CN107190013B - 一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够表达寨卡病毒Env蛋白，并且密码子得到优化的核苷酸序列，所述序列可以与密码子得到优化的寨卡病毒prM蛋白以及prM蛋白内源信号肽融合，插入穿梭载体pDC316后，与辅助载体pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，包装出以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体的重组腺病毒，所述重组腺病毒载体能够在感染细胞中高效表达寨卡病毒的包膜蛋白。插入所述核苷酸的重组腺病毒作为疫苗单次免疫动物后即可快速诱发强烈的体液免疫和细胞免疫反应。所述重组腺病毒载体寨卡疫苗可以大规模快速制备，能够用于寨卡疫情爆发时大规模人群的应急接种及平时人群的预防性免疫。

Description

一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗

技术领域

本发明公开了一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗，本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

寨卡病毒(Zika Virus，ZIKV)是一种单股正链RNA病毒，与黄热病毒(YellowFever)、登革热病毒(Dengue Fever)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、森林脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)和西尼罗河病毒(West NileVirus，WNV)等同属于黄病毒(Flavivirus)科黄病毒属。ZIKV于1947年首次发现于乌干达寨卡森林的猴子身上，主要通过伊蚊传播，少数情况下也可以通过母婴传播、性传播和输血传播。ZIKV最初仅在少数地区有小规模的爆发和流行:1952年，在乌干达、尼日利亚和印度进行的血清流行病学调查显示人类有感染寨卡病毒；1951-1983年，寨卡病毒在非洲和亚洲多个国家传播；2007年，大洋洲的密克罗尼西亚爆发了寨卡疫情，为首次非洲和亚洲之外的爆发；2013-2014年，法属波利尼西亚、复活节岛、库克群岛、法属新喀里多尼亚有疫情的小规模爆发。2015年美洲疫情为首次大规模的寨卡疫情爆发，短时间内便席卷南美，后又扩散至北美和世界其他地区，全球累计有73个国家和地区有疫情报告，根据泛美卫生组织(PanAmerican Health Organization，PAHO)的数据，截止2017年3月23日，美洲各地政府累计报告确诊病例1003509例。

大部分ZIKV的感染没有明显的症状或者仅有发热、头痛、皮疹、关节痛等轻微症状，这也是之前ZIKV并未受到国际社会重视的原因之一。但在此次美洲疫情的流行中，研究人员发现寨卡感染也能够导致非常严重的疾病：孕妇感染导致的新生儿小头畸形及其他形式的脑部畸形，成年人的Guillain-Barre综合症，近期的研究还发现病毒可以长达半年时间存在于精液等体液中，而且具有传染性；此外，动物模型的研究也发现ZIKV能够损害雄性小鼠的生殖系统。

ZIKV基因组的长度在11Kb左右，所编码的10个蛋白被翻译为一条多肽链，然后经由宿主和病毒编码的蛋白酶切割为3个结构蛋白(衣壳蛋白(Capsid，C)、前膜/膜蛋白(Premembrane/Membrane protein，prM/M)和包膜蛋白(Envelope，E))和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。基于NS5基因序列的遗传分析认为：ZIKV可以分为三个系(Lineage)，东非系、西非系和亚洲系。ZIKV只有一个血清型，因此，单价疫苗即有可能形成针对当前所有毒株的防护。

ZIKV与其他黄病毒属的成员具有相似的基因结构和病毒结构，其prM/M蛋白和Env蛋白位于病毒的表面，其中Env蛋白负责病毒与其细胞膜上受体的结合及病毒与细胞膜的融合，是主要的保护性抗原。尽管已经有针对黄热病毒、日本脑炎病毒、登革热病毒等其他黄病毒属成员的上市疫苗，但到目前为止还没有获得批准的针对ZIKV的疫苗，甚至在2015年南美疫情大爆发之前，科学家对机体应对ZIKV的保护性免疫反应也知之甚少。疫情爆发后，WHO在寨卡疫苗产品特征(Target Product Profile for ZIKV vaccines，TPP)文件中对ZIKV疫苗及疫苗的研发提出了建议和要求。ZIKV疫苗需要满足针对大规模人群进行的应急免疫，需要能够快速产生保护性免疫反应，此外，疫苗的优先人群是怀孕的妇女和育龄妇女，因此，疫苗要有足够的安全性来满足特定人群的需要。目前全世界正在研发的ZIKV疫苗有30多个，仅美国NIH就在2016年获得国会两亿美元的拨款用于多种ZIKV疫苗的研发。根据疫苗平台的不同，在研的ZIKV疫苗主要有五种类型：ZIKV灭活病毒疫苗、ZIKV重组亚单位疫苗、ZIKV减毒疫苗(包括嵌合疫苗)、病毒载体疫苗和核酸疫苗(mRNA/DNA)。每种类型都有各自的优点和缺点：灭活ZIKV疫苗的优点在于安全性高，适合孕妇和儿童等特定人群的使用，之前已经有其它获批的灭活黄病毒类疫苗上市，但缺点在于需要多次免疫才能产生足够的保护性免疫反应，不利于大规模人群应急免疫的使用；重组亚单位疫苗也具有安全性高的优点，但其缺点也在于需要多次免疫，此外，目前尚未有获得批准的黄病毒类重组亚单位疫苗。减毒疫苗的优点在于仅1次免疫就可以产生很高的免疫反应，减毒的黄病毒疫苗已经使用多年，但对于特定人群(孕妇、老人和儿童等免疫低下者)，考虑到其安全性，减毒疫苗要慎用；病毒载体疫苗，如以腺病毒或水泡性口炎病毒为载体的疫苗，具有单次免疫就可迅速产生较高免疫反应的优点，此类疫苗在埃博拉疫苗的研发期间积累了大量的人体安全性数据，尽管目前没有上市的此类疫苗，但其还是具有很高的临床应用前景；核酸疫苗具有制备和储存上简单、快速和稳定的优势，但其缺点在于人体的免疫原性低，目前也没有获批上市的核酸疫苗。在美国，ZIKV的灭活疫苗与核酸疫苗(包括DNA疫苗和mRNA疫苗)已经获得FDA的批准率先进入临床I期的研究，其中DNA疫苗已经于2017年3月份进入临床Ⅱ期的研究。

复制缺陷型腺病毒的大规模制备具有成本较低和工艺简单的优点，其宿主范围广、外源蛋白表达水平高、不整合到染色体中，无插入致突变性，因此，近年来越来越多的被应用于基因治疗和疫苗的研发中。本发明中使用的AdMax腺病毒系统是由Frank Graham在1999年创建，由加拿大的Micobix公司开发成为一种腺病毒载体包装系统。它本身不具备增殖能力，需要通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方便快捷的腺病毒包装系统之一。

虽然AdMax系统具有出毒快，产率高等优点。但作为一种有效的活病毒载体疫苗，除了载体本身的优势，如何使插入的外源目标蛋白更有效地表达至关重要。如果外源蛋白的表达水平过低，需通过增加免疫剂量来获得有效的免疫效果，这样必然会增加载体对接种者的不良影响。因此，通过对目标蛋白的基因进行优化，使其能够更高效的正确表达，是提高疫苗免疫效果的一种有效方法。

基于现有技术领域在寨卡病毒病预防接种上的现实需求，及目前现有疫苗在预防效果上效率不高，以及AdMax系统在应用上存在的技术难题，本申请人欲通过对相关蛋白进行密码子优化，并对抗原的表达形式进行合理的设计，使其在真核细胞中的表达量明显增高，并提供具有更强免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗体的重组腺病毒载体寨卡病毒病疫苗。

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种能够表达寨卡病毒Env蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如SEQ ID NO:1所示的Env蛋白编码序列。

在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列还含有如SEQ ID NO:2所示的编码前膜蛋白的核苷酸序列。

在一个更为优选的实施方案中，所述编码前膜蛋白的核苷酸序列位于所述核苷酸序列的5’端。

在一个尤为优选的实施方案中，在所述编码前膜蛋白的5’端还含有如SEQ ID NO:3所示的前膜蛋白内源信号肽密码子优化的核苷酸序列。

在一个最为优选的实施方案中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述核苷酸序列表达出的融合多肽为ZIKV prM蛋白内源信号肽-prM-Env融合多肽，即Sig-prM-Env。

其次，本发明还提供了一种能够表达寨卡病毒前膜蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如SEQ ID NO:2所示的前膜蛋白编码序列

第三，本发明还提供了一种含有如上所述核苷酸序列的穿梭质粒载体，所述载体为pDC316。

第四，本发明提供了一种能够表达如上所述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体来源于AdMax腺病毒系统。

第五，本发明提供了如上所述的人复制缺陷重组腺病毒载体在制备预防寨卡病毒病疫苗中的应用。

最后，本发明提供了一种制备可表达ZIKV Env蛋白的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含有如前任一所述核苷酸序列的穿梭质粒载体；

(2)将步骤(1)所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；

(3)培养步骤(2)所述宿主细胞；

(4)收获从步骤(3)所述细胞释放的人复制缺陷重组腺病毒。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述载体为pDC316。

在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGlox_E1,3Cre。

在又一个优选的实施方案中，步骤(3)所述细胞为HEK 293细胞。

在又一个优选的实施方案中，在步骤(4)中采用Benzonase消化核酸后通过Source30Q柱层析法对重组腺病毒进行纯化。

本发明提供的Env密码子优化核苷酸序列或所述的prM蛋白内源信号肽-prM-Env融合多肽(Sig-prM-Env)密码子优化核苷酸序列插入穿梭载体pDC316后，与辅助载体pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，包装出以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体的重组腺病毒，该重组腺病毒携带有密码子经过优化的亚洲型寨卡病毒毒株MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015(GeneBank Accession No KU647676)的包膜糖蛋白(Envelope，Env)基因或者该株病毒prM蛋白内源信号肽-prM-Env融合多肽的基因。携带上述基因的重组质粒载体和重组腺病毒载体能够在转染/感染细胞中高效表达寨卡病毒的包膜蛋白，插入所述核苷酸的重组腺病毒作为疫苗免疫动物后能够快速诱发针对寨卡病毒包膜蛋白的体液免疫和细胞免疫反应。重组腺病毒载体寨卡病毒病疫苗可以进行大规模的快速制备，具有单次注射即可诱发强烈免疫反应的特点，能够用于寨卡疫情爆发时大规模人群的应急接种及平时人群的预防性免疫。

附图说明

图1A.穿梭质粒pDC316结构示意图；

图1B.重组穿梭质粒pDC316-Env ori结构示意图；

图1C.pDC316-Env opt结构示意图；

图1D.pDC316-Sig-prM-Env opt结构示意图；

图2.重组穿梭质粒体外表达Env蛋白的Western blot检测图谱；

图3.重组腺病毒载体ZIKV疫苗中目标序列的扩增鉴定；

图4.重组腺病毒载体ZIKV疫苗表达ZIKV Env蛋白的Western blot检测图谱；

图5.Source 30Q柱层析纯化重组腺病毒载体ZIKV疫苗的层析图谱；

图6.重组腺病毒载体ZIKV疫苗免疫小鼠四周后血清Env特异性IgG抗体水平和血清prM特异性IgG抗体水平；

图7.细胞内细胞因子染色流式细胞术检测ZIKV疫苗免疫小鼠脾细胞IFNγ和IL-2分泌水平的统计分析图；

图8.ELISPOT检测ZIKV疫苗免疫小鼠脾细胞IFNγ和IL-2分泌水平统计分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1：以人复制缺陷腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗的制备

1.ZIKV prM内源信号肽密码子序列、prM蛋白密码子序列及Env蛋白密码子序列的优化及合成。

使用软件Upgene(Gao,W.,Rzewski,A.,Sun,H.,Robbins,P.D.,&Gambotto,A.(2004).UpGene:Application of a web-based DNA codon optimizationalgorithm.Biotechnol Prog,20(2),443-448.doi:10.1021/bp0300467)对2015年在加勒比地区Martinique爆发流行时分离到的ZIKV毒株MRS_OPY_Martinique_PaRi_2015(GeneBank Accession No KU647676)的ZIKV prM内源信号肽密码子序列、prM蛋白密码子序列及Env蛋白密码子序列进行优化，使其更适合在哺乳动物细胞中进行表达。优化后的ZIKV prM内源信号肽密码子序列见SEQ ID NO.3，按照该序列进行寡核苷酸片段的合成；优化后的prM蛋白密码子序列见SEQ ID NO.2，按照该序列进行基因的合成；优化后Env蛋白密码子序列见SEQ ID NO.1，将组织纤溶酶原激活物信号肽tPA的编码序列置于其5’端，并在翻译起始密码子前面加入Kozak序列，进行基因的合成；优化后的ZIKV prM蛋白内源信号肽-prM-Env-融合多肽(Sig-prM-Env)的密码子序列见SEQ ID NO.4，按照该序列进行该融合多肽编码序列的构建。

2.重组穿梭载体的构建及ZIKV Env蛋白的表达鉴定。

2.1载体构建

将合成的tPA信号肽-Env原始序列或者tPA信号肽-Env密码子优化序列使用NcoI和SalI进行双酶切，回收酶切产物，将其与NcoI和SalI双酶切的AdMax腺病毒系统(加拿大Microbix Biosystems Inc.)的穿梭质粒pDC316(结构如图1A所示)进行连接，连接产物转化DH5α感受态，涂布Amp^r LB平板，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。测序正确的质粒命名为pDC316-Env ori(原始序列)或者pDC316-Env opt(优化序列)，质粒图谱如图1B和1C所示。

以合成的寡核苷酸序列P1和P2为引物，重组穿梭质粒pDC316-Env opt为模板，使用Q5DNA聚合酶(NEB)扩增出线状序列L-pDC316-Env opt，使用NcoI单切该序列后回收酶切产物；以合成的寡核苷酸P3和P4为引物，合成的密码子优化的prM为模板，使用Q5DNA聚合酶(NEB)扩增出S-prM序列；以合成的寡核苷酸P5和P4为引物，S-prM序列为模板，使用Q5DNA聚合酶(NEB)扩增出Sig-prM序列，使用序列NcoI单切该序列，然后将其与上述NcoI单切的L-pDC316-Env进行连接，连接产物转化DH5α感受态，涂布Amp^r LB平板，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。测序正确的质粒命名为pDC316-Sig-prM-Env opt，其插入有ZIKV prM蛋白内源信号肽-prM-Env-融合多肽(Sig-prM-Env)的优化密码子序列，质粒图谱如图1D所示。pDC316-Sig-prM-Env opt构建所使用的引物及其序列如下所示：

P1：atccgctgcattggtgtctcgaac；

P2：ctatccatggccatggtggcggcaagcttagatc；

P3：atctgttgggatcgtcgggcttctccttaccacggcgatggcagctgaggtgacccgtcgc；

P4：ggaataggcgggggcg；

P5：ctatccatgggcgctgagacatctgttgggatcgtcggg；

2.2重组穿梭质粒pDC316-Env ori、pDC316-Env opt和pDC316-Sig-prM-Env opt表达ZIKV Env蛋白的体外鉴定。

293T细胞的转染：转染前一天，将293T细胞以1×10⁶细胞/孔接种6孔板，在细胞培养箱中培养至第二天，细胞丰度大约在80％左右，培养基更换为0.5ml/孔的新鲜培养基(MEM+10％FBS)。分别将4μg的无关质粒、pDC316-Env ori、pDC316–Env opt或pDC316-Sig-prM-Env opt与10μl的Lipofectamine2000^TM(Life Science)在Opti-MEM中混合后加入细胞孔中(转染的详细步骤参见厂家说明书)，转染4小时后更换为新鲜培养基。继续培养细胞，48小时后制备样品，用于目标蛋白的表达分析。

细胞裂解样品的制备：转染48小时后，吹打使贴壁细胞悬浮；将细胞悬浮液转移入离心管中，室温，500g离心5分钟，弃上清；用冰冷的PBS将细胞清洗一遍；然后加入100μl的90μl RIPA buffer(Pierce)+10μl蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)悬浮细胞，置于冰上20分钟，每2分钟震荡一次；20分钟后，将细胞裂解液于12000g，4℃离心10分钟，取上清，与4×的SDS-PAGE上样缓冲液(含有40％的2-Mercaptoethanol)混合，分装后冻存于-80℃备用。

WB检测ZIKV Env蛋白的表达：使用12％的SDS-PAGE不连续凝胶对样品进行分离，电泳条件为50V恒压，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，电转条件为100V恒压1小时。电转完成后按照下列步骤进行WB分析：1)预洗：将膜在20ml PBST(0.05％Tween20)中预洗10分钟；2)封闭：将膜在含有3％脱脂奶粉的PBST溶液中室温震荡孵育1小时；3)ZIKV Env特异性抗体结合：PBST洗膜3次，每次10分钟，然后将膜在10ml的含有1％脱脂奶粉和ZIKV Env特异性兔多抗(1：2000稀释，多抗购自Alpha DiagnosticInternational)的PBST溶液中于4℃孵育过夜；4)酶标二抗结合：PBST洗膜3次，每次10分钟间隔，然后将膜在10ml的含有1％脱脂奶粉和HRP标记的羊抗兔(1：2000，购自Santa Cluz)的PBST溶液中于室温孵育1小时；6)显色：PBST洗膜4次，每次10分钟间隔；使用Immobilon^TMWestern Chemiluminescent HRP Subsrate(Millipore)进行化学发光显色，化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。结果如图2所示，图2中A部分：从左到右依次为1号：pDC316-Env ori，2号：pDC316-Env opt，序列优化后Env的表达量大约是未优化序列表达量的2倍；图2中B部分：从左到右依次为1号：pDC316-Env opt，2号：无关质粒，3号：pDC316-Sig-prM-Env opt；pDC316-Env ori、pDC316-Env opt和pDC316-Sig-prM-Env opt转染的样品都能够检测到ZIKV Env蛋白的表达，而且目标产物分子量与预期一致(大约53KD)。

3.重组腺病毒Ad5-Env opt和Ad5-Sig-prM-Env opt的包装、制备及目标蛋白ZIKVEnv的表达鉴定

3.1重组腺病毒Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env的包装

将重组穿梭质粒pDC316-Env opt和pDC316-Sig-prM-Env opt分别与AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre混合后共转染HEK293细胞以包装出重组腺病毒Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env，具体过程如下所示：

1)HEK293细胞的准备：转染前1天，将HEK293细胞消化后以5×10⁵细胞/孔的数量接种于6孔板，所用培养基为MEM+10％FBS，置于细胞培养箱中培养过夜；

2)转染前，更换新鲜培养基，细胞丰度大约在85％左右，取4μg的骨架质粒(pBHGlox_E1,3Cre)与1μg的重组穿梭质粒(pDC316-Env opt或pDC316-Sig-prM-Env opt)混合，将其稀释于300μl的Opti-MEM培养基中，室温放置；取10μl的Lipofectamine^TM 2000脂质体，稀释于300μl的Opti-MEM培养基中,室温放置5分钟；5分钟后，将上述DNA与Lipofectamine^TM 2000脂质体混合后室温放置30分钟，然后轻轻加入培养有HEK293细胞的培养孔中；继续培养细胞，第二天，将6孔板中接近100％丰度的细胞转接于T25细胞培养瓶中，使用添加了5％FBS的MEM培养基继续培养，待细胞再次达到100％丰度时，将其转接入T75细胞培养瓶中，每日观察出毒迹象，出毒时细胞会逐渐变圆并不再粘附于培养容器，当大部分细胞出现出毒病变时，吹打细胞，使其完全脱落，转移入15ml的细胞离心管中，反复3次-75℃冰箱低温冷冻与37℃水浴融化，3000g，4℃离心细胞裂解液5分钟，收集上清，上清中的病毒即为第一代毒种(P1)，将其分别命名为P1-Ad5-Env和P1-Ad5-Sig-prM-Env。

3.2P1-Ad5-Env和P1-Ad5-Sig-prM-Env中目标基因的序列鉴定

使用引物P6和P7，以P1-Ad5-Env和P1-Ad5-Sig-prM-Env为模板，分别扩增出Env和Sig-prM-Env的编码序列，具体操作过程如下所示：

1)合成引物P6和P7：P6位于上游的MCMV启动子内，P7位于下游的SV40终止子内，其序列如下所示：

P6：ACGTGGGTATAAGAGGCG

P7：CGATGCTAGACGATCCAG

2)模板制备：取50μl的P1-Ad5-Env或P1-Ad5-Sig-prM-Env上清液，加入5μl的蛋白酶K(2mg/ml)溶液，50℃孵育1小时，然后于4℃，12000g离心10分钟，取上清作为扩增模板。

3)PCR反应体系及反应条件

100μl反应体系如表1所示：

表1.PCR反应体系

PCR参数及循环数：94℃预变性5分钟，循环参数：94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，25个循环，最后72℃孵育5分钟。

PCR结果如图3中A和B所示，图3的A中，从左到右依次分别是DNA Marker(DL-2000)、1号：P1-Ad5-Env模板扩增产物；图3的B中，从左到右依次分别是DNA Marker(DL-2000)、1号：P1-Ad5-Sig-prM-Env模板扩增产物。将凝胶上的目标条带切下后回收，测序显示为目标条带且序列正确。

3.3重组腺病毒P1-Ad5-Env和P1-Ad5-Sig-prM-Env表达ZIKV Env蛋白的鉴定

HEK293细胞的准备及感染：感染前一天，将293T细胞以1×10⁶细胞/孔接种6孔板，细胞培养箱中培养至第二天，细胞丰度大约在80％左右，培养基更换为1ml/孔的新鲜培养基；将10μl的P1-Ad5-Env或P1-Ad5-Sig-prM-Env加入细胞孔中，继续培养细胞48小时。

细胞裂解样品的制备：感染48小时后，吹打使细胞悬浮后转移入离心管中，500g离心5分钟，弃上清，先用冰冷的PBS将细胞清洗一遍，然后加入90μl的RIPA buffer(Pierce)和10μl蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)悬浮细胞，置于冰上20分钟，每2分钟震荡一次。20分钟后，将细胞裂解液于12000g，4℃离心10分钟，取上清，与4×的SDS-PAGE上样缓冲液(含有40％的2-Mercaptoethanol)混合，分装后冻存于-80℃备用。

WB检测ZIKV-Env蛋白的表达：使用12％的SDS-PAGE不连续凝胶对样品进行分离，电泳条件为50V恒压，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，电转条件为100V恒压1小时。电转完成后按照下列步骤进行WB分析：1)预洗：将膜在20ml PBST(0.05％Tween20)中预洗10分钟；2)封闭：将膜在含有3％脱脂奶粉的PBST溶液中室温震荡孵育1小时；3)ZIKV-Env特异性抗体结合：PBST洗膜3次，每次10分钟，然后将膜在10ml的含有1％脱脂奶粉和ZIKV-Env特异性兔多抗(1：2000稀释，多抗购自Alpha DiagnosticInternational)的PBST溶液中于4℃孵育过夜；4)酶标二抗结合：PBST洗膜3次，每次10分钟间隔，然后将膜在10ml的含有1％脱脂奶粉和HRP标记的羊抗兔(1：2000，购自Santa Cluz)的PBST溶液中于室温孵育1小时；6)显色：PBST洗膜4次，每次10分钟间隔；使用Immobilon^TMWestern Chemiluminescent HRP Subsrate(Millipore)进行化学发光显色，化学发光成像仪采集不同曝光时间的图像。结果如图4所示：pDC316-Env和pDC316-Sig-prM-Env转染的样品都能够检测到ZIKV-Env蛋白的表达，而且目标产物分子量与预期一致(大约53KD)，后者的目标蛋白表达量大约是前者的2.5倍，一般认为，表达量的提高与密码子优化的prM蛋白对于Env蛋白形成特异性的分子伴侣从而对表达产生了协同效应。

4.重组腺病毒Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env的扩增培养、纯化及纯化病毒的滴度测定

4.1重组腺病毒Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env的小规模扩增制备培养

在37℃、5％CO₂，130rpm条件下悬浮培养293F细胞，将活度大于95％的细胞调整浓度为1×10⁶细胞/ml，体积为2L。Ad5-Env或Ad5-Sig-prM-Env以10个MOI进行感染，继续之前条件培养细胞，每隔24小时取样检测细胞活度和密度。大约在接种72小时后，细胞活度下降到40％以下时，停止培养，500g室温离心收获细胞，将细胞悬浮于1/10体积的A液(20mMTris，250mM NaCl，1mM MgCl2，pH 7.5)中，反复3次-75℃冰箱低温冷冻与37℃水浴融化，然后4℃，12000g离心20分钟，取上清用于病毒纯化。

4.2重组腺病毒Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env的纯化

在病毒上清中加入终浓度为50U/ml的Benzonase(Sigma)，37℃孵育2小时以降解溶液中的核酸，然后4℃，12000g离心20分钟，取上清；使用A液平衡Source 30Q柱子，上样流速5ml/分钟，上样结束后，继续使用A液冲洗至UV基线走平；使用B液(20mM Tris，2M NaCl，2mM MgCl2，pH7.5)以线性梯度洗脱，20个柱体积内从0-40％B液，如图5所示，病毒主要分布在红色箭头所示的洗脱峰中。将收集的病毒溶液合并后使用截留分子量为100KD的超滤管(Millipore)进行浓缩，使用0.2μM的滤膜过滤病毒浓缩液以除菌，然后加入终浓度为10％的无菌甘油，分装后冻存于-80℃。

4.3重组腺病毒Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env的滴度测定

病毒滴度测定使用Clontech Adeno-X^TM Rapid Titer Kit进行，操作过程如下所示(详见厂家的操作说明)：

1)消化HEK293细胞，然后将细胞悬浮于新鲜的MEM+10％FBS中，调整细胞浓度为5.0×10⁵/ml，以0.5ml/孔的量加入24孔板中，然后将24孔板放入培养箱中；

2)使用MEM(10％FBS)稀释病毒，取10μl的病毒加入90μl的稀释液中，依次10倍稀释，从10倍到10⁷倍，稀释完毕后从10²倍稀释度开始，每孔中加入50μl的病毒稀释液；

3)培养48小时后，倾去培养基，使细胞在生物安全柜中干燥5分钟；

4)每孔中加入0.5ml的100％的甲醇，于-20℃孵育10分钟；

5)吸弃甲醇，使用PBS+1％BSA洗细胞3次，0.5ml/孔；

6)吸弃洗液，加入0.25ml的抗Hexon抗体(1:1000稀释于PBS+1％BSA)，37℃孵育1小时；

7)吸弃抗体，加入0.5ml的PBS+1％BSA洗细胞3次；

8)使用PBS+1％BSA以1：500的比例稀释Rat Anti-Mouse Antibody(HRPconjugate)，0.25ml/孔，37℃孵育1小时；

9)使用1×的Stable Peroxidase Buffer稀释10×的DAB Substrate，使其温度达到室温；

10)吸弃酶标二抗，加入0.5ml的PBS+1％BSA洗细胞3次；

11)加入0.25ml的DAB工作液到细胞孔，室温孵育10分钟；

12)吸弃DAB工作液，加入PBS，0.5ml/孔；

13)在显微镜下数至少6个视野的棕色/黑色的阳性细胞的数目，然后计算其平均数；

14)依下列公式进行计算。

滴度测定结果显示，纯化Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env的感染滴度分别为5.19×10⁹ifu/ml和2.97×10⁹ifu/ml。

实施例2寨卡病毒病疫苗在小鼠模型上的免疫学评价。

在小鼠模型上，研究重组腺病毒载体ZIKV疫苗的免疫剂量，评价疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫的水平。

1.重组腺病毒载体ZIKV疫苗Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env诱发机体体液免疫反应的评价和比较

1.1疫苗免疫剂量的比较及小鼠体液免疫反应的评价

SPF级雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)，购自维通利华。饲养于军事医学科学院丰台院动物房。注射体积为50μl，免疫后每周采血，所制备血清冻存于-20℃备用。小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表2-4所示：表2：Ad5-Env免疫分组、免疫部位、免疫剂量及免疫体积

*LUC：荧光素酶

表3：Ad5-Sig-prM-Env免疫分组、免疫部位、免疫剂量及免疫体积

表4:比较Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env诱发的体液免疫

血清总IgG滴度的测定使用ELISA法，具体方法如下所示：

1)包被缓冲液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，重组rEnv_1-409(本室制备，大肠杆菌表达系统表达后复性)的包被浓度为8μg/ml，重组rPrM_1-110(本室制备，大肠杆菌表达系统表达后复性)的包被浓度为4μg/ml，以100μl/孔的体积加入96孔EIA板(Coastar)，4℃包被过夜；

2)第二天，取出采集的免疫后血清，置于室温，待其融化后，轻弹管壁使融化后的溶液均匀，短暂离心后将EP管置于管架上排列好；

3)使用PBST(0.3％的Tween-20)洗板3次，每次间隔3分钟；

4)根据样品布局图，使用封闭缓冲液(含有3％BSA的PBST)以2倍梯度稀释样品，100μl/孔加样；

5)37℃孵育1小时后洗板6次，每次间隔3分钟；

6)使用稀释缓冲液(含有1％BSA的PBST)以1：5000的比例稀释酶标二抗(Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody，Cell Signaling)，100μl/孔加样；

7)37℃孵育1小时后洗板6次，每次间隔3分钟；

8)以100μl/孔加入显色缓冲液(TMB，Solarbio)进行显色；

9)显色5分钟，加入50μl/孔的终止液(2N H₂SO₄)终止反应，然后立即放入酶标仪(Bio-Rad)读值A450。以大于空白孔2倍的读值对应的稀释度作为血清中特异性抗体的滴度。

免疫后四周的检测结果如图6所示：不管是Ad5-Env，还是Ad5-Sig-prM-Env，都能够迅速激发小鼠产生较高的体液免疫；对于Ad5-Env来说，1×10⁸ifu的免疫剂量能够产生最高及最一致的抗体水平(图6，A)，而Ad5-Sig-prM-Env仅需要1×10⁷ifu的免疫剂量即可(图6，B)，Ad5-Sig-prM-Env所产生的针对prM的抗体水平较低(图6，C)；同时免疫两种候选疫苗，Ad5-Sig-prM-Env在第四周所产生的体液免疫水平与Ad5-Env没有太大的区别(图6，D)。

2.重组腺病毒载体ZIKV疫苗Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env诱发机体细胞免疫反应的评价和比较

2.1小鼠的免疫

SPF级雌性BALB/c小鼠(4-6周龄)，购自维通利华。饲养于军事医学科学院丰台院动物房。注射体积为50μl，小鼠分组、免疫剂量及免疫部位如表5所示：

表5 重组腺病毒载体ZIKV疫苗免疫分组、免疫部位、免疫剂量及免疫体积

2.2小鼠脾淋巴细胞的分离

免疫2周后将小鼠处死，取出脾脏，研磨释放淋巴细胞，200目细胞筛过滤，使用RBCLysis Buffer(Biolegend)裂解红细胞，接着使用RPMI1640完全培养基清洗细胞一次，然后将细胞悬浮于RPMI1640完全培养基中，细胞计数后待用。

2.3 ELISPOT检测IFN-γ和IL-2

使用BD^TM ELISPOT mouse IFN-γSet和BD^TM ELISPOT mouse IL-2 Set进行IFN-γ和IL-2的ELISPOT检测。方法简述如下，详见制造商的说明书。

1)分别使用5μg/ml抗小鼠IFN-γ和IL-2抗体包被ELISPOT板，4℃孵育过夜；

2)实验前使用RPMI1640+10％FBS培养基于室温封闭ELISPOT板2小时；

3)弃封闭液，每孔加入5μg/ml的ZIKV的Env蛋白重叠肽库或prM蛋白重叠肽库(长度为15个Aa残基，相邻多肽之间有10个氨基酸的重叠，由上海吉尔生化合成)刺激细胞，含有相同体积DMSO的RPMI1640+10％FBS培养基作为对照，均设置3个复孔；

4)每孔加入50μl的小鼠脾淋巴细胞，IFN-γ检测的细胞浓度为2×10⁶cells/ml，IL-2检测的细胞浓度为4×10⁶cells/ml，常规细胞培养箱中培养18-24小时；

5)吸弃孔内的细胞，使用蒸馏水洗两次，然后使用PBST(0.05％Tween-20)洗3次，每次洗液孵育3分钟；

6)每孔加入100μl的稀释于PBS+10％FBS的Biotinylated anti-mouse IFN-γ或Biotinylated anti-mouse IL-2(250倍稀释)，室温孵育2小时；

7)弃去孔内液体，使用PBST(0.05％Tween-20)洗3次，每次洗液孵育3分钟；

8)每孔加入100μl的稀释于PBS+10％FBS的streptavidin-horseradishperoxidase(100倍稀释)，室温孵育1小时；

9)弃去孔内液体，使用PBST(0.05％Tween-20)洗4次，每次洗液孵育3分钟，然后使用PBS洗3次；

10)使用BD^TM ELISPOT AEC substrate set进行生色反应。待孔内斑点长至合适大小时(一般于室温反应15-25分钟)弃去显色底物，用大量的蒸馏水冲洗以终止反应。将板晾干，使用酶联斑点成像分析系统(安泰永信，AT-Spot 2100)进行斑点计数

2.4细胞内细胞因子的染色及流式细胞术检测

1)将分离的小鼠脾淋巴细胞调整为4×10⁶cells/ml，以0.5ml/孔加入24孔板中，每只小鼠的细胞加入3个孔，然后分别加入Env蛋白的重叠多肽、prM蛋白的重叠多肽和等体积的DMSO，多肽混合溶液中每条多肽的终浓度为2.5μg/ml；

2)常规细胞培养箱中培养2小时后，每孔加入适量的BD GolgiStop^TM(4μl作用于6ml细胞)和BD GolgiPlug^TM(1μl作用于1ml细胞)，继续培养细胞4小时后将细胞转移至流式管中，每管加入3ml PBS清洗一次，4℃，500g离心5分钟，弃上清；

3)使用LIVE/DEADTM Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Invitrogen)对死细胞染色30分钟；

4)使用3ml PBS+2％FBS洗涤一次，然后使用Mouse BD Fc Block^TM(Biolegend,Clone,2.4G2)室温阻断Fc受体10分钟；

5)使用PerCP/Cy5.5anti-mouse CD3(Biolegend,Clone,17A2)，BrilliantViolet 510^TM anti-mouse CD4(Biolegend,Clone,RM4-5)，FITC anti-mouse CD8a(Biolegend,Clone,5H10-1)，Brilliant Violet 421^TM anti-mouse CD107a(Biolegend,Clone,1D4B)，Alexa

700anti-mouse CD62L(Biolegend,Clone,MEL-14)和PE/Cy7anti-mouse CD127(Biolegend,Clone,A7R34)，按说明书建议浓度进行细胞表面标示物的染色。将上述抗体稀释于Cell Staining Buffer(Biolegend)，然后4℃孵育30分钟；

6)使用3ml PBS+2％FBS洗涤一次，每管加入200μl Cytofix/Cytoperm^TM Fixationand Permeabilizaiton Solution(BD)，4℃孵育20分钟，对细胞进行固定和穿孔；

7)20分钟后，每管加入1ml 1×Perm/Wash^TM Buffer(BD)，4℃，600g离心5分钟，弃上清；

8)使用1×Perm/Wash^TM Buffer按说明书推荐使用量先稀释好适量的PE anti-mouse IFN-γ(Biolegend,clone XMG1.2),APC anti-mouse TNF-α(Biolegend,cloneMP6-XT22)和Brilliant Violet 605TM anti-mouse IL-2(Biolegend,Clone,JES6-5H4)，每管加50μl，并轻轻混匀，于4℃孵育30分钟。最后，每管分别用1ml 1×Perm/Wash^TM Buffer和3ml的PBS各洗一次，弃上清后用200μl PBS重悬，用于检测。

9)为了在检测时调节各染料间的荧光补偿，设置不染色细胞管，并将以上各荧光染料抗体单染Anti-Rat/hamster Ig,κ/Negative Control Compensation Particles Set(BD)。使用BD FACSCanto流式细胞仪进行样品检测，使用BD FACSDiva软件对检测结果进行分析。

2.5重组腺病毒ZIKV疫苗刺激细胞免疫结果

Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env以1×10⁸ifu/只的剂量免疫BALB/c小鼠2周后，其脾细胞可检测到强烈的特异性细胞免疫反应。细胞内细胞因子染色结果(图7)显示，Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env均可诱导BALB/c小鼠产生强烈的ZIKV Env特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应。两者CD8+T细胞的IFN-γ和IL-2阳性细胞的百分比以及CD4+T细胞的IFN-γ和IL-2阳性细胞百分比均显著高于Ad5-Luc对照小鼠。尽管Ad5-Env诱导产生的细胞免疫水平略高于Ad5-Sig-prM-Env，但两者诱导产生的CD8+T细胞和CD4+T细胞免疫反应无显著性差异。同时，Ad5-Sig-prM-Env免疫的小鼠还诱导产生了低水平的ZIKV prM特异的细胞免疫反应，prM特异的CD8+T细胞和CD4+T细胞IFN-γ阳性细胞的百分比均显著高于Ad5-Env免疫的小鼠和Ad5-Luc免疫的小鼠。IFN-γ和IL-2ELISPOT检测结果(图8)进一步证实了细胞内细胞因子染色的检测结果，说明Ad5-Env和Ad5-Sig-prM-Env均可诱导产生强烈的细胞免疫反应。

总结：

研究结果表明寨卡疫苗免疫后主要起保护作用的是体液免疫(Larocca RA,Abbink P,Peron JP,et al.Vaccine protection against Zika virus fromBrazil.Nature.2016 Aug25；536(7617):474-8.)。通过密码子优化，重组寨卡病毒Env的表达量得到明显的提高，通过进一步采用与prM蛋白融合表达的方式，表达量进一步得以提高，尽管表达量提高后细胞免疫水平保持不变，但要达到相同的体液免疫水平，免疫剂量可以降低一个数量级。这可以大大降低疫苗制备、运输和储存方面的成本，此外，也有助于免疫时减少不良副反应的发生。

序 列 表

<110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120> 一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> Zika Virus

<400> 1

atccgctgca ttggtgtctc gaaccgcgat ttcgtggagg gcatgagcgg cgggacctgg 60

gtggacgtgg tgctggaaca tggcggctgc gtgactgtga tggcccagga taaacccacc 120

gtggacatcg agttagtcac aactactgtg tccaatatgg ccgaggtgag atcgtactgc 180

tacgaggcct cgatctcgga tatggccagt gattcccgct gcccaaccca gggggaggcg 240

tacctggaca aacagagtga tacacagtac gtgtgcaagc ggaccctcgt ggaccgcggg 300

tgggggaacg gctgcggact gttcggcaag ggctccctgg tgacttgtgc taaattcgcc 360

tgcagtaaga agatgactgg caagagtatc cagccggaga atctcgagta ccgcatcatg 420

ctgtccgtgc acggatcgca gcactcgggc atgatcgtaa acgacaccgg ccacgagact 480

gacgagaacc gcgcgaaagt cgagatcacc cccaatagtc cccgggctga ggcgaccctg 540

ggaggcttcg ggagtctcgg gctggactgc gagccacgga caggtctcga cttttccgat 600

ctttactatc tcactatgaa taataagcac tggctggtgc acaaggagtg gttccacgat 660

attccactcc cctggcacgc cggcgcagac accggcactc cacattggaa taacaaagag 720

gccctggtcg agttcaagga tgcgcatgcc aagcgccaga cggtggtggt gctgggctcc 780

caggaggggg ctgtacacac agcgctcgct ggggccctgg aggccgagat ggatggggct 840

aaagggcgcc tgagcagcgg gcaccttaag tgcaggctca agatggacaa actgaggctg 900

aagggcgtga gctactcact gtgcaccgct gctttcacgt ttacgaagat ccctgctgag 960

accctgcacg gtaccgtgac ggtggaggtt cagtacgccg gtaccgatgg cccttgcaaa 1020

gtgccagcac agatggctgt ggatatgcag actctcacgc ctgtcggccg cctgataacg 1080

gctaatcccg tgataacaga atcgaccgaa aattctaaga tgatgctgga gctggacccg 1140

ccattcggcg attcctatat cgtgatcggg gtgggagaga agaagatcac acatcactgg 1200

caccgcagcg gttctactat cggcaaagca ttcgaggcca ccgtgcgggg agccaagcgg 1260

atggctgtgc tgggggacac cgcctgggac tttggttcgg tgggcggcgc ccttaactcc 1320

ctcgggaagg gcatacatca gattttcgga gcggccttca agtccctctt cgggggcatg 1380

tcctggttct cccagatcct gatcggtact ctgctgatgt ggctgggcct caataccaag 1440

aacggcagca tctccctgat gtgtctcgcg ctgggaggag tcctgatctt cctgtccacc 1500

gccgtgtccg cc 1512

<210> 2

<211> 504

<212> DNA

<213> Zika Virus

<400> 2

gctgaggtga cccgtcgcgg ctccgcttac tatatgtatc tggacaggaa cgacgccggc 60

gaggccatca gtttccccac tacgctgggt atgaacaagt gttacatcca gatcatggac 120

ctgggccaca tgtgcgatgc cacgatgagt tacgaatgtc caatgctgga cgagggtgtt 180

gagcctgatg atgtggactg ctggtgcaac acgaccagca cctgggtcgt gtacgggact 240

tgtcaccaca agaagggcga ggccagacgg tccagacgcg cggtgacatt gccttcccac 300

tcaacgcgca aactccagac ccggtcccag acctggctgg agagtcggga gtatacgaag 360

catctcatcc gcgtggagaa ttggatcttc cgcaaccccg gcttcgccct ggccgccgcc 420

gcgattgctt ggctgctggg gtctagcaca tcccagaagg tcatctacct ggtaatgatc 480

ctgctcatcg cccccgccta ttcc 504

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Zika Virus

<400> 3

ggcgctgaga catctgttgg gatcgtcggg cttctcctta ccacggcgat ggca 54

<210> 4

<211> 2070

<212> DNA

<213> Zika Virus

<400> 4

ggcgctgaga catctgttgg gatcgtcggg cttctcctta ccacggcgat ggcagctgag 60

gtgacccgtc gcggctccgc ttactatatg tatctggaca ggaacgacgc cggcgaggcc 120

atcagtttcc ccactacgct gggtatgaac aagtgttaca tccagatcat ggacctgggc 180

cacatgtgcg atgccacgat gagttacgaa tgtccaatgc tggacgaggg tgttgagcct 240

gatgatgtgg actgctggtg caacacgacc agcacctggg tcgtgtacgg gacttgtcac 300

cacaagaagg gcgaggccag acggtccaga cgcgcggtga cattgccttc ccactcaacg 360

cgcaaactcc agacccggtc ccagacctgg ctggagagtc gggagtatac gaagcatctc 420

atccgcgtgg agaattggat cttccgcaac cccggcttcg ccctggccgc cgccgcgatt 480

gcttggctgc tggggtctag cacatcccag aaggtcatct acctggtaat gatcctgctc 540

atcgcccccg cctattccat ccgctgcatt ggtgtctcga accgcgattt cgtggagggc 600

atgagcggcg ggacctgggt ggacgtggtg ctggaacatg gcggctgcgt gactgtgatg 660

gcccaggata aacccaccgt ggacatcgag ttagtcacaa ctactgtgtc caatatggcc 720

gaggtgagat cgtactgcta cgaggcctcg atctcggata tggccagtga ttcccgctgc 780

ccaacccagg gggaggcgta cctggacaaa cagagtgata cacagtacgt gtgcaagcgg 840

accctcgtgg accgcgggtg ggggaacggc tgcggactgt tcggcaaggg ctccctggtg 900

acttgtgcta aattcgcctg cagtaagaag atgactggca agagtatcca gccggagaat 960

ctcgagtacc gcatcatgct gtccgtgcac ggatcgcagc actcgggcat gatcgtaaac 1020

gacaccggcc acgagactga cgagaaccgc gcgaaagtcg agatcacccc caatagtccc 1080

cgggctgagg cgaccctggg aggcttcggg agtctcgggc tggactgcga gccacggaca 1140

ggtctcgact tttccgatct ttactatctc actatgaata ataagcactg gctggtgcac 1200

aaggagtggt tccacgatat tccactcccc tggcacgccg gcgcagacac cggcactcca 1260

cattggaata acaaagaggc cctggtcgag ttcaaggatg cgcatgccaa gcgccagacg 1320

gtggtggtgc tgggctccca ggagggggct gtacacacag cgctcgctgg ggccctggag 1380

gccgagatgg atggggctaa agggcgcctg agcagcgggc accttaagtg caggctcaag 1440

atggacaaac tgaggctgaa gggcgtgagc tactcactgt gcaccgctgc tttcacgttt 1500

acgaagatcc ctgctgagac cctgcacggt accgtgacgg tggaggttca gtacgccggt 1560

accgatggcc cttgcaaagt gccagcacag atggctgtgg atatgcagac tctcacgcct 1620

gtcggccgcc tgataacggc taatcccgtg ataacagaat cgaccgaaaa ttctaagatg 1680

atgctggagc tggacccgcc attcggcgat tcctatatcg tgatcggggt gggagagaag 1740

aagatcacac atcactggca ccgcagcggt tctactatcg gcaaagcatt cgaggccacc 1800

gtgcggggag ccaagcggat ggctgtgctg ggggacaccg cctgggactt tggttcggtg 1860

ggcggcgccc ttaactccct cgggaagggc atacatcaga ttttcggagc ggccttcaag 1920

tccctcttcg ggggcatgtc ctggttctcc cagatcctga tcggtactct gctgatgtgg 1980

ctgggcctca ataccaagaa cggcagcatc tccctgatgt gtctcgcgct gggaggagtc 2040

ctgatcttcc tgtccaccgc cgtgtccgcc 2070

Claims (8)

1.一种能够表达寨卡病毒Env蛋白的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列含有寨卡病毒前膜蛋白内源信号肽密码子、前膜蛋白编码序列和Env蛋白编码序列，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:4所示。

2.一种含有如权利要求1所述多核苷酸的穿梭质粒载体，其特征在于，所述载体为pDC316。

3.一种能够表达如权利要求1所述多核苷酸的人复制缺陷重组腺病毒载体，其特征在于，所述人复制缺陷重组腺病毒载体的骨架来源于AdMax腺病毒系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre，所述人复制缺陷重组腺病毒载体由权利要求2所述穿梭质粒载体pDC316与所述骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre一起转染入宿主细胞HEK 293细胞后由所述穿梭质粒载体pDC316和所述骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre之间发生的同源重组产生。

4.根据权利要求3所述的人复制缺陷重组腺病毒载体在制备预防寨卡病毒病疫苗中的应用。

5.一种制备可表达寨卡病毒 Env蛋白的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

（1） 构建含有如权利要求1所述多核苷酸的穿梭质粒载体；

（2）将步骤（1）所述载体与骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre一起转染入宿主细胞；

（3）培养步骤（2）所述宿主细胞；

（4）收获从步骤（3）所述细胞释放的人复制缺陷重组腺病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述载体为pDC316。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述细胞为HEK 293细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤（4）中，样品使用Benzonase消化核酸后，通过Source 30Q柱层析法对重组腺病毒进行纯化。

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