将上述昆虫细胞表达纯化的病毒样颗粒与206佐剂按1：1体积比混合均匀，挑选健康成年马匹经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测马血浆效价达到1:10000以上时采血。
“嵌合类病毒颗粒”基因序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的优化过程如下：按照传统方法，一种病毒样颗粒只能预防一种病毒类型，为提高预防效果，覆盖更多的病毒种类，就需要增加颗粒的种类数量。采用“一对一”的方法制备预防多种病毒的疫苗，造成接种剂量大，副反应大，复杂性高、生产成本高。本发明利用结构疫苗学方法设计了“嵌合类病毒颗粒”，利用不同型埃博拉病毒颗粒在结构上共有的骨架(长丝状球体)和不同的外在细节形貌特征(纹路、线条、凸起、凹陷环区)的特性，计算、设计、合成一组在共同“骨架”上集成三种病毒型别的“环”特征的基因序列，能够模拟三种病毒型别的形貌，即一种病毒样颗粒可以同时保护三种型别病毒的功能。经步骤1、2、3筛选，获得优化后的GP和VP40基因序列(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)，具有最大的交叉免疫保护效果。
4、将获得的血浆按照ZL 200410010704.3中实施例1制备F(ab′)2片段的方法，收集F(ab′)2片段峰，冻干后获得抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2。
实施例2埃博拉病毒病精制免疫球蛋白及其制备方法
埃博拉病毒病精制免疫球蛋白的制备方法包括以下步骤：
1、埃博拉病毒GP和VP40的设计及合成：从NCBI下载埃博拉病毒序列，利用DNAMAN等生物信息学软件分析基因同源性、抗原位点、偏爱密码子等生物信息；根据埃博拉病毒结构特征，优化埃博拉病毒GP和VP40基因序列，使其能全面覆盖扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒的主要抗原表位并根据表达系统优化细胞偏爱密码子，GP核苷酸序列如SEQID NO:1所示，VP40核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2、免疫原的制备：
以TK基因上(L)、下(R)游同源臂为基础构建转移质粒，中间依次插入三个独立的以PE/L为启动子和以T5nT为终止子的外源基因表达盒，分别表达序列优化后的埃博拉病毒结构蛋白GP和VP40基因及两侧含有Loxp基因的筛选标记蛋白EGFP基因，转移质粒载体pBluescipt多克隆位点内核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；将转移质粒与痘苗病毒天坛株共转染真核细胞Vero，筛选到的重组痘苗病毒能稳定存在，并表达埃博拉病毒样颗粒和绿色荧光蛋白；将Cre酶真核表达质粒如pVAX1-Cre质粒与带有外源筛选标记的重组痘苗病毒天坛株共转染真核细胞，筛选到的重组痘苗病毒能稳定全程高效产生埃博拉病毒样颗粒。原液使用300kDa纤维柱浓缩后采用蔗糖密度梯度离心(用20％、30％、60％蔗糖密度梯度离心)后，在30％和60％之间得到纯化重组痘苗病毒。
3、将上述Vero细胞表达纯化的重组痘苗病毒，挑选健康成年马匹经过背部皮下分点注射的方法进行初免、多次加强免疫，检测马血浆效价达到1:10000以上时采血。
“嵌合类病毒颗粒”基因序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的优化过程如下：按照传统方法，一种病毒样颗粒只能预防一种病毒类型，为提高预防效果，覆盖更多的病毒种类，就需要增加颗粒的种类数量。采用“一对一”的方法制备预防多种病毒的疫苗，造成接种剂量大，副反应大，复杂性高、生产成本高。本发明利用结构疫苗学方法设计了“嵌合类病毒颗粒”，利用不同型埃博拉病毒颗粒在结构上共有的骨架(长丝状球体)和不同的外在细节形貌特征(纹路、线条、凸起、凹陷环区)的特性，计算、设计、合成一组在共同“骨架”上集成三种病毒型别的“环”特征的基因序列，能够模拟三种病毒型别的形貌，即一种病毒样颗粒可以同时保护三种型别病毒的功能。经步骤1、2、3筛选，获得优化后的GP和VP40基因序列(SEQID NO:1和SEQ ID NO:2)，具有最大的交叉免疫保护效果。
4、将获得的血浆按照ZL 201110202539.1中实施例2制备F(ab′)2片段的方法，收集F(ab′)2片段峰，获得抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2。
实施例3抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2体外中和抗体效价测定
1、EBOV假病毒的制备
购买商品化的慢病毒包装体系(如Nie J,Wu X,Ma J,Cao S,Huang W,Liu Q,etal.Development of in vitro and in vivo rabies virus neutralization assaysbased on a high-titer pseudovirus system.Sci Rep 2017；7:42769，也可以使用其他慢病毒包装体系)，293V细胞、293T细胞和Promega荧光素酶测定体系。按照慢病毒操作说明书制备假病毒：
(1)转染前准备细胞
在一个75平方厘米的细胞培养瓶中，调整293V细胞至合适浓度，加入20ml包含10％热灭活的胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，放于37℃，5％CO2培养箱培养。
(2)培养细胞血清的充分去除
细胞达到70～80％铺满时，换16ml包含1％青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基，放于37℃，5％CO2培养箱培养2小时。
(3)转染前准备
转染前准备一个15ml的细胞管，按说明书依次加入Opti-MEM、transfectionreagent(LipofectamineTMTM2000)、包装质粒，混匀30秒，室温静止20分钟，得到混合物。包装质粒构建和提取方法如下：将SEQ ID NO:1所示的GP基因构建到pcDNA3.1-opti-LASV-GPC载体(Li Q,Liu Q,Huang W,Wu J,Nie J,Wang M,Zhao C,Zhang L,Wang Y.An LASVGPC pseudotyped virus based reporter system enables evaluation of vaccines inmice under non-BSL-4conditions.Vaccine.2017Sep 12；35(38):5172-5178)的多克隆位点上，用质粒提取试剂盒提取即得包装质粒。
(4)转染
将混合物加入293V细胞，放于37℃，5％CO2培养箱。
(5)转染后12小时，用20ml包含1％双抗的DMEM培养基更换以上转染培养基，放于37℃，5％CO2培养箱继续培养60小时。
(6)收集上清，并经0.2μm滤膜过滤，分装，放于-76℃，待用。
(7)使用293T细胞，按照Reed-Muench法测定假病毒滴度，三种假病毒滴度均超过1×105U/ml。
2、利用假病毒测定抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2的中和抗体效价
采用微量快速荧光素酶抑制试验法对实施例1和实施例2制备的抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2中和抗体效价进行测定：
(1)取一块96孔板横向使用，每块板可做6份待测血清，对待检血清进行系列稀释。96孔板每孔加入50μl稀释液；A1-A12：每孔加入相应样品50μl，由A行混匀后吸50μl至B行混匀，依次混匀稀释至G行，吸取G行的抗体50μl弃掉；H1-H6加入相应待测血清样品50μl，混匀；细胞对照孔补加抗体稀释液50μl，混匀。
(2)将病毒稀释至1000U/0.05ml，取50μl垂直悬滴入96孔板(血清、细胞对照除外)的各孔中；另取1.5ml 1000U/0.05ml病毒于小离心管中，4℃暂存，待回测病毒滴度。
(3)将细胞培养板轻拍混匀，至37℃中和1h。
(4)病毒滴度回测
取4支小管，每管加0.9ml稀释液，吸取0.1ml的1000U/0.05ml病毒加入第1管中，混匀后作为100U/0.05ml，依次10倍稀释至10U/0.05ml；另取一块96孔板，将每个稀释度的病毒每孔加入0.1ml，并做8个复孔；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液。
(5)用消化液消化细胞，制备成2×105个/ml的细胞悬液，每孔分别加入0.1ml细胞悬液，混匀，放入35℃、5％CO2孵箱中孵育培养；测定荧光素值，以抑制50％荧光素值的血清最高稀释度的倒数为终点效价，2天后判定最终结果。如果病毒回滴结果不在320～3200U/0.05ml的范围内，实验无效，重复实验。
结果表明，上述制备的抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2对扎伊尔型EBOV假病毒、苏丹型EBOV假病毒、科特迪瓦型EBOV假病毒的中和抗体效价均大于1:15000。
3、利用埃博拉病毒实毒测定抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2的中和抗体效价
采用微量中和试验法对实施例1和实施例2制备的抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2中和抗体效价进行测定：
(1)取一块96孔板横向使用，每块板可做6份待测血清，对待检血清进行系列稀释。96孔板每孔加入50μl稀释液；A1-A12：每孔加入相应样品50μl，由A行混匀后吸50μl至B行混匀，依次混匀稀释至G行，吸取G行的抗体50μl弃掉；H1-H6加入相应待测血清样品50μl，混匀；细胞对照孔补加抗体稀释液50μl，混匀。
(2)将病毒(MA-EBOV，USAMRIID/BALB/c-lab/COD/1976/Mayinga-MA-p3或者EBOV-Makona-C07或者GA-EBOV,VECTOR/C.porcellus-lab/COD/1976/Mayinga-GPA-p7，均由美国陆军传染病医学研究所提供，参见Chan M,Leung A,Griffin BD,Vendramelli R,TailorN,Tierney K,Audet J,Kobasa D.Generation and Characterization of a Mouse-Adapted Makona Variant of Ebola Virus.Viruses.2019Oct26；11(11)；或Patel A,Reuschel EL,Kraynyak KA,Racine T,Park DH,Scott VL,Audet J,Amante D,Wise MC,Keaton AA,Wong G,Villarreal DO,Walters J,Muthumani K,Shedlock DJ,de La VegaMA,Plyler R,Boyer J,Broderick KE,Yan J,Khan AS,Jones S,Bello A,Soule G,TranKN,He S,Tierney K,Qiu X,Kobinger GP,Sardesai NY,Weiner DB.Protective Efficacyand Long-Term Immunogenicity in Cynomolgus Macaques by Ebola VirusGlycoprotein Synthetic DNA Vaccines.J Infect Dis.2019Jan29；219(4):544-555；或Wong G,Audet J,Fernando L,Fausther-Bovendo H,Alimonti JB,Kobinger GP,QiuX.Immunization with vesicular stomatitis virus vaccine expressing the Ebolaglycoprotein provides sustained long-term protection inrodents.Vaccine.2014Sep 29；32(43):5722-9。也可以使用其他病毒)稀释至100TCID50/0.05ml，取50μl垂直悬滴入96孔板(血清、细胞对照除外)的各孔中；另取1.5ml 1000TCID50/0.05ml病毒于小离心管中，4℃暂存，待回测病毒滴度。
(3)将细胞培养板轻拍混匀，至37℃中和1h。
(4)病毒滴度回测
取4支小管，每管加0.9ml稀释液，吸取0.1ml的100TCID50/0.05ml病毒加入第1管中，混匀后作为100TCID50/0.05ml，依次10倍稀释至10TCID50/0.05ml；另取一块96孔板，将每个稀释度的病毒每孔加入0.1ml，并做8个复孔；同时留出4孔做为细胞对照孔，每孔加入0.1ml病毒稀释液。
(5)用消化液消化细胞，制备成2×105个/ml的细胞悬液，每孔分别加入0.1ml细胞悬液，混匀，放入35℃、5％CO2孵箱中孵育培养；测定荧光素值，以抑制50％病变的血清最高稀释度的倒数为终点效价，2天后判定最终结果。如果病毒回滴结果不在320～3200TCID50/0.05ml的范围内，实验无效，重复实验。
结果表明，上述制备的抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2对扎伊尔型EBOV实毒、苏丹型EBOV实毒、科特迪瓦型EBOV实毒的中和抗体效价均大于1:15000。
实施例4抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2的安全性检测
按照2015年版《中国药典》的要求，委托北京昭衍新药研究中心股份有限公司，严格按照2015年版《中国药典》附录中各检测内容的步骤，对实施例1和2制备得到的6批抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2安全性进行检测。
6批抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2均为无色或淡黄色透明液体或冻干品，纯度高于90％，无异常毒性，无菌，无热源，类A血型物质含量低于4μg/ml；通过免疫组化证实与正常人心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、肠组织器官没有交叉反应，证明制品没有抗人组织的成份，用于患者治疗是安全的。
实施例5抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2的稳定性检测
对实施例1和2制备得到的6批抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2稳定性进行检测。结果表明，置于4～8℃的6批抗EBOV特异性免疫球蛋白F(ab′)2原液放置36个月以上中和效价不减，有很好的稳定性。
实施例6抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2预防效果评价
将成年恒河猴(4-5岁，4-7Kg)随机分为2组，每组5只。在感染前1天通过腹腔注射方式以1mg F(ab′)2/Kg体重的剂量对恒河猴进行预防用药(实施例1制备的F(ab′)2)，对照组给予相同体积的PBS进行处理，将全部恒河猴以腹腔注射方式接种1000倍LD50剂量(5000PFU)的扎伊尔型/苏丹型/科特迪瓦型埃博拉病毒(MA-EBOV，USAMRIID/BALB/c-lab/COD/1976/Mayinga-MA-p3或者EBOV-Makona-C07或者GA-EBOV,VECTOR/C.porcellus-lab/COD/1976/Mayinga-GPA-p7，均由美国陆军传染病医学研究所提供)。每天称量体重并观察状态，连续称量16天，存活恒河猴再观察12天。结果表明，对照组全部死亡。治疗组存活率为4/5(80％)，体重减轻10％。可见，在病毒感染前以F(ab′)2进行预防，可有效保护宿主免受扎伊尔型/苏丹型/科特迪瓦型埃博拉病毒的攻击。
实施例7马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2治疗效果评价
将成年恒河猴(4-5岁，4-7Kg)随机分为2组，5只/组。以腹腔注射方式接种1000倍LD50剂量(5000PFU)的扎伊尔型/苏丹型/科特迪瓦型埃博拉病毒(MA-EBOV，USAMRIID/BALB/c-lab/COD/1976/Mayinga-MA-p3或者EBOV-Makona-C07或者GA-EBOV,VECTOR/C.porcellus-lab/COD/1976/Mayinga-GPA-p7)。分别在感染后1天通过腹腔注射方式以1mgF(ab′)2/Kg体重对感染猴进行治疗(实施例2制备的F(ab′)2)，每天2次，连续用3天，对照组在病毒感染后1天给予相同体积的PBS进行处理。每天称量体重并观察状态，连续称量16天，存活猴再观察12天。结果表明，对照组全部死亡。在病毒感染后1天进行治疗，治疗组所有猴均存活。可见，在病毒感染后以F(ab′)2进行治疗，可完全保护猴免受扎伊尔型/苏丹型/科特迪瓦型埃博拉病毒的致死性攻击。
实施例8免疫健康动物后的抗体消长规律
1、免疫健康动物
方案1：采用Prime-Boost免疫策略，每次均采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫合格的成年马匹，间隔18～23天，第一次免疫3mg实施例2中制备的重组痘苗病毒(不加佐剂)；第二次免疫4mg重组痘苗病毒(不加佐剂)；第三次免疫6mg重组痘苗病毒(不加佐剂)；第四次免疫9mg重组痘苗病毒(不加佐剂)；当免疫动物中和抗体效价达到1：10000时采集血浆，-70℃以下保存备用。
方案2：采用Prime-Boost免疫策略，每次均采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫合格的成年马匹，间隔18～23天，第一次免疫3mg实施例1中制备的VLP蛋白免疫原(加弗氏完全佐剂)；第二次免疫4mg昆虫表达的VLP疫苗抗原(加弗氏不完全佐剂)；第三次免疫6mg昆虫表达的VLP疫苗抗原(加弗氏不完全佐剂)；第四次免疫9mg昆虫表达的VLP疫苗抗原(加弗氏不完全佐剂)；当免疫动物中和抗体效价达到1：10000时采集血浆，-70℃以下保存备用。
方案3：采用Prime-Boost免疫策略，每次均采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫合格的成年马匹，间隔18～23天，第一次免疫3mg实施例1中制备的VLP蛋白免疫原(加206佐剂)；第二次免疫4mg VLP蛋白免疫原(加206佐剂)；第三次免疫6mg VLP蛋白免疫原(加206佐剂)；第四次免疫9mg VLP蛋白免疫原(加206佐剂)；当免疫动物中和抗体效价达到1：10000时采集血浆，-70℃以下保存备用。
方案4：采用Prime-Boost免疫策略，每次均采用皮下、肌肉、腹股沟淋巴结多点免疫经检疫合格的成年马匹，间隔18～23天，第一次免疫3mg实施例2中制备的重组痘苗病毒(不加佐剂)；第二次免疫4mg重组痘苗病毒(不加佐剂)；第三次免疫6mg昆虫表达的VLP疫苗抗原(加206佐剂)；第四次免疫9mg昆虫表达的VLP疫苗抗原(加206佐剂)；当免疫动物中和抗体效价达到1：10000时采集血浆，-70℃以下保存备用。
经测定，经4次免疫后14天采血，免疫马匹的平均几何效价方案4＞方案3＞方案1＞方案2，但均不低于1:10000。
2、免疫健康动物后抗体消长规律
方案1：一免疫后14天几何平均效价1:120-250；二免疫后14天几何平均效价1:1280-2560；三免疫后14天几何平均效价1:12800-25600；四免疫后14天几何平均效价1:25600-51200；
方案2：一免疫后14天几何平均效价1:65-80；二免疫后14天几何平均效价1:640-780；三免疫后14天几何平均效价1:6400-7800；四免疫后14天几何平均效价1:12800-15600；
方案3：一免疫后14天几何平均效价1:240-320；二免疫后14天几何平均效价1:2410-3230；三免疫后14天几何平均效价1:24100-32300；四免疫后14天几何平均效价1:48400-64600；
方案4：一免疫后14天几何平均效价1:250-510；二免疫后14天几何平均效价1:2560-5120；三免疫后14天几何平均效价1:25600-51200；四免疫后14天几何平均效价1:51200-102400。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所
<120> 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用
<130> KHP191117169.6
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2034
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actatgggag tgactggaat cctgcagctg ccaagagaca gattcaagag aacttccttc 60
ttcctgtggg tgatcatcct gttccagaga actttctcca tcccactggg agtgatccac 120
aactccactc tgcaggtgtc cgacgtggac aagctggtgt gcagagacaa gctgtcctcc 180
actaaccagc tgagatccgt gggactgaac ctggagggaa acggagtggc tactgacgtg 240
ccatccgtga ctaagagatg gggattcaga tccggagtgc caccaaaggt ggtgaactac 300
gaggctggag agtgggctga gaactgctac aacctggaga tcaagaagcc agacggatcc 360
gagtgcctgc cagctgctcc agacggaatc agaggattcc caagatgcag atacgtgcac 420
aaggtgtccg gaactggacc atgcgctgga gacttcgctt tccacaagga gggagctttc 480
ttcctgtacg acagactggc ttccactgtg atctacagag gaactacttt cgctgaggga 540
gtggtggctt tcctgatcct gccacaggct aagaaggact tcttctcctc ccacccactg 600
agagagccag tgaacgctac tgaggaccca tcctccggat actactccac tactatcaga 660
taccaggcta ctggattcgg agctcagcac tccactactc tgttcaagat cgacaacaac 720
actttcgtga gactggacag accacacact ccacagttcc tgttccagct gaacgacact 780
atccacctgc accagcagct gtccaacact actggaagac tgatctggac tctggacgct 840
aacatcaacg ctgacatcgg agagtgggct ttctgggaga acaagaagaa cctgtccgag 900
cagctgagag gagaggagct gtccttcgag gctctgtccc tgaacgagac tgaggacgac 960
gacgctgctt cctccagaat cactaaggga agaatctccg acagagctac tagacagtac 1020
tccgacctgg tgccaaagaa cccaccagga atggtgccac tgcacatccc agagggagag 1080
actactctgc catcccagaa ctccactgag ggaagaagag tgtccgtgaa cactcaggag 1140
actatcactg agactgctgc tactatcatc ggaactaacg gaaaccacat gcagatctcc 1200
actatcggaa tcagaccatc ctcctcccag atcccatcct cctccccaac tactgctcca 1260
tccccagagg ctcagactcc aactactcac acttccggac catccgtgat ggctactgag 1320
gagccaacta ctccaccagg atcctcccca ggaccaacta ctccaactac tctgccagag 1380
cagcacactg ctgcttccgc tatcccaaga gctgtgcacc cagacgagct gtccggacca 1440
ggattcctga ctaacactat cagaggagtg actaacctgc tgactggatc cagaagaaag 1500
agaagagacg tgactccaaa cactcagcca aagtgcaacc caaacctgca ctactggact 1560
gctctggacg agggagctgc tatcggactg gcttggatcc catacttcgg accagctgct 1620
gagggaatct acactgaggg aatcatggag aaccagaacg gactgatctg cggactgaga 1680
cagctggcta acgagactac tcaggctctg cagctgttcc tgagagctac tactgagctg 1740
agaactttct ccatcctgaa cagaaaggct atcgacttcc tgctgcagag atggggagga 1800
acttgccaca tcctgggacc agactgctgc atcgagccac aggactggac taagaacatc 1860
actgacaaga tcgaccagat catccacgac ttcgtggaca acaacctgcc aaaccagaac 1920
gacggatcca actggtggac tggatggaag cagtgggtgc cagctggaat cggaatcact 1980
ggagtgatca tcgctatcat cgctctgctg tgcatctgca agttcatgct gtaa 2034
<210> 2
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagaagag tgatcctgcc aactgctcca ccagagtaca tggaggctat ctacccagct 60
agatccaact ccactatcgc tagaggagga aactccaaca ctggattcct gactccagag 120
tccgtgaacg gagacactcc atccaaccca ctgagaccaa tcgctgacga cactatcgac 180
cacgcttccc acactccagg atccgtgtcc tccgctttca tcctggaggc tatggtgaac 240
gtgatctccg gaccaaaggt gctgatgaag cagatcccaa tctggctgcc actgggagtg 300
gctgaccaga agacttactc cttcgactcc actactgctg ctatcatgct ggcttcctac 360
actatcactc acttcggaaa ggctaacaac ccactggtga gagtgaacag actgggacag 420
ggaatcccag accacccact gagactgctg agaatgggaa accaggcttt cctgcaggag 480
ttcgtgctgc caccagtgca gctgccacag tacttcactt tcgacctgac tgctctgaag 540
ctggtgactc agccactgcc agctgctact tggactgacg agactccatc caacctgtcc 600
ggagctctga gaccaggact gtccttccac ccaaagctga gaccagtgct gctgccagga 660
agagctggaa agaagggatc caactccgac ctgacttccc cagacaagat ccaggctatc 720
atgaacttcc tgcaggacct gaagatcgtg ccaatcgacc caactaagaa catcatggga 780
atcgaggtgc cagagctgct ggtgcacaga ctgactggaa agaagactac tactaagaac 840
ggacagccaa tcatcccaat cctgctgcca aagtacatcg gactggaccc actgtcccag 900
ggagacctga ctatggtgat cactcaggac tgcgactcct gccactcccc agcttccctg 960
ccaccagtga acgagaagta a 981
<210> 3
<211> 5459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataaagattg tgcaatgctt ttgcgatcaa taaatggatc acaaccagta tctcttaacg 60
atgttcttcg cagatgatga ttcatttttt aagtatttgg ctagtcaaga tgatgaatct 120
tcattatctg atatattgca aatcactcaa tatttagact ttctgttatt attattgatc 180
caatcaaaaa ataaattaga agccgtgggt cattgttatc aatctctttc agaggaatac 240
agacaattga caaaattcac agactctcaa gattttataa aactgtttaa caaggtccct 300
attgttacag atggaagggt caaacttaat aaaggatatt tgttcgactt tgtgattagt 360
ttgatgcgat tcaaaaaaga atcctctcta gctaccaccg caatagatcc tattagatac 420
atagatcctc gtcgcgaaat cgcattttct aacgtgatgg atatattaaa gtcgaataaa 480
gtgaacaata attaattctt aaaaattgaa attttatttt ttttttttgg aatataaata 540
actatgggag tgactggaat cctgcagctg ccaagagaca gattcaagag aacttccttc 600
ttcctgtggg tgatcatcct gttccagaga actttctcca tcccactggg agtgatccac 660
aactccactc tgcaggtgtc cgacgtggac aagctggtgt gcagagacaa gctgtcctcc 720
actaaccagc tgagatccgt gggactgaac ctggagggaa acggagtggc tactgacgtg 780
ccatccgtga ctaagagatg gggattcaga tccggagtgc caccaaaggt ggtgaactac 840
gaggctggag agtgggctga gaactgctac aacctggaga tcaagaagcc agacggatcc 900
gagtgcctgc cagctgctcc agacggaatc agaggattcc caagatgcag atacgtgcac 960
aaggtgtccg gaactggacc atgcgctgga gacttcgctt tccacaagga gggagctttc 1020
ttcctgtacg acagactggc ttccactgtg atctacagag gaactacttt cgctgaggga 1080
gtggtggctt tcctgatcct gccacaggct aagaaggact tcttctcctc ccacccactg 1140
agagagccag tgaacgctac tgaggaccca tcctccggat actactccac tactatcaga 1200
taccaggcta ctggattcgg agctcagcac tccactactc tgttcaagat cgacaacaac 1260
actttcgtga gactggacag accacacact ccacagttcc tgttccagct gaacgacact 1320
atccacctgc accagcagct gtccaacact actggaagac tgatctggac tctggacgct 1380
aacatcaacg ctgacatcgg agagtgggct ttctgggaga acaagaagaa cctgtccgag 1440
cagctgagag gagaggagct gtccttcgag gctctgtccc tgaacgagac tgaggacgac 1500
gacgctgctt cctccagaat cactaaggga agaatctccg acagagctac tagacagtac 1560
tccgacctgg tgccaaagaa cccaccagga atggtgccac tgcacatccc agagggagag 1620
actactctgc catcccagaa ctccactgag ggaagaagag tgtccgtgaa cactcaggag 1680
actatcactg agactgctgc tactatcatc ggaactaacg gaaaccacat gcagatctcc 1740
actatcggaa tcagaccatc ctcctcccag atcccatcct cctccccaac tactgctcca 1800
tccccagagg ctcagactcc aactactcac acttccggac catccgtgat ggctactgag 1860
gagccaacta ctccaccagg atcctcccca ggaccaacta ctccaactac tctgccagag 1920
cagcacactg ctgcttccgc tatcccaaga gctgtgcacc cagacgagct gtccggacca 1980
ggattcctga ctaacactat cagaggagtg actaacctgc tgactggatc cagaagaaag 2040
agaagagacg tgactccaaa cactcagcca aagtgcaacc caaacctgca ctactggact 2100
gctctggacg agggagctgc tatcggactg gcttggatcc catacttcgg accagctgct 2160
gagggaatct acactgaggg aatcatggag aaccagaacg gactgatctg cggactgaga 2220
cagctggcta acgagactac tcaggctctg cagctgttcc tgagagctac tactgagctg 2280
agaactttct ccatcctgaa cagaaaggct atcgacttcc tgctgcagag atggggagga 2340
acttgccaca tcctgggacc agactgctgc atcgagccac aggactggac taagaacatc 2400
actgacaaga tcgaccagat catccacgac ttcgtggaca acaacctgcc aaaccagaac 2460
gacggatcca actggtggac tggatggaag cagtgggtgc cagctggaat cggaatcact 2520
ggagtgatca tcgctatcat cgctctgctg tgcatctgca agttcatgct gtaatttttg 2580
taaaaattga aattttattt tttttttttg gaatataaat attacttctc gttcactggt 2640
ggcagggaag ctggggagtg gcaggagtcg cagtcctgag tgatcaccat agtcaggtct 2700
ccctgggaca gtgggtccag tccgatgtac tttggcagca ggattgggat gattggctgt 2760
ccgttcttag tagtagtctt ctttccagtc agtctgtgca ccagcagctc tggcacctcg 2820
attcccatga tgttcttagt tgggtcgatt ggcacgatct tcaggtcctg caggaagttc 2880
atgatagcct ggatcttgtc tggggaagtc aggtcggagt tggatccctt ctttccagct 2940
cttcctggca gcagcactgg tctcagcttt gggtggaagg acagtcctgg tctcagagct 3000
ccggacaggt tggatggagt ctcgtcagtc caagtagcag ctggcagtgg ctgagtcacc 3060
agcttcagag cagtcaggtc gaaagtgaag tactgtggca gctgcactgg tggcagcacg 3120
aactcctgca ggaaagcctg gtttcccatt ctcagcagtc tcagtgggtg gtctgggatt 3180
ccctgtccca gtctgttcac tctcaccagt gggttgttag cctttccgaa gtgagtgata 3240
gtgtaggaag ccagcatgat agcagcagta gtggagtcga aggagtaagt cttctggtca 3300
gccactccca gtggcagcca gattgggatc tgcttcatca gcacctttgg tccggagatc 3360
acgttcacca tagcctccag gatgaaagcg gaggacacgg atcctggagt gtgggaagcg 3420
tggtcgatag tgtcgtcagc gattggtctc agtgggttgg atggagtgtc tccgttcacg 3480
gactctggag tcaggaatcc agtgttggag tttcctcctc tagcgatagt ggagttggat 3540
ctagctgggt agatagcctc catgtactct ggtggagcag ttggcaggat cactcttctc 3600
ataggaaaga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tataaaaatt gaaattttat 3660
tttttttttt tggaatataa ataatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 3720
tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 3780
agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 3840
agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 3900
gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 3960
acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 4020
tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 4080
aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 4140
tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 4200
aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 4260
ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 4320
acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 4380
gcatggacga gctgtacaag taatttttgt ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 4440
ttatatctaa aaaactaaaa ataaacattg attaaatttt aatataatac ttaaaaatgg 4500
atgttgtgtc gttagataaa ccgtttatgt attttgagga aattgataat gagttagatt 4560
acgaaccaga aagtgcaaat gaggtcgcaa aaaaactgcc gtatcaagga cagttaaaac 4620
tattactagg agaattattt tttcttagta agttacagcg acacggtata ttagatggtg 4680
ccaccgtagt gtatatagga tctgctcccg gtacacatat acgttatttg agagatcatt 4740
tctataattt aggagtgatc atcaaatgga tgctaattga cggccgccat catgatccta 4800
ttttatatgg attgcgtgat gtgactctag tgactcggtt cgttgatgag gaatatctac 4860
gatccatcaa aaaacaactg catccttcta agattatttt aatttctgat gtgagatcca 4920
aacgaggagg aaatgaacct agtacggcgg atttactaag taattacgct ctacaaaatg 4980
tcatgattag tattttatac cccgtggcat ctagtcttaa atggagatgc ccgtttccag 5040
atcaatggat caaggacttt tatatcccac acggtaataa aatgttacaa ccttttgctc 5100
cttcatattc agctgaaatg agattattaa gtatttatac cggtgagaac atgagactga 5160
ctagagttac caaatcagac gctgtaaatt atgaaaaaaa gatgtactac cttaataaga 5220
tcgtccgtaa caaagtagtt gttaactttg attatcctaa tcaggaatat gactattttc 5280
acatgtactt tatgctgagg accgtgtact gcaataaaac atttcctact actaaagcaa 5340
aggtactatt tctacaacaa tctatatttc gtttcttaaa tattccaaca acatcaactg 5400
aaaaagttag tcatgaacca atacaacgta aagtatctag caaagattct atgtctaaa 5459

Claims (12)

1.一种分离的聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸包含如下序列或由其组成：
i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.一种分离的聚核苷酸，其特征在于，所述聚核苷酸包含如下序列或由其组成：
i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.含有权利要求1和/或2所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
4.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包含权利要求1和/或2所述聚核苷酸编码的蛋白质。
5.埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，其特征在于，其是利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备包含权利要求1和2所述聚核苷酸的重组杆状病毒，将收获的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养转染的细胞，收集细胞培养上清，纯化后与佐剂混合得到的；
优选地，昆虫细胞-杆状病毒表达系统所使用的表达载体为pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT A、pFastBacHT B或pFastBacHT C，更优选pFastBacDual；
昆虫细胞为Sf21、Sf9或Mimic Sf9，更优选Sf9；
佐剂为206佐剂、弗氏完全或不完全佐剂，更优选206佐剂。
6.埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将埃博拉病毒基因GP和VP40克隆于同一昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDual上，转化大肠杆菌DH10 Bac感受态细胞，提取阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒，用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞Sf9，拯救获得重组杆状病毒，将获得的重组杆状病毒接种昆虫细胞Sf9，27-30℃静止培养48-72h后，或27-30℃50-100rpm摇床振荡培养24-48h后收获细胞上清液，即得到埃博拉病毒样颗粒抗原原液；
(2)上述原液使用300kDa纤维柱浓缩后，采用蔗糖密度梯度离心，在蔗糖密度30％和60％之间得到纯化的病毒样颗粒；
(3)将上述纯化的病毒样颗粒与206佐剂按1：1体积比混合均匀；
其中，基因GP采用权利要求1中所述聚核苷酸的定义；基因VP40采用权利要求2中所述聚核苷酸的定义。
7.表达埃博拉病毒GP和VP40蛋白的重组痘苗病毒，其特征在于，其是将包含权利要求1和2所述聚核苷酸的转移质粒载体与痘苗病毒载体共转染真核细胞，培养转染的细胞，收集细胞培养上清，纯化后得到的；
优选地，所述痘苗病毒载体为山羊痘疫苗、痘苗病毒安哥拉株或痘苗病毒天坛株，更优选痘苗病毒天坛株；
转移质粒载体为pVAX1或pBluescipt，更优选pBluescipt；
真核细胞为Vero、MRC-5或MDCK，更优选Vero。
8.表达埃博拉病毒GP和VP40蛋白的重组痘苗病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以TK基因上、下游同源臂为基础构建转移质粒载体，中间依次插入三个独立的以PE/L为启动子和以T5nT为终止子的外源基因表达盒，分别表达序列优化后的埃博拉病毒结构蛋白GP和VP40基因及两侧含有Loxp基因的筛选标记蛋白EGFP基因，转移质粒载体pBluescipt多克隆位点内核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；将转移质粒载体与痘苗病毒天坛株共转染真核细胞Vero，获得表达埃博拉病毒样颗粒和绿色荧光蛋白的重组痘苗病毒；
2)将携带Cre酶编码基因的真核表达质粒pVAX1与步骤1)得到的重组痘苗病毒共转染真核细胞，培养转染的细胞，收集细胞上清液，蚀斑纯化获得表达埃博拉病毒GP和VP40蛋白的重组痘苗病毒纯品，用重组痘苗病毒纯品感染真核细胞，收集上清液，即得到埃博拉病毒样颗粒抗原原液；
3)上述原液使用300kDa纤维柱浓缩后，采用蔗糖密度梯度离心，在蔗糖密度30％和60％之间得到纯化的重组痘苗病毒；
其中，GP基因采用权利要求1中所述聚核苷酸的定义；VP40基因采用权利要求2中所述聚核苷酸的定义。
9.权利要求4所述免疫原性组合物，或权利要求5所述埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或按照权利要求6所述方法制备得到的埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或权利要求7所述重组痘苗病毒，或者按照权利要求8所述方法构建得到的重组痘苗病毒在制备用于治疗或预防埃博拉病毒感染的药物中的应用；
所述埃博拉病毒包括扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒。
10.通用埃博拉病毒病免疫球蛋白的制备方法，其特征在于，用权利要求5所述埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或按照权利要求6所述方法制备得到的埃博拉病毒蛋白质亚单位疫苗，或权利要求7所述重组痘苗病毒，或者按照权利要求8所述方法构建得到的重组痘苗病毒接种实验动物，采集血浆，从血浆中分离纯化IgG蛋白，经胃蛋白酶酶切，酶切产物纯化后即得通用埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2；
优选地，所述实验动物选自非人灵长类动物、马属动物；所述马属动物包括马、驴及其杂交后代；更优选地，所述非人灵长类动物为猴。
11.按照权利要求10所述方法制备得到的通用埃博拉病毒病免疫球蛋白。
12.权利要求11所述通用埃博拉病毒病免疫球蛋白在制备用于预防和/或治疗埃博拉病毒病感染及其所致疾病的药物中的应用；
所述埃博拉病毒包括扎伊尔型、苏丹型、科特迪瓦型埃博拉病毒。
CN202010121145.2A 2020-02-26 2020-02-26 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用 Active CN111518815B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010121145.2A CN111518815B (zh) 2020-02-26 2020-02-26 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010121145.2A CN111518815B (zh) 2020-02-26 2020-02-26 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111518815A true CN111518815A (zh) 2020-08-11
CN111518815B CN111518815B (zh) 2021-11-26

Family

ID=71910301

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010121145.2A Active CN111518815B (zh) 2020-02-26 2020-02-26 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111518815B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113416714A (zh) * 2021-06-24 2021-09-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070082011A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Hawaii Biotech, Inc. Recombinant proteins from filoviruses and their use
CN104829710A (zh) * 2015-03-26 2015-08-12 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种抗埃博拉病毒的免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法
CN104946646A (zh) * 2014-03-25 2015-09-30 中国医学科学院基础医学研究所 用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、dna 分子、蛋白及应用
CN105254755A (zh) * 2014-12-01 2016-01-20 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
CN106636014A (zh) * 2015-10-28 2017-05-10 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于埃博拉病毒样颗粒的体外和体内新型感染模型
CN107034225A (zh) * 2017-05-04 2017-08-11 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法
CN107417788A (zh) * 2016-05-23 2017-12-01 中国科学院上海巴斯德研究所 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070082011A1 (en) * 2005-10-07 2007-04-12 Hawaii Biotech, Inc. Recombinant proteins from filoviruses and their use
CN104946646A (zh) * 2014-03-25 2015-09-30 中国医学科学院基础医学研究所 用于预防和/或治疗埃博拉病毒性出血热的小核酸分子、dna 分子、蛋白及应用
CN105254755A (zh) * 2014-12-01 2016-01-20 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 马抗埃博拉病毒病免疫球蛋白F(ab’)2及其制备方法
CN104829710A (zh) * 2015-03-26 2015-08-12 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种抗埃博拉病毒的免疫球蛋白F(ab′)2及其制备方法
CN106636014A (zh) * 2015-10-28 2017-05-10 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于埃博拉病毒样颗粒的体外和体内新型感染模型
CN107417788A (zh) * 2016-05-23 2017-12-01 中国科学院上海巴斯德研究所 抗埃博拉病毒的中和性单克隆抗体
CN107034225A (zh) * 2017-05-04 2017-08-11 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 制备埃博拉病毒糖蛋白与基质蛋白融合突变体的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREA MARZI ET AL.: "Vesicular Stomatitis Virus–Based Ebola Vaccines With Improved Cross-Protective Efficacy", 《THE JOURNAL OF INFECTIOUS DISEASES》 *
JAMES DUEHR ET AL.: "Novel Cross-Reactive Monoclonal Antibodies against Ebolavirus Glycoproteins Show Protection in a Murine Challenge Model", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
ZHIHAI LI ET AL.: "Rational design of a triple-type human papillomavirus vaccine by compromising viral-type specificity", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
孙鹏艳等: "埃博拉病毒GP和VP40蛋白在哺乳动物细胞中的共表达及病毒样颗粒装配", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113416714A (zh) * 2021-06-24 2021-09-21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 一种表达埃博拉gp蛋白的重组病毒及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111518815B (zh) 2021-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2021254327A1 (zh) 一种包膜替换型病毒载体疫苗及其构建方法
US11098084B2 (en) Virus-like particles and methods of use
CN112618707B (zh) 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
EP2370455B1 (en) Virus like particle compositions and methods of use
FI110438B (fi) Menetelmä mutanttiherpesviruksen valmistamiseksi
WO2022218325A1 (zh) 一种基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒毒株及其构建方法和应用
CN104480143B (zh) 一种表达脊髓灰质炎病毒样颗粒蛋白的载体及脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法
CN113201507B (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
EP3342865B1 (en) Ebola virus disease vaccine taking human replication deficient adenovirus as vector
UA73712C2 (en) Multi-envelope vaccines against hiv, method for generating cellular and/or humoral immune response against hiv in mammals, bifunctional plasmid used for producing recombinant viruses comprising anti-hiv vaccine
CN107190013B (zh) 一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗
CN109880838B (zh) 一种分泌表达猪o型口蹄疫病毒多表位基因的重组病毒及其制备方法和应用
CN109804075A (zh) 用于疫苗应用的复制缺陷型腺病毒载体的组合物和方法
CN112011521A (zh) 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
WO2015167710A1 (en) Adenoviral vector-based vaccine against enterovirus infection
Cheng et al. Incorporation of GM-CSF or CD40L enhances the immunogenicity of hantaan virus-like particles
CN117551677A (zh) 一种以5型腺病毒为载体的猴痘病毒特异性融合蛋白疫苗
CN111518815B (zh) 通用埃博拉病毒病免疫球蛋白及其制备方法与应用
Xu et al. Generation and evaluation of recombinant baculovirus coexpressing GP5 and M proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus type 1
CN101586106A (zh) Hiv-1亚型间(c/b’)基因组和其用途
CN105296507B (zh) 拉沙热病毒样颗粒、其制备方法与应用
Li et al. Development and characterization of Rift Valley fever virus-like particles
CN110462030B (zh) 强毒性肠道病毒71的稳定生产及其利用
EP4036226A1 (en) Attenuated african swine fever virus and its use as a vaccine
CN115044562A (zh) 一种嵌合表达分子佐剂的重组狂犬病病毒及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant