CN108103091B - 一种表达寨卡病毒结构蛋白e的重组多形汉逊酵母及其构建方法 - Google Patents

一种表达寨卡病毒结构蛋白e的重组多形汉逊酵母及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建方法，所述重组多形汉逊酵母是将人工合成的寨卡病毒蛋白E基因片段导入多形汉逊酵母中，获得表达寨卡病毒蛋白结构的重组菌。所述寨卡病毒结构蛋白E基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。本发明的重组多形汉逊酵母可用来生产重组寨卡病毒结构蛋白E，纯化步骤简单、成本低，工业化生产潜力大。

Description

一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建 方法
技术领域
本发明属于基因疫苗工程技术领域，涉及寨卡病毒糖蛋白的多形汉逊酵母表达系统的构建。
背景技术
寨卡病毒属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，与登革病毒、黄热病毒、乙脑病毒、西尼罗病毒特征相似，寨卡病毒为单股正链RNA病毒，基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶酶切而成，包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。和其他黄病毒属病毒类似，寨卡病毒的结构蛋白E(ZKE)高度保守且含有多个中和抗原决定簇。此外，ZKE蛋白是与细胞膜受体结合并与细胞膜融合而使病毒进入细胞的主要蛋白，与病毒的吸附、穿入、致病性、组织嗜性和诱导宿主的免疫应答等作用紧密相关。因此，结构蛋白E是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白，能刺激机体产生中和抗体，保护机体免受病毒攻击。
多形汉逊酵母属于甲醇型酵母，其作为单细胞低等真核生物，不仅具有易培养、繁殖快、便于遗传操作、能对外源产物进行翻译后加工和修饰及无毒性代谢产物等优点，还具有其特有的耐高温特性。这些优点使多形汉逊酵母表达系统近年来迅速发展成为生物工程领域中备受关注的主要细胞工厂之一。多形汉逊酵母表达系统已经成功用于表达许多药用、工业用蛋白质及酶制剂，如具有诊断和治疗价值的真核生物蛋白，其中一些已得到商业化推广，如水蛭素、乙型肝炎病毒表面抗原B(HBsAg)、人干扰素(IFNa-2a)、胰岛素、青霉素、明胶、尿酸氧化酶、植酸酶。
目前，国内外尚未见到利用多形汉逊酵母宿主表达寨卡病毒结构蛋白E的报道。主要的难点可能在于：受到ZKE蛋白结构影响，宿主细胞的ZKE蛋白表达效率较低甚至不表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明首先提供一种寨卡病毒结构蛋白E的分泌型表达载体，该表达载体表达的目的基因为如SEQ.ID.NO.1所示的寨卡病毒结构蛋白E基因片段。
优选的，所述表达载体选自多克隆位点插入有所述目的基因的pHMOXG-alpha-A质粒载体(也简称为pHMOXG-α-A，Song houhui et al，biotechnology letters，25(23):1999-2006)。
本发明所提供的能表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母，是将含有寨卡病毒结构蛋白E基因片段的重组表达载体(例如使用的骨架载体为上述pHMOXG-alpha-A质粒载体的分泌型表达载体，诱导表达)转化多形汉逊酵母宿主而获得的多形汉逊酵母，其中所述重组表达载体中含有如SEQ.ID.NO.1所示的寨卡病毒结构蛋白E基因片段的核苷酸序列。该寨卡病毒结构蛋白E基因片段的设计来源于寨卡病毒结构蛋白E基因，设计的要点在于：1)去除了寨卡病毒结构蛋白E基因自身的分泌信号肽序列部分，2)同时去除了部分疏水区的编码序列。
多形汉逊酵母为FDA批准的食品级酵母。多形汉逊酵母在进行分泌型表达时，外源蛋白在分泌过程中可完成蛋白信号肽切除、糖基化修饰和二硫键形成等翻译后加工修饰，使所表达的蛋白质更接近具有生物学活性的天然蛋白质形式，是一种广泛被应用的真核表达系统。本发明所述多形汉逊酵母宿主优选为多形汉逊酵母DL-1(AT26012)。
构建上述重组多形汉逊酵母的方法，包括以下步骤：
1)人工合成寨卡病毒结构蛋白E基因片段(SEQ.ID.NO.1)；
2)将所述寨卡病毒结构蛋白E基因片段插入在表达质粒载体(例如pHMOXG-alpha-A质粒载体)的多克隆位点，构建重组表达载体；
3)将所述重组表达载体转化入多形汉逊酵母宿主中，获得能表达重组寨卡病毒结构蛋白E的多形汉逊酵母，即重组多形汉逊酵母。
本发明所述的重组多形汉逊酵母可用于生产重组寨卡病毒结构蛋白E。生产过程的第一阶段是重组多形汉逊酵母的发酵培养(增加细胞生物量)，第二阶段为诱导表达，表达的产物(保留了寨卡病毒结构蛋白E的核心功能区域结构，即抗原决定簇等与免疫原性和抗原递呈相关的结构部分)通过分离发酵上清液、亲和层析等简单步骤即可获得富集和分离纯化。
本发明的有益效果体现在：
本发明首次在多形汉逊酵母表达系统中分泌表达了寨卡病毒结构蛋白E的核心结构，分泌表达因所表达的蛋白存在于胞外而杂蛋白含量极低，纯化步骤简单、成本低，工业化生产潜力大。此外，所得重组多形汉逊酵母具备多形汉逊酵母易于高密度发酵，培养简单的优点，表达产物具有很好的免疫原性，适用于医药领域。
附图说明
图1为PCR扩增人工合成的寨卡病毒结构蛋白E基因片段；泳道1为PCR扩增含pMD18-T-ZKE(生工生物工程(上海)股份有限公司，克隆载体为pMD18-T，插入的目的基因为上述片段)载体的大肠杆菌，泳道2为空白对照组(大肠杆菌Top10)，泳道M为精准定量300bpDNA Ladder。
图2为EcoRI和NotI酶切鉴定含寨卡病毒结构蛋白E基因片段的pHMOXG-alpha-ZKE重组质粒；泳道1为pHMOXG-α-ZKE的EcoRI和NotI双酶切产物，泳道2为pHMOXG-α-A的EcoRI和NotI双酶切产物，泳道M为精准定量300bp DNA Ladder。
图3为重组多形汉逊酵母表达后培养上清液Western blotting检测结果；泳道1为pHMOXG-α-A转化酵母细胞后的发酵产物(20mL上清的浓缩液)，泳道2为pHMOXG-α-ZKE转化酵母细胞并培养48h后的上清液(20mL上清的浓缩液)，泳道3为pHMOXG-α-ZKE转化酵母细胞并培养72h后的上清液(20mL上清的浓缩液)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
(一)构建含有寨卡病毒结构蛋白E基因片段的pHMOXG-alpha-ZKE重组表达载体1、依据报道的寨卡病毒结构蛋白E基因信息(GenBank:KU820899.2)，人工设计待表达的寨卡病毒结构蛋白E基因片段(2017年5月设计完成)，其两端利用扩增引物(引物1和引物2，2017年7月设计完成)可添加酶切位点EcoRI(碳端，参见序列下划线位置)和酶切位点NotI(氮端，参见序列斜体位置)。人工设计的寨卡病毒结构蛋白E基因片段序列如SEQ.ID.NO.1所示，人工合成序列。
2、将含有所设计的寨卡病毒结构蛋白E基因片段的质粒(pMD18-T，Takara)成功转入大肠杆菌Top10(生工生物工程(上海)股份有限公司)后，置于含0.1％氨苄青霉素的LB液体培养基中培养。
3、用PCR进行扩增，反应体系为：引物1(1μL)、引物2(1μL)、2×Taq Master Mix(10μL，南京诺唯赞生物科技有限公司)、大肠杆菌培养菌液(1μL)、ddH2O(7μL)、合计20μL，扩增条件为：94℃5min；94℃35s、52℃35s、72℃1.5min、30循环；72℃10min，4℃保存。
引物1(ZKE-primer 1)：5'-GGAATTCATGATCAGGTGCATAGGAGTCAG-3'
引物2(ZKE-primer 2)：5'-GCGGCCGCAGCAGAGACGGCTGTGGATA-3'
4、扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示，在DNA标准分子量的1500bp处检测出条带约为1515bp的扩增产物，符合寨卡病毒结构蛋白E基因片段人工设计的碱基数。
5、用北京全式金公司的胶回收试剂盒回收上述PCR扩增产物。并将回收后产物经EcoRI和NotI双酶切后与用相同限制性内切酶酶切的pHMOXG-alpha-A载体借助T4连接酶进行连接，连接条件为4℃、连接时间为16h，构建成功的质粒命名为pHMOXG-alpha-ZKE(或称为pHMOXG-α-ZKE)。插入的目的基因上游含有共表达的分泌信号肽序列，下游含有融合表达的His标签序列。
6、将重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE用热激法转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)内，37℃、在LB培养基中160rpm条件下温育培养1h后，离心收集菌体涂布于含有0.2％卡那霉素的LB固体培养基上，在37℃培养16h进行筛选。随机选取6个转化子分别接种到3mL含有0.1％卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养8h。然后用引物1和引物2进行菌落PCR，反应体系：菌液1μL、引物1和引物2分别为1μL、2×Taq Master Mix 10μL(南京诺唯赞生物科技有限公司)、ddH2O为7μL，总体积为20μL。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，在DNA标准分子量1500bp处检测出所设计的寨卡病毒结构蛋白E基因片段，目的条带为1515bp，符合人工设计的碱基数。即成功获得含有寨卡病毒结构蛋白E基因片段的重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE的阳性大肠杆菌。
含0.1％氨苄青霉素的LB液体培养基组分：1.0g/100mL氨苄青霉素，5g/1000mL酵母提取物，10g/1000mL胰化蛋白胨、10g/1000mL氯化钠，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。
含0.2％卡那霉素的LB固体培养基组分：2.0g/100mL卡那霉素，5g/1000mL酵母提取物、10g/1000mL胰化蛋白胨、10g/1000mL氯化钠，15g/1000mL琼脂粉，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。
含0.1％卡那霉素的LB液体培养基组分：1.0g/100mL卡那霉素，5g/1000mL酵母提取物、10g/1000mL胰化蛋白胨、10g/1000mL氯化钠，NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。
(二)构建能够表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母
2.1多形汉逊酵母DL-1感受态细胞的制备
多形汉逊酵母DL-1来源于ATCC(AT26012)，获得时间为2010年3月。
1、从新鲜YPD平板上挑取多形汉逊酵母DL-1单菌落于5mL YPD液体培养基中，37℃培养16h，至菌落长至饱和；
2、取1mL接种入50mL YPD液体培养基中，37℃培养至OD600＝0.8-1.2后5000rpm离心8min，收集细胞；
3、加入50mL pH8.0的TED(100mm Tris HCl和50mm EDTA)后，置于37℃，100rpm/min摇床培养30min，于4℃、5000rpm/min离心8min收集细胞；
4、加入50mL冰预冷的270mM的蔗糖轻轻悬浮细胞后，于4℃、5000rpm/min离心5min收集细胞；
5、加入25mL冰预冷的270mM的蔗糖轻轻悬浮细胞后，于4℃、5000rpm/min离心5min收集细胞；
6、加入1mL冰预冷的270mM的蔗糖轻轻悬浮细胞，80μL/管分装，即制备完成多形汉逊酵母DL-1感受态细胞。
2.2重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE的线性化及重组多形汉逊酵母的构建
将1mL含有重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE的大肠杆菌菌液加入50mL LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下培养24h。用北京全式金公司生产的质粒提取试剂盒提取重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE。
用DraI对重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE进行线性化处理，酶切反应条件为37℃，酶切8h。
线性化后产物进行琼脂糖凝胶电泳，用北京全式金生产的胶回收试剂盒回收电泳产物，溶解在20-30μL TE溶液中。
电转化：将20-30μL线性化产物与80μL的多形汉逊酵母DL-1感受态细胞轻轻混匀后，立即放入冰浴的电击杯凹槽中，冰浴5min，用Bio-Rad电穿孔仪对样品进行脉冲(脉冲设置：50μF，200Ω，1.5KV)电击，电击结束后立即加入冰预冷的1mL YPD(含1mM MgCl2)液体培养基，然后移入2mL的无菌离心管中，37℃，100rpm培养1-2h后，取100-200μL涂布于YPD(含G418终浓度为300μg/mL)平板(简称YPDG)上，37℃培养48-96h，观察转化子出现。
随机选取20-30个转化子分别接种到5mL含有300μg/mL G418的YPD液体培养基中，37℃培养24h后，5000rpm/min离心5min收集细胞，提取基因组，用引物1和引物2进行PCR扩增筛选。PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果在DNA标准分子量1500bp处检测出目的条带，符合人工设计的寨卡病毒结构蛋白E基因片段的碱基数(1515bp)，则获得含有寨卡病毒结构蛋白E基因片段的重组表达载体pHMOXG-alpha-ZKE的阳性多形汉逊酵母重组菌株。
2.3寨卡病毒结构蛋白E在重组多形汉逊酵母中表达
将构建成功的重组多形汉逊酵母菌株(上述阳性多形汉逊酵母重组菌株)接种到5mL YPDG中，37℃、120rpm培养16h后，将培养物转接到250mL YPD液体培养基中继续培养24h后，开始诱导(保持培养条件)，期间每12h补加甲醇(诱导物)至终浓度达到0.5％(V/V)，连续诱导96h，诱导期间及诱导结束，4℃、12000rpm离心收集发酵上清，经MilliporeAmicon mLtra-15(MWSO，30000)超滤浓缩至20mL备用，用His tag抗体进行westernblotting分析，检测结果如图3所示，在蛋白质标准分子量55kDa处检测出蛋白条带，目的蛋白为55.6kDa，符合理论值。即成功获得能表达寨卡病毒结构蛋白E基因的多形汉逊酵母重组菌株。且随诱导表达时间由48h延续至72h，重组寨卡病毒结构蛋白E表达量从5.7mg/L增加到8.6mg/L。
(三)重组寨卡病毒结构蛋白E的分离纯化
亲和层析预处理：在浓缩的20mL上清中加入NaCl、NaH2PO4，Imidazole和Tris-HCl，浓度分别为0.3M、0.05M、0.01M和0.01M，溶液体积定容于25mL，体积不足用超纯水补齐，然后用0.22μm滤器过滤。
1)Ni柱平衡：取100mL平衡液平衡Ni-NTA resin柱。
2)将预处理样品经过上述平衡好的Ni柱处理，收集流过液。
3)将80mL洗涤液(0.3M NaCl，0.05M NaH2PO4，0.01M Imidazole，0.01MTris-HCl)洗涤没有吸附上Ni柱的蛋白，连续收集8管，每管10mL。
4)再用80mL洗脱液(0.3M NaCl，0.05M NaH2PO4，0.5M Imidazole，0.01M Tris-HCl)洗脱吸附到Ni柱上的目的蛋白，连续收集16管，每管5mL，洗脱液第3和4管中均检测出目的蛋白。
(四)重组寨卡病毒结构蛋白E的浓缩及保存
将经过亲和层析纯化后的含有目的蛋白(重组寨卡病毒结构蛋白E)的洗脱液用孔径大于3.5kD的超滤管在4℃，于4000rpm离心浓缩。
将浓缩后的蛋白用透析袋于含5％(体积分数)甘油的PBS缓冲液中进行透析12-16h(除盐)。
将透析液过0.22μm滤器，注入无菌EP管中，置于-80℃条件下保存备用。
(五)重组寨卡病毒结构蛋白E的免疫原性分析
(1)动物免疫
选取6～8周龄雌性Balb/c小鼠24只，随机分成3组，实验组1免疫原为表达的目的蛋白(重组寨卡病毒结构蛋白E)，实验组2免疫原为灭活的寨卡病毒，实验组3为阴性对照组(佐剂)，进行皮下多点免疫注射。实验组1初次免疫用30μg表达的重组寨卡病毒结构蛋白E与相同量弗氏完全佐剂进行乳化处理后免疫，初次免疫2周后进行二次免疫，用15μg表达的重组寨卡病毒结构蛋白E与相同量弗氏不完全佐剂进行乳化后免疫，接着每周一次加强免疫，加强免疫2次，最后一次加强免疫1周后断尾取血，置于4500r/min离心10min，分离血清备用。实验组2初次免疫用1×105PFU(空斑形成单位,Plaque-forming unit,PFU)灭活寨卡病毒与相同量弗氏完全佐剂进行乳化处理后免疫，初次免疫2周后进行二次免疫，用1×104PFU灭活寨卡病毒与相同量弗氏不完全佐剂进行乳化处理后免疫，接着每周一次加强免疫，加强免疫2次，最后一次加强免疫1周后断尾取血，置于4500r/min离心10min，分离血清备用。实验组3初次免疫用30μg弗氏完全佐剂进行免疫，初次免疫2周后进行二次免疫，用15μg弗氏不完全佐剂进行免疫，接着每周一次加强免疫，加强免疫2次，最后一次加强免疫1周后断尾取血，置于4500r/min离心10min，分离血清备用。
(2)抗体效价测定
利用PRNT(Plaque reduction neutralization test，噬斑减少中和试验)，将实验组2(以灭活病毒免疫小鼠组)小鼠血清作为阳性血清，实验组3(只免疫佐剂小鼠组)小鼠血清为阴性对照血清，以Hanks缓冲液为空白对照，分析表达的重组寨卡病毒结构蛋白E免疫小鼠(实验组1)抗体效价，结果表明实验组1即表达的重组寨卡病毒结构蛋白E免疫小鼠组抗寨卡病毒抗体效价达到1:1280，表明本发明所表达的重组寨卡病毒结构蛋白E具有一定免疫原性。
序列表
<110> 宁波市疾病预防控制中心；陕西科技大学
<120> 一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母及其构建方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1515
<212> DNA
<213> Zika virus
<400> 1
atgatcaggt gcataggagt cagcaatagg gactttgtgg aaggtatgtc aggtgggact 60
tgggttgatg ttgtcttgga acatggaggt tgtgtcaccg taatggcaca ggacaaaccg 120
actgtcgaca tagagctggt tacaacaaca gtcagcaaca tggcggaggt aagatcctac 180
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aagaatggat ctatttccct tatgtgcttg gccttagggg gagtgttgat cttcttatcc 1500
acagccgtct ctgct 1515
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成(引物1)
<400> 2
ggaattcatg atcaggtgca taggagtcag 30
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成(引物2)
<400> 3
gcggccgcag cagagacggc tgtggata 28

Claims (1)

1.一种表达寨卡病毒结构蛋白E的重组多形汉逊酵母，其特征在于：该重组多形汉逊酵母是通过将重组表达载体转化多形汉逊酵母宿主而得到的，所述重组表达载体含有如SEQ.ID.NO.1所示的寨卡病毒结构蛋白E基因片段的核苷酸序列，寨卡病毒结构蛋白E基因片段表达后分泌到多形汉逊酵母宿主胞外；所述的重组表达载体使用的骨架载体为pHMOXG-alpha-A质粒载体，寨卡病毒结构蛋白E基因片段插入在该质粒载体的多克隆位点内；所述的多形汉逊酵母宿主为多形汉逊酵母DL-1菌株。
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