WO2017128783A1

WO2017128783A1 - 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗

Info

Publication number: WO2017128783A1
Application number: PCT/CN2016/103016
Authority: WO
Inventors: 陈薇; 吴诗坡; 侯利华; 宋小红; 张金龙; 付玲
Original assignee: 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
Priority date: 2016-01-31
Filing date: 2016-10-24
Publication date: 2017-08-03
Also published as: CN105483140A; EP3342865A4; EP3342865A1; CN105483140B; US20180264100A1; US10172932B2; EP3342865B1

Abstract

提供一种埃博拉病毒包膜糖蛋白（即GP蛋白）密码子优化的核苷酸序列、能够表达该核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒及在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。该核苷酸序列以E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包装细胞系，携带的保护性抗原基因是密码子优化后的Zaire型埃博拉病毒Makona株包膜糖蛋白基因。包膜糖蛋白基因经密码子优化后，在转染细胞中的表达水平明显增高。

Description

一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗技术领域

[0001] 本发明公幵了一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗，目的在于预防埃博拉病毒病。本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 埃博拉病毒（Ebola vims , EBOV) 属于丝状病毒科，可引起人和灵长类动物产生出血热。 1976年首次发现于苏丹南部和扎伊尔的埃博拉河地区， "埃博拉"由此得名。发病者有发烧、呕吐、腹泻、体内外出血、脑肝肾功能损害等，死亡率高达 50<¾〜90%。埃博拉病毒感染引起的疾病在 2014年以前的称为 "埃博拉出血热（Ebola hemorrhagic fever) "； 2014年西非埃博拉疫情爆发之后，世界卫生组织和美国疾病预防控制中心已将埃博拉出血热更名为埃博拉病毒病（Ebola virus disease , EVD) °

[0003] 目前已发现的埃博拉病毒包括 5个亚种：扎伊尔型（Zaire ebolavims, EBOV) 、苏丹型（Sudan ebolavims, SUDV) 、塔伊森林型 (Tai Forest ebolavims, TAFV,又叫科特迪瓦型或象牙海岸型）、本迪布焦型（Bundibugyoe ebolavims, BDBV) 和莱斯顿型（Reston ebolavims, RESTV) 。前 4种埃博拉病毒都有感染人类并导致类似临床症状的报道，目前仅在非洲发现。其中，扎伊尔型对人致病性最强,苏丹型次之。

[0004] 在 2014年西非埃博拉疫情肆虐之前，历史上埃博拉疫情共发生 24起，死亡人数累积约 1500人，主要发生在非洲中部的刚果、乌干达、苏丹等地，疫情一般发生在人烟稀少的地区，单次疫情死亡没有超过 300人。 2014年疫情起始于几内亚，迅速蔓延到了周边的利比里亚、塞拉利昂等国家，众多 EVD患者出现在人口稠密的大城市，如几内亚的首都科纳克里，塞拉利昂的首都弗里敦，利比里亚首都蒙罗维亚和尼日利亚首都拉各斯，病毒呈现出沿交通干线传播的特征，而且首次传播到非洲大陆以外的地区，如美国、英国、西班牙等地。截止到 2015 年 12月，死亡人数已逾万人。 [0005] 截止到 2015年 12月，目前世界上还没有批准的埃博拉疫苗或者治疗药物。许多实验室和制药公司正在进行 EBOV疫苗和治疗药物的研发。这些疫苗包括 DNA疫苗、亚单位疫苗、非复制型和可复制型病毒载体疫苗，一些 DNA疫苗或者基于活病毒载体的疫苗已经进入到临床研究阶段。

[0006] 埃博拉病毒包膜糖蛋白（Glycoprotein, GP) 是埃博拉病毒包膜唯一的表面蛋白，具有 2个阅读框，分别编码 1个分泌型的小蛋白 sGP和 1个全长的跨膜 GP。 GP 被认为是埃博拉病毒致病性的重要决定因素，它通过与受体结合介导病毒进入宿主细胞，并可通过与内皮细胞结合破坏微血管的完整性，引起血管渗漏。而与此同吋， GP也是诱导产生保护性免疫反应的主要靶蛋白。目前，所有埃博拉病毒疫苗的研究基本上以 GP (或 GP联合 NP) 作为目标抗原，而在动物实验中证明有效的单克隆抗体（或抗体混合物）也都是靶向于 GP的抗体。传统的灭活疫苗及亚单位疫苗对埃博拉病毒无效，目前在研的疫苗中动物保护效果良好的疫苗是以 GP为目标抗原的基于活病毒载体的疫苗。如何实现以最低的免疫剂量来携带尽可能多的 GP成为急需解决的问题。

[0007] AdMax系统由含有 ΙοχΡ位点的穿梭质粒、骨架质粒和 HEK-293细胞株组成，夕卜源基因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在 HEK-293细胞中进行基因重组来产生重组腺病毒。

[0008] AdMax腺病毒系统是由 Frank Graham在 1999年创建的一套重组腺病毒构建系统，目前已被加拿大的 Micobix公司幵发成为一种腺病毒载体包装系统。 AdMax系统进行重组腺病毒包装的基本原理是通过 Cre-loxP或 FLP-frt重组酶，使转染进 HE K-293细胞的穿梭质粒和骨架质粒发生定点重组，产生重组腺病毒，这样得到的重组病毒是 E1缺失的复制缺陷型腺病毒，病毒在不能够提供 E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能力。 AdMax系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方便快捷的腺病毒包装系统之一。

[0009] 与现在使用最普及的 AdEasy系统相比， AdMax系统出毒更快，能够高效率、简便而快速地获得重组腺病毒，并且病毒的产率（yielding) 明显提高。利用 AdMa X系统，只需要 2〜4周就能完成从质粒构建到重组出毒的全过程，成功率大于 98 % (其中 95%的克隆含有目的基因），因为重组出毒是在真核细胞内完成的，保持了对腺病毒的生存压力，因此有助于保持重组腺病毒基因组的完整性；而 A dEasy系统的出毒成功率只有 18-34% (Stratagene公司新版的 AdEasyXL系统成功率在 94%左右），而且在原核细胞（BJ5183) 中完成病毒基因组重组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会受到影响。

[0010] 虽然 AdMax系统具有出毒快，产率高等优点。但作为一种有效的活病毒载体疫苗，除了载体本身的优势，如何使插入的外源目标蛋白更有效的表达至关重要。如果外源蛋白的表达水平过低，需通过增加免疫剂量来获得有效的免疫效果，这样必然会增加载体对接种者的不良影响。因此，通过对目标蛋白的基因进行优化，使其能够更高效的正确表达，是提高疫苗免疫效果的一种有效方法。技术问题

[0011] 基于埃博拉病毒病的现实威胁，及现有技术在疫苗预防效果上效率不高，以及 AdMax系统在应用上存在的技术难题，本申请人欲通过对 GP进行密码子优化，使其在真核细胞中的表达量明显增高，并提供具有更强免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗体的重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗。

问题的解决方案

技术解决方案

[0012] 基于上述目的，本发明首先提供了一种用于重组腺病毒载体埃博拉疫苗的 GP 蛋白基因密码子优化的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如 SEQ ID NO:l所示。所述核苷酸序列以 El、 E3联合缺失的复制缺陷型人 5型腺病毒为载体，以整合腺病毒 E1基因的 HEK293细胞为包装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗。

[0013] 本发明还提供了含有上述核苷酸序列的载体。

[0014] 在一个优选的实施方案中，所述载体为 pDC316。

[0015] 本发明还提供了一种能够表达上述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒。

[0016] 在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒载体来源于 AdMax腺病毒系统。

[0017] 本发明还提供了上述重组腺病毒载体在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。 [0018] 在一个优选的实施方案中，上述应用中，所述重组腺病毒被制备为注射剂。

[0019] 最后，本发明提供了一种制备上述的可表达埃博拉 GP蛋白的重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

[0020] (1) 构建含有埃博拉病毒 GP蛋白核苷酸编码序列的穿梭质粒载体；

[0021] (2) 将步骤（1) 所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；

[0022] (3) 培养步骤（²) 所述宿主细胞；

[0023] (4) 从步骤（3) 所述宿主细胞中提取可表达埃博拉 GP蛋白的人复制缺陷重组腺病毒。

[0024] 优选地，步骤（1) 所述载体为 pDC316。

[0025] 优选地，步骤（2) 所述骨架质粒为 pBHGlox_El,3Cre，两种质粒均属于 AdMax 腺病毒系统，共同用于在宿主细胞中进行含有编码 GP蛋白的核苷酸序列的重组腺病毒包装。

[0026] 优选地，步骤（3) 所述细胞为 HEK 293细胞

[0027] 优选地，在步骤（4) 中采用 Source 30Q和 Sepharose4 FF两步法柱层析对重组埃博拉病毒 GP蛋白进行提取并纯化。

发明的有益效果

有益效果

[0028] 本发明提供的可表达埃博拉 GP蛋白的重组腺病毒作为埃博拉病毒病疫苗免疫动物后，能在短吋间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。该疫苗制备方法简单，可在短期内大规模生产，用于应对突发埃博拉疫情和生物恐怖袭击。而且 GP蛋白的基因经密码子优化后，在转染细胞中的表达水平明显增高，以其为基础而包装的重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗所诱导的体液免疫水平在原有基础上又有很大程度的提高。体液免疫水平的提高对于预防埃博拉病毒病的感染具有重要的意义。

对附图的简要说明

附图说明

[0029] 图 1穿梭质粒图谱；

[0030] 图 2 GP体外表达鉴定 Western blot检测图谱； [0031] 图 3第一代毒种 PCR鉴定图谱；

[0032] 图 4重组腺病毒埃博拉疫苗 GP表达鉴定 Western blot检测图谱；

[0033] 图 5疫苗纯化 Source 30Q层析图谱；

[0034] 图 6疫苗纯化 Sepharose 4 FF层析图谱；

[0035] 图 7重组腺病毒埃博拉疫苗纯化样本 PCR鉴定图谱；

[0036] 图 8重组腺病毒载体埃博拉疫苗纯化样品 GP表达鉴定 Western blot检测图谱；

[0037] 图 9重组腺病毒载体埃博拉疫苗负染透射电镜观察图；

[0038] 图 10重组腺病毒载体埃博拉疫苗冷冻切片透射电镜观察图；

[0039] 图 11疫苗免疫小鼠血清抗体 IgG水平随吋间变化曲线图；

[0040] 图 12流式细胞术检测疫苗免疫小鼠脾细胞 IFN γ分泌水平的统计分析图；

[0041] 图 13 ELISP0T检测疫苗免疫小鼠脾细胞 IFN γ分泌水平统计分析图。

本发明的实施方式

[0042] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

[0043] 实施例 1以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗的制备

[0044] 1. GP基因密码子优化及合成。

[0045] 对 2014年西非几内亚暴发流行的 Z re型埃博拉病毒 Makona株（Genebank编号： KJ660346.1) 包膜糖蛋白的基因使用 Upgene软件（Gao, W.， Rzewski, A., Sun, H.， Robbins, P. D.， & Gambotto, A. (2004) . UpGene: Application of a web-based DNA codon optimization algorithm. Biotechnol Prog, 20 (2) , 443-448. doi:

10.1021/bp0300467) 进行密码子优化，使其更适合在真核细胞中表达。密码子优化后， GP核苷酸序列整体变化 24.2%。同吋，将 GP原始信号肽（laa-32_aa) 改为组织纤溶酶原激活物信号肽 tPA，并在翻译起始密码子前面加入 Kozak序列，进行基因合成。与此同吋，作为对照，将包膜糖蛋白基因的原始序列进行合成。密码子优化 GP基因序列（酶切位点为 EcoRI和 Hindlll) 见 SEQ ID NO:l， GP原始基因序列（酶切位点为 EcoRI和 Hindlll) 见 SEQ ID NO:2。 [0046] 2. 载体构建和 GP的体外表达鉴定。

[0047] 2.1载体构建。

[0048] 以上合成的基因序列，分别用 EcoRI和 Hindlll进行双酶切，回收目的基因片断，将其连接至 AdMax腺病毒系统（加拿大 Microbix Biosystems

Inc.) 的穿梭质粒 pDC316上，转化 DH5-a感受态，涂布 Amp r _LB平板，挑单克隆进行菌落 PCR鉴定，并对 PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。 GP基因序列未进行密码子优化的质粒记为 pDC316-GGP， GP基因密码子优化后的质粒记为 pDC 316-GGPopt, 质粒图谱如图 1所示。其中 A为 pDC316-GGPopt质粒图谱， B为 pDC316-GGP质粒图谱。

[0049] 2.2 GP的体外表达鉴定。

[0050] 将以上构建的 2个穿梭质粒和 pDC316载体，使用转染试剂 TurboFect

Transfection Reagent转染至 293 T细胞， 48小吋后收细胞进行 WB检测。实验方法如下：

[0051] 转染：实验前一天， 293T细胞以 8x10 ⁵细胞 /孔接种 6孔板，于 37°C、 5% CO ₂细胞培养箱中培养过夜。转染前 1小吋，将培养基换成新鲜的含 2%

胎牛血清的 MEM培养基，每孔 2 mL。转染吋，每个转染孔取对应质粒 2 μ_§，加入到 200 无胎牛血清的 MEM培养基中，混匀，加入转染试剂 3 μί，轻轻混匀，室温放置 15分钟。将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到 6孔板中，轻摇混匀。细胞于 37°C、 5% CO ₂细胞培养箱中培养， 5小吋后将培养基换成新鲜的含 10% 胎牛血清的 MEM培养基， 48小吋后收集细胞，制备样品，进行 WB检测。

[0052] 样品制备：转染 48小吋后，小心地吸弃培养基，用 PBS洗涤细胞一次。将 6孔板置于冰上，每孔各加入 120 细胞裂解液（含 50 mmol/L DTT、 lx蛋白酶抑制剂和 250 U/mL核酸酶的 lxSDS-PAGE Buffer) 。用细胞刮刀将裂解的细胞收集起来，转移至 1.5 mL EP管中，冰浴 15分钟， 95°C力卩热 5分钟，冰浴冷却， 4°C 12000 rpm离心 5分钟，取上清分装，冻存，用于 WB检测。

[0053] WB检测：使用 10孔的 12<¾ SDS-PAGE胶进行 SDS-PAGE, 上样量每孔 10 μί。

电泳条件： 80 V， 15 min; 180

V，直到溴酚蓝刚好从凝胶中出来为止。将 SDS-PAGE胶上的蛋白质通过电转仪转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为 300 mA， 1小吋。电转完成后，将硝酸纤维素膜用 5%脱脂奶粉封闭 1小吋，然后以 1:500的稀释度加入抗 Zaire型 GP兔血清， 4°C放置过夜。将膜用 WB洗涤液洗涤 4次，每次于摇床上摇动 7分钟。然后加入以 1:5000稀释于 5%脱脂奶粉的 HRP标记的抗小鼠 IgG抗体，室温孵育 1小吋。用 WB洗涤液将膜洗涤 4次，使用 Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Subsrate (MILLIPORE) 进行化学发光反应，使用化学发光成像仪采集不同曝光吋间的图像。结果如图 2所示，其中 1 : 转染 pDC316空载体细胞样品； 2: 转染密码子未优化穿梭质粒 PDC316-GGP细胞样品； 3: 转染密码子优化穿梭质粒 pD C316-GGPopt细胞样品； 4：蛋白质分子质量标准。 2个载体 GP均可在转染的 293 T细胞中良好表达。其中密码子优化后 GP的表达量有所增加，根据灰度分析， G P密码子优化后其在 293T细胞中的表达量约为未优化的 2倍。

[0054] 3. 疫苗的包装、制备和鉴定。

[0055] 3.1疫苗的包装

[0056] 将以上构建好的载体 pDC316-GGP和 pDC316-GGPopt分别与 AdMax腺病毒系统的骨架质粒 pBHGlox_El,3Cre共转染 HEK 293细胞进行重组腺病毒的包装。过程如下：

[0057] a) 转染前一天，将 HEK293细胞接种于六孔板中，每孔 5x10 ⁵

个细胞，培养基为 MEM + 10% FBS，置 37°C含 5% CO ₂细胞培养箱中培养过夜。

[0058] b)转染当天换液，用新鲜的含 10% FBS的 MEM培养基继续培养。待细胞生长至底面积的 80-90%吋，取骨架质粒（pBHGlox_El,

3Cre) 和穿梭质粒，用 Lip_Of_eCtami_ne™2000脂质体按其所附说明书进行转染。具体步骤为：

[0059] (1) 每个转染孔取骨架质粒 4 μ_§，穿梭质粒 1 μ_§，混和均匀。

[0060] (2) 质粒用 300 无血清的 MEM培养液进行稀释，室温放置 5 min。

[0061] (3) 取 10 脂质体用 300 无血清 MEM培养液进行稀释，室温放置 5 min。

[0062] (4) 将两者混和，室温避光放置 30 min。然后将混合物加入到细胞中。

[0063] c) 转染后第二天，将长满的细胞传代于 25 cm ²细胞培养瓶中，用含 5%

FBS的 MEM培养基继续培养，每天观察，待细胞长满瓶底吋，再传入 75 cm ²细胞培养瓶中，每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并幵始出现明显噬斑。待细胞大部分病变并从底部脱落吋进行收毒。

[0064] d)将出毒的细胞培养瓶先后置于 -70°C冰箱和 37°C水浴锅中反复冻融三次，使病毒从病变细胞中充分释放。将冻融液 3000 rpm离心 5 min，收集含病毒的上清液，弃沉淀。该上清即为第一代毒种（P1) ，作为随后大量病毒扩增的毒种。

[0065] 所包装的埃博拉重组腺病毒一代毒种，分别记为 Ad5-GGP和 Ad5-GGPopt。

[0066] 3.2 第一代毒种的鉴定

[0067] 3.2.1 PCR扩增 EBOV-GP全序列

[0068] 使用 pDC316载体的通用引物，扩增 EBOV-GP的全序列，引物序列如下： [0069] pDC316-F: ACGTGGGTATAAGAGGCG

[0070] pDC316-R: CGATGCTAGACGATCCAG

[0071] 根据天根生物病毒基因组 DNA/RNA提取试剂盒（DP315) 说明书，提取埃博拉重组腺病毒一代毒种基因组，使用以上引物，进行 PCR鉴定。

[0072] PCR扩增条件为：

[] [表 1]

[0073] 反应程序为： 94°C 5

[0074] 72。C 10 min

[0075] PCR扩增结果如图 3所示，其中 1 : 阳性对照； 2: DNA分子质量标准（Takam DL2000) ； 3： Ad5-GGPopt—代毒种 DNA/RNA扩增产物； 4: Ad5-GGP—代毒种 DNA/RNA扩增产物。图 3显示目的条带均正确。

[0076] 3.2.2 埃博拉重组腺病毒目标蛋白表达鉴定

[0077] 将埃博拉重组腺病毒一代毒种感染 293

T细胞， 48小吋后收集细胞进行 GP的 Western blot检测，可以看到疫苗感染的细胞均出现了目标条带，结果如图 4所示。其中 1 : Ad5-GGP感染细胞样品； 2: Ad 5-GGPopt感染细胞样品； 3: 空白细胞样品； 4: 蛋白质分子质量标准。

[0078] 3.3 重组腺病毒的扩大培养和纯化

[0079] 3.3.1重组腺病毒工作种子批培育。

[0080] 经构建、鉴定合格的毒种，记为 P1代。将 P1代在 HEK293细胞上感染一次后收获的病毒种子液作为原代种子批（记作 P2代）。从原代种子批随机复苏一支毒种。连续传代 2次构建主种子批（记为 P4代）；从 P4代幵始，连续传代 2次构建工作种子批（记为 P6代）。

[0081] 3.3.2重组腺病毒小规模培养。

[0082] HEK293细胞在 37°C、 5% CO ₂条件下 130 rpm悬浮培养。毒种接种吋，将活度大于 95%的细胞稀释至 1.0xl0 ⁶ cells/mL，终体积为 1L。 P6代重组腺病毒以 MOI 10感染 HEK293细胞， 37°C， 5% CO ₂, 130 rpm摇动培养。每隔 24小吋取样，检测细胞活度和密度。

[0083] 毒种接种 72小吋后，当细胞活度下降到 40%以下吋，每个细胞摇瓶各加入 10 mL吐温 -20 (终浓度 1%) ， 130 rpm, 继续摇动 1小吋。细胞培养液于 6000 rpm离心 30分钟，取上清， -70°C冻存。沉淀用等体积 20 mM Tris， 250 mM NaCl, 1 mM MgCl ₂， pH 7.5重悬，加入 1%的吐温 -20， 130

rpm, 37°C摇 1小吋。悬液于 6000 rpm离心 45分钟，取上清，于 -70°C冻存。

[0084] 3.3.3重组腺病毒的纯化

[0085] 以上 -70°C冻存的重组腺病毒培养液（2瓶共 4L) ，融化后合并。用 300kDa膜包超滤浓缩至 500mL，加入等体积 20mM Tris+150mM NaCl+2mM MgC12 pH7.5 (A 液），超滤换液 3次后，浓缩至最小体积（约 200mL) ，排空膜包及管路后，用少量 A液冲洗管路（约 150mL) ，所得液体合并至超滤浓缩液，混匀。加入 Benz onase (30U/mL) ， 37°C水浴，酶解 4h。

[0086] 采用 Source 30Q和 Sepharose4 FF两步分离纯化腺病毒颗粒；第一步柱层析主要去除大部分杂蛋白质，收集洗脱峰，而第二步柱层析去除杂 DNA分子和部分杂蛋白，收集的是流穿样品。具体过程如下：

[0087] Source 30Q层析： Source 30Q层析过程如图 5所示，层析柱用 A液平衡，上样，上样流速为 5 mL/min;上样结束，用 A液平衡至 Uv基线， 10 m!Jmin, 50 min, 0% B - 20% B梯度洗脱，分管收集洗脱峰，最后 100% B洗脱， B液为 20mM Tris+2 M NaCl+2mM MgC12 pH7.5。洗脱峰出现在 NaCl浓度 530mM左右的缓冲液里。

[0088] Sepharose 4 FF层析：上述洗脱峰使用 Sepharose 4 FF进一步纯化。 Sepharose 4 FF层析过程如图 6所示，流动相为 A液，流速 5mL/min，限压 0.3MPa，收集外水体积峰。纯化后的疫苗经鉴定后用 0.22 μηι—次性滤器过滤除菌，分装保存于 -70 °。冰箱中。

[0089] 3.4 重组腺病毒载体埃博拉疫苗纯化样品的鉴定和滴度测定

[0090] 3.4.1 PCR扩增 EB0V-GP全序列和测序

[0091]

实验方法和过程同 3.2.1，结果如图 7所示，其中 1 : 阳性对照； 2: Ad5-GGPopt纯化样品 DNA/RNA扩增产物； 3: Ad5-GGP纯化样品 DNA/RNA扩增产物； 4: 阴性对照； 5: DNA分子质量标准（Takara DL2000) 。疫苗纯化样品均检测到目标条带。将目标条带胶回收并测序，比对结果表明，疫苗纯品所包含的序列完全正确。

[0092] 3.4.2 WB检测

[0093] 将埃博拉重组腺病毒纯化样品以 MOI=10感染 293 T细胞， 48小吋后收集细胞进行 GP的 Western blot检测，结果如图 8所示，其中 1 : 空白细胞样品； 2: 表达炭疽保护性抗原 PA的重组腺病毒（Ad5-PAopt) 感染细胞样品； 3: Ad5-GGP感染细胞样品； 4： Ad5-GGPopt感染细胞样品； 5: 蛋白质分子质量标准。可以看到疫苗纯化样品感染的细胞均出现了目标条带，对照重组腺病毒感染的细胞和空白细胞没有目标条带。

[0094] 3.4.3 滴度测定

[0095] 使用 Clontech Adeno-X™ Rapid Titer Kit进行重组腺病毒滴度的测定。操作按试剂盒所附说明书进行，具体方法如下：

[0096] a) 将 HEK293细胞接种于 24孔板。细胞密度为 5x10 ⁵

cells/mL, 每孔接种 0.5 mL，培养基为 MEM + 10% FBS;

[0097] b) 使用培养基把将要检测的病毒从 10 -2至 10 -6进行 10倍稀释，制备一系列稀释度的病毒样品，每孔 50 加入到细胞中；

[0098] c) 细胞于 37°C、 5% C02培养箱中培养 48小吋；

[0099] d) 吸弃细胞的培养基，让细胞稍微晾干（不要过干），每孔轻轻加入 0.5 mL冰甲醇，于 -20°C放置 10分钟，对细胞进行固定；

[0100] e) 吸弃甲醇，用 PBS+1% BSA将细胞轻轻地洗 3次，每孔加入 0.25 mL 抗 -Hexon抗体稀释液（1:1000稀释）， 37°C孵育 1小吋；

[0101] f) 吸弃抗 -Hexon抗体，用 PBS+1<¾ BSA将细胞轻轻洗 3次，每孔加入 0.25 mL HRP标记的 Rat Anti-Mouse Antibody (1:500稀释）， 37°C孵育 1小吋；

[0102] g) 在吸弃 0.25 mL HRP标记的 Rat Anti-Mouse Antibody之前，将 lOxDAB底物用 lxStable Peroxidase Buffer稀释成 lxDAB工作液，让其达到室温；

[0103] h) 吸弃 Rat Anti-Mouse Antibody稀释液，用 PBS+1<¾ BSA将细胞轻轻地洗 3 次。每孔加入 0.25 mL DAB工作液，室温放置 10分钟；

[0104] i) 吸弃 DAB工作液，用 PBS将细胞轻轻地洗 2次；

[0105] j) 于显微镜下对棕色 /黑色的阳性细胞进行计数，每孔至少随机计数 3个视野，计算其平均阳性细胞数；

[0106] k) 计算感染滴度（ifu/mL) ，公式如下：

[0107]

[0108] 滴度测定结果显示， Sepharose 4 FF层析洗脱的峰尖，感染滴度达 1.0 xlO ¹⁽⁾ ifu/mL°

[0109] 3.4.4 电镜观察形态

[0110] 3.4.4.1负染

[0111] 将纯化的重组腺病毒液体滴于载网，静置 5-10 min后用滤纸吸去载网边缘多余的液体。于载网未完全干吋，滴上磷钨酸钠染色液，染色 3-5 min，用滤纸吸去载网边缘多余液体，自然干燥，透射电镜观察。结果如图 9所示，其中 A: 放大 2 万倍的观察结果； B : 放大 15万倍的观察结果。重组腺病毒载体埃博拉疫苗的形状与腺病毒一致。

[0112] 3.4.4.2冷冻切片

[0113] 将纯化的重组腺病毒埃博拉疫苗以 MOI 10感染 HEK293细胞，待细胞幵始病变，从培养瓶上脱落吋，收细胞，进行冷冻切片处理，透射电镜观察，结果如图 1 0所示，其中 A: 放大 0.5万倍的观察结果； B: 放大 1.5万倍的观察结果。可以看到细胞内遍布腺病毒样颗粒。

[0114] 实施例 2埃博拉病毒病疫苗在小鼠模型上的免疫学评价。

[0115] 1. 实验材料。

[0116] 1.1实验动物

[0117] SPF级雌性 BALB/c小鼠（4-6周齢），购自军事医学科学院实验动物中心。小鼠于军事医学科学院丰台院动物房饲养。

[0118] 1.2 实验材料

[0119] 突光标记抗体 PerCP/Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD3e (clone 145-2c 11) ， FITC Rat Anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) 购自美国 Biolegend公司；荧光标记抗体 PE Rat Anti-Mouse IFN-γ (clone XMG1.2) ，固定穿透液 Cytofix/ Cytoperm ^TM Fixation and Permeabilizaiton Solution, 洗液 Perm/Wash™ Buffer, BD™ ELISPOT set, BD™ ELISPOT AEC substrate set和阻断 GolgiStop购自美国 BD公司； ACK红细胞裂解液自配； RPMI1640培养基购自弘博康公司； TMB，过氧化脲， PMA和 ionomycin购自美国 sigma公司； BSA购自 Merck公司； HRP标记抗小鼠 IgG抗体购自美国 Santa Cruz公司；截短分泌型 GP (46aa-364aa) 为本室纯化；对照重组腺病毒载体疫苗 Ad5-PAopt为本室构建。 [0120] 2. 小鼠免疫。

[0121] 根据实验设计，将纯化的重组腺病毒埃博拉疫苗和重组腺病毒载体对照疫苗用生理盐水稀释到感染滴度为 2xl0 ⁸ ifu/mL，使用 I mL注射器，经左后腿内侧肌肉注射免疫，每只 50 μί，每只小鼠的免疫剂量为 1x10 7 if_u。小鼠免疫分组情况如下：

[0122] 表 1.体液免疫水平检测及细胞免疫水平免疫后 22周检测小鼠分组情况。

[] [表 2]

[0123] 表 2.细胞免疫水平免疫后 2周检测小鼠分组情况。

[] [表 3]

[0124] 1. 体液免疫水平的检测。

[0125] 3.1采血及血清分离

[0126] 小鼠免疫后，在特定的吋间点上经尾静脉采血。血液于室温静置 1小吋以上。

待血清形成， 5000 rpm离心 10分钟，将血清转移至新的离心管， -20°C冻存，待用。

[0127] 3.2血清抗体水平 ELISA检测

[0128] 实验前一天， ELISA板条用截短分泌型 GP以 4 g/mL的浓度进行包被，于 4°C放置过夜。实验当天，甩弃孔内液体，用 ELISA洗液（PBS+0.1%吐温 -20) 清洗 3 次。甩弃洗液，并于干净吸水纸上拍净孔内液体，每孔加入 120 2% BSA，于 37°C封闭 1小吋。甩弃封闭液，将板清洗 3次，每孔加入 100 样品稀释液（PBST + 0.2% BSA) 。血清样品以特定的初始稀释度进行对倍稀释（初始稀释度通过预实验来确定），每个样品设 8个稀释度。同吋每板设定 2个不加血清的空白对照孔。血清稀释完成后，于 37°C孵育 1小吋。 ELISA板用洗液洗 4次，每孔 100 加入对应稀释好的二抗（抗小鼠 IgG抗体），于 37°C孵育 50分钟。用洗液洗板 4次，甩净孔内的液体，进行显色反应。显色过程为每孔加入 50 的显色液 Α液，再加入 50 的显色液 B液，显色 5分钟后用 2 mol/L硫酸终止反应。最后在酶标仪上检测 450 nm处的吸光值。样品中 OD450大于空白孔 2.1倍读数的孔设为阳性孔。每个血清样品中稀释度最大的阳性孔的稀释倍数记为本样品的抗体滴度。

[0129] 检测结果如图 11所示， GP密码子优化后，埃博拉疫苗免疫小鼠能在更短的吋间内产生抗体，免疫后 1周即可检测到特异性抗体；同吋，抗体水平更高，血清抗体滴度为未优化的 4倍；除此之外，抗体滴度在免疫后 22周以内能够维持在一个稳定的水平上。

[0130] 2. 细胞免疫水平的检测。

[0131] 4.1脾淋巴细胞的分离

[0132] 颈椎脱臼处死，于 70%酒精浸泡 3分钟。将小鼠于生物安全柜内无菌取出脾脏，放到置于无菌平皿中的 200目细胞筛上。加入 10 mL RPMI1640完全培养基，用注射器的活塞将脾轻柔地研磨成单个细胞，再用 20 mL RPMI1640完全培养基冲洗细胞筛，以获得更多的脾细胞。将脾细胞悬液转移至 50 mL离心管中，于 4°C 500g离心 5分钟。弃上清，细胞用 3 mL ACK红细胞裂解液重悬，室温裂解 5分钟，加入 27 mL RPMI1640完全培养基， 4°C 500g离心 5分钟。弃上清，细胞再用 30 mL

RPMI1640完全培养基清洗一次，用适量培养基重悬，经 200目细胞筛过滤至 10 mL试管中，取 50 稀释 20倍后进行计数，待用。

[0133] 2.2 流式细胞术检测特异性细胞因子分泌情况。

[0134] 4.2.1小鼠脾细胞的体外刺激

[0135] 将上面分离的小鼠脾细胞取适量稀释至 4x10 ⁶ cells/mL, 每孔 0.5 mL加入到 24孔板中。每只小鼠的脾细胞分别设特异 CTL表位刺激孔和无刺激孔。特异 CTL表位刺激所使用的肽为 GF-9和 LV-9，浓度分别为 10

g/mL。作为阳性对照，加入 PMA和 ionomycin刺激孔，其中 PMA浓度为 100 ng/mL, ionomycin浓度为 1 g/mL。细胞于 37°C、 5% CO ₂培养箱中培养 1小吋后，每孔各加入适量的 GolgiStop (4 L作用于 6 mL细胞）作为细胞因子分泌的阻断剂。总共培养 6小吋后进行相关抗原的染色，用于细胞内细胞因子的流式细胞术检测。

[0136] 4.2.2细胞表面抗原和细胞内细胞因子的染色

[0137] 脾细胞经体外刺激 6小吋后，转移至流式管中， 4°C， 500g离心 5分钟，弃上清。用 PBS+2<¾

FBS按说明书推荐的使用量先稀释好适量的荧光标记抗体 PerCP/Cy5.5-conjugated anti-CD3 (clone 145-2cl l) 和 FITC conjugated anti-CD8 (clone 53-6.7) ，每管加入 50 μί，轻轻混匀， 4°C放置 30分钟。 30分钟后，每管加入 3 mL PBS+2<¾ FBS ， 4°C， 500g离心 5分钟，弃上清。每管加入 200 Cytofix/ Cytoperm™ Fixation and Permeabilizaiton Solution, 于 4°C放置 20分钟，对细胞进行固定和穿孔。 20分钟后，每管加入 1 mL lxPerm/Wash™ Buffer, 4°C， 600g离心 5分钟，弃上清。用 lxPerm/Wash™ Buffe按说明书推荐使用量先稀释好适量的 PE conjugated anti-IFN-γ (clone XMG1.2) 抗体，每管加 50μί，轻轻混匀，于 4°C放置 30分钟。最后，每管分别用 1 mL lxPerm/Wash™Buffer和 3 mL的 PBS各洗一次，弃上清后用 20(^L PBS重悬，上机检测。为了在检测吋调节各染料间的荧光补偿，设置不染色管、单染 PerCP/Cy5.5-conjugated anti-CD3管、单染 FITC conjugated anti-CD8管和单染 PE conjugated anti-IFN-γ管，其中 PE conjugated anti-IFN-γ单染管使用的是阳性刺激的细胞。

[0138] 4.2.3上机检测

[0139] 使用 Beckman Culter® CyAnTM ADP进行流式细胞术检测。首先调节合适的电压，使用单荧光染色样品调节各染料间的荧光补偿，然后上样。通过 FSC和 SSC 圈出淋巴细胞，设为门 1。从门 1出来的细胞，通过 FL3 (PerCP/Cy5.5) 和 SSC，圈出 CD3细胞，设为门 2。从门 2中出来的细胞，通过 FL1 (FITC) 和 FL2 (PE) 作点图，分析 CD8细胞中 IFN-γ阳性细胞占总 T细胞（CD3细胞）的百分比。或直接圈出 CD8细胞，通过 FL1 (FITC) 和 FL2 (ΡΕ) 作点图，分析 CD8细胞中 IFN-γ 阳性细胞的百分比。使用 Beckman Culter®幵发的 Summit流式分析软件对检测结果进行分析。

[0140] 如图 12所示，结果显示，免疫后 2周和 22周，重组腺病毒埃博拉疫苗免疫小鼠的脾细胞，其 CD8阳性细胞分泌的 IFN-γ的水平明显高于对照疫苗组。而对于 GP 密码子优化与未优化的两种重组腺病毒埃博拉疫苗之间， IFN-γ的分泌水平无统计学差异。

[0141] 4.3细胞因子的 ELISPOT检测

[0142] 使用 BD™ ELISPOT mouse IFN-γ Set进行 IFN-γ的 ELISPOT检测。按试剂盒说明书所给方法进行操作，其方法如下： ELISPOT板用 5 g/mL抗小鼠 IFN-γ抗体包被， 4°C放置过夜。实验前用 RPMI1640+10% FBS培养基于室温封闭 2小吋。实验吋弃封闭液，每孔先加入 100 含有埃博拉病毒 GP

CTL表位 GF-9和 LV-9的 RPMI1640+10<¾

FBS培养基， GF-9和 LV-9的浓度分别为 10 g/mL。按设计每孔加入 100 分离的小鼠脾细胞，细胞浓度为 2χ 10 ⁶ cells/mL。阳性对照孔每孔加入 50 ng/mL的 PMA 和 500 ng/mL的 ionomycin, 同吋设置无刺激对照孔和不加细胞的空白对照孔。细胞于 37°C、 5% CO ₂培养箱中培养 18-24小吋。次日，弃板内细胞，每孔 200 用蒸馏水洗两次，然后用洗液 PBS+0.1%吐温 -20洗 3次，每次放置 2-3分钟。弃板内洗液，每孔 100 加入以 1:250稀释于 PBS+10<¾ FBS的 Biotinylated anti-mouse IFN-γ, 室温放置 2个小吋。 2小吋后弃孔内液体，用洗液洗 3次，每次放置 2-3分钟，每孔加入 100 以 1:100稀释于 PBS+10<¾ FBS的 streptavidin-horseradish peroxidase, 室温放置 1小吋。弃去孔内液体，用洗液洗 4次，然后用 PBS洗 3次。使用 BD™ ELISPOT AEC substrate set进行生色反应。待孔内斑点长至合适大小吋（一般于室温反应 15-25分钟）弃去显色底物，用大量的蒸馏水冲洗以终止反应。将板晾干，使用酶联斑点成像分析系统进行斑点计数。

[0143] 实验结果如图 13所示，无论是免疫后 2周还是免疫后 22周，埃博拉疫苗组免疫小鼠的脾细胞分泌的 IFN-γ的量明显高于对照疫苗组。而 GP密码子优化与未优化的两种重组腺病毒疫苗之间，无论是免疫后 2周还是免疫后 22周，两者免疫小鼠的脾细胞所分泌的 IFN-γ的量无显著性差异。这一结果与流式细胞术检测的结果相一致。

[0144] 3. 免疫学评价小结

[0145] GP密码子优化后，埃博拉重组腺病毒载体疫苗在小鼠模型上虽然细胞免疫水平保持不变，但体液免疫水平明显增高。细胞免疫反应与体液免疫反应对机体抵抗埃博拉病毒感染都是至关重要的。近年来在动物模型中的研究表明，相比于细胞免疫反应，埃博拉 GP特异的 IgG抗体水平与攻毒动物存活的相关性更高（ Wong, G., Richardson, J. S" Pillet, S.， Patel, A., Qiu, X., Alimonti, L, . . . Kobinger,

G. P. (2012) · Immune parameters correlate with protection against ebola virus infection in rodents and nonhuman primates. Sci Transl Med, 4 ( 158) , 158ral46.

10.1126/scitranslmed.3004582) 。后继的研究表明，单克隆抗体混合物 ZMapp可对攻毒 5天后症状明显的恒河猴给予 100%的治疗效果（Qiu, X., Wong, G.， Audet, J., Bello, A., Fernando, L., Alimonti, J. B.， . . . Kobinger, G. P. (2014) . Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp. Nature,

514 (7520) , 47-53. doi: 10.1038/nature 13777) 。尽管 ZMapp在人体上的疗效还没有得到相关的临床论证，但在西非埃博拉疫情中确实有一些接受 ZMapp治疗的患者存活了下来。这些结果充分体现了埃博拉 GP特异的抗体对抵抗埃博拉病毒感染的重要性。我们将 GP密码子优化后，其构建的重组腺病毒载体疫苗免疫后的小鼠，不但抗体产生的吋间提前，而且抗体滴度也明显增高。这一优化将很大程度上改善该疫苗对抵抗埃博拉病毒感染的效果。

工业实用性

[0146] 本发明公幵了一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗，制备方法和在疫苗药物制备中的应用，所述本发明提供的埃博拉病毒病疫苗易于工业化生产，具有工业实用性。

[0147] 序列表

[0148] <110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 [0149]

[0150] <120> 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗

[0151]

[0152] <160> 2

[0153]

[0154] <170> Patentln version 3.3

[0155]

[0156] <210> 1

[0157] <211> 2037

[0158] <212> DNA

[0159] <213> Ebola virus

[0160]

[0161] <■> 1

[0162] atcgaattcg ccgccaccat ggacgccatg aagcggggcc tctgctgtgt tctgctgctc 60 [0163]

[0164] tgcggcgccg tgttcgtgag taactcgatc cctctgggcg tcatccataa ttccaccctg 120 [0165]

[0166] caagtgtccg acgtggacaa gctcgtgtgc cgcgacaagc tgtccagtac caatcagctc 180 [0167]

[0168] cgatccgtcg gtctcaacct ggagggcaac ggtgtcgcca ccgatgtgcc ctccgccacg 240 [0169]

[0170] aagcggtggg gcttcagatc gggcgtgcct ccaaaggtcg taaactacga agccggcgaa 300 [0171]

[0172] tgggccgaga actgttacaa tctggagatc aaaaagcctg atggaagtga gtgtctcccc 360 [0173]

[0174] gcagcccctg acggaatccg aggttttcca aggtgcagat atgtgcacaa ggtctccggc 420 [0175]

[0176] accgggccgt gcgcgggaga cttcgcattc cacaaagagg gggctttttt cctgtacgac 480 ggggg gggggg003024 accaccct cccctctaacaaa aataccaaca catctaaatc ccaactcc 12 ggggggg ggg gggggg¾000022tcp pcpcptppcptppcptcpcp 000__00p012 ggggggg gggg000002 cccataact ccaccataa cacaccat tacaactc acatctccaccacca 12 ¾gg ggggg09801 opoo__opoop ooo__oopo tptctcpct tcpptctpcpcppp. gg ggg gggggggg ggggggg0960801 tccaaacattccaattacat cacatcatcaaac cccttca 1

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[0234] <213> Ebola virus

[0235]

[0236] <400> 2

[0237] atcgaattcg ccgccaccat gggtgttaca ggaatattgc agttacctcg tgatcgattc 60 [0238]

[0239] aagaggacat cattctttct ttgggtaatt atccttttcc aaagaacatt ttccatcccg 120

[0240]

[0241] cttggagtta tccacaatag tacattacag gttagtgatg tcgacaaact agtttgtcgt 180 [0242]

[0243] gacaaactgt catccacaaa tcaattgaga tcagttggac tgaatctcga ggggaatgga 240 [0244]

[0245] gtggcaactg acgtgccatc tgcgactaaa agatggggct tcaggtccgg tgtcccacca 300 [0246]

[0247] aaggtggtca attatgaagc tggtgaatgg gctgaaaact gctacaatct tgaaatcaaa 360 [0248]

[0249] aaacctgacg ggagtgagtg tctaccagca gcgccagacg ggattcgggg cttcccccgg 420 [0250]

[0251] tgccggtatg tgcacaaagt atcaggaacg ggaccatgtg ccggagactt tgccttccac 480 [0252]

[0253] aaagagggtg ctttcttcct gtatgatcga cttgcttcca cagttatcta ccgaggaacg 540 [0254]

[0255] actttcgctg aaggtgtcgt tgcatttctg atactgcccc aagctaagaa ggacttcttc 600 [0256]

[0257] agctcacacc ccttgagaga gccggtcaat gcaacggagg acccgtcgag tggctattat 660 [0258]

[0259] tctaccacaa ttagatatca ggctaccggt tttggaacta atgagacaga gtacttgttc 720 [0260] /3/:/ O 9ϊοεοϊ9ϊ1£ s/-/JoiAV

囊固od職

【寸 os

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Claims

权利要求书

[权利要求 1] 一种编码埃博拉病毒 GP蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1所示。

[权利要求 2] 一种含有权利要求 1所述核苷酸序列的载体。

[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的载体，其特征在于，所述载体为 pDC316。

[权利要求 4] 一种能够表达权利要求 1所述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒。

[权利要求 5] 根据权利要求 4所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒载体来源于 AdMax腺病毒系统。

[权利要求 6] 权利要求 4或 5所述重组腺病毒载体在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。

[权利要求 7] 根据权利要求 6所述的应用，其特征在于，所述重组腺病毒被制备为注射剂。

[权利要求 8] 一种制备权利要求 5所述的人复制缺陷重组腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(1) 构建含有埃博拉病毒 GP蛋白核苷酸编码序列的穿梭质粒载体；

(2) 将步骤（1) 所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；

(3) 培养步骤（2) 所述宿主细胞；

(4) 收获从步骤（3) 所述细胞释放的人复制缺陷重组腺病毒。

[权利要求 9] 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤（1) 所述载体为 pDC

316。

[权利要求 10] 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤（2) 所述骨架质粒为 pBHGlox_El,3Cre。

[权利要求 11] 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于，步骤（3) 所述细胞为 HEK

293细胞。

[权利要求 12] 根据权利要求 8所述的方法，其特征在于，在步骤（4) 中采用 Source

30Q和 Sepharose4 FF两步法柱层析对重组腺病毒进行提取并纯化。