JP2023501879A - 重症急性呼吸器症候群ウイルスｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための免疫生物学的製剤 - Google Patents

重症急性呼吸器症候群ウイルスｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための免疫生物学的製剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、バイオテクノロジー、免疫学及びウイルス学、特に免疫生物学的製剤に関する。さらに、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫を誘導する方法であって、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防のための１つ以上の免疫生物学的製剤の哺乳類への投与を含む方法が開示される。本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答の有効な誘導を促進する。

Description

発明の分野
本発明は、バイオテクノロジー、免疫学及びウイルス学に関する。特許請求される薬剤は、重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防において、使用され得る。
発明の背景
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、２０１９年末に武漢（中国）で単離され、数か月以内に世界中に伝播したコロナウイルス(coronavirus)の新株である。２０２０年１月、世界保健機関(World Health Organization)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に関連した大流行が国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態であることを明言し、３月には疾患の伝播をパンデミックと述べた。２０２０年４月初旬には、１００万件を超える疾病の症例が確認され、６万人が死亡した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされた疾患は、ＣＯＶＩＤ－１９という特定の名称が与えられている。それは、肺炎、急性呼吸促迫症候群、急性呼吸不全、急性心不全、急性腎障害、敗血症性ショック、心筋症その他などの合併症を引き起こし得る、軽症から重症の様々な臨床経過を伴う潜在的に重度の急性呼吸器感染症である。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、空気中の経路又は直接的接触を通じたヒトからヒトへの感染により伝播される。異なる論文によると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の基本再生産数（Ｒ０）、即ち一人の人間から同疾患に感染する人の数は、２．６８(Wu JT,Leung K,Leung GM.Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan,China:a modelling study.Lancet.2020)から６．６(Sanche S,Lin YT,Xu C,Romero-Severson E,Hengartner N,Ke R.The Novel Coronavirus,2019-nCoV,is Highly Contagious and More Infectious Than Initially Estimated.medRxiv.2020)の範囲に及び、潜伏期間の中央値は、５．２日である(Li Q,Guan X,Wu P,Wang X,Zhou L,Tong Y.et al.Early Transmission Dynamics in Wuhan,China,of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia.N Engl J Med.2020)。
ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者から単離された株の系統発生解析によると、コウモリにおいて最も密接な関係があるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスが見出されることが示された(Zhou P.et al.A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin.Nature.2020;579:270-273)。さらに、他の哺乳動物種が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がそのヒトへの有効な感染に必要とされる一部又は全部の突然変異を獲得可能である場合の「中間宿主」として寄与したかもしれないという仮説がなされている(Zhang YZ,Holmes EC.A Genomic Perspective on the Origin and Emergence of SARS-CoV-2.Cell.2020 Mar 26.)。
高い死亡率、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の急速な地理的伝播、及び疾患の明確に定められていない病因により、このウイルスによって引き起こされる疾患の予防及び治療のために有効な製剤を開発する緊急の必要性が生じている。
ここ数年にわたり、コロナウイルス感染に対する様々なワクチンを創出するための多大な努力がなされている。開発されたワクチン候補は、６つのクラス：１）ウイルスベクターワクチン；２）ＤＮＡワクチン；３）サブユニットワクチン；４）ナノ粒子に基づくワクチン；５）不活化全ウイルスワクチン；及び６）弱毒生ワクチンに分けることが可能である。
これらのワクチンは、選択されたウイルスタンパク質、例えばヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質、ＮＳＰ１６タンパク質、及びコロナウイルスＳタンパク質に基づく(Ch.Yong et al.Recent Advances in the Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus.Front Microbiol.2019 Aug 2;10:1781.)。
これらの製品の一部は、臨床試験の段階に達している(https://www.clinicaltrials.gov/)。しかし、これらの製品は、主にこのコロナウイルスとＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＭＥＲＳ－ＣｏＶとの低い相同性に起因して、新規なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対して有効でない。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２及びＳＡＲＳ－ＣｏＶのＳタンパク質は、わずか７６％の相同性を示す(Xu X,Chen P,Wang J,Feng J,Zhou H,Li X,et al.Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission.Sci China Life Sci.2020;63(3):457-60)。したがって、現在、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２によって引き起こされる疾患に対し、単一でない登録されたワクチンが利用可能である。
特許の米国特許第７４５２５４２Ｂ２号によると、弱毒生コロナウイルスワクチンの使用を示唆する解決策があり、そこでウイルスは、ＭＨＶ－Ａ５９のチロシン６３９８、又はその類似位置に置換を含むＥｘｏＮポリペプチド、及びＭＨＶ－Ａ５９のｌｅｕ１０６、又はその類似位置に置換を含むＯｒｆ２ａポリペプチドをコードするゲノム、並びに薬学的に許容できる溶媒を含むものとして特徴づけられる。
特許の国際公開第２０１６１１６３９８Ａ１号によると、ワクチンとしての使用が意図された、中東呼吸症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）のＮヌクレオカプシドタンパク質及び／又はその免疫原性断片、又はＭＥＲＳ－ＣｏＶのＮヌクレオカプシドタンパク質及び／又はその免疫原性断片をコードする核酸分子に関する解決策がある。
特許の中国特許第１００３６０５５７Ｃ号によると、重症急性呼吸器症候群に対するワクチンを作製するための、位置：７７８Ｄ→Ｙ；７７Ｄ→Ｇ；２４４Ｔ→Ｉ；１１８２Ｋ→Ｑ；３６０Ｆ→Ｓ；４７９Ｎ→ＲилиＫ；４８０Ｄ→Ｇ；６０９Ａ→Ｌの１つにおける突然変異を有する、ＳＡＲＳウイルスのＳタンパク質の使用を説明する解決策がある。特許出願の出願の優先日：２００３年１０月７日。
米国特許出願公開第２００８０２６７９９２Ａ１号の発明における請求項によると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＳ抗原のＳ１ドメイン若しくはＳＡＲＳ－ＣｏＶウイルスのＳ抗原のＳ２ドメイン、若しくは両ドメインを含む配列を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく、重症急性呼吸器症候群に対するワクチンを唱える解決策がある。さらに、発現カセット内のこの組換えウイルスは、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂｇｈ－ポリＡ）シグナルを有する。
特許請求された発明の筆者らは、プロトタイプとして、この特許に最も類似するものとして準じた技術的解決策を選択する。この解決策の有意な欠点は、コロナウイルス科(Coronaviridae)の別種の抗原の使用である。
したがって、発明の背景によると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する有効な免疫応答の誘導を保証する新規な免疫生物学的製剤(immunobiological agent)を開発する緊急の必要性が生じている。
発明の開示
発明の請求項群の目的は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する免疫応答の有効な誘導のための免疫生物学的製剤を作製することである。
本発明の技術的成果は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための有効な薬剤の作製である。
この技術的成果は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、１８アミノ酸のＣ’末端の遺伝子欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ防御抗原の配列（配列番号２）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤の作製により達成される。
この技術的成果は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（配列番号３）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤の作製によっても達成される。
この技術的成果は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ウイルスのリーダーペプチド配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列（配列番号４）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスによって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤の作製によっても達成される。
この技術的成果は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスタンパク質Ｓ受容体結合ドメイン配列（配列番号５）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスによって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤の作製によっても達成される。
この技術的成果は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、リーダーペプチド配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（配列番号６）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスによって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤の作製によっても達成される。
この技術的成果は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、免疫生物学的製剤（配列番号２）、及び／又は（配列番号３）、及び／又は（配列番号４）、及び／又は（配列番号５）、及び／又は（配列番号６）と組み合わせた、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質遺伝子の配列に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原配列を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスによって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤（配列番号１）の作製によっても達成される。
この技術的成果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫の誘導方法であって、１つ以上の薬剤（配列番号１）、及び／又は（配列番号２）、及び／又は（配列番号３）、及び／又は（配列番号４）、及び／又は（配列番号５）、及び／又は（配列番号６）の有効量での哺乳類への投与を含む方法を通じても達成される。
この技術的成果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫の誘導方法であって、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく２つの異なる免疫生物学的製剤、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく２つの異なる免疫生物学的製剤が、２週以上の時間間隔で哺乳類に連続投与される、方法を通じても達成される。
この技術的成果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫の誘導方法であって、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤のいずれか及び組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれかが、２週以上の時間間隔で哺乳類に連続投与される；又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれか及び組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤のいずれかが、２週以上の時間間隔で哺乳類に連続投与される、方法を通じても達成される。
この技術的成果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫の誘導方法であって、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれか２つが哺乳類に同時投与される、方法を通じても達成される。
発明の請求項群の本質は、図面の参照により、より十分に理解されてもよく、ここで図１～５は、免疫有効性の評価の結果を図示する。
発明の実施
図面の短い説明
実験動物の免疫後８日目、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質で再刺激された増殖性ＣＤ４＋リンパ球の百分率によって評価される通り、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、ＲＢＤ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えアデノウイルスに基づく、開発された免疫剤での免疫の有効性評価の結果を図示する。 Ｙ軸－増殖性細胞の数，％ Ｘ軸－異なる動物の群： １）リン酸緩衝液（１００μｌ） ２）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ３）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ４）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ５）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ６）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ７）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス 実験動物の免疫後１５日目、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質で再刺激された増殖性ＣＤ４＋リンパ球の百分率によって評価される通り、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、ＲＢＤ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えアデノウイルスに基づく、開発された免疫剤での免疫の有効性評価の結果を図示する。 Ｙ軸－増殖性細胞の数，％ Ｘ軸－異なる動物の群： １）リン酸緩衝液（１００μｌ） ２）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ３）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ４）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ５）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ６）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ７）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス 実験動物の免疫後８日目、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質で再刺激された増殖性ＣＤ８＋リンパ球の百分率によって評価される通り、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、ＲＢＤ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えアデノウイルスに基づく、開発された免疫剤での免疫の有効性評価の結果を図示する。 Ｙ軸－増殖性細胞の数，％ Ｘ軸－異なる動物の群： １）リン酸緩衝液（１００μｌ） ２）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ３）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ４）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ５）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ６）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ７）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス 実験動物の免疫後１５日目、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質で再刺激された増殖性ＣＤ８＋リンパ球の百分率によって評価される通り、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、ＲＢＤ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えアデノウイルスに基づく、開発された免疫剤での免疫の有効性評価の結果を図示する。 Ｙ軸－増殖性細胞の数，％ Ｘ軸－異なる動物の群： １）リン酸緩衝液（１００μｌ） ２）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ３）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ４）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ５）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ６）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ７）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス 実験動物の免疫後１５日目、アデノウイルスコンストラクトで免疫されたＣ５７／ＢＬ６マウスの脾細胞がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓタンパク質で再刺激された後の培地中のＩＦＮ－γ濃度の増加によって評価される通り、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、ＲＢＤ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えアデノウイルスに基づく、開発された免疫生物学的製剤の有効性評価の結果を図示する。 Ｙ軸－刺激された細胞を有する培地中のＩＦＮ－γ濃度におけるインタクト細胞と比べての増加の値（倍） Ｘ軸－動物の試験群：無処置動物及び１０８ＰＦＵ／マウスが投与された動物 １）リン酸緩衝液（１００μｌ） ２）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ３）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ４）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ５）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ６）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス ７）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスに対する免疫生物学的製剤の開発における最初の段階は、ワクチン抗原の選択であった。このプロセスの一部として、文献検索を実施し、コロナウイルスのＳタンパク質が候補ワクチンを作製するための最も有望な抗原であることを立証した。１型膜貫通糖タンパク質は、ウイルス粒子の細胞への結合、融合及び侵入に関与する。実証された通り、それは中和抗体のインデューサーであった(Liang M et al,SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity.Biomed Environ Sci.2005 Dec;18(6):363-74)。
Ｓタンパク質は、シグナルペプチド（アミノ酸１～１２）及び３つのドメイン：細胞外ドメイン（アミノ酸１３～１１９３）、膜貫通ドメイン（アミノ酸１１９４～１２１５）、及び細胞内ドメイン（アミノ酸１２１６～１２５５）からなる。細胞外ドメインは、２つのサブユニットＳ１及びＳ２、並びにそれらの間の小領域からなり、それらの機能は完全には理解されていない。Ｓ１サブユニットは、ウイルスのＡＣＥ２（アンジオテンシン変換酵素２）受容体への結合に関与する。Ｓ１サブユニットの中間領域に位置する断片（アミノ酸３１８～５１０）は、受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）と称されている。推定上の融合ペプチド及び２つの７アミノ酸繰り返し（ＨＲ１及びＨＲ２）を有するＳ２サブユニットは、ウイルスと標的細胞膜との融合を促進する。感染は、ウイルスＳ１サブユニットのそのＲＢＤを介するＡＣＥ２細胞受容体への結合によって開始される。
次に、Ｓ２サブユニットのＨＲ１及びＨＲ２領域間に融合コアが形成される。結果として、ウイルスと細胞膜は、密に接近した状態になり、続いてそれらが融合し、ウイルスが細胞に侵入する。したがって、ワクチン処方におけるＳタンパク質又はその断片の使用は、ウイルスの細胞への侵入を阻害する抗体を誘導することがある。
免疫応答の最も有効な誘導を達成するため、筆者らは、標的タンパク質の発現レベルを増加させるため、この抗原の複数の修飾変異体、及び水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインとのその潜在的な組み合わせについて特許請求した。
（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの修飾Ｓ遺伝子、又はＳタンパク質の受容体結合ドメインの）ヌクレオチド配列の６つの異なる変異体が、これらの配列を哺乳動物細胞内での発現について最適化することにより得られた。
次に、修飾遺伝子が哺乳動物細胞に有効に送達されることを保証するため、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は血清型２６に基づく複数のコンストラクトが開発された。安全性、広範な組織向性、十分に特徴づけられたゲノム、遺伝子操作の単純性、大きいトランスジェニックＤＮＡインサートを組み込む能力、内因性アジュバント特性、並びに安定なＴ細胞媒介性及び体液性免疫応答を誘導する能力などの利点を有することから、アデノウイルスベクターが選択された。
血清型５のヒトアデノウイルスは、既知のアデノウイルスの中で最も試験されたものであり、それ故、ベクターを誘導するため、遺伝子療法において最も一般的に使用される。第一世代及び第二世代ベクター、キメラウイルスベクター（他のウイルス血清型のタンパク質を有する）(J.N.Glasgow et.al.,An adenovirus vector with a chimeric fiber derived from canine adenovirus type 2 displays novel tropism,Virology,2004,No.324,103-116)、及び複数の他のベクターを作製するための技術が開発された。さらに、他の血清型由来のベクターが作製された(H.Chen et.al.,Adenovirus-Based Vaccines:Comparison of Vectors from Three Species of Adenoviridae,Virology,2010,No.84(20),10522-10532)。
ヒトアデノウイルス血清型２６に基づくベクターは、質の観点でヒトアデノウイルス血清型５に基づくベクターにより宿主体内で誘発されるＴ細胞媒介性応答よりも優位である強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することが可能である場合、霊長類において高レベルの免疫原性を示す(J.Liu et.al.,Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys,Virology,2008,No.82,4844-4852)。それに加えて、より多くのエピトープが認識され、（γインターフェロンの支配的な生成でなく）より広範な因子の生成が誘導される(J.Liu et.al.,Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys,Virology,2008,No.82,4844-4852)。これらのデータは、ヒトアデノウイルス血清型２６に基づくベクターが、標的抗原に対する免疫応答を誘導するその能力について、他のアデノウイルスベクターと比較して基本的な違いを有することを示唆する。
変異体１の発明は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質遺伝子配列に基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長防御Ｓ抗原の配列（配列番号１）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６である。
変異体２の発明は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、１８アミノ酸のＣ’末端の遺伝子欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列（配列番号２）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６である。
変異体３の発明は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（配列番号３）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６である。
変異体４の発明は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ウイルスのリーダーペプチド配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列（配列番号４）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６である。
変異体５の発明は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列（配列番号５）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６である。
変異体６の発明は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、リーダーペプチド配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（配列番号６）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６である。
筆者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫を誘導するための方法であって、変異体１～６からの１つ以上の薬剤の有効量での哺乳類への投与を含む方法を開発している。この方法は、以下を想定する。
１）変異体１～６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく２つの異なる免疫生物学的製剤又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく２つの異なる免疫生物学的製剤の２週以上の時間間隔での哺乳類への連続投与。
２）変異体１～６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤のいずれか及び組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれかの２週以上の時間間隔での哺乳類への連続投与、又は変異体１～６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれか及び組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤のいずれかの２週以上の時間間隔での哺乳類への連続投与。
３）本明細書中の請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は血清型２６に基づくいずれか２つの免疫生物学的製剤の哺乳類への同時投与。
本発明の実施は、以下の実施例によって立証される。
実施例１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質の異なる変異体の取得
最初の段階で、筆者らは最も有効な免疫応答を達成するためのワクチン抗原のいくつかの修飾を開発した。
基本として、配列番号１の配列を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質を取得し、次に以下のいくつかの方法により修飾した。
１）Ｓタンパク質を原形質膜上に提示するため、配列番号２としてのＣ’末端の遺伝子に対する１８アミノ酸の欠失（Ｓ－ｄｅｌ）を実施した（変異体２に使用した）。
２）さらに、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原配列を、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列とともに取得した（変異体３に使用した）。
この修飾は、タンパク質Ｆｃ断片の抗原提示細胞内のＦｃ受容体への潜在的結合を通じて免疫原性を増強し(Li Z.,Palaniyandi S.,Zeng R.,Tuo W.,Roopenian D.C.,Zhu X.,Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor(FcRn)confers protective immunity to vaginal infection.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2011,No.108,4388-93)、さらにタンパク質安定性を増強し、インビボでその半減期を延長する(Zhang M.Y.,Wang Y.,Mankowski M.K.,Ptak R.G.,Dimitrov D.S.,Cross-reactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc:Possible role of the prolonged half-life of the immunogen,Vaccine,2009,No.27,857-863)。
３）分泌型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の免疫原性を単独で評価するため、（タンパク質分泌のため付加する）リーダーペプチド配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメイン配列を含む（変異体４に使用する）配列番号４の配列を作製した。
４）非分泌型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質ＲＢＤを検討するため、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインの配列（ＲＢＤ－Ｇ）が付加される対象のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質ＲＢＤからなる配列番号５の配列を選択した（変異体５に使用した）。
５）リーダーペプチド配列を有するＳタンパク質ＲＢＤの分泌型及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列を検討するため、配列番号６の配列を選択した（変異体６に使用した）。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列の付加は、タンパク質Ｆｃ断片の抗原提示細胞内のＦｃ受容体への潜在的結合を通じて免疫原性を増強し(Z.Li et.al.,Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor(FcRn)confers protective immunity to vaginal infection,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,2011,No.108,4388-4393)、さらにタンパク質安定性を増強し、インビボでその半減期を延長することがある(M.Y.Zhang et.al.,Crossreactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc:Possible role of the prolonged half-life of the immunogen,Vaccine,2008,No.27,857-63)。
実施例２．異なる変異体におけるＳタンパク質遺伝子をコードする遺伝子コンストラクトの取得
次の段階で、本明細書の実施例１で提示したアミノ酸配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６）をヌクレオチド配列に翻訳した。次のステップは、得られた配列の哺乳動物細胞内での発現についての最適化を含んだ。すべてのヌクレオチド配列は、ZAO“Evrogen”Company(Moscow)の合成方法を用いて取得した。結果として、以下の遺伝子コンストラクト：
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ遺伝子のヌクレオチド配列を含むｐＶａｘ－Ｓ－ＣｏＶ－２；
２）Ｃ’末端の遺伝子での１８アミノ酸の欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ遺伝子のヌクレオチド配列を含むｐＶａｘ－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２；
３）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ遺伝子のヌクレオチド配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片の配列を含むｐＶａｘ－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２；
４）リーダーペプチド遺伝子配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメインのヌクレオチド配列を含むｐＡＬ２－Ｔ－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２；
５）水疱性口内炎ウイルス(vesicular stomatitis virus)のＧ遺伝子を有するＳタンパク質受容体結合ドメインのヌクレオチド配列を含むｐＡＬ２－Ｔ－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２；
６）リーダーペプチド遺伝子配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメインのヌクレオチド配列、及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片のヌクレオチド配列を含むｐＡＬ２－Ｔ－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２
が利用可能であった。
次に、遺伝子工学的方法により、コンストラクトｐＶａｘ－Ｓ－ＣｏＶ－２からのＳタンパク質遺伝子配列を、ＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてシャトルプラスミドpShuttle-CMV(Stratagene,US)にクローン化し；そして得られたプラスミドをｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓ－ＣｏＶ－２と称した。したがって、（実施例１で得られた通り）哺乳動物細胞内での発現について最適化された、Ｓアミノ酸配列のヌクレオチド配列を保有する、シャトルプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓ－ＣｏＶ－２を作製した（配列番号１）。
同様に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質の修飾変異体のヌクレオチド配列をシャトルプラスミドpShuttle-CMV(Stratagene,US)にクローン化し、以下のシャトルプラスミド：
－（Ｃ’末端の遺伝子で１８アミノ酸の欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ遺伝子の最適化されたヌクレオチド配列を含む）ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２；
－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ遺伝子の最適化されたヌクレオチド配列及びヒトＩｇＧ１からのＦｃ断片の配列を含む、ｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２；
－（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列を含む）ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２；
－（水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインを有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列を含む）ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２；
－（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列をヒトＩｇＧ１からのＦｃ断片の最適化された配列とともに有する）ｐＳｈｕｔｔｌｅ－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２
を取得した。
実施例３．組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤の取得。
次の段階で、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の全長Ｓ防御抗原の配列を含む、組換えアデノウイルスプラスミドｐＡｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２を取得した（配列番号１）（変異体１）。このプラスミドは、Ｅ１及びＥ３部位が欠失したヒトアデノウイルス血清型５のゲノム領域を有するプラスミドｐＡｄと、アデノウイルスゲノムの相同性部位及び（Ｓタンパク質の）標的遺伝子を有する発現カセットを保有する（実施例３で取得した）シャトルプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓとの間の相同組換えのプロセスにより取得した。このため、実施例３で取得したシャトルプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓを制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩにより線状化した。
相同組換えは、大腸菌(E.Coli)株ＢＪ５１８３の細胞内で実施した。プラスミドｐＡｄをプラスミドｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓと混合し、次に得られた混合物を使用して、ガイド“MicroPulser（商標）Electroporation Apparatus Operating Instructions and Applications Guide”(Bio-Rad,US)に従うエレクトロポレーション法により、大腸菌(E.coli)細胞を形質転換した。形質転換が完了すると、大腸菌(E.Coli)株ＢＪ５１８３の細胞を、選択的抗生物質を含有するＬＢ寒天皿に接種し、＋３７℃で１８時間増殖させた。形質転換有効性は、プラスミドpBluescript II SK(-)の１μｇあたり１０１０～１０１１個の形質転換クローンであった。
相同組換えの結果として、（Ｓタンパク質の）標的導入遺伝子を有するカセットがプラスミドｐＡｄ内に出現し、抗生物質耐性遺伝子が変化した。
したがって、実施例３で得られた組み込まれた遺伝子コンストラクトとともに（Ｅ１及びＥ３部位がゲノムから欠失させた）組換えヒトアデノウイルス血清型５の全長ゲノムを有する組換えアデノウイルスプラスミドｐＡｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２を構築した。次に、プラスミドｐＡｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２を制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩで加水分解し、ヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ２９３の許容細胞培養物のトランスフェクションに使用した。ＨＥＫ２９３細胞のゲノムは、ヒトアデノウイルス血清型５ゲノムの組み込まれたＥ１部位を有することで、組換え複製欠損ヒトアデノウイルス血清型５の複製が生じることがある。トランスフェクション後６日目、最初の盲目継代を実施し、組換えアデノウイルスのより有効な作製を保証した。細胞変性ウイルス効果の発生時（顕微鏡データ）、培地とともに細胞を３回凍結させ、細胞の破壊及びウイルス放出を促進した。次に、得られた材料を蓄積する調製量の組換えアデノウイルスに使用した。
以降、調製したｐＡｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２の活性を、プラーク形成細胞アッセイを用いて、感受性２９３ＨＥＫ細胞の培養下で標準滴定技術により評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ遺伝子を発現する、ヒトアデノウイルス血清型５から誘導した潜在的な組換えシュードアデノウイルス粒子のコンストラクトの作製を検証するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を確立された標準技術に従って実施した。
同様の方法で、さらなる５つの組換えウイルス：Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２を取得した。
それ故、結果として、
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列（変異体１）；
２）Ｃ’末端の遺伝子で１８アミノ酸の欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスＳ防御抗原の最適化されたヌクレオチド配列（変異体２）；
３）哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片の配列（変異体３）；
４）リーダーペプチド配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列（変異体４）；
５）水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインを有するＳタンパク質受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列（変異体５）、
６）リーダーペプチド配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメインの最適化された配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（変異体６）
を有する、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤の変異体を取得した。
実施例４．組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤の取得。
最初の段階で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ遺伝子を有する発現カセットを組換えベクターｐＡｄ２６－ＯＲＦ６－Ａｄ５に配置した。このため、ベクターｐＡｄ２６－ＯＲＦ６－Ａｄ５を制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩで線状化した一方で、実施例３で取得したプラスミドコンストラクトｐＳｈｕｔｔｌｅ－Ｓを制限エンドヌクレアーゼＰｍｅＩで処理した。加水分解生成物をライゲートし、次に標準技術を用いてプラスミドｐＡｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２を作製した。
次の段階で、プラスミドｐＡｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２を、制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩ及びＳｗａＩで加水分解し、許容細胞株ＨＥＫ２９３培養物のトランスフェクションに使用した。トランスフェクション後３日目、最初の盲目継代を実施し、組換えウイルスのより有効な作製を保証した。細胞変性ウイルス効果の発生時（顕微鏡データ）、培地とともに細胞を３回凍結させ、細胞の破壊及びウイルス放出を促進した。次に、得られた材料を蓄積する調製量の組換えアデノウイルスに使用した。以降、調製したｐＡｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２の活性を、プラーク形成細胞アッセイを用いて、２９３ＨＥＫ細胞の培養下で標準滴定技術により評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ遺伝子を発現する、ヒトアデノウイルス血清型２６に基づく提示された組換えシュードアデノウイルス粒子のコンストラクトが作製されていることを検証するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を確立された標準技術に従って実施した。
同様の方法で、さらなる５つの組換えウイルス：ｐＡｄ２６－Ｓ－ｄｅｋ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２を取得した。
それ故、結果として、
１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列（変異体１）；
２）Ｃ’末端の遺伝子で１８アミノ酸の欠失を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ防御抗原の最適化されたヌクレオチド配列（変異体２）；
３）哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片の配列（変異体３）；
４）リーダーペプチド配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列（変異体４）；
５）水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインを有するＳタンパク質受容体結合ドメインの最適化されたヌクレオチド配列（変異体５）；
６）リーダーペプチド配列を有するＳタンパク質受容体結合ドメインの最適化された配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（変異体６）
を有する、組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤の変異体を取得した。
実施例５．組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤の添加後のＨＥＫ２９３細胞内でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質遺伝子の異なる変異体の発現の検証。
この実験の目的は、構築された組換えアデノウイルスＡｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２が哺乳動物細胞内でＳタンパク質遺伝子の異なる変異体を発現する能力を検証することであった。
３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーター内、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。細胞を３５ｍｍ２の培養ペトリ皿に配置し、７０％のコンフルエンスに達するまで２４時間インキュベートした。次に、組換えアデノウイルスの試験製剤（Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２）、及び対照製剤（Ａｄ５－ヌル－インサートを有しない組換えアデノウイルス）を１００ＰＦＵ／細胞の量で、そして陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を該細胞に添加した。形質導入の２日後、該細胞を収集し、通常強度の(normal strength)緩衝液CCLR(Promega)０．５ｍｌに溶解した。ライセートを炭酸－炭酸水素緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートウェルに配置した。プレートを＋４℃で一晩中インキュベートした。
プレートウェルを、２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で３回洗浄し、次にブロッキング緩衝液１００μｌをすべてのウェルに添加し；プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の緩衝液で３回洗浄し、回復期血清１００μｌをすべてのウェルに添加した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で３回洗浄し、次にビオチンとコンジュゲートした二次抗体１００μｌを添加した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、室温で２時間インキュベートした。次に、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンの溶液を調製した。このため、６０μｌの量のコンジュゲートをアッセイ緩衝液５．９４ｍｌで希釈した。プレートウェルを、２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン溶液１００μｌをプレートウェルの各々に添加した。プレートを、４００ｒｐｍの振盪機、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートウェルを、２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＴＭＢ基質１００μｌをプレートウェルの各々に添加した。プレートを室温、暗所下で１０分間インキュベートし、次に停止溶液１００μｌをプレートウェルの各々に添加した。プレート分光光度計(Multiskan FC,Thermo)を４５０ｎｍの波長で使用し、光学密度を測定した。実験結果を表１に提示する。
Figure 2023501879000002
得られたデータによって示される通り、標的タンパク質の異なる変異体の発現が、組換えアデノウイルスＡｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２が形質導入されたすべての細胞内で認められた。
実施例６．組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤の添加後の、ＨＥＫ２９３細胞内でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ糖タンパク質遺伝子の異なる変異体の発現の検証。
この実験の目的は、構築された組換えアデノウイルスｐＡｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２が、哺乳動物細胞内でＳタンパク質遺伝子の異なる変異体を発現する能力を検証することであった。
３７℃及び５％СО２のインキュベーター内、１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ培地中で、ＨＥＫ２９３細胞を培養した。該細胞を３５ｍｍ２の培養ペトリ皿に配置し、７０％のコンフルエンスに達するまで２４時間インキュベートした。次に、組換えアデノウイルスの試験製剤（ｐＡｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２）、及び対照製剤（Ａｄ２６－ヌル－インサートを有しない組換えアデノウイルス）を１００ＰＦＵ／細胞の量で、そして陰性対照としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を該細胞に添加した。形質導入の２日後、該細胞を収集し、通常強度の緩衝液CCLR(Promega)０．５ｍｌに溶解した。ライセートを炭酸－炭酸水素緩衝液で希釈し、ＥＬＩＳＡプレートウェルに配置した。プレートを＋４℃で一晩中インキュベートした。
プレートウェルを、２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で３回洗浄し、次にブロッキング緩衝液１００μｌを各ウェルに添加し；プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、３７℃で１時間インキュベートした。次に、プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の緩衝液で３回洗浄し、回復期血清１００μｌをすべてのウェルに添加した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で３回洗浄し、ビオチンとコンジュゲートした二次抗体１００μｌを添加した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、室温で２時間インキュベートした。次に、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンの溶液を調製した。このため、６０μｌの量のコンジュゲートをアッセイ緩衝液５．９４ｍｌで希釈した。プレートウェルを、２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン溶液１００μｌをプレートウェルの各々に添加した。プレートを、４００ｒｐｍの振盪機、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートウェルを、２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、ＴＭＢ基質１００μｌをプレートウェルの各々に添加し、室温、暗所下で１０分間インキュベートした。次に停止溶液１００μｌをプレートウェルの各々に添加した。プレート分光光度計(Multiskan FC,Thermo)を４５０ｎｍの波長で使用し、光学密度の値を測定した。実験結果を表２に提示する。
Figure 2023501879000003
得られたデータによって示される通り、標的タンパク質の異なる変異体の発現が、組換えアデノウイルスｐＡｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２、Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２、ｐＡｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２が形質導入されたすべての細胞内で認められた。
実施例７．開発された免疫生物学的製剤の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための有効量での哺乳類への単回投与による利用方法。
哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５及び２６に基づく開発された免疫生物学的製剤は、このウイルスベクターについて既知の投与経路のいずれかを通じて（皮下に、筋肉内に、静脈内に、鼻腔内に）哺乳類に投与することにより利用する。このようにして、哺乳類においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質の標的タンパク質に対する免疫応答が発現する。
免疫有効性の主な特徴の一つが抗体価である。哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原の配列を含む、血清型５又は２６の組換えヒトアデノウイルスを有する免疫生物学的製剤での動物の単回筋肉内免疫後２１日目の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する抗体の力価における変化に関連するデータを例示する。
実験に使用した哺乳類－マウスＣ５７ＢＬ／６、雌、１８ｇ。すべての動物は、４３群に分割し、動物５匹の各々に、
１）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
３）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
４）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
５）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
６）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
７）Ａｄ５－ヌル １０７ＰＦＵ／マウス
８）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
９）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１０）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１１）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１２）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１３）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１４）Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
１５）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
１６）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
１７）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
１８）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
１９）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
２０）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
２１）Ａｄ５－ヌル １０９ＰＦＵ／マウス
２２）Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２３）Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２４）Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２５）Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２６）Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２７）Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０７ＰＦＵ／マウス
２８）Ａｄ２６－ヌル １０７ＰＦＵ／マウス
２９）Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３０）Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３１）Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３２）Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３３）Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３４）Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３５）Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
３６）Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
３７）Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
３８）Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
３９）Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
４０）Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
４１）Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウス
４２）Ａｄ２６－ヌル １０９ＰＦＵ／マウス
４３）リン酸緩衝生理食塩水
を筋肉内注射した。
３週後、血液サンプルを動物の尾静脈から採取し、血清を単離した。抗体価を以下のプロトコルを用いるＥＬＩＳＡにより測定した：
１）タンパク質（Ｓ）を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに＋４℃で１６時間吸着させた。
２）次に、非特異的結合を阻止するため、プレートをＴＰＢＳに１００μｌ／ウェルの量で溶解した５％ミルクで「ブロッキング」した。それを振盪機、３７℃で１時間インキュベートした。
３）免疫マウスからの血清サンプルを、２倍希釈法を用いて希釈した。全体的に、各サンプルの１２の希釈物を調製した。
４）５０μｌの希釈血清サンプルの各々をプレートウェルに添加した。
５）次に、３７℃で１時間のインキュベーションを実施した。
６）インキュベーション後、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
７）次に、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウス免疫グロブリンに対する二次抗体を添加した。
８）次に、３７℃で１時間のインキュベーションを実施した。
９）インキュベーション後、ウェルをリン酸緩衝液で３回洗浄した。
１０）次に、西洋わさびペルオキシダーゼに対する基質として機能し、該反応により着色化合物に変換されるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を添加した。１５分後、反応を硫酸添加により停止させた。次に、分光光度計を使用し、４５０ｎｍの波長で各ウェル内の溶液の光学密度（ＯＤ）を測定した。
抗体価は、溶液の光学密度が陰性対照群におけるよりも有意に高い場合の最終希釈として決定した。得られた結果（幾何平均）を表３に提示する。
Figure 2023501879000004
実験の結果は、哺乳類に投与される開発された免疫生物学的製剤が、選択された用量範囲全体にわたり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する体液性免疫応答を誘導することを示している。用量漸増が哺乳類血液中の抗体価増加を有毒な効果が生じるまでもたらすことは明白である。
実施例８．開発された免疫生物学的製剤の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための有効量での哺乳類への連続投与による利用方法。
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく開発された免疫生物学的製剤の１週の時間間隔での哺乳類への連続投与による利用方法を記載する。
実施例７に記載のプロトコルに従い、実験を実施した。
すべての動物は、２９群（各々が動物３匹）に分割し：
１．リン酸緩衝液（１００μｌ）、及び１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
２．リン酸緩衝液（１００μｌ）、及び１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
３．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
４．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
５．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
６．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
７．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
８．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
９．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１０．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１１．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１２．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１３．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１４．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１５．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１６．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１７．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１８．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１９．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２０．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２１．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２２．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２３．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２４．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２５．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２６．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２７．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２８．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２９．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３０．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３１．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３２．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３３．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３４．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３５．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３６．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３７．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３８．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３９．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
４０．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
４１．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
を筋肉内に注射した。
結果を表４及び５に提示する。
Figure 2023501879000005
Figure 2023501879000006
したがって、実験結果では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質の異なる形態を含む異なる組み合わせにおける開発された免疫生物学的製剤での連続免疫が、類似のレジメンに従って実施された１つの抗原での免疫よりも強力な免疫応答の誘導を引き起こすことが十分に確認されている。
実施例９．開発された免疫生物学的製剤での免疫の増殖性リンパ球の百分率による有効性評価。
リンパ球増殖アッセイは、リンパ球が抗原への遭遇後により活発に分離する能力を評価することを可能にする。増殖を評価するため、筆者らは、蛍光色素ＣＦＳＥを使用し、リンパ球を染色した。この色素は、細胞性タンパク質に結合し、長期間そこに留まっても、集団内の隣接する細胞に決して広がらない。しかし、蛍光標識は娘細胞へと移される。標識濃度、ひいては娘細胞における蛍光強度は、正確に２倍減少する。それ故、分裂細胞は、それらの蛍光における減少により容易に追跡可能である。したがって、分裂細胞は、減少する蛍光強度により容易に追跡可能である。
実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。すべての動物は、８群（各々が動物３匹）に分割し：
１）リン酸緩衝液（１００μｌ）
２）Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
３）Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
４）Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
５）Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
６）Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
７）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
８）Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
を筋肉内に注射した。
２週後、動物を安楽死させた。フィコールウログラフィン密度勾配遠心分離により、リンパ球を脾臓から単離した。次に、単離細胞を、ＣＦＳＥ技術（インビトロ及びインビボでリンパ球増殖を細胞内蛍光色素カルボキシ蛍光二酢酸スクシンイミジルのエステル／Ｑｕａｈ ＢＪで監視すること、Warren HS,Parish CR Nat Protoc.2007;2(9),p:2049-2056）に従ってＣＦＳＥで染色し、抗原の存在下で培養した。次に、フローサイトメトリーを用いて、該細胞を分析した。得られた結果を図１、２、３、４に示す。故に、得られたアデノウイルスコンストラクトが抗原特異的免疫応答（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の双方）を誘導すると結論づけることができた。
実験結果（図１、２、３、４）によって示す通り、請求項１、請求項２、請求項３、請求項４、請求項５に従って開発した免疫生物学的製剤は、使用用量でリンパ球の増殖を有効に刺激する。
実施例１０．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための、組換えヒトアデノウイルス血清型５及び２６に基づく開発された免疫生物学的製剤の哺乳類への連続投与による利用方法。
実験は、実施例７に記載のプロトコルに従って実施した。免疫生物学的製剤の組み合わせは、実施例７及び８に基づいて選択した。
すべての動物は、３１群（各々が動物３匹）に分割し：
１．リン酸緩衝液（１００мкл）、及び１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
２．Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
３．リン酸緩衝液（１００μｌ）、及び１週後、Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
４．Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
５．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
６．リン酸緩衝液（１００μｌ）、及び１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
７．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
８．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
９．Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
１０．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１１．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１２．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１３．Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１４．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１５．Ａｄ２６－Ｓ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１６．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１７．Ａｄ２６－Ｓ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１８．Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１９．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２０．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２１．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２２．Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２３．Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２４．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２５．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２６．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２７．Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２８．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２９．Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３０．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
３１．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
を筋肉内に注射した。
結果を表６及び７に提示する。
Figure 2023501879000007
Figure 2023501879000008
Figure 2023501879000009
したがって、実験結果では、（ヒトアデノウイルス血清型５及び２６に基づく）異なるアデノウイルスベクターを含む開発された免疫生物学的製剤での連続免疫が、類似する免疫レジメンに応じて実施した１つのベクターでの免疫よりも強力な免疫応答の誘導を引き起こすことが十分に確認されている。
実施例１１．ＩＦＮ－γ誘導による開発された免疫生物学的製剤での免疫の有効性評価
この実験は、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの（タンパク質Ｓ、Ｓ－ｄｅｌ、Ｓ－Ｆｃ、ＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えアデノウイルスに基づく開発された免疫生物学的製剤での免疫の有効性を評価するため、アデノウイルスコンストラクトで免疫したＣ５７／ＢＬ６マウスの脾細胞をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス組換え全長Ｓタンパク質で刺激した後の培地中のＩＦＮ－γ濃度における増加による評価として実施した。
マウスＩＦＮ－γのPlatinum ELISAキット(Affymetrix eBioscience,USA)を使用し、ＩＦＮ－γレベルを測定した。
ＥＬＩＳＡプロトコル。プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、次に１００μｌの参照溶液及び１００μｌのサンプル希釈剤を陰性対照として添加した。５０μｌのサンプル希釈剤をウェルの各々に配置し、次に５０μｌのサンプル（刺激した脾細胞からの培地）をすべてのウェルに添加した。ビオチンコンジュゲート抗体の溶液を調製した。このため、６０μｌの量のコンジュゲートを５．９４ｍｌのアッセイ緩衝液で希釈した。次に、５０μｌのビオチンコンジュゲート抗体溶液をウェルの各々に配置した。プレートを蓋で覆い、４００ｒｐｍの振盪機、室温で２時間インキュベートした。次に、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンの溶液を調製した。このため、６０μｌの量のコンジュゲートを５．９４ｍｌのアッセイ緩衝液で希釈した。プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジン溶液１００μｌをプレートウェルの各々に添加した。プレートを４００ｒｐｍの振盪機、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートウェルを２００μｌ／ウェルの量の通常強度の洗浄緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質をプレートウェルの各々に添加し、プレートを暗所、室温で１０分間インキュベートした。次に、１００μｌの停止溶液をプレートウェルの各々に添加した。プレート分光光度計(Multiskan FC,Thermo)を使用し、４５０ｎｍの波長で光学密度を測定した。
実験動物のアデノウイルスコンストラクトでの免疫後１５日目のＩＦＮ－γ産生の測定結果を、図５にＩＦＮ－γ濃度の増加（倍）としてグラフ表示し、ここでＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス組換え全長Ｓタンパク質で刺激した細胞をインタクト細胞と比較する。
試験結果は、得られたコンストラクトの動物への投与により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス組換えＳタンパク質で刺激された脾細胞におけるＩＦＮ－γの発現が高レベルで誘導されたことを示しており、特異的なＴ細胞媒介性免疫応答が形成されたことが示唆される。
実施例１２．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１及び配列番号５から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（Ｓタンパク質及びＲＢＤ－Ｇの）防御抗原配列を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく開発された免疫生物学的製剤の哺乳類への同時投与による利用方法。
実験は、実施例７に記載のプロトコルに従って実施した。免疫生物学的製剤の組み合わせは、実施例８及び１１に基づいて選択した。
すべての動物は、１７群（各々が動物５匹）に分割し：
１．リン酸緩衝液（１００μｋ）
２．Ａｄ５－ヌル １０５個のウイルス粒子／マウス
３．Ａｄ５－ヌル １０６個のウイルス粒子／マウス
４．Ａｄ５－ヌル １０７個のウイルス粒子／マウス
５．Ａｄ５－ヌル １０８個のウイルス粒子／マウス
６．Ａｄ５－ヌル １０９個のウイルス粒子／マウス
７．Ａｄ５－ヌル １０１０個のウイルス粒子／マウス
８．Ａｄ５－ヌル ５＊１０１０個のウイルス粒子／マウス
９．Ａｄ５－ヌル １０１１個のウイルス粒子／マウス
１０．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０５個のウイルス粒子／マウス
１１．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０６個のウイルス粒子／マウス
１２．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０７個のウイルス粒子／マウス
１３．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８個のウイルス粒子／マウス
１４．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０９個のウイルス粒子／マウス
１５．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０１０個のウイルス粒子／マウス
１６．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ ５＊１０１０個のウイルス粒子／マウス
１７．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２＋Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０１１個のウイルス粒子／マウス
を筋肉内に注射した。
結果を表８及び９に提示する。
Figure 2023501879000010
Figure 2023501879000011
したがって、実験結果では、開発された免疫生物学的製剤での同時免疫が、１０６個のウイルス粒子／マウス～１０１１個のウイルス粒子／マウスの用量範囲にわたり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２糖タンパク質に対する体液性免疫応答を誘導することが十分に確認されている。したがって、用量漸増が有毒な効果が生じるまで哺乳類の血液中の抗体価増加をもたらすことは明白である。
実施例１３．開発された免疫生物学的製剤の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための有効量での、異なる時間間隔での哺乳類への連続投与による利用方法。
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６から選択される配列とともにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の（タンパク質Ｓ、Ｓ－ｄｅｌ、ＲＢＤ、ＲＢＤ－Ｇ、ＲＢＤ－Ｆｃの）防御抗原配列を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく開発された免疫生物学的製剤の、１週の時間間隔又は３週の時間間隔での哺乳類への連続投与による利用方法を記載する。
実施例７に記載のプロトコルに従い、実験を実施した。
すべての動物は、２８群（各々が動物３匹）に分割し：
１．リン酸緩衝液（１００μｌ）、及び１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
２．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
３．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
４．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
５．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
６．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
７．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
８．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
９．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１０．Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１１．Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１２．Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１３．Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１４．Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び１週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１５．リン酸緩衝液（１００μｌ）、及び３週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
１６．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
１７．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１８．Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
１９．Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２０．Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２１．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２２．Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ５－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２３．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２４．Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ２６－Ｓ－ｄｅｌ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２５．Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ２６－Ｓ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２６．Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２７．Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｇ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
２８．Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、及び３週後、Ａｄ２６－ＲＢＤ－Ｆｃ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
を筋肉内に注射した。
結果を表１０に提示する。
Figure 2023501879000012
したがって、実験結果では、開発された免疫生物学的製剤の連続免疫が単回免疫よりも高い免疫応答レベルをもたらすことが立証されている。平均レベルの専門家の場合、最終製品での免疫の最終レジメンが、多年試験に基づき、様々な要素、例えば、患者の標的群、彼らの年齢、疫学的状況などに応じて、医師により頻繁に調節されることは明白であるように思われる。
実施例１４．
開発された免疫生物学的製剤の１週の時間間隔での、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための有効量での哺乳類への連続投与による利用方法。
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための、組換えヒトアデノウイルス血清型５及び組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく開発された免疫生物学的製剤の１週の時間間隔での哺乳類への連続投与による利用方法を記載する。
実施例７に記載のプロトコルに従い、実験を実施した。
すべての動物は、９群（各々が動物５匹）に分割し：
１．リン酸緩衝液（１００μｌ）、次に１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）、次に１週後、リン酸緩衝液（１００μｌ）
２．Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
３．Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－ヌル １０８ＰＦＵ／マウス
４．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
５．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
６．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
７．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
８．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
９．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス、次に１週後、Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０８ＰＦＵ／マウス
を筋肉内に注射した。
結果を表１１に提示する。
Figure 2023501879000013
したがって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質配列を含む組換えヒトアデノウイルス血清型５又は血清型２６に基づく、開発された免疫生物学的製剤によるこの実験の結果は、この薬剤の任意の変異体の連続的な３回の投与が、それを１回又は２回投与する場合よりも強力な抗原に対する免疫応答の誘導を引き起こすことを示している。平均レベルの専門家の場合、開発された免疫生物学的製剤が、哺乳類の血液中の抗体価の有毒な効果が生じるレベルまでの増加を引き起こすことになる複数回投与計画に従って投与され得ることが明白であるように思われる。免疫の必要数は、標的集団カテゴリー（国籍、年齢、職業など）に応じて変化してもよい。免疫の頻度は、費用便益評価にも依存する。
実施例１５．
哺乳類により異なる経路により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための有効量での１回投与される開発された免疫生物学的製剤の利用方法。
本実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する特異的免疫の誘導のための、哺乳類に３つの経路（鼻腔内、皮下、筋肉内）により１回投与される、組換えヒトアデノウイルス血清型５及び組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく開発された免疫生物学的製剤の利用方法を記載する。
実施例７に記載のプロトコルに従い、実験を実施した。
すべての動物は、１５群（各々が動物３匹）に分割し：
１．ＰＢＳを鼻腔内に
２．ＰＢＳを皮下に
３．ＰＢＳを筋肉内に
４．Ａｄ５－ヌル １０９ＰＦＵ／マウスを鼻腔内に
５．Ａｄ５－ヌル １０９ＰＦＵ／マウスを皮下に
６．Ａｄ５－ヌル １０９ＰＦＵ／マウスを筋肉内に
７．Ａｄ２６－ヌル １０９ＰＦＵ／マウスを鼻腔内に
８．Ａｄ２６－ヌル １０９ＰＦＵ／マウスを皮下に
９．Ａｄ２６－ヌル １０９ＰＦＵ／マウスを筋肉内に
１０．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウスを鼻腔内に
１１．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウスを皮下に
１２．Ａｄ５－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウスを筋肉内に
１３．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウスを鼻腔内に
１４．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウスを皮下に
１５．Ａｄ２６－Ｓ－ＣｏＶ－２ １０９ＰＦＵ／マウスを筋肉内に
注射した。
結果を表１２に提示する。
Figure 2023501879000014
したがって、この実験の結果では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫を誘導するための、開発された免疫生物学的製剤の鼻腔内、筋肉内又は皮下投与経路による利用可能性が確認される。
産業上の利用可能性
特許請求される技術的解決策の利点は、動物において免疫原性を増強するが、そこで有毒な作用を引き起こさないことを可能にする全長タンパク質遺伝子を発現する組換えアデノウイルスのかかる用量での利用である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ遺伝子の受容体結合ドメインの免疫原性において、細胞から環境へのタンパク質分泌を促進するためのリーダー配列を連結する結果としてさらなる増強があれば、有利であるとみなすことができる。投与された抗原に対する十分なＴ細胞媒介性応答（ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋の双方）の存在は、特許請求される技術的解決策のさらなる利点である。
それ故、免疫生物学的製剤は、Е１／Е３部位が欠失したヒトアデノウイルス血清型５を含む組換えヒトアデノウイルス血清型５、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ防御抗原の開発された最適なアミノ酸配列をコードする組み込まれた遺伝子コンストラクトに基づいて作製されている。
さらに、免疫生物学的製剤は、Е１／Е３部位が欠失したヒトアデノウイルス血清型２６を含む組換えヒトアデノウイルス血清型２６、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ防御抗原の開発された最適なアミノ酸配列をコードする組み込まれた遺伝子コンストラクトに基づいて作製されている。異なるタイプのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質のコード配列の発現は、対象の身体内の組換えシュードアデノウイルス粒子により確認される。
開発された免疫生物学的製剤であれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルスによって引き起こされる感染に対して有効なヒト保護をもたらす能力がある抗ウイルスワクチンとして、前臨床試験における使用について検討することができる。かかるワクチンを作製する技術が特許請求される。

Claims (10)

  1. 重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、１８アミノ酸のＣ’末端の遺伝子欠失を有する前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳ防御抗原の配列（配列番号２）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤。
  2. 重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原の配列及びヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（配列番号３）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤。
  3. 重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのリーダーペプチド配列を有する前記ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列（配列番号４）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤。
  4. 重症急性呼吸器症候群ウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２によって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質の膜貫通ドメインを有する前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのタンパク質Ｓ受容体結合ドメイン配列（配列番号５）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤。
  5. 前記重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスによって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、前記リーダーペプチド配列を有する前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質受容体結合ドメイン配列及び前記ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ断片配列（配列番号６）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤。
  6. 前記重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）ウイルスによって引き起こされる疾患の予防のための免疫生物学的製剤であって、哺乳動物細胞内での発現について最適化された、請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６において本明細書で提示される免疫生物学的製剤と組み合わせた、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのＳタンパク質遺伝子の配列に基づく前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの全長Ｓ防御抗原配列（配列番号１）を含む、組換えヒトアデノウイルス血清型５、又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤。
  7. 前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する特異的免疫の誘導の方法であって、請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６において本明細書で提示される１つ以上の薬剤の有効量での哺乳類への投与を含む方法。
  8. 請求項７において本明細書で提示される方法であって、請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく２つの異なる免疫生物学的製剤又は組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく２つの異なる免疫生物学的製剤が２週以上の時間間隔で哺乳類に投与される、方法。
  9. 請求項７において本明細書で提示される方法であって、請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤のいずれか及び組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれかが２週以上の時間間隔で哺乳類に連続投与される、又は請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型２６に基づく免疫生物学的製剤のいずれか及び組換えヒトアデノウイルス血清型５に基づく免疫生物学的製剤のいずれかが２週以上の時間間隔で哺乳類に連続投与される、方法。
  10. 請求項７において本明細書で提示される方法であって、請求項１及び／又は請求項２、及び／又は請求項３、及び／又は請求項４、及び／又は請求項５、及び／又は請求項６において本明細書で提示される、組換えヒトアデノウイルス血清型５又は血清型２６に基づくいずれか２つの免疫生物学的製剤が哺乳類に同時投与される、方法。
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022003719A2 (en) * 2020-07-03 2022-01-06 Indian Institute Of Science POLYPEPTIDE FRAGMENTS, IMMUNOGENIC COMPOSITION AGAINST SARS-CoV-2, AND IMPLEMENTATIONS THEREOF
RU2733832C1 (ru) * 2020-07-28 2020-10-07 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
RU2733834C1 (ru) * 2020-07-28 2020-10-07 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
RU2745774C1 (ru) * 2020-08-14 2021-03-31 Алексей Викторович Марочков Способ лечения пациентов с новой коронавирусной инфекцией (covid-19)
EP4003414A4 (en) * 2020-08-22 2023-05-10 Fed. State Budgetary Institution "Nat. Res. Centre for Epidemiology and Microbiology named after the Honorary Academician N.F. Gamaleya" of the .... MEDICATIONS TO INDUCE SPECIFIC IMMUNITY AGAINST SARS-COV-2
CN112618707B (zh) * 2020-10-15 2023-07-04 广州达博生物制品有限公司 一种SARS-CoV-2冠状病毒疫苗及其制备方法
WO2022119481A1 (ru) * 2020-12-03 2022-06-09 Антон Иосифович ОРЛОВ Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции
CN112646781B (zh) * 2020-12-25 2023-07-25 广东省人民医院 一种包含人ace2蛋白的外泌体及其应用
RU2771288C1 (ru) * 2021-02-02 2022-04-29 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2E1B5 - продуцент моноклонального антитела к рецептор-связывающему домену белка S вируса SARS-CoV-2
RU2769817C1 (ru) * 2021-02-15 2022-04-06 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1F1 - продуцент моноклонального антитела к нуклеокапсидному белку N вируса SARS-CoV-2
EP4291212A1 (en) 2021-02-15 2023-12-20 LivingMed Biotech S.R.L. Genetically clostridium modifiedstrains expressing recombinant antigens and uses thereof
US11857621B2 (en) 2021-05-18 2024-01-02 Imam Abdulrahman Bin Faisal University Synthetic pDNA vaccines against COVID-19
RU2751485C1 (ru) * 2021-06-14 2021-07-14 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19
WO2023018384A1 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 Chulalongkorn University A vaccine composition against coronavirus infection
WO2023019309A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Monash University Vaccine compositions
AR123532A1 (es) * 2021-09-16 2022-12-14 Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecn Conicet Vacuna contra coronavirus, cepas de levadura, métodos de detección, métodos de tratamiento y usos
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途
RU2761904C1 (ru) * 2021-11-26 2021-12-13 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей
RU2765729C1 (ru) * 2021-12-29 2022-02-02 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа против SARS-CoV-2 и способ его применения (варианты)
WO2023250111A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Combination therapies for the treatment of viral infections
US11654121B1 (en) 2022-06-22 2023-05-23 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Combination therapies for the treatment of viral infections
KR20230074664A (ko) 2023-05-03 2023-05-31 김승찬 코로나19 변이＆전사 방지 말단결합 헤어핀 상보적 dna 염기조성물

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014516536A (ja) * 2011-05-25 2014-07-17 アイシス イノヴェーション リミテッド サルアデノウイルス及び雑種アデノウイルスベクター
WO2017176596A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Multivalent vaccines for rabies virus and coronaviruses
WO2017221031A1 (en) * 2016-06-23 2017-12-28 Oxford University Innovation Limited Adenoviral vector
JP2019521679A (ja) * 2016-06-20 2019-08-08 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 強力でバランスのとれた双方向性プロモーター
CN110974950A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080267992A1 (en) * 2004-06-04 2008-10-30 Cancer Center, Sun Yat-Sun University Sars Virus Vaccine with Adenovirus Carrier and Preparation Method Thereof, and Use of Sars Virus S Gene for Preparation of Vaccine
RU2510281C2 (ru) * 2012-06-22 2014-03-27 Общество с ограниченной ответственностью "Эпитоп" (ООО "Эпитоп") ВАКЦИНА ПРОТИВ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ Streptococcus pneumoniae, НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА
KR20200032050A (ko) * 2020-03-05 2020-03-25 김승찬 COVID-19 바이러스 맞춤형 삼중 knockout DNA 치료제

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014516536A (ja) * 2011-05-25 2014-07-17 アイシス イノヴェーション リミテッド サルアデノウイルス及び雑種アデノウイルスベクター
WO2017176596A1 (en) * 2016-04-04 2017-10-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Multivalent vaccines for rabies virus and coronaviruses
JP2019521679A (ja) * 2016-06-20 2019-08-08 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 強力でバランスのとれた双方向性プロモーター
WO2017221031A1 (en) * 2016-06-23 2017-12-28 Oxford University Innovation Limited Adenoviral vector
CN110974950A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗

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