EA037903B1 - ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА SARS-CoV-2 (ВАРИАНТЫ) - Google Patents
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА SARS-CoV-2 (ВАРИАНТЫ) Download PDFInfo
- Publication number
- EA037903B1 EA037903B1 EA202000368A EA202000368A EA037903B1 EA 037903 B1 EA037903 B1 EA 037903B1 EA 202000368 A EA202000368 A EA 202000368A EA 202000368 A EA202000368 A EA 202000368A EA 037903 B1 EA037903 B1 EA 037903B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cov
- mouse
- pfu
- rbd
- sars
- Prior art date
Links
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 121
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 230000036039 immunity Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 title abstract description 12
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 claims abstract description 15
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 claims description 94
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 79
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 50
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 48
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 claims description 46
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 38
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 30
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 27
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 27
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 21
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 claims description 18
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 claims description 18
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims description 12
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 claims description 9
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 claims description 9
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 370
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 34
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 33
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 31
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 30
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 16
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 15
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 12
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 10
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 10
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 9
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 9
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 8
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 108091005634 SARS-CoV-2 receptor-binding domains Proteins 0.000 description 6
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 4
- 108091005774 SARS-CoV-2 proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 4
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100035765 Angiotensin-converting enzyme 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000975 Angiotensin-converting enzyme 2 Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 101000629318 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 2
- 206010046914 Vaginal infection Diseases 0.000 description 2
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108010068617 neonatal Fc receptor Proteins 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 101800001779 2'-O-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101800003073 2'-O-methyltransferase nsp16 Proteins 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 241000701114 Canine adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 206010007556 Cardiac failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000288673 Chiroptera Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 101800001632 Envelope protein E Proteins 0.000 description 1
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 101100233255 Mus musculus Ipp gene Proteins 0.000 description 1
- 101100513472 Mus musculus Minpp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101800001255 Putative 2'-O-methyl transferase Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 102000044437 S1 domains Human genes 0.000 description 1
- 108700036684 S1 domains Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 101100203795 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 S gene Proteins 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137302 Surface antigen S Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 206010001053 acute respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester Chemical compound C=1C(OC(=O)C)=CC=C2C=1OC1=CC(OC(C)=O)=CC=C1C2(C1=C2)OC(=O)C1=CC=C2C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JGPOSNWWINVNFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K trisodium;2-dodecylbenzenesulfonate;3-dodecylbenzenesulfonate;4-dodecylbenzenesulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1.CCCCCCCCCCCCC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O AVWQQPYHYQKEIZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/543—Mucosal route intranasal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
- A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10061—Methods of inactivation or attenuation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/20011—Coronaviridae
- C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Mycology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии, в частности к иммунобиологическому средству для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2. Также раскрыт способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих одного или более иммунобиологических средств для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2. Изобретение позволяет эффективно индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2.
Description
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники
SARS-CoV-2 - новый штамм коронавируса, выделенный в конце 2019 года в г. Ухань (Китай), который за несколько месяцев распространился во всему миру. В январе 2020 года Всемирная организация здравоохранения объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию. В начале апреля 2020 г количество заболевших превысило 1 млн человек, а количество погибших - 60 тыс. человек.
Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2, получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресссиндром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии и др.
SARS-CoV-2 распространяется путем передачи от человека человеку воздушно-капельным путем или при прямом контакте. Репродуктивный индекс SARS-CoV-2 (Basic reproduction number, R0), т.е. количество людей, которые заражаются от одного инфицированного человека, по разным источникам составляет от 2,68 (Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet. 2020) до 6,6 (Sanche S, Lin YT, Xu C, Romero-Severson E, Hengartner N, Ke R. The Novel Coronavirus, 2019-nCoV, is Highly Contagious and More Infectious Than Initially Estimated. medRxiv. 2020), а средний инкубационный период составляет 5,2 дня (Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020).
Филогенетические исследования штаммов, выделенных от больных COVID-19, показали, что наиболее близкие к SARS-CoV-2 вирусы обнаруживаются у летучих мышей (Zhou P. et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579: 270-273). Также, предполагается, что другие виды млекопитающих могут быть промежуточными хозяевами, в которых SARSCoV-2 смог приобрести некоторые или все мутации, необходимые для эффективной передачи человеку (Zhang YZ, Holmes EC. A Genomic Perspective on the Origin and Emergence of SARS-CoV-2. Cell. 2020 Mar 26.)
Высокий процент смертности, быстрое географическое распространение SARS-CoV-2 и нечетко определенная этиология заболевания создали острую необходимость в создании эффективных средств профилактики и лечения заболеваний, вызываемых данным вирусом.
За прошедшие годы было предпринято немало усилий по созданию различных вакцин против коронавирусных инфекций. Разработанные кандидатные вакцины можно классифицировать на шесть типов: 1) вакцины на основе вирусных векторов; 2) ДНК-вакцины; 3) субъединичные вакцины; 4) вакцины на основе наночастиц; 5) вакцины на основе инактивированного цельного вируса; 6) живые аттенуированные вакцины. Данные вакцины были основаны на различных вирусных белках, таких как белок нуклеокапсида N, белок оболочки Е, белок NSP16, S белок коронавируса (Ch. Yong et al. Recent Advances in the Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus. Front Microbiol. 2019 Aug 2;10:1781). Часть из этих препаратов находится на стадии клинических исследований (https://www.clinicaltrials.gov/). Однако, данные препараты не эффективны против нового вируса SARSCoV-2, это объясняется главным образом низкой гомологией данного коронавируса с возбудителями заболеваний человека SARS-CoV и MERS-CoV. Так, например, степень гомологии между S белком SARSCoV-2 и SARS-CoV составляет всего 76% (Xu X, Chen P, Wang J, Feng J, Zhou H, Li X, et al. Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Sci China Life Sci. 2020;63(3):457-60). Таким образом, на данный момент не существует ни одной зарегистрированной вакцины против заболеваний вызываемых SARS-COV-2.
Известно решение по патенту US 7452542 B2, в котором предлагается использование живой аттенуированной коронавирусной вакцины, в которой указанный вирус характеризуется как содержащий геном, кодирующий полипептид ExoN, включающий замену на тирозин6398 MHV-A59 или его аналогичное положение, и полипептид Orf2a, содержащий замену на лейцин106 MHV-A59 или его аналогичное положение, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
Известно решение по патенту WO 2016116398 A1, в котором рассматривается вакцина против коронавируса MERS-CoV, представляющая собой N-нуклеокапсидный белок вируса MERS-CoV и/или его иммуногенный фрагмент или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую N-нуклеокапсидный белок MERS-CoV и/или его иммуногенный фрагмент.
Известно решение по патенту CN 100360557 C, в котором описано использование S белка вируса SARS, который имеет мутацию в одном из положений: 778D^Y; 77D^G; 244T^I; 1182K^Q; 360F^S;
- 1 037903
479N^R или K; 480D^-G; 609A^L для производства вакцины против тяжелого острого респираторного синдрома. Дата приоритета заявки 10.07.2003.
Известно решение по заявке на изобретение US 20080267992 A1, где описана вакцина против тяжелого острого респираторного синдрома на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV или последовательность, которая включает домен S1 антигена S вируса SARS-CoV или домен S2 антигена S вируса SARS-CoV, или оба домена. Кроме того, данный рекомбинантный аденовирус в составе экспрессионной кассеты содержит промотор цитомегаловируса человека (CMV-промотор) и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (polyA BGH).
Данный патент как наиболее близкий по техническому решению был выбран авторами заявляемого изобретения за прототип. Существенным недостатком данного решения является использование антигенов вируса другого вида семейства коронавирусов.
Таким образом, в уровне техники существует острая потребность в разработке нового иммунобиологического средства, обеспечивающего индукцию эффективного иммунного ответа против коронавируса SARS-CoV-2.
Раскрытие изобретения
Целью изобретения является создание иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2.
Технический результат заключается в создании эффективного средства для индукции специфического иммунитета к SARS-Cov-2.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена (SEQ ID NO: 2).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARSCoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fcфрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARSCoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO: 4).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARSCoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO: 5).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARSCoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 6).
Также указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARSCoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) в комбинации с иммунобиологическими средствами (SEQ ID NO: 2), и/или (SEQ ID NO: 3), и/или (SEQ ID NO: 4), и/или (SEQ ID NO: 5), и/или (SEQ ID NO: 6).
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих одного или более средств (SEQ ID NO: 1), и/или (SEQ ID NO: 2), и/или (SEQ ID NO: 3), и/или (SEQ ID NO: 4), и/или (SEQ ID NO: 5), и/или (SEQ ID NO: 6) в эффективном количестве.
- 2 037903
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где последовательно вводят в организм млекопитающих два различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или два различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю.
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где последовательно вводят в организм млекопитающих любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с интервалом более чем в 1 неделю.
Также указанный технический результат достигается способом индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, где одновременно вводят в организм млекопитающих любые два иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа.
Сущность заявленной группы изобретений поясняется чертежами, где на фиг. 1-5 представлены результаты оценки эффективности иммунизации.
Осуществление изобретения
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, Sdel, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %;
Ось абсцисс - различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
На фиг. 2 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, Sdel, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 по оценке доли пролиферирующих CD4+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %;
Ось абсцисс - различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, Sdel, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S SARS-CoV-2, на 8 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %;
Ось абсцисс - различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
- 3 037903
2) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
На фиг. 4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, Sdel, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 по оценке доли пролиферирующих CD8+ лимфоцитов, рестимулированных гликопротеином S вируса SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %;
Ось абсцисс - различные группы животных:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
На фиг. 5 представлены результаты оценки эффективности разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, RBD, S-del, S-Fc, RBDG, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 по оценке прироста концентрации ИФН-гамма в среде после стимуляции спленоцитов иммунизированных аденовирусными конструкциями мышей линии C57/BL6 рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, на 15 день после иммунизации испытуемых животных.
Ось ординат - значения прироста концентрации ИФН-гамма в среде стимулированных клеток при сравнении с интактными клетками (разы).
Ось абсцисс - исследуемые группы животных: интактные животные и животные, которым вводили по 108 БОЕ/мышь:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
Первым этапом в разработке иммунобиологического средства против коронавируса SARS-CoV-2 являлся выбор вакцинного антигена. В ходе работы был проведен литературный поиск, который показал, что наиболее перспективным антигеном для создания кандидатной вакцины является S белок коронавируса. Это трансмембранный гликопротеин I типа, который отвечает за связывание, слияние и проникновение вирусных частиц в клетку. Было показано, что он является индуктором нейтрализующих антител (Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. Biomed Environ Sci. 2005 Dec; 18(6):363-74).
S белок состоит из сигнального пептида (аминокислоты 1-12) и 3 доменов: внеклеточного домена (аминокислоты 13-1193), трансмембранного домена (аминокислоты 1194-1215), внутриклеточного домена (аминокислоты 1216-1255). Внеклеточный домен состоит из 2 субъединиц S1 и S2, и небольшого участка между ними, функции которого до конца не ясны. Субъединица S1 отвечает за связывание вируса с рецептором АСЕ2 (angiotensin-converting enzyme 2). Участок, который находится в среднем регионе субъединицы S1 (аминокислоты 318-510) называется рецептор-связывающим доменом (receptor-binding domain (RBD)). Субъединица S2, которая содержит предполагаемый пептид слияния (putative fusion peptide) и два гептадных повтора (heptad repeats (HR1 and HR2)), отвечает за слияние между вирусом и целевой клеточной мембраной. Инфекция инициируется связыванием RBD субъединицы S1 вируса с клеточным рецептором АСЕ2. После этого формируется ядро слияния между HR1 и HR2 регионами субъединицы S2, что влечет за собой сближение вирусной и клеточной мембран, которые в результате сливаются и вирус проникает в клетку. Следовательно, использование S белка или его фрагментов, в составе вакцины, может индуцировать антитела, блокирующие проникновение вируса в клетку.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы предложили раз
- 4 037903 личные варианты модификаций данного антигена, а также возможность его комбинации с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита для повышения уровня экспрессии целевого белка.
Было получено 6 различных вариантов нуклеотидных последовательностей (модифицированного гена S вируса SARS-CoV-2 либо рецептор-связывающего домена белка S) путем оптимизации данных последовательностей под экспрессию в клетках млекопитающих.
Далее было разработано несколько конструкций на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов для эффективной доставки модифицированных генов в клетки млекопитающих. Аденовирусные векторы были выбраны, поскольку они обладают такими преимуществами, как безопасность, широкий диапазон тканевого тропизма, хорошо охарактеризованный геном, легкость генетических манипуляций, способность включать большие вставки трансгенной ДНК, присущие им свойства адъюванта, способность индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ.
Из ряда известных аденовирусов, наиболее исследованными являются аденовирусы человека 5-го серотипа, поэтому они стали основой для создания векторов для генотерапии. Были разработаны технологии получения векторов первого и второго поколений, химерных векторов (содержащих белки вирусов других серотипов) (J.N. Glasgow et al., An adenovirus vector with a chimeric fiber derived from canine adenovirus type 2 displays novel tropism, Virology, 2004, № 324, 103-116) и ряда других векторов. Также были созданы векторы, производные от других серотипов, например 26-го (Н. Chen et al., Adenovirus-Based Vaccines: Comparison of Vectors from Three Species of Adenoviridae, Virology, 2010, № 84(20), 1052210532).
Векторы на основе аденовируса человека 26-го серотипа показывают высокий уровень иммуногенности у приматов, где они способны индуцировать мощный CD8+ T-клеточный ответ, качественно превосходящий Т-клеточный ответ при введении в организм векторов на основе аденовируса человека 5-го серотипа (J. Liu et al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844-4852). При этом происходит распознавание большего числа эпитопов и индукция выработки более широкого спектра факторов, а не преимущественно интерферона гамма (J. Liu et al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844-4852). Эти данные позволяют предполагать, что векторы на основе аденовируса человека 26-го серотипа обладают фундаментальными отличиями в способности индуцировать формирование иммунного ответа на целевой антиген относительно других аденовирусных векторов.
Изобретение по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа, или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 на основании последовательностей генов белка S вируса SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1).
Изобретение по варианту 2 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена (SEQ ID NO: 2).
Изобретение по варианту 3 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARSCoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 3).
Изобретение по варианту 4 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса (SEQ ID NO: 4).
Изобретение по варианту 5 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (SEQ ID NO: 5).
Изобретение по варианту 6 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа или рекомбинантный аденовирус человека 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность рецептор-связывающего домена белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (SEQ ID NO: 6).
Разработан способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий во введении в организм млекопитающих одного или более средств по вариантам 1-6 в эффективном количестве. Данный способ предусматривает:
1) последовательное введение в организм млекопитающих двух различных иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или двух различных иммуно
- 5 037903 биологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по вариантам 16 с интервалом более чем в 1 неделю;
2) последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и любое из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю, или в последовательном введении в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа и любого из иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по вариантам 1-6 с интервалом более чем в 1 неделю;
3) одновременное введение в организм млекопитающих любых двух иммунобиологических средств на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа по п.1, и/или п.2, и/или п.3, и/или п.4, и/или п.5, и/или п.6.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение различных вариантов гликопротеина S SARS-CoV-2.
На первом этапе работы авторы разработали несколько модификаций вакцинного антигена для достижения наиболее эффективного иммунного ответа.
За основу был взят S белок вируса SARS-CoV-2 с последовательностью SEQ ID NO: 1, который затем был модифицирован несколькими способами:
1) Для представления белка S на плазматической мембране была произведена деления 18 аминокислот на С'-конце белка S (S-del) SEQ ID NO: 2 (использована для варианта 2).
2) Кроме того, была получена оптимизированная экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (использована для варианта 3). Такая модификация усиливает иммуногенность за счет возможного связывания Fc фрагмента белка с Fc рецептором на антиген-презентирующих клетках (Li Z., Palaniyandi S., Zeng R., Tuo W., Roopenian D.C., Zhu X., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2011, № 108, 4388-93), а также увеличивает стабильность белка и продлевает период его полу-жизни in vivo (Zhang M.Y., Wang Y., Mankowski M.K., Ptak R.G., Dimitrov D.S., Cross-reactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2009, № 27, 857-863).
3) Для исследования иммуногенности только рецептор-связывающего домена (RBD) белка S вируса SARS-CoV-2 в секретируемой форме, была создана последовательность SEQ ID NO: 4 (использована для варианта 4), содержащая последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (добавлена для секреции белка).
4) Для исследования RBD белка S вируса SARS-CoV-2 в несекретируемой форме, была выбрана последовательность SEQ ID NO: 5 (использована для варианта 5), состоящая из RBD белка S вируса SARSCoV-2, к которой была добавлена последовательность трансмембранного домена гликопротеина вируса везикулярного стоматита (RBD-G).
5) Для исследования секретируемой формы RBD белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 была выбрана последовательность SEQ ID NO: 6 (использована для варианта 6). Добавление Fc-фрагмента от человеческого IgG1 усиливает иммуногенность за счет возможного связывания Fc фрагмента белка с Fc рецептором на антигенпрезентирующих клетках (Z. Li et al., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2011, № 108, 4388-4393), а также может усилить стабильность белка и продлить период полужизни in vivo (M.Y. Zhang et al., Crossreactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2008, № 27, 857-63).
Пример 2. Получение генетических конструкций, кодирующих ген белка S в различных вариантах.
На следующем этапе работы аминокислотные последовательности по примеру 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6) были переведены в нуклеотидные последовательности. Далее была проведена оптимизация полученных последовательностей под экспрессию в клетках млекопитающих. Все нуклеотидные последовательности были получены методом синтеза компанией ЗАО Евроген (Москва). В итоге были получены следующие генетические конструкции:
1) pVax-S-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARSCoV-2;
2) pVax-S-del-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность гена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена;
3) pVax-S-Fc-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARSCoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1;
4) pAL2-T-RBD-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего
- 6 037903 домена белка S с последовательностью гена лидерного пептида;
5) pAL2-T-RBD-G-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с геном G вируса везикулярного стоматита;
6) pAL2-T-RBD-Fc-CoV-2, содержащая нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью гена лидерного пептида и нуклеотидной последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1.
Далее с помощью методов генной инженерии последовательность гена белка S из конструкции pVax-S-CoV-2 была клонирована с использованием эндонуклеазы рестрикции XbaI в челночную плазмиду pShuttle-CMV (StrataGen, США) и полученная плазмида была названа pShuttle-S-CoV-2. Таким образом, была создана челночная плазмида pShuttle-S-CoV-2, несущая оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность аминокислотной последовательности S (SEQ ID NO: 1), полученной в примере 1.
Аналогично нуклеотидные последовательности модифицированных вариантов белка S SARS-CoV2 были клонированы в челночную плазмиду pShuttle-CMV (StrataGen, США) и были получены следующие челночные плазмиды:
pShuttle-S-del-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность гена S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце);
pShuttle-S-Fc-CoV-2, содержащая оптимизированную нуклеотидную последовательность полного гена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1;
pShuttle-RBD-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецепторсвязывающего домена S SARS-CoV-2);
pShuttle-RBD-G-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецепторсвязывающего домена S SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита);
pShuttle-RBD-Fc-CoV-2 (содержит оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARS-CoV-2 с оптимизированной последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1).
Пример 3. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа.
На следующем этапе работы была получена рекомбинантная аденовирусная плазмида pAd5-S-CoV2, содержащая оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S SARS-CoV-2 (SEQ ID NO: 1) (вариант 1). Данная плазмида была получена методом гомологичной рекомбинации между плазмидой pAd, содержащей геномную часть аденовируса человека 5 серотипа с удаленной Е1 и Е3 областями, и челночной плазмидой pShuttle-S (полученной в примере 3), несущей гомологичные участки генома аденовируса и экспрессионную кассету с целевым геном (белка S). Для этого, полученная в примере 3 челночная плазмида pShuttle-S была линеаризована эндонуклеазой рестрикции PmeI.
Гомологичную рекомбинацию проводили в клетках Е.coli штамма BJ5183. Плазмиду pAd смешивали с плазмидой pShuttle-S, а затем полученной смесью трансформировали клетки E.coli методом электропорации согласно руководству MicroPulser™ Electroporation Apparatus Operating Instructions and Applications Guide (Bio-Rad, США). После трансформации клетки E.coli штамма BJ5183 высевали на чашки с LB-агаром, содержащим селективный антибиотик и подращивали в течение 18 ч при температуре 37°С. Эффективность трансформации составляла 101-1011 трансформированных клонов на 1 мкг плазмиды pBluescript II SK(-).
В результате гомологичной рекомбинации в плазмиде pAd появлялась кассета с целевым трансгеном (белка S), и менялся ген устойчивости к антибиотику.
Таким образом, была сконструирована рекомбинантная аденовирусная плазмида pAd5-S-CoV-2, содержащая полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа (с делетированными Е1 и Е3 областями генома) со встроенной генетической конструкцией, полученной в примере 3. Далее плазмиду pAd5-S-CoV-2 гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Рас I и трансфецировали ею пермессивную культуру клеток эмбриональной почки человека линии НЕК 293. Клетки линии НЕК 293 содержат в своем геноме встроенную область Е1 генома аденовируса человека 5-го серотипа, благодаря чему в них может происходить размножение рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов человека 5-го серотипа. На шестой день после трансфекции проводили первые слепые пассажи для более эффективного получения рекомбинантного аденовируса. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживали для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Активность препарата pAd5-S-CoV-2 здесь и далее оценивали стандартным методом титрования на культуре чувствительных клеток 293 НЕК в реакциях бляшкообразования.
Для подтверждения создания конструкции предлагаемой рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующей ген S вируса SARS-CoV-2, прово
- 7 037903 дили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по известной стандартной методике.
Аналогичным образом были получены еще пять рекомбинантных аденовирусов: Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены варианты иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего:
1) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARSCoV-2 (вариант 1);
2) оптимизированную нуклеотидную последовательность протективного антигена S вируса SARSCoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена (вариант 2);
3) оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 3);
4) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (вариант 4);
5) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (вариант 5);
6) оптимизированную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 6).
Пр имер 4. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
На первом этапе, в рекомбинантный вектор pAd26-ORF6-Ad5 была помещена экспрессионная кассета с геном S SARS-CoV-2. Для этого вектор pAd26-ORF6-Ad5 был линеаризован с помощью эндонуклеазы рестрикции PmeI, а плазмидная конструкция pShuttle-S, полученная в примере 3 была обработана эндонуклеазами рестрикции PmeI. Продукты гидролиза лигировали, после чего при помощи стандартных методов была получена плазмида pAd26-S-CoV-2.
На следующем этапе плазмиду pAd26-S-CoV-2 гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Pad и SwaI и трансфецировали ею пермессивную культуру клеток линии НЕК 293. На третий день после трансфекции проводили первые слепые пассажи для более эффективного получения рекомбинантного аденовируса. После наступления цитопатического действия вируса (данные микроскопирования), клетки с культуральной средой трехкратно перемораживали для разрушения клеток и выхода вируса. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов. Активность препарата pAd26-S-CoV-2 здесь и далее оценивали стандартным методом титрования на культуре клеток 293 НЕК в реакции бляшкообразования.
Для подтверждения создания конструкции предлагаемой рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, экспрессирующей ген S SARSCoV-2, проводили полимеразную цепную реакцию (ПЦР) по известной стандартной методике.
Аналогичным образом были получены еще пять рекомбинантных аденовирусов: pAd26-S-dek-CoV2, pAd26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены варианты иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащего:
1) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена S SARSCoV-2 (вариант 1);
2) оптимизированную нуклеотидную последовательность протективного антигена S вируса SARSCoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена (вариант 2);
3) оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность полного протективного антигена S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 3);
4) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида (вариант 4);
5) оптимизированную нуклеотидную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита (вариант 5);
6) оптимизированную последовательность рецептор-связывающего домена белка S с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 (вариант 6).
Пример 5. Проверка экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии НЕК293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа.
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2 экспрессировать различные варианты гена белка S в клетках млекопитающих.
Клетки НЕК293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% СО2. Клетки помещали на 35 мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавили
- 8 037903 исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2), контрольный препарат (Ad5-null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок) из расчета 100 БОЕ/клетку и фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонат-бикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи 4°С.
Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 ч 37°С на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100 мкл сыворотки крови реконвалесцента. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 ч. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 ч. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 1 ч. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 мин, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.
Таблица 1 Результаты эксперимента по проверке экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARSCoV-2 в клетках линии НЕК293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа
Среднее значение оптической плотности при длине волны 450 нм | |
ФСБ | 0,19 (±0,05) |
Ad5-null | 0,23 (±0,08) |
Ad5-S-CoV-2 | 1,85 (±0,15) |
Ad5-S-del-CoV-2, | 1,63 (±0,19) |
Ad5-S-Fc-CoV-2 | 1,57 (±0,30) |
Ad5-RBD-CoV-2 | 1,47 (±0,21) |
Ad5-RBD-G-CoV-2 | 1,52 (±0,19) |
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 | 1,58± (0,11) |
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5RBD-Fc-CoV-2 наблюдалась экспрессия различных вариантов целевого белка.
Пример 6. Проверка экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARS-CoV-2 в клетках линии НЕК293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа.
Целью данного эксперимента была проверка способности сконструированных рекомбинантных аденовирусов pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-GCoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2 экспрессировать различные варианты гена белка S в клетках млекопитающих.
Клетки НЕК293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% СО2. Клетки помещали на 35 мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения 70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавили исследуемые препараты рекомбинантных аденовирусов (pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-FcCoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2), контрольный препарат (Ad26null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок) из расчета 100 БОЕ/клетку и фосфатносолевой буфер (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Через 2 суток после трансдукции клетки собрали, лизировали в 0,5 мл однократного буфера CCLR (Promega), лизат развели карбонатбикарбонатным буфером и внесли в лунки планшета для ИФА. Инкубировали планшет в течение ночи 4°С.
Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл блокирующего буфера, накрыли крышкой и инкубировали 1 ч 37°С на шейкере при 400 об/мин. Далее промыли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку и внесли по 100 мкл сыворотки крови реконвалесцента. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 ч. Далее промы
- 9 037903 ли лунки планшета однократным буфером для промывки трижды объемом 200 мкл на лунку, затем внесли 100 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с биотином. Накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 ч. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 1 ч. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 мин, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.
Таблица 2
Результаты эксперимента по проверке экспрессии различных вариантов гена гликопротеина S SARSCoV-2 в клетках линии НЕК293 после добавления иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа
Среднее значение оптической плотности при длине волны 450 нм | |
ФСБ | 0,17 (±0,08) |
Ad26-null | 0,22 (±0,09) |
Ad26-S-CoV-2 | 1,68 (±0,21) |
Ad26-S-del-CoV-2 | 1,65 (0,14) |
Ad26-S-Fc-CoV-2 | 1,71 (±0,13) |
Ad26-RBD-CoV-2 | 1,61 (±0,18) |
Ad26-RBD-G-CoV-2 | 1,45 (±0,22) |
Ad26-RBD-Fc-CoV-2 | 1,51± (0,14) |
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2 наблюдалась экспрессия различных вариантов целевого белка.
Пример 7. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем однократного введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку гликопротеина SARS-CoV-2.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против гликопротеина SARS-CoV-2 через 21 день после однократной внутримышечной иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный аденовирус человека 5-го или 26-го серотипа, содержащий оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии C57BL/6, самки 18 г. Все животные были разделены на 43 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили:
1) Ad5-S-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
2) Ad5-S-del-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
з) Ad5-S-Fc-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
4) Ad5-RBD-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
5) Ad5-RBD-G-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
7) Ad5-null 107 БОЕ/мышь;
8) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
9) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
10) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
11) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
12) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
- 10 037903
13) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
14) Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
15) Ad5-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
16) Ad5-S-del-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
17) Ad5-S-Fc-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
18) Ad5-RBD-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
19) Ad5-RBD-G-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
20) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
21) Ad5-null 109 БОЕ/мышь;
22) Ad26-S-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
23) Ad26-S-del-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
24) Ad26-S-Fc-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
25) Ad26-RBD-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
26) Ad26-RBD-G-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
27) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 107 БОЕ/мышь;
28) Ad26-null 107 БОЕ/мышь;
29) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
30) Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
31) Ad26-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
32) Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
33) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
34) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
35) Ad26-null 108 БОЕ/мышь;
36) Ad26-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
37) Ad26-S-del-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
38) Ad26-S-Fc-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
39) Ad26-RBD-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
40) Ad26-RBD-G-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
41) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 109 БОЕ/мышь;
42) Ad26-null 109 БОЕ/мышь;
43) фосфатно-солевой буфер.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу.
1) Белок (S) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 ч при температуре +4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась забивка планшета 5% молоком, растворенном в TPBS в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных мышей. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 ч при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 мин добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в табл. 1.
- 11 037903
Таблица 3
Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител)
Рекомбинантный аденовирус | БОЕ/мышь | ||
107 | 108 | 109 | |
Ad5-null | 0 | 0 | 0 |
Ad5-S-CoV-2 | 1:10809 | 1:18820 | 1:57052 |
Ad5-S-del-CoV-2 | 1:21619 | 1:28526 | 1:114105 |
Ad5-S-Fc-CoV-2 | 1:14263 | 1:18820 | 1:57052 |
Ad5-RBD-CoV-2 | 1:12417 | 1:14263 | 1:99334 |
Ad5-RBD-G-CoV-2 | 1:32768 | 1:49667 | 1:172951 |
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 | 1:10809 | 1:12417 | 1:28526 |
Ad26-null | 0 | 0 | 0 |
Ad26-S-CoV-2 | 1:18820 | 1:24834 | 1:43238 |
Ad26-S-del-CoV-2 | 1:24834 | 1:43238 | 1:57052 |
Ad26-S-Fc-CoV-2 | 1:28526 | 1:32768 | 1:86475 |
Ad26-RBD-CoV-2 | 1:12417 | 1:18820 | 1:86475 |
Ad26-RBD-G-CoV-2 | 1:24834 | 1:32768 | 1:150562 |
Ad26-RBD-Fc-CoV-2 | 1:9410 | 1:12417 | 1:24834 |
Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое средство, введенное в организм млекопитающего, индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2 во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 8. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, SFc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю, для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 29 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
2) фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
4) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
8) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
9) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
10) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
11) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
12) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
13) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
14) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
15) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
16) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
17) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
18) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
19) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
20) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
21) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
22) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
23) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
24) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
25) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
26) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
27) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
28) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
29) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
30) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
- 12 037903
31) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
32) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
33) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
34) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
35) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
36) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
37) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
38) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
39) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 BOE/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
40) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
41) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь. Результаты представлены в табл. 4 и 5.
Таблица 4
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Вторая иммунизация (через неделю) | |||
PBS | Ad5-null | ||
Первая | PBS | 0 | 0 |
иммунизация | Ad5-null | 0 | 0 |
Таблица 5
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Вторая иммунизация (через неделю) | |||||||
Первая иммунизация | Ad5-S- CoV-2 | Ad5-Sdel-CoV- 2 | Ad5-S- Fc-CoV- 2 | Ad5- RBD- CoV-2 | Ad5- RBD- G-CoV-2 | Ad5- RBD-Fc- CoV-2 | |
Ad5-S- CoV-2 | 1:32768 | 1:131072 | 1:104032 | 1:131072 | 1:65536 | 1:104032 | |
Ad5-S-del- CoV-2 | 1:65536 | 1:131072 | 1:131072 | 1:131072 | 1:65536 | 1:104032 | |
Ad5-S-Fc- CoV-2 | 1:65536 | 1:104032 | 1:65536 | 1:104032 | 1:52016 | 1:131072 | |
Ad5-RBD- CoV-2 | 1:52016 | 1:65536 | 1:131072 | 1:65536 | 1:32768 | 1:52016 | |
Ad5-RBD- G-CoV-2 | 1:13107 2 | 1:131072 | 1:104032 | 1:131072 | 1:65536 | 1:104032 | |
Ad5-RBD- Fc-CoV-2 | 1:82570 | 1:131072 | 1:65536 | 1:32768 | 1:65536 | 1:65536 |
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами в различных комбинациях, включающими различные формы белка S SARS-CoV-2 вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же антигеном.
Пример 9. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
Пролиферативный анализ позволяет оценивать способность лимфоцитов усиленно делиться после встречи с антигеном. Для того чтобы оценить пролиферацию, авторы использовали окраску лимфоцитов флуоресцентным красителем CFSE. Данный краситель связывается с клеточными белками, и сохраняется долгое время и при этом никогда не передается соседним клеткам в популяции. Однако флуоресцентная метка передается дочерним клеткам. Концентрация метки, а, следовательно, и интенсивность флуоресценции, снижаются ровно в два раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать по уменьшению их флуоресценции.
В эксперименте использовались мыши линии C57BL/6. Все животные были разделены на 8 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
8) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
- 13 037903
Дозы рекомбинантных аденовирусов были выбраны на основании данных, полученных при определении титра антител.
Через две недели животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (B.J. Quah et al., Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Nature Protocols, 2007, № 2(9), 2049-2056) и культивировали в присутствие антигена. Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены на фиг. 1-4. Таким образом, можно заключить, что полученные аденовирусные конструкции индуцируют формирование антиген-специфического иммунного ответа (как CD4+, так и CD8+).
Как видно из результатов эксперимента (фиг. 1-4), разработанные иммунобиологические средства по пп.1-5 в данной дозе эффективно стимулируют пролиферацию лимфоцитов.
Пример 10. Способ использования разработанных иммунобиологических средств на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов путем их последовательного введения в организм млекопитающих для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7. Комбинации иммунобиологических средств были выбраны исходя из примеров 7 и 8.
Все животные были разделены на 31 группу (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad26-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
3) фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad26-null 108 БОЕ/мышь;
4) Ad26-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-null 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
6) фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
8) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-null 108 БОЕ/мышь;
9) Ad26-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
10) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
11) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
12) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
13) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
14) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
15) Ad26-S-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
16) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
17) Ad26-S-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
18) Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
19) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
20) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
21) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
22) Ad26-S-del-Co V-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
23) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
24) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
25) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
26) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
27) Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
28) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
29) Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
30) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
31) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 108 БОЕ/мышь.
Результаты представлены в табл. 6 и 7.
Таблица 6
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Вторая иммунизация (через неделю) | ||||
PBS | Ad5-null | Ad26-null | ||
Первая иммунизация | PBS | 0 | 0 | 0 |
Ad5-null | 0 | 0 | 0 | |
Ad26-null | 0 | 0 | 0 |
- 14 037903
Таблица 7
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Группа животных | Среднее геометрическое значение титра антител |
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G Ю8БОЕ/мышь | 1:208064 |
Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь | 1:1321123 |
Ad26-S-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 Ю8БОЕ/мьппь | 1:832255 |
Ad26-RBD-G-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:1321123 |
Ad5- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:165140 |
Ad26- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD -CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:104032 |
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мьппь | 1:104032 |
Ad26- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 Ю8БОЕ/мьппь | 1:52016 |
Ad26-RBD-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мьппь | 1:131072 |
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 Ю8Б0Е/мышь | 1:104032 |
Ad5- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:165140 |
Ad5-RBD-G-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:208064 |
Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:660561 |
Ad26-RBD-G-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5- S-del -CoV-2 Ю8БОЕ/мышь | 1:416128 |
Ad5-S-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь | 1:208064 |
Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь | 1:65536 |
Ad5-RBD-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:131072 |
Ad26-RBD-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:165140 |
Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:208064 |
Ad26-S-G-CoV-2 Ю8Б0Е/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь | 1:208064 |
Ad5-S-CoV-2 108БОЕ/мышь, а через неделю Ad26- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь | 1:165140 |
Ad26-S-CoV-2 Ю8БОЕ/мышь, а через | 1:165140 |
неделю Ad5- S-del -CoV-2 108БОЕ/мышь |
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами, включающими различные аденовирусные векторы (на основе аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов) вызовет более мощную индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же вектором.
Пример 11. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке индукции ИФН-гамма.
В данном эксперименте проводили оценку эффективности иммунизации разработанным иммуно
- 15 037903 биологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc) вируса SARS-COV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SeQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 по определению прироста концентрации ИФН-гамма в среде после стимуляции спленоцитов иммунизированных аденовирусными конструкциями мышей линии C57/BL6 рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2.
Для определения уровня ИФН-гамма был использован набор Mouse IFN gamma Platinum ELISA (Affymetrix eBioscience, USA).
Порядок проведения ИФА. Промыли лунки планшета однократным буфером для промывки дважды объемом 200 мкл на лунку, а затем внесли по 100 мкл стандартов и 100 мкл раствора для разведения образцов в качестве отрицательного контроля. В лунки образцов внесли по 50 мкл раствора для разведения образцов, а затем по 50 мкл самих образцов (среда от стимулированных спленоцитов). Приготовили раствор антител, конъюгированных с биотином. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Затем во все лунки внесли по 50 мкл раствора антител, конъюгированных с биотином, накрыли планшет крышкой и инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 2 ч. Далее приготовили раствор стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Для этого развели конъюгат объемом 60 мкл в 5,94 мл буфера для анализа. Промыли лунки планшета дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл раствора стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена. Планшет инкубировали при комнатной температуре на шейкере при 400 об/мин в течение 1 ч. Затем лунки планшета промыли дважды однократным буфером для промывки объемом 200 мкл на лунку и во все лунки планшета внесли по 100 мкл ТМБ субстрата и инкубировали в темноте при комнатной температуре 10 мин, а затем добавили во все лунки по 100 мкл останавливающего раствора. Значение оптической плотности определяли измерением на планшетном спектрофотометре (Multiskan FC, Thermo) при длине волны 450 нм.
Результаты измерения продукции ИФН-гамма на 15-й день после иммунизации испытуемых животных аденовирусными конструкциями представлены графически на фиг. 5 в виде прироста концентрации ИФН-гамма (разы) при сравнении клеток, стимулированных рекомбинантным полноразмерным белком S вируса SARS-CoV-2, с интактными клетками.
По результатам исследования было показано, что введение полученных конструкций животным приводит высокому уровню индукции экспрессии ИФН-гамма спленоцитами при стимуляции рекомбинантным белком S вируса SARS-CoV-2, что свидетельствует о формировании специфического Тклеточного иммунитета.
Пример 12. Способ использования разработанных иммунобиологических средств на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го серотипа, содержащих оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белка S и RBD-G) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 5 путем их одновременного введения в организм млекопитающих, для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7. Комбинация иммунобиологических средств была выбрана исходя из примеров 8 и 11.
Все животные были разделены на 17 групп (по 5 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-null 105 вирусных частиц/мышь;
3) Ad5-null 106 вирусных частиц/мышь;
4) Ad5-null 107 вирусных частиц/мышь;
5) Ad5-null 108 вирусных частиц/мышь;
6) Ad5-null 109 вирусных частиц/мышь;
7) Ad5-null 1010 вирусных частиц/мышь;
8) Ad5-null 5х 1010 вирусных частиц/мышь;
9) Ad5-null 1011 вирусных частиц/мышь;
10) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 105 вирусных частиц/мышь;
11) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 106 вирусных частиц/мышь;
12) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 107 вирусных частиц/мышь;
13) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 108 вирусных частиц/мышь;
14) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 109 вирусных частиц/мышь;
15) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1010 вирусных частиц/мышь;
16) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 5х1010 вирусных частиц/мышь;
17) Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1011 вирусных частиц/мышь.
Результаты представлены в табл. 8 и 9.
- 16 037903
Таблица 8
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей контрольных групп
Группа животных | Среднее геометрическое значение титра антител к белку S SARS-CoV2 |
фосфатный буфер | 0 |
Ad5-null 105 вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 10б вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 107 вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 108 вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 109 вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 1010 вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 5* 10'° вирусных частиц/мышь | 0 |
Ad5-null 10й вирусных частиц/мышь | 0 |
Таблица 9
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей опытных групп
Группа животных, вирусных частиц/мышь | Среднее геометрическое значение титра антител к белку S SARS-CoV-2 |
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 105 | 0 |
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 106 | 1:14263 |
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 107 | 1:99334 |
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 108 | 1:131072 |
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 109 | 1:172951 |
Ad5-S-CoV-2+Ad5-RBD-G-CoV-2 1010 | 1:301124 |
Ad5-S-CoV-2+Ad5-RBD-G-CoV-2 5* 1010 | 1:345901 |
Ad5-S-CoV-2+ Ad5-RBD-G-CoV-2 1011 | 1:524288 |
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что одновременная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами индуцирует гуморальный иммунный ответ к гликопротеину SARS-CoV-2 в диапазоне доз от 106 вирусных частиц/мышь до 1011 вирусных частиц/мышь. При этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 13 Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих через различные интервалы времени в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность протективного антигена (белков S, S-del, RBD, RBD-G, RBD-Fc) SARS-CoV-2 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю или с интервалом в 3 недели для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 28 группы (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл), а через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
3) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
8) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
9) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
10) Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
11) Ad26-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
12) Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
1з) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
14) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
15) фосфатный буфер (100 мкл), а через 3 недели фосфатный буфер (100 мкл);
16) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-null 108 БОЕ/мышь;
- 17 037903
17) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
18) Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
19) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мьшь;
20) Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
21) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мьшь, а через 3 недели Ad5-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
22) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
23) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
24) Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-del-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
25) Ad26-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-S-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
26) Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
27) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-G-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
28) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь, а через 3 недели Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
Результаты представлены в табл. 10.
Таблица 10
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
2 иммунизация | ||
с интервалом в 1 неделю | с интервалом в 2 недели | |
ФСБ/ФСБ | 0 | 0 |
Ad5-null/ Ad5-null | 0 | 0 |
Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV- 2 | 1:32768 | 1:41285 |
Ad5-S-del-CoV-2/ Ad5-Sdel-CoV-2 | 1:41285 | 1:52016 |
Ad5-S-Fc-CoV-2/ Ad5-S- Fc-CoV-2 | 1:82570 | 1:104032 |
Ad5-RBD-CoV-2/ Ad5- RBD-CoV-2 | 1:65536 | 1:82570 |
Ad5-RBD-G-CoV-2/ Ad5- RBD-G-CoV-2 | 1:65536 | 1:82570 |
Ad5-RBD-Fc-CoV-2/ Ad5- RBD-Fc-CoV-2 | 1:65536 | 1:104032 |
Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S- CoV-2 | 1:26008 | 1:32768 |
Ad26-S-del-CoV-2/ Ad26- S-del-CoV-2 | 1:52016 | 1:65536 |
Ad26-S-Fc-CoV-2/ Ad26-S- Fc-CoV-2 | 1:26008 | 1:52016 |
Ad26-RBD-CoV-2/ Ad26- | 1:20643 | 1:26008 |
RBD-CoV-2 | ||
Ad26-RBD-G-CoV-2/ Ad26-RBD-G-CoV-2 | 1:41285 | 1:52016 |
Ad26-RBD-Fc-CoV-2/ Ad26-RBD-Fc-CoV-2 | 1:13004 | 1:16384 |
Таким образом, результаты эксперимента подтверждают, что последовательная иммунизация разработанным иммунобиологическим средством приводит к более высоким уровням иммунного ответа, по сравнению с однократной иммунизацией. Специалисту среднего уровня очевидно, что конечная схема иммунизации готовым препаратом опирается на многолетние исследования и часто корректируется непосредственно врачом, она зависит от многих факторов, в том числе от целевой группы пациентов, их возраста, эпидемиологической ситуации и пр.
Пример 14. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем последовательно введения в организм млекопитающих с интервалом в одну неделю в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, путем их последовательного введения в организм млекопитающих с интервалом в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 9 групп (по 5 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл), затем через неделю фосфатный буфер (100 мкл), затем через неделю фосфатный буфер (100 мкл);
2) Ad5-null 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-null 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5
- 18 037903 null 108 БОЕ/мышь;
3) Ad26-null 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-null 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26null 108 БОЕ/мышь;
4) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
5) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
6) Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
7) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
8) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь;
9) Ad26-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь, затем через неделю Ad5-S-CoV-2 108 БОЕ/мышь.
Результаты представлены в табл. 11.
Таблица 11
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
Группа животных | Титр антител |
ФСБ/ФСБ/ФСБ | 0 |
Ad 5-null/ Ad5-null/ Ad5-null | 0 |
Ad26-null/ Ad26-null/ Ad26-null | 0 |
Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 | 1:150562 |
Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 | 1:301124 |
Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 | 1:228209 |
Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 | 1:172950 |
Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad26-S-CoV-2 | 1:262144 |
Ad26-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2/ Ad5-S-CoV-2 | 1:301124 |
Таким образом, результаты данного эксперимента на примере разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го или 26-го серотипа, содержащего оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих последовательность белка S SARS-CoV-2 показали, что 3-кратное последовательное введение любых вариантов данного средства приводит к более сильному иммунному ответу на антиген, по сравнению с однократным и двукратным введением. Специалисту среднего уровня очевидно, что разработанное иммунобиологическое средство можно вводить многократно, что будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до наступления токсического эффекта. Необходимое количество иммунизаций может отличаться в зависимости от целевой категории населения (их национальной принадлежности, возраста, работы и пр). Кратность иммунизации определяется также экономической целесообразностью.
Пример 15. Способ использования разработанного иммунобиологического средства путем однократного введения в организм млекопитающих различными способами в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
В данном примере описан способ использования разработанного иммунобиологического средства основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа и рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, путем их однократного введения в организм млекопитающих 3 способами (интраназально, подкожно, внутримышечно) для индукции специфического иммунитета к SARS-CoV-2.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 7.
Все животные были разделены на 15 групп (по 3 животных), которым вводили:
1) ФСБ интраназально;
2) ФСБ подкожно;
3) ФСБ внутримышечно;
4) Ad5-null 109 БОЕ/мышь интраназально;
5) Ad5-null 109 БОЕ/мышь подкожно;
6) Ad5-null 109 БОЕ/мышь внутримышечно;
7) Ad26-null 109 БОЕ/мышь интраназально;
8) Ad26-null 109 БОЕ/мышь подкожно;
9) Ad26-null 109 БОЕ/мышь внутримышечно;
10) Ad5-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь интраназально;
11) Ad5-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь подкожно;
12) Ad5-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь внутримышечно;
13) Ad26-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь интраназально;
14) Ad26-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь подкожно;
15) Ad26-S-CoV-2 109 БОЕ/мышь внутримышечно.
Результаты представлены в табл. 12.
- 19 037903
Таблица 12
Титр антител к белку S вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей
Группа животных | Титр антител |
ФСБ интраназально | 0 |
ФСБ подкожно | 0 |
ФСБ внутримышечно | 0 |
Ad5-null интраназально | 0 |
Ad5-null подкожно | 0 |
Ad5-null внутримышечно | 0 |
Ad26-null интраназально | 0 |
Ad26-null подкожно | 0 |
Ad26-null внутримышечно | 0 |
Ad5-S-CoV-2 интраназально | 1:16384 |
Ad5-S-CoV-2 подкожно | 1:26008 |
Ad5-S-CoV-2 внутримышечно | 1:57052 |
Ad26-S-CoV-2 интраназально | 1:13004 |
Ad26-S-CoV-2 подкожно | 1:24300 |
Ad26-S-CoV-2 внутримышечно | 1:43238 |
Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем его интраназального, внутримышечного или подкожного введения.
Промышленная применимость
Преимуществом заявленного технического решения является использование таких доз рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих ген полноразмерного белка, которые позволяют повысить иммуногенность, но при которых еще не наблюдаются токсические эффекты на животных. Также к преимуществам можно отнести дополнительное возрастание иммуногенности рецептор-связывающего домена гена S вируса SARS-CoV-2 за счет присоединения лидерной последовательности для секреции белка из клетки во внешнюю среду. Одним из преимуществ заявленного технического решения является наличие адекватного Т-клеточного ответа (как CD4+, так и CD8+) на введение антигена.
Таким образом, создано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа, содержащее аденовирус человека 5-го серотипа с делетированными Е1/Е3 областями и встроенную генетическую конструкцию, кодирующую разработанные оптимальные аминокислотные последовательности протективного антигена S вируса SARS-CoV-2.
Также, создано иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее аденовирус человека 26-го серотипа с делегированными Е1/Е3 областями, замененной открытой рамкой считывания 6 на открытую рамку считывания аденовируса человека 5-го серотипа и с встроенной генетической конструкцией, кодирующей разработанные оптимальные аминокислотные последовательности протективного антигена S вируса SARS-CoV-2. При этом кодирующие последовательности различных форм белка S вируса SARS-CoV-2 экспрессируются рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами непосредственно в организме субъекта.
Разработанное иммунобиологическое средство может рассматриваться в качестве препарата для доклинических исследований, как противовирусная вакцина, которая способна эффективно защищать человека от заражения коронавирусом SARS-CoV-2. Предложена технология производства такой вакцины.
Claims (11)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2, на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность, кодирующую протективный антиген S вируса SARS-CoV-2 с делецией 18 аминокислот на С'-конце гена SEQ ID NO: 2.
- 2. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2, на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность, кодирующую полный протективный антиген S вируса SARS-CoV-2 и последовательность Fc-фрагмента от человеческого IgG1 SEQ ID NO: 3.
- 3. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2, на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность, кодирующую рецепторсвязывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида вируса SEQ ID NO: 4.
- 4. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого- 20 037903 респираторного синдрома SARS-CoV-2, на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность, кодирующую рецепторсвязывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2 с трансмембранным доменом гликопротеина вируса везикулярного стоматита SEQ ID NO: 5.
- 5. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2, на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность, кодирующую рецепторсвязывающий домен белка S вируса SARS-CoV-2 с последовательностью лидерного пептида и последовательностью Fc-фрагмента от человеческого IgG1 SEQ ID NO: 6.
- 6. Иммунобиологическое средство для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого респираторного синдрома SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа или рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа, содержащее оптимизированную под экспрессию в клетках млекопитающих нуклеотидную последовательность, кодирующую полный протективный антиген S вируса SARS-CoV-2 SEQ ID NO: 1 в комбинации по меньшей мере с одним иммунобиологическим средством по любому из пп.1-5.
- 7. Способ индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2, включающий введение в организм млекопитающих по меньшей мере одного иммунобиологического средства по любому из пп.16 в эффективном количестве.
- 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что последовательно вводят в организм млекопитающих два различных иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по любому из пп.1-6 или два различных иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по любому из пп.1-6 с интервалом более чем в 1 неделю.
- 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что последовательно вводят в организм млекопитающих иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по любому из пп.1-6 и иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по любому из пп.1-6 с интервалом более чем в 1 неделю.
- 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что последовательно вводят в организм млекопитающих иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26-го серотипа по любому из пп.1-6 и иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по любому из пп.1-6 с интервалом более чем в 1 неделю.
- 11. Способ по п.7, отличающийся тем, что одновременно вводят в организм млекопитающих любые два иммунобиологических средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа по любому из пп.1-6 или 26-го серотипа по любому из пп.1-6.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020114424A RU2720614C9 (ru) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) |
PCT/RU2020/000344 WO2021002776A1 (en) | 2020-04-23 | 2020-07-13 | Immunobiological agent for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA202000368A1 EA202000368A1 (ru) | 2021-06-02 |
EA037903B1 true EA037903B1 (ru) | 2021-06-03 |
Family
ID=70735097
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA202000368A EA037903B1 (ru) | 2020-04-23 | 2020-07-13 | ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ТЯЖЕЛОГО ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА SARS-CoV-2 (ВАРИАНТЫ) |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220305111A1 (ru) |
EP (1) | EP4010017A4 (ru) |
JP (1) | JP2023501879A (ru) |
KR (1) | KR20230005102A (ru) |
CN (1) | CN115052624A (ru) |
AR (1) | AR121931A1 (ru) |
BR (1) | BR112022003154A2 (ru) |
CA (1) | CA3156350A1 (ru) |
EA (1) | EA037903B1 (ru) |
IL (1) | IL290787B1 (ru) |
MX (1) | MX2022002194A (ru) |
RU (1) | RU2720614C9 (ru) |
WO (1) | WO2021002776A1 (ru) |
Families Citing this family (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20180128545A1 (en) | 2016-11-08 | 2018-05-10 | Berry Metal Company | Modular furnace cooling wall |
CN116348101A (zh) * | 2020-06-05 | 2023-06-27 | 瓦克萨特公司 | 嵌合腺病毒载体 |
US20240262869A1 (en) * | 2020-07-03 | 2024-08-08 | Indian Institute Of Science | POLYPEPTIDE FRAGMENTS, IMMUNOGENIC COMPOSITION AGAINST SARS-CoV-2, AND IMPLEMENTATIONS THEREOF |
RU2733832C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
RU2733834C1 (ru) * | 2020-07-28 | 2020-10-07 | Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2 |
RU2745774C1 (ru) * | 2020-08-14 | 2021-03-31 | Алексей Викторович Марочков | Способ лечения пациентов с новой коронавирусной инфекцией (covid-19) |
MX2022002611A (es) * | 2020-08-22 | 2022-06-17 | Federal State Budgetary Institution National Res Centre For Epidemiology And Microbiology Named Afte | Agente farmaceutico y metodo de utilizacion del mismo para inducir inmunidad especifica contra el virus de sindrome respiratorio agudo grave sars-cov-2 (variantes). |
US20230321220A1 (en) * | 2020-08-28 | 2023-10-12 | Joint Stock Company "Biocad" | Aav5-based vaccine against sars-cov-2 |
CN112618707B (zh) * | 2020-10-15 | 2023-07-04 | 广州达博生物制品有限公司 | 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法 |
WO2022119481A1 (ru) * | 2020-12-03 | 2022-06-09 | Антон Иосифович ОРЛОВ | Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции |
CN112646781B (zh) * | 2020-12-25 | 2023-07-25 | 广东省人民医院 | 一种包含人ace2蛋白的外泌体及其应用 |
RU2771288C1 (ru) * | 2021-02-02 | 2022-04-29 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2 |
RU2769817C1 (ru) * | 2021-02-15 | 2022-04-06 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1F1 - продуцент моноклонального антитела к нуклеокапсидному белку N вируса SARS-CoV-2 |
US20240254167A1 (en) | 2021-02-15 | 2024-08-01 | Livingmed Biotech S.R.L. | Genetically modified clostridium strains expressing recombinant antigens and uses thereof |
US11857621B2 (en) | 2021-05-18 | 2024-01-02 | Imam Abdulrahman Bin Faisal University | Synthetic pDNA vaccines against COVID-19 |
RU2751485C1 (ru) * | 2021-06-14 | 2021-07-14 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19 |
WO2023018384A1 (en) * | 2021-08-13 | 2023-02-16 | Chulalongkorn University | A vaccine composition against coronavirus infection |
WO2023019309A1 (en) * | 2021-08-17 | 2023-02-23 | Monash University | Vaccine compositions |
AR123532A1 (es) * | 2021-09-16 | 2022-12-14 | Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecn Conicet | Vacuna contra coronavirus, cepas de levadura, métodos de detección, métodos de tratamiento y usos |
TW202334429A (zh) | 2021-10-01 | 2023-09-01 | 中央研究院 | Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途 |
RU2761904C1 (ru) * | 2021-11-26 | 2021-12-13 | федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации | Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей |
RU2765729C1 (ru) * | 2021-12-29 | 2022-02-02 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты) |
WO2023250111A1 (en) | 2022-06-22 | 2023-12-28 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Combination therapies for the treatment of viral infections |
US11654121B1 (en) | 2022-06-22 | 2023-05-23 | Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc | Combination therapies for the treatment of viral infections |
KR20230074664A (ko) | 2023-05-03 | 2023-05-31 | 김승찬 | 코로나19 변이&전사 방지 말단결합 헤어핀 상보적 dna 염기조성물 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080267992A1 (en) * | 2004-06-04 | 2008-10-30 | Cancer Center, Sun Yat-Sun University | Sars Virus Vaccine with Adenovirus Carrier and Preparation Method Thereof, and Use of Sars Virus S Gene for Preparation of Vaccine |
KR20200032050A (ko) * | 2020-03-05 | 2020-03-25 | 김승찬 | COVID-19 바이러스 맞춤형 삼중 knockout DNA 치료제 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB201108879D0 (en) * | 2011-05-25 | 2011-07-06 | Isis Innovation | Vector |
RU2510281C2 (ru) * | 2012-06-22 | 2014-03-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") | ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА |
EP4104854A3 (en) * | 2016-04-04 | 2023-03-08 | The United States of America as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Multivalent vaccines for rabies virus and coronaviruses |
CN109312362B (zh) * | 2016-06-20 | 2022-06-28 | 扬森疫苗与预防公司 | 有效和平衡的双向启动子 |
GB2549809C (en) * | 2016-06-23 | 2022-11-30 | Univ Oxford Innovation Ltd | Vector |
CN110974950B (zh) * | 2020-03-05 | 2020-08-07 | 广州恩宝生物医药科技有限公司 | 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗 |
-
2020
- 2020-04-23 RU RU2020114424A patent/RU2720614C9/ru active
- 2020-07-13 US US17/427,745 patent/US20220305111A1/en not_active Abandoned
- 2020-07-13 CA CA3156350A patent/CA3156350A1/en not_active Abandoned
- 2020-07-13 KR KR1020227005787A patent/KR20230005102A/ko unknown
- 2020-07-13 WO PCT/RU2020/000344 patent/WO2021002776A1/en active Application Filing
- 2020-07-13 MX MX2022002194A patent/MX2022002194A/es unknown
- 2020-07-13 BR BR112022003154A patent/BR112022003154A2/pt unknown
- 2020-07-13 EP EP20834701.3A patent/EP4010017A4/en active Pending
- 2020-07-13 JP JP2022520116A patent/JP2023501879A/ja active Pending
- 2020-07-13 CN CN202080068594.3A patent/CN115052624A/zh active Pending
- 2020-07-13 IL IL290787A patent/IL290787B1/en unknown
- 2020-07-13 EA EA202000368A patent/EA037903B1/ru unknown
-
2021
- 2021-04-23 AR ARP210101104A patent/AR121931A1/es unknown
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080267992A1 (en) * | 2004-06-04 | 2008-10-30 | Cancer Center, Sun Yat-Sun University | Sars Virus Vaccine with Adenovirus Carrier and Preparation Method Thereof, and Use of Sars Virus S Gene for Preparation of Vaccine |
KR20200032050A (ko) * | 2020-03-05 | 2020-03-25 | 김승찬 | COVID-19 바이러스 맞춤형 삼중 knockout DNA 치료제 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
LANYING DU et al., A 219-mer CHO-Expressing Receptor-Binding Domain of SARS-CoV S Protein Induces Potent Immune Responses and Protective Immunity, Viral Immunol., 2010, vol. 23, N. 2, p. 211-219, abstact * |
LIANG M.F. et al., SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity, Biomed Environ Sci., 2005, 18(6), 363-374, abstract * |
NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1, 30.03.2020 [online] [retrived on 10.09.2020]. Retrived from <NCBI Database> * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2021002776A1 (en) | 2021-01-07 |
US20220305111A1 (en) | 2022-09-29 |
IL290787B1 (en) | 2024-08-01 |
CA3156350A1 (en) | 2021-01-07 |
KR20230005102A (ko) | 2023-01-09 |
RU2720614C1 (ru) | 2020-05-12 |
AR121931A1 (es) | 2022-07-27 |
MX2022002194A (es) | 2022-05-24 |
BR112022003154A2 (pt) | 2022-11-16 |
IL290787A (en) | 2022-04-01 |
CN115052624A (zh) | 2022-09-13 |
EA202000368A1 (ru) | 2021-06-02 |
JP2023501879A (ja) | 2023-01-20 |
EP4010017A1 (en) | 2022-06-15 |
EP4010017A4 (en) | 2022-12-07 |
RU2720614C9 (ru) | 2021-02-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2720614C9 (ru) | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты) | |
WO2021184560A1 (zh) | 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗 | |
ES2716010T3 (es) | Métodos y composiciones para la proteína IL-10 de citomegalovirus | |
Kohlmann et al. | Protective efficacy and immunogenicity of an adenoviral vector vaccine encoding the codon-optimized F protein of respiratory syncytial virus | |
WO2021076010A1 (en) | Pharmaceutical agent for inducing specific immunity against sars-cov-2 | |
Rice et al. | A next generation bivalent human Ad5 COVID-19 vaccine delivering both spike and nucleocapsid antigens elicits Th1 dominant CD4+, CD8+ T-cell and neutralizing antibody responses | |
JP2016136950A (ja) | ベータヘルペスウイルス感染に対するワクチンおよびその使用 | |
WO2021076009A1 (en) | Expression vector against severe acute respiratory syndrome virus sars-cov-2 | |
Logsdon et al. | Design and analysis of rhesus cytomegalovirus IL-10 mutants as a model for novel vaccines against human cytomegalovirus | |
JP2022507857A (ja) | アデノウイルスおよびアデノウイルスを使用するための方法 | |
EP4205761A1 (en) | Novel coronavirus recombinant spike protein, polynucleotide encoding same, vector comprising polynucleotide, and vaccine for preventing or treating coronavirus infection, comprising vector | |
US20230242940A1 (en) | Methods of making and using a vaccine against coronavirus | |
JP7369276B2 (ja) | 重症急性呼吸器症候群ウイルスsars-cov-2に対する発現ベクター | |
KR100347220B1 (ko) | 재조합아데노바이러스hiv백신 | |
US11806395B2 (en) | Epstein-Barr virus-like particles with broadened antigenic spectrum | |
RU2709659C1 (ru) | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета к вирусу ближневосточного респираторного синдрома (варианты) | |
WO2021178844A1 (en) | Zika and flavivirus immunogenic compositions and their use | |
KR20220083773A (ko) | 암 항원을 포함하는 개선된 lamp 구축물 | |
RU2811791C1 (ru) | Экспрессионный вектор на основе аденовируса человека 19 серотипа и способ его применения | |
RU2782528C1 (ru) | Аденовирусы и способы применения аденовирусов | |
US20220370600A1 (en) | Multigenic mva-sars-cov-2 vaccine | |
US20240226283A9 (en) | Vaccination of hematopoietic stem cell donors with cytomegalovirus triplex composition | |
US20220226466A1 (en) | Pharmaceutical agent for inducing specific immunity against sars-cov-2 | |
Cicin-Sain et al. | MCMV based vaccine vectors expressing full-length viral proteins provide long-term humoral immune protection upon a single-shot vaccination | |
RU2578159C1 (ru) | Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса эбола |