KR20230005102A - 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 면역생물제 - Google Patents

중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 면역생물제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생명공학, 면역학 및 바이러스학, 특히 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 면역생물제에 관한 것이다. 또한, 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발되는 질환의 예방을 위한 하나 이상의 면역생물제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역을 유도하는 방법이 개시된다. 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응의 효과적 유도를 촉진한다.

Description

중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 면역생물제
본 발명은 생명공학, 면역학 및 바이러스학에 관한 것이다. 청구된 약제는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환의 예방에 사용할 수 있다.
SARS-CoV-2는 2019년 말에 우한(중국)에서 단리된 코로나바이러스의 신규한 변종으로 수개월 이내에 세계로 확산되었다. 2020년 1월, 세계보건기구(WHO)는 SARS-CoV-2 관련 발생을 국제적으로 우려되는 공중 위생 긴급사태로 선언했고, 3월에는 이 질환의 확산을 팬데믹(pandemic)으로 표현했다. 2020년 4월 초순에는 100만명 이상의 질환이 확인되었고, 6만명이 사망했다.
SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환에는 COVID-19라는 특정 명칭이 지정되었다. 이는 폐렴, 급성 호흡 곤란 증후군, 급성 호흡 부전, 급성 심부전, 급성 신장 손상, 패혈성 쇼크, 심근병증 등의 합병증을 유발할 수 있는 경증으로부터 중증까지 다양한 임상 경과를 수반하는 잠재적 중증 급성 호흡기 감염이다.
SARS-CoV-2는 공기를 통한 경로 또는 직접 접촉을 통한 인간-대-인간의 전파에 의해 확산된다. 상이한 간행물에 따르면, SARS-CoV-2의 기본 재생산 수(R0), 즉 1명의 사람으로부터 질환에 걸리는 사람의 수는 2.68[참조: Wu JT, Leung K, Leung GM. Nowcasting and Forecasting the potential domestic and international spread of the 2019-nCoV outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. Lancet. 2020]으로부터 6.6[참조: Sanche S, Lin YT, Xu C, Romero-Severson E, Hengartner N, Ke R. The Novel Coronavirus, 2019-nCoV, is Highly Contagious and More Infectious Than Initially Estimated. medRxiv. 2020]의 범위이고, 잠복기의 중앙치는 5.2일이다[참조: Li Q, Guan X, Wu P, Wang X, Zhou L, Tong Y. et al. Early Transmission Dynamics in Wuhan, China, of Novel Coronavirus-Infected Pneumonia. N Engl J Med. 2020].
COVID-19 환자로부터 단리된 균주의 계통발생학적 분석은 SARS-CoV-2 바이러스와 가장 밀접하게 관련된 것이 박쥐에서 발견되었다는 것을 입증했다[참조: Zhou P.et al. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 2020; 579: 270-273]. 또한, 기타 포유동물 종들은, SARS-CoV-2가 인간에게 효과적으로 전달되는 데 필요한 돌연변이의 일부 또는 전부를 획득할 수 있는 "중간 숙주"로서 기능할 수 있다는 가정이 있다[참조: Zhang YZ, Holmes EC. A Genomic Perspective on the Origin and Emergence of SARS-CoV-2. Cell. 2020 Mar 26.]
높은 사망률, SARS-CoV-2의 급속한 지리적 확산, 및 명확하게 정의되지 않은 질환의 병인에 의해, 이 바이러스에 의해 유발되는 질환의 예방 및 치료를 위한 효과적 제품을 개발하는 긴급한 필요성이 발생하고 있다.
과거 수년에 걸쳐, 코로나바이러스 감염에 대한 다양한 백신을 생성하기 위한 복수의 노력이 있어 왔다. 개발된 백신 후보는 6개의 클래스로 분류할 수 있다. 1) 바이러스 벡터 백신; 2) DNA 백신; 3) 서브유닛 백신; 4) 나노입자 기반의 백신; 5) 불활성화된 전체 바이러스 백신; 및 6) 약독화 생백신.
이들 백신은 뉴클레오캡시드(N) 단백질, 엔벨로프(E) 단백질, NSP16 단백질 및 코로나바이러스 S 단백질 등의 선택된 바이러스 단백질을 기반으로 했다[참조: Ch. Yong et al. Recent Advances in the Vaccine Development Against Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus. Front Microbiol. 2019 Aug 2; 10:1781.].
이들 제품 중 일부는 임상 시험의 단계에 도달했다(https://www.clinicaltrials.gov/). 그러나, 이러한 제품은 주로 이 코로나바이러스와 SARS-CoV 또는 MERS-CoV 사이의 상동성이 낮기 때문에, 신규 SARS-CoV-2 바이러스에 대해서는 효과적이지 않다. 예를 들면, SARS-CoV-2 및 SARS-CoV의 S 단백질은 76%의 상동성을 나타낸다[참조: Xu X, Chen P, Wang J, Feng J, Zhou H, Li X, et al. Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike protein for risk of human transmission. Sci China Life Sci. 2020;63(3):457-60]. 따라서, 현 시점에서는, SARS-COV-2에 의해 유발된 질환에 대해 등록된 백신은 1개도 없다.
미국 특허 US7452542B2에 따른 해결책은 살아있는, 약독화된 코로나비라다에 백신의 사용을 시사하고, 여기서 바이러스는 MHV-A59의 티로신6398 또는 이의 유사 위치에서의 치환을 포함하는 ExoN 폴리펩타이드, 및 MHV-A59의 leu106 또는 이의 유사 위치에서의 치환을 포함하는 Orf2a 폴리펩타이드를 코딩하는 게놈, 및 약제학적으로 허용되는 용매를 포함하는 것을 특징으로 한다.
특허 제WO2016116398A1호에 따르는 해결책은, 백신으로 사용하기 위한, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(MERS-CoV) N 뉴클레오캡시드 단백질 및/또는 이의 면역원성 단편, 또는 MERS-CoV N 뉴클레오캡시드 단백질 및/또는 이의 면역원성 단편을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
특허 제CN100360557C호에 따르는 해결책은, SARS 바이러스의 S 단백질의 사용에 대해 설명하고, 이는 하기 위치: 778D → Y; 77D → G; 244T → I; 1182K → Q; 360F → S; 479N → R 또는 K; 480D → G; 609A → L 중의 하나에 돌연변이를 가져, 중증 급성 호흡기 증후군에 대한 백신을 생산했다. 특허 출원의 우선일: 2003년 7월 10일.
발명 US20080267992A1의 특허청구범위에 따르는 해결책은, SARS-CoV 바이러스의 전장 S 보호 항원의 서열, 또는 SARS-CoV 바이러스의 S 항원의 S1 도메인 또는 SARS-CoV 바이러스의 S 항원의 S2 도메인, 또는 이들 양 도메인 모두를 포함하는 서열을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군에 대한 백신을 설명한다. 추가로, 발현 카세트 내의 이 재조합 바이러스에는 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(CMV-프로모터) 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bgh-PolyA) 신호가 포함되어 있다.
청구된 발명의 저자는, 프로토타입으로서, 이 특허에 따르는 기술적 해결책을 가장 유사한 것으로서 선택했다. 이 해결책의 중요한 단점은 코로나비리다에의 다른 종의 항원을 사용한다는 것이다.
따라서, 본 발명의 배경은 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 효과적인 면역 반응의 유도를 보장하는 신규한 면역생물제(immunobiological agent)를 개발하기 위한 긴급한 필요성을 유발한다.
청구된 발명 그룹의 목적은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 면역 반응을 효과적으로 유도하기 위한 면역생물제를 생성하는 것이다.
본 발명의 기술적 결과는 SARS-Cov-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 효과적 약제의 생성이다.
이 기술적 결과는, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 18개 아미노산의 유전자 C'-말단 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스의 S 보호 항원의 서열(서열번호 2)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제의 생성에 의해 달성된다.
이 기술적 결과는 또한, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 전장 S 보호 항원의 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열(서열번호 3)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제의 생성에 의해 달성된다.
이 기술적 결과는 또한, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 바이러스 리더 펩타이드 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 4)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제의 생성에 의해 달성된다.
이 기술적 결과는 또한, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 단백질 S 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 5)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제의 생성에 의해 달성된다.
이 기술적 결과는 또한, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 리더 펩타이드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 6)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV-2) 바이러스에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제의 생성에 의해 달성된다.
이 기술적 결과는 또한, 면역생물제 (서열번호 2), 및/또는 (서열번호 3), 및/또는 (서열번호 4), 및/또는 (서열번호 5), 및/또는 (서열번호 6)과 조합하여, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 S 단백질 유전자의 서열에 기초하는 SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 단백질 보호 항원 서열(서열번호 1)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV-2) 바이러스에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제의 생성에 의해 달성된다.
이러한 기술적 결과는 또한, 하나 이상의 약제(서열번호 1), 및/또는 (서열번호 2), 및/또는 (서열번호 3), 및/또는 (서열번호 4), 및/또는 (서열번호 5), 및/또는 (서열번호 6)을 유효량으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역의 유도 방법에 의해 달성된다.
이러한 기술적 결과는 또한 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역의 유도 방법에 의해 달성되고, 여기서 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 2개의 상이한 면역생물제 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 2개의 상이한 면역생물제는 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속적으로 투여된다.
이 기술적 결과는 또한 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역의 유도 방법에 의해 달성되고, 여기서 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 임의의 면역생물제 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 임의의 면역생물제는 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속적으로 투여되거나; 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 임의의 면역생물제 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 임의의 면역생물제는 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속적으로 투여된다.
이러한 기술적 결과는 또한 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역의 유도 방법에 의해 달성되고, 여기서 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 혈청형 26에 기반하는 면역생물제 중 임의의 2개는 포유동물에게 동시에 투여된다.
청구된 발명 그룹의 본질은 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있고, 여기서 도 1 내지 5는 면역화 유효성의 평가 결과를 나타낸다.
도 1은, 실험 동물의 면역화 후 8일차에 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질에 의해 재자극된 증식 CD4+ 림프구의 백분율에 의해 추정된 바와 같이, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 기반하는 개발된 면역제에 의한 면역화의 유효성 평가의 결과를 나타낸다.
Y축 - 증식 세포의 수, %
X축 - 상이한 그룹의 동물:
1) 인산염 완충액(100μl)
2) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
도 2는, 실험 동물의 면역화 후 15일차에 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질에 의해 재자극된 증식 CD4+ 림프구의 백분율에 의해 추정된 바와 같이, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 기반하는 개발된 면역제에 의한 면역화의 유효성 평가의 결과를 나타낸다.
Y축 - 증식 세포의 수, %
X축 - 상이한 그룹의 동물:
1) 인산염 완충액(100μl)
2) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
도 3은, 실험 동물의 면역화 후 8일차에 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질에 의해 재자극된 증식 CD8+ 림프구의 백분율에 의해 추정된 바와 같이, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 보호 항원 서열(단백질 S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 기반하는 개발된 면역제에 의한 면역화의 유효성 평가의 결과를 나타낸다.
Y축 - 증식 세포의 수, %
X축 - 상이한 그룹의 동물:
1) 인산염 완충액(100μl)
2) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
도 4는, 실험 동물의 면역화 후 15일차에 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질에 의해 재자극된 증식 CD8+ 림프구의 백분율에 의해 추정된 바와 같이, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 기반하는 개발된 면역제에 의한 면역화의 유효성 평가의 결과를 나타낸다.
Y축 - 증식 세포의 수, %
X축 - 상이한 그룹의 동물:
1) 인산염 완충액(100μl)
2) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
도 5는, 아데노바이러스 작제물로 면역화시킨 C57/BL6 마우스의 비장세포를 SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 단백질로 자극시킨 후에 배지 중의 INF-감마 농도의 증가에 의해 추정된 바와 같이, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, RBD, S-del, S-Fc, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 기반하는 개발된 면역생물제의 유효성 평가의 결과를 나타낸다.
Y-축 - 무손상 세포와 비교하여 자극된 세포를 갖는 배지에서 IFN-감마 농도 증가 값(배).
X-축 - 연구된 동물 그룹: 무손상 동물 및 108 PFU/마우스를 투여한 동물
1) 인산염 완충액(100μl)
2) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
3) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
4) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
5) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 면역생물제의 개발의 제1 단계는 백신 항원의 선택이었다. 이 프로세스의 일환으로 코로나바이러스 S 단백질이 후보 백신을 생성하기 위한 가장 유망한 항원인 것을 입증하는 문헌 검색이 수행되었다. 유형 1 막관통 당단백질은 바이러스 입자 결합, 융합 및 세포로의 침입을 담당한다. 입증된 바와 같이, 이는 중화 항체의 유도제였다[참조: Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. Biomed Environ Sci. 2005 Dec;18(6):363-74].
S 단백질은 신호 펩타이드(아미노산 1-12)와 3개의 도메인으로 구성되어 있다: 세포외 도메인(아미노산 13-1193), 막관통 도메인(아미노산 1194-1215) 및 세포내 도메인(아미노산 1216-1255). 세포외 도메인은 2개의 서브유닛 S1과 S2, 및 이들 사이의 작은 영역으로 구성되어 있고, 이의 기능은 완전히 이해되어 있지 않다. S1 서브유닛은 바이러스를 ACE2(안지오텐신 전환 효소 2) 수용체에 결합시키는 역할을 한다. S1 서브유닛의 중앙 영역(아미노산 318-510)에 위치한 단편은 수용체 결합 도메인(RBD)으로 명명되었다. 추정 융합 펩타이드와 2개의 헵타드 반복부(HR1 및 HR2)를 포함하는 S2 서브유닛은 바이러스와 표적 세포막의 융합을 촉진한다. 감염은 RBD를 통해 ACE2 세포 수용체에 결합하는 바이러스 S1 서브유닛에 의해 개시된다.
이어서, S2 서브유닛의 HR1 및 HR2 영역의 사이에 융합 코어가 형성된다. 그 결과, 바이러스와 세포막이 근접하고, 이어서 융합하고 바이러스가 세포에 침입한다. 따라서, 백신 제형에서 S 단백질 또는 이의 단편을 사용하면, 바이러스가 세포로 침입하는 것을 억제하는 항체를 유도할 수 있다.
면역 반응의 가장 효과적인 유도를 달성하기 위해, 저자들은 이 항원의 변형의 복수의 변이체, 게다가 표적 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위한 수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인과의 잠재적 조합을 주장했다.
포유동물 세포에서의 발현을 위해 이들 서열을 최적화함으로써 (SARS-CoV-2 바이러스의 변형된 S 유전자 또는 S 단백질의 수용체 결합 도메인의) 뉴클레오티드 서열의 6개 상이한 변이체가 수득되었다.
이어서, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 혈청형 26에 기반하는 다중 작제물은, 변형된 유전자가 포유동물 세포에 효과적으로 전달되는 것을 보장하도록 개발되었다. 아데노바이러스 벡터가 선택되었고, 이는 안전성, 광범위한 조직 향성, 충분히 특성화된 게놈, 유전자 조작의 단순성, 큰 형질전환 DNA 삽입체를 통합하는 능력, 고유한 애주번트 특성 및 안정한 T-세포 매개 및 체액성 면역 반응을 유도하는 능력 등의 장점을 갖고 있기 때문이다.
혈청형 5의 인간 아데노바이러스는 공지된 아데노바이러스 중에서 가장 잘 연구된 바이러스이고, 따라서 벡터를 유도하기 위한 유전자 치료에서 가장 일반적으로 사용된다. 기술은 1세대 및 2세대 벡터, 키메라 바이러스 벡터(기타 바이러스 혈청형의 단백질을 함유)[참조: JN Glasgow et. al., An adenovirus vector with a chimeric fiber based from canine adenovirus type 2 displays novel tropism, Virology, 2004, № 324, 103-116] 및 복수의 기타 벡터를 생산하기 위해 개발되었다. 또한, 기타 혈청형으로부터 유래하는 벡터가 생산되었다[참조: H. Chen et. al., Adenovirus-Based Vaccines: Comparison of vectors from Three Species of Adenoviridae, Virology, 2010, № 84(20), 10522-10532].
인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 벡터는 영장류에서 높은 수준의 면역원성을 나타내고, 여기서 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 숙주 신체에서 유도되는 Т-세포 매개 반응보다 품질의 점에서 우수한 강력한 CD8+ Т-세포 반응을 유도할 수 있다[참조: J. Liu et. al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844-4852]. 이에 의해, 더 많은 에피토프가 인식되고, (감마 인터페론의 주요 생산보다) 더 넓은 스펙트럼의 인자의 생산이 유도된다[참조: J. Liu et. al., Magnitude and phenotype of cellular immune responses elicited by recombinant adenovirus vectors and heterologous prime-boost regimens in rhesus monkeys, Virology, 2008, № 82, 4844-4852]. 이러한 데이터는 인간 아데노바이러스 혈청형-26 기반의 벡터가 기타 아데노바이러스 벡터와 비교하여 표적 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 능력과 관련하여 근본적 차이가 있음을 시사한다.
변이체 1의 발명은, 포유동물 세포에서의 발현을 위해 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 S 단백질 유전자 서열에 기반하는 SARS-CoV-2 바이러스의 전장 보호 S 항원의 서열(서열번호 1)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26이다.
변이체 2의 발명은, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 18개 아미노산의 유전자 C'-말단 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스의 전장 S 보호 항원의 서열(서열번호 2)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26이다.
변이체 3의 발명은, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 전장 S 보호 항원의 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편의 서열(서열번호 3)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26이다.
변이체 4의 발명은, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 바이러스 리더 펩타이드 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 4)을 함유하는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26이다.
변이체 5의 발명은, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 5)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26이다.
변이체 6의 발명은, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 리더 펩타이드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 6)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26이다.
저자들은 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역을 유도하는 방법을 개발했고, 이는 변이체 1 내지 6의 하나 이상의 약제를 포유동물에게 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 이 방법은 하기를 상정한다:
1) 변이체 1 내지 6으로 본 명세서에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 2개의 상이한 면역생물제 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 2개의 상이한 면역생물제를 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속 투여.
2) 변이체 1 내지 6으로 본 명세서에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 임의의 면역생물제 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 임의의 면역생물제를 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속 투여, 또는 변이체 1 내지 6으로 본 명세서에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 임의의 면역생물제 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 임의의 면역생물제를 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속 투여.
3) 본 명세서의 제1항, 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 혈청형 26에 기반하는 임의의 2개 면역생물제를 포유동물에게 동시 투여.
본 발명의 실시는 하기 실시예에 의해 입증된다.
실시예 1. SARS-CoV-2 바이러스 S 당단백질의 상이한 변이체의 수득
제1 단계에서, 저자들은 가장 효과적인 면역 반응을 달성하기 위해 백신 항원의 몇몇 변형을 개발했다.
기본적으로, 서열번호 1의 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질을 채취하고, 이어서 이를 몇몇 방법으로 변형시켰다:
1) 원형질막에 S 단백질을 제시하기 위해, 유전자 C'-말단(S-del) 서열번호 2 상의 18개 아미노산의 결실을 수행했다(변이체 2에 사용됨).
2) 또한, 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 보호 항원 서열이 수득되었다(변이체 3에 사용됨). 이 변형은 항원 제시 세포에서 Fc 수용체에 대한 단백질 Fc 단편의 잠재적 결합을 통해 면역원성을 증강시키고[참조: Li Z., Palaniyandi S., Zeng R., Tuo W., Roopenian D.C., Zhu X., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2011, №108, 4388-93], 또한 단백질 안정성을 증가시키고 생체내에서 반감기를 연장시킨다[참조: Zhang M.Y., Wang Y., Mankowski M.K., Ptak R.G., Dimitrov D.S., Cross-reactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2009, №27, 857-863].
3) 분비된 형태의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질의 수용체-결합 도메인(RBD) 단독의 면역원성을 평가하기 위해, 리더 펩타이드 서열을 갖는 S 단백질 서열-결합 도메인 서열(단백질 분비를 위해 부가됨)을 함유하는, 서열번호 4의 서열(변이체 4에 사용됨)를 생성했다.
4) 비분비 형태의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 RBD를 조사하기 위해, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(RBD-G)의 막관통 도메인의 서열이 부가된 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 RBD로 이루어진 서열번호 5의 서열(변이체 5에 사용됨)을 선택했다.
5) 리더 펩타이드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는 분비된 형태의 S 단백질 RBD를 조사하기 위해, 서열번호 6의 서열이 선택되었다(변이체 6에 사용됨). 인간 IgG1 Fc-단편 서열의 부가는 항원 제시 세포에서 Fc 수용체에 대한 단백질 Fc 단편의 잠재적 결합을 통해 면역원성을 증강시키고[참조: Z. Li et. al., Transfer of IgG in the female genital tract by MHC class I-related neonatal Fc receptor (FcRn) confers protective immunity to vaginal infection, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2011, № 108, 4388-4393], 또한 단백질 안정성을 증가시키고 생체내에서 이의 반감기를 연장시킬 수 있다[참조: M.Y. Zhang et. al., Crossreactive HIV-1-neutralizing activity of serum IgG from a rabbit immunized with gp41 fused to IgG1 Fc: Possible role of the prolonged half-life of the immunogen, Vaccine, 2008, № 27, 857-63].
실시예 2. 상이한 변이체에서 S 단백질 유전자를 코딩하는 유전자 작제물의 수득.
후속 단계에서, 실시예 1에서 본 명세서에 제시된 아미노산 서열(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6)이 뉴클레오티드 서열로 번역되었다. 후속 단계는 포유동물 세포에서의 발현을 위해 수득된 서열의 최적화를 포함했다. 모든 뉴클레오티드 서열은 ZAO "에브로겐(Evrogen)" 컴파니(Moscow)의 합성 방법을 사용하여 수득했다. 그 결과, 하기의 유전자 작제물을 이용할 수 있었다:
1) pVax-S-CoV-2, SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 유전자의 뉴클레오티드 서열을 함유;
2) pVax-S-del-CoV-2, 유전자 C'-말단에 18개 아미노산의 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 유전자의 뉴클레오티드 서열을 함유;
3) pVax-S-Fc-CoV-2, SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편의 서열을 함유;
4) pAL2-T-RBD-CoV-2, 리더 펩타이드 유전자 서열을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 뉴클레오티드 서열을 함유;
5) pAL2-T-RBD-G-CoV-2, 수포성 구내염 바이러스의 G 유전자를 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 뉴클레오티드 서열을 함유;
6) pAL2-T-RBD-Fc-CoV-2, 리더 펩타이드 유전자 서열을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 뉴클레오티드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편의 뉴클레오티드 서열을 함유.
이어서, 유전 공학 방법에 의해, 작제물 pVax-S-CoV-2의 S 단백질 유전자 서열을, XbaI 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여, 셔틀 플라스미드 pShuttle-CMV(Stratаgene, US)에 클로닝하고, 수득된 플라스미드를 pShuttle-S-CoV-2로 명명했다. 따라서, 셔틀 플라스미드 pShuttle-S-CoV-2가 생성되었고, 이는, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 S 아미노산 서열(서열번호 1)의 뉴클레오티드 서열을 운반한다(실시예 1에서 수득됨).
유사하게는, SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질의 변형된 변이체의 뉴클레오티드 서열을 셔틀 플라스미드 pShuttle-CMV(Stratаgene, US)에 클로닝하여 하기 셔틀 플라스미드를 수득했다:
- pShuttle-S-del-CoV-2(유전자 C'-말단에 18개 아미노산의 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 유전자의 최적화된 뉴클레오티드 서열을 함유);
- pShuttle-S-Fc-CoV-2, SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 유전자의 최적화된 뉴클레오티드 서열 및 인간 IgG1로부터의 Fc-단편 서열을 함유;
- pShuttle-RBD-CoV-2(SARS-CoV-2 바이러스 S 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열을 함유);
- pShuttle-RBD-G-CoV-2(수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열을 함유);
- pShuttle-RBD-Fc-CoV-2(인간 IgG1로부터의 Fc-단편의 최적화된 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열을 함유).
실시예 3. 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 면역생물제의 수득.
후속 단계에서, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 SARS-CoV-2 전장 S 보호 항원의 서열(서열번호 1)(변이체 1)을 함유하는 재조합 아데노바이러스 플라스미드 pAd5-S-CoV-2가 수득되었다. 이 플라스미드는 E1 및 E3 부위가 결실된 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 게놈 영역을 포함하는 플라스미드 pAd와, 아데노바이러스의 상동성 부위 및 표적 유전자(S 단백질의)를 갖는 발현 카세트를 운반하는 셔틀 플라스미드 pShuttle-S(실시예 3에서 수득) 사이의 상동 재조합 프로세스에 의해 수득되었다. 이 목적을 위해, 실시예 3에서 수득된 셔틀 플라스미드 pShuttle-S를 제한 엔도뉴클레아제 PmeI에 의해 선형화했다.
이. 콜라이(E. coli) 균주 BJ5183의 세포에서 상동성 재조합을 수행했다. 플라스미드 pAd를 플라스미드 pShuttle-S와 혼합하고, 이어서 수취된 혼합물을 사용하여 가이드 "MicroPulser™ 전기천공 장치 조작 설명서 및 어플리케이션 가이드"(Bio-Rad, US)에 따라 전기천공법으로 이. 콜라이(E.coli) 세포를 형질전환했다. 형질전환이 완료되면, 이. 콜라이 균주 BJ5183의 세포를 선택적 항생물질을 포함하는 LB-아가 접시에 접종하고, +37℃에서 18시간 동안 성장시켰다. 형질전환의 유효성은 플라스미드 pBluescript II SK(-)의 μg당 1010 -1011 형질전환된 클론이었다.
상동성 재조합의 결과, (S 단백질의) 표적 도입유전자를 갖는 카세트가 플라스미드 pAd에 출현하고, 항생물질 내성 유전자가 변화했다.
따라서, 재조합 아데노바이러스 플라스미드 pAd5-S-CoV-2가 작제되었고, 이는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 전장 게놈(게놈으로부터 E1 및 E3 부위가 결실됨)와 실시예 3에서 수득된 통합된 유전자 작제물을 함유한다. 이어서, 플라스미드 pAd5-S-CoV-2를 제한 엔도뉴클레아제 Pac I로 가수분해하고, 인간 배아 신장 세포주 HEK 293의 허용 세포 배양의 형질감염에 사용했다. HEK 293 세포의 게놈은 인간 아데노바이러스 혈청형 5 게놈의 통합된 E1 부위를 함유하고, 따라서 재조합 복제-결함 인간 아데노바이러스 혈청형 5의 복제가 발생할 수 있다. 형질감염 후 6일차에, 재조합 아데노바이러스의 보다 효과적 생산을 보장하기 위해, 제1 블라인드 계대를 수행했다. 세포변성 바이러스 효과(현미경 데이터)가 발생하면, 배양 배지를 갖는 세포를 3회 동결시켜 세포 파괴 및 바이러스 방출을 촉진했다. 이어서, 수득된 물질을 조제 양의 재조합 아데노바이러스의 축적에 사용했다.
하기의 조제물(preparation) pAd5-S-CoV-2의 활성은 플라크 형성 세포 검정을 사용하여 감수성 293 HEK 세포의 배양에서 표준 적정 기술에 의해 평가했다.
SARS-CoV-2 바이러스 S 유전자를 발현하는 인간 아데노바이러스 혈청형 5로부터 유래하는 잠재적 재조합 슈도-아데노바이러스 입자의 작제물의 생성을 검증하기 위해, 확립된 표준 기술에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행했다.
유사한 방식으로, 추가로 5개 재조합 바이러스를 수득했다: Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2.
따라서, 결과적으로, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 면역생물제의 변이체가 수득되고, 하기를 함유한다:
1) SARS-CoV-2 바이러스 S 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 1);
2) 유전자 C'-말단에서 18개 아미노산의 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 보호 항원의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 2);
3) 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된 SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 보호 항원의 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편의 서열(변이체 3);
4) 리더 펩타이드 서열을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 4);
5) 수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 5),
6) 리더 펩타이드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 최적화된 서열(변이체 6).
실시예 4. 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 면역생물제의 수득.
제1 단계에서, SARS-CoV-2 바이러스 S 유전자를 갖는 발현 카세트를 재조합 벡터 pAd26-ORF6-Ad5에 넣었다. 이 목적을 위해, 벡터 pAd26-ORF6-Ad5를 제한 엔도뉴클레아제 PmeI로 선형화하고, 실시예 3에서 수득된 플라스미드 작제물 pShuttle-S를 제한 엔도뉴클레아제 PmeI로 처리했다. 가수분해 생성물을 결찰시킨 후, 표준 기술을 사용하여 플라스미드 pAd26-S-CoV-2를 생성했다.
후속 단계에서, 플라스미드 pAd26-S-CoV-2를 제한 엔도뉴클레아제 PacI 및 SwaI로 가수분해하고, 허용 세포주 HEK 293 배양물의 형질감염에 사용했다. 형질감염 3일차에, 1차 블라인드 계대를 실시하여 재조합 바이러스의 보다 효과적 생성을 보장했다. 세포변성 바이러스 효과(현미경 데이터)가 발생하면, 배양 배지를 갖는 세포를 3회 동결시켜, 세포 파괴 및 바이러스 방출을 촉진했다. 수득된 물질을 사용하여, 조제 양의 재조합 아데노바이러스를 축적시켰다. 이어서, 조제물 pAd26-S-CoV-2의 활성은 플라크 형성 세포 검정을 사용하여 293 HEK 세포의 배양에서 표준 적정 기술에 의해 평가되었다.
SARS-CoV-2 바이러스 S 유전자를 발현하는 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 제안된 재조합 슈도-아데노바이러스 입자의 작제물이 생성되었는지를 확인하기 위해, 확립된 표준 기술에 따라 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 수행했다.
유사한 방식으로, 추가의 5개 재조합 바이러스가 수득되었다: pAd26-S-dek-CoV-2, pAd26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2.
따라서, 그 결과, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 면역생물제의 변이체가 수득되고, 하기를 함유한다:
1) SARS-CoV-2 바이러스 S 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 1);
2) 유전자 C'-말단에서 18개 아미노산의 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 보호 항원의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 2);
3) 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 전장 S 보호 항원의 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편의 서열(변이체 3);
4) 리더 펩타이드 서열을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 4);
5) 수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 최적화된 뉴클레오티드 서열(변이체 5);
6) 리더 펩타이드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는 S 단백질 수용체-결합 도메인의 최적화된 서열(변이체 6).
실시예 5. 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 면역생물제의 첨가 후에 HEK293 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질 유전자의 상이한 변이체의 발현의 검증.
이 실험의 목적은 작제된 재조합 아데노바이러스 Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2가 포유동물 세포에서 S 단백질 유전자의 다양한 변이체를 발현하는 능력을 검증하는 것이었다.
HEK293 세포는 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 배양되었다. 세포를 35mm2 배양 페트리 접시에 넣고, 70% 컨플루언스에 도달할 때까지 24시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 재조합 아데노바이러스의 연구된 조제물(Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2) 및 음성 대조군으로서 100PFU/세포 양의 대조군 조제물(Ad5-null - 삽입체를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스) 및 인산염 완충 식염수(PBS)를 세포에 첨가했다. 형질도입 2일 후, 세포를 수집하고, 0.5ml의 정상 강도 완충액 CCLR(Promega)에 용해시켰다. 용해물을 탄산염-중탄산염 완충액으로 희석하고, ELISA 플레이트 웰에 넣었다. 플레이트를 +4℃에서 밤새 인큐베이팅했다.
플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 3회 세척한 다음, 100㎕의 차단 완충액을 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 400rpm의 진탕기에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도의 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 3회 세척하고, 100㎕의 회복기 혈청을 모든 웰에 첨가했다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 진탕기에서 400rpm으로 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 3회 세척한 후, 비오틴과 접합된 2차 항체 100㎕를 첨가했다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 진탕기에서 400rpm으로 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 스트렙트아비딘 용액을 제조했다. 이 목적을 위해, 60㎕의 접합체를 5.94ml의 검정 완충액에서 희석했다. 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 스트렙트아비딘 용액 100㎕를 각각의 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트를 진탕기에서 400rpm으로 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, 100㎕의 TMB 기질을 각 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트를 암소에서 실온에서 10분 동안 인큐베이팅한 후, 100㎕의 정지 용액을 각 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트 분광 광도계(Multiskan FC, Thermo)를 사용하여 450nm의 파장에서 광학 밀도를 측정했다. 실험 결과는 표 1에 제시되어 있다.
재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 면역생물제를 첨가한 후에 HEK293 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질 유전자의 다양한 변이체의 발현을 검증하기 위한 실험 결과.
450nm의 파장에서 평균 광학 밀도
PBS 0.19 (±0.05)
Ad5-null 0.23 (±0.08)
Ad5-S-CoV-2 1.85 (±0.15)
Ad5-S-del-CoV-2 1.63 (±0.19)
Ad5-S-Fc-CoV-2 1.57 (±0.30)
Ad5-RBD-CoV-2 1.47 (±0.21)
Ad5-RBD-G-CoV-2 1.52 (±0.19)
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1.58 (±0.11)
수신된 데이터에 제시된 바와 같이, 표적 단백질의 상이한 변이체의 발현이 재조합 아데노바이러스 Ad5-S-CoV-2, Ad5-S-del-CoV-2, Ad5-S-Fc-CoV-2, Ad5-RBD-CoV-2, Ad5-RBD-G-CoV-2, Ad5-RBD-Fc-CoV-2로 형질도입된 모든 세포에서 관찰되었다.
실시예 6. 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 면역생물제의 첨가 후에 HEK293 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질 유전자의 상이한 변이체의 발현의 검증.
이 실험의 목적은 작제된 재조합 아데노바이러스 pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2가 포유동물 세포에서 S 단백질 유전자의 다양한 변이체를 발현하는 능력을 검증하는 것이었다.
HEK293 세포는 37℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 10% 태아 송아지 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 배양되었다. 세포를 35mm2 배양 페트리 접시에 넣고, 70% 컨플루언스에 도달할 때까지 24시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 재조합 아데노바이러스의 연구된 조제물(pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2) 및 음성 대조군으로서 100PFU/세포 양의 대조군 조제물(Ad26-null - 삽입체를 함유하지 않는 재조합 아데노바이러스) 및 인산염 완충 식염수(PBS)를 세포에 첨가했다. 형질도입 2일 후, 세포를 수집하고, 0.5ml의 정상 강도 완충액 CCLR(Promega)에 용해시켰다. 용해물을 탄산염-중탄산염 완충액으로 희석하고, ELISA 플레이트 웰에 넣었다. 플레이트를 +4℃에서 밤새 인큐베이팅했다.
플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 3회 세척한 다음, 100㎕의 차단 완충액을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 400rpm의 진탕기에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도의 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 3회 세척하고, 100㎕의 회복기 혈청을 모든 웰에 첨가했다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 진탕기에서 400rpm으로 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 3회 세척하고, 비오틴과 접합된 2차 항체 100㎕를 첨가했다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 진탕기에서 400rpm으로 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 스트렙트아비딘 용액을 제조했다. 이 목적을 위해, 60㎕의 접합체를 5.94ml의 검정 완충액에서 희석했다. 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 스트렙트아비딘 용액 100㎕를 각각의 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트를 진탕기에서 400rpm으로 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, 100㎕의 TMB 기질을 각 플레이트 웰에 첨가하고, 암소에서 실온에서 10분 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 100μl의 정지 용액을 각 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트 분광 광도계(Multiskan FC, Thermo)를 사용하여 450nm의 파장에서 광학 밀도의 값을 측정했다. 실험 결과는 표 2에 제시되어 있다.
재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 면역생물제를 첨가한 후에 HEK293 세포에서 SARS-CoV-2 바이러스의 S 당단백질 유전자의 다양한 변이체의 발현을 검증하기 위한 실험 결과.
450nm의 파장에서 평균 광학 밀도
PBS 0.17 (±0.08)
Ad26-null 0.22 (±0.09)
Ad26-S-CoV-2 1.68 (±0.21)
Ad26-S-del-CoV-2 1.65 (0.14)
Ad26-S-Fc-CoV-2 1.71 (±0.13)
Ad26-RBD-CoV-2 1.61 (±0.18)
Ad26-RBD-G-CoV-2 1.45 (±0.22)
Ad26-RBD-Fc-CoV-2 1.51 (±0.14)
수신된 데이터에 제시된 바와 같이, 표적 단백질의 상이한 변이체의 발현이 재조합 아데노바이러스 pAd26-S-CoV-2, Ad26-S-del-CoV-2, Ad26-S-Fc-CoV-2, pAd26-RBD-CoV-2, pAd26-RBD-G-CoV-2, pAd26-RBD-Fc-CoV-2로 형질도입된 모든 세포에서 관찰되었다 .
실시예 7. SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 유효량에서 포유동물에 대한 단일 투여에 의한 개발된 면역생물제의 이용 방법.
포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 및 26에 기반하는 개발된 면역생물제는 이 바이러스 벡터에 대해 공지된 임의의 투여 경로(피하, 근육내, 정맥내, 비강내)를 통해 포유동물에게 투여함으로써 이용된다. 이렇게 하여, SARS-CoV-2 당단백질의 표적 단백질에 대한 면역 반응이 포유동물에서 발생한다.
면역화 유효성의 주요 특징 중의 하나는 항체 역가이다. 실시예는, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원의 서열(단백질 S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc의)을 포함하는, 혈청형 5 또는 26의 재조합 인간 아데노바이러스를 함유하는 면역생물제에 의한 동물의 단일 근육내 면역화 후 21일차에 SARS-CoV-2 당단백질의 역가 변화에 관한 데이터를 제시한다.
실험에 사용된 포유동물 - 마우스 C57BL/6, 암컷, 18g. 모든 동물을 각각 5마리씩 43개 그룹으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1) Ad5-S-CoV-2 107 PFU/마우스
2) Ad5-S-del-CoV-2 107 PFU/마우스
3) Ad5-S-Fc-CoV-2 107 PFU/마우스
4) Ad5-RBD-CoV-2 107 PFU/마우스
5) Ad5-RBD-G-CoV-2 107 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 107 PFU/마우스
7) Ad5-null 107 PFU/마우스
8) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
9) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
10) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
11) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
12) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
13) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
14) Ad5-null 108 PFU/마우스
15) Ad5-S-CoV-2 109 PFU/마우스
16) Ad5-S-del-CoV-2 109 PFU/마우스
17) Ad5-S-Fc-CoV-2 109 PFU/마우스
18) Ad5-RBD-CoV-2 109 PFU/마우스
19) Ad5-RBD-G-CoV-2 109 PFU/마우스
20) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 109 PFU/마우스
21) Ad5-null 109 PFU/마우스
22) Ad26-S-CoV-2 107 PFU/마우스
23) Ad26-S-del-CoV-2 107 PFU/마우스
24) Ad26-S-Fc-CoV-2 107 PFU/마우스
25) Ad26-RBD-CoV-2 107 PFU/마우스
26) Ad26-RBD-G-CoV-2 107 PFU/마우스
27) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 107 PFU/마우스
28) Ad26-null 107 PFU/마우스
29) Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
30) Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
31) Ad26-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
32) Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
33) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
34) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
35) Ad26-null 108 PFU/마우스
36) Ad26-S-CoV-2 109 PFU/마우스
37) Ad26-S-del-CoV-2 109 PFU/마우스
38) Ad26-S-Fc-CoV-2 109 PFU/마우스
39) Ad26-RBD-CoV-2 109 PFU/마우스
40) Ad26-RBD-G-CoV-2 109 PFU/마우스
41) Ad26-RBD-Fc-CoV-2 109 PFU/마우스
42) Ad26-null 109 PFU/마우스
43) 인산염 완충 식염수
3주 후, 동물의 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채취하여 혈청을 단리했다. 항체 역가는 하기 프로토콜을 사용하여 ELISA에 의해 결정되었다:
1) 단백질(S)을 96-웰 ELISA 플레이트의 웰에 +4℃에서 16시간 동안 흡착시켰다.
2) 이어서, 비특이적 결합을 방지하기 위해, 플레이트를 웰당 100μl의 양으로 TPBS에 용해된 5% 밀크로 "차단"했다. 진탕기에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다.
3) 면역화된 마우스로부터의 혈청 샘플은 2배 희석 방법을 사용하여 희석했다. 합계로, 각 샘플의 12개 희석액이 제조되었다.
4) 희석된 혈청 샘플 각각 50㎕를 플레이트 웰에 첨가했다.
5) 이어서, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅했다.
6) 인큐베이션 후, 웰을 인산염 완충액으로 3회 세척했다.
7) 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 마우스 면역글로불린에 대한 2차 항체를 첨가했다.
8) 이어서, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션을 수행했다.
9) 인큐베이션 후, 웰을 인산염 완충액으로 3회 세척했다.
10) 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제의 기질로서 기능하고 반응에 의해 유색 화합물로 전환되는 테트라메틸벤지딘(TMB) 용액을 첨가했다. 15분 후, 황산을 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 이어서, 분광 광도계를 사용하여 용액의 광학 밀도(OD)를 450nm의 파장에서 각 웰에서 측정했다.
항체 역가는 용액의 광학 밀도가 음성 대조군보다 유의하게 높은 최종 희석액으로서 결정했다. 수득된 결과(기하 평균)를 표 3에 제시한다.
마우스의 혈액 혈청내 S 단백질에 대한 항체 역가(항체 역가의 기하 평균)
재조합 아데노바이러스 PFU/마우스
107 108 109
Ad5-null 0 0 0
Ad5-S-CoV-2 1:10809 1:18820 1:57052
Ad5-S-del-CoV-2 1:21619 1:28526 1:114105
Ad5-S-Fc-CoV-2 1:14263 1:18820 1:57052
Ad5-RBD-CoV-2 1:12417 1:14263 1:99334
Ad5-RBD-G-CoV-2 1:32768 1: 49667 1:172951
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1:10809 1:12417 1:28526
Ad26-null 0 0 0
Ad26-S-CoV-2 1:18820 1:24834 1:43238
Ad26-S-del-CoV-2 1:24834 1:43238 1:57052
Ad26-S-Fc-CoV-2 1:28526 1:32768 1:86475
Ad26-RBD-CoV-2 1:12417 1:18820 1:86475
Ad26-RBD-G-CoV-2 1:24834 1:32768 1:150562
Ad26-RBD-Fc-CoV-2 1:9410 1:12417 1:24834
실험 결과는, 포유동물에 투여된 개발된 면역생물제가 선택된 용량 범위 전체에 걸쳐 SARS-CoV-2 당단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 것을 나타냈다. 용량을 증량하면, 독성 효과가 발생할 때까지 포유동물 혈액에서 항체 역가가 상승하는 것이 명백하다.
실시예 8. SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 유효량으로 포유동물에게 연속 투여에 의한 개발된 면역생물제의 이용 방법.
본 실시예는, SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 1주 시간 간격으로 포유동물에게 연속 투여함으로써, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 개발된 면역생물제의 이용 방법을 기재한다.
실험은 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행되었다.
모든 동물을 29개 그룹(각 3마리 동물)으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1) 인산염 완충액(100μl) 및 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
2) 인산염 완충액(100μl) 및 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
3) Ad5-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
4) Ad5-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
5) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
8) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
9) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
10) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
11) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
12) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
13) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
14) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
15) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
16) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
17) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
18) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
19) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
20) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
21) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
22) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
23) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
24) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
25) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
26) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
27) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
28) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
29) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
30) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
31) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
32) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
33) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
34) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
35) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
36) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
37) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
38) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
39) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
40) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
41) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
결과는 표 4 및 5에 제시되어 있다.
대조군 그룹으로부터의 마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
2차 면역화 (1주일 후)
PBS Ad5-null
1차 면역화 PBS 0 0
Ad5-null 0 0
실험 그룹으로부터의 마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
2차 면역화 (1주일 후)
1차 면역화 Ad5-S-CoV-2 Ad5-S-del-CoV-2 Ad5-S-Fc-CoV-2 Ad5-RBD-CoV-2 Ad5- RBD-G-CoV-2 Ad5-RBD-Fc-CoV-2
Ad5-S-CoV-2 1:32768 1:131072 1:104032 1:131072 1:65536 1:104032
Ad5-S-del- CoV-2 1:65536 1:131072 1:131072 1:131072 1:65536 1:104032
Ad5-S-Fc- CoV-2 1:65536 1:104032 1:65536 1:104032 1:52016 1:131072
Ad5-RBD-CoV-2 1:52016 1:65536 1:131072 1:65536 1:32768 1:52016
Ad5-RBD-G-CoV-2 1:131072 1:131072 1:104032 1:131072 1:65536 1:104032
Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1:82570 1:131072 1:65536 1:32768 1:65536 1:65536
따라서, 실험 결과는 SARS-CoV-2의 상이한 형태의 S 단백질을 포함하는 상이한 조합으로 개발된 면역생물제에 의한 연속 면역화가, 유사한 섭생에 따라 수행된 1개 항원에 의한 면역화보다 더 강력한 면역 반응의 유도를 유발하는 것을 충분히 확인시켜 주었다.
실시예 9. 증식성 림프구의 백분율에 따른 개발된 면역생물제에 의한 면역화의 유효성 평가.
림프구 증식 검정은, 항원과 조우한 후, 림프구가 더 활발하게 분열하는 능력을 평가하는 것을 가능하게 한다. 증식을 평가하기 위해, 저자들은 림프구의 염색에 형광 염료 CFSE를 사용했다. 이 염료는 세포 단백질에 결합하여 장기간 그곳에 체류하지만 모집단 내의 인접하는 세포로 확산하지 않는다. 그러나, 형광 표지는 딸 세포에 전달된다. 표지 농도 및 그 결과로서 딸 세포의 형광 강도는 정확히 2배 감소한다. 따라서, 분열하는 세포는 이들의 형광의 감소에 의해 용이하게 추적할 수 있다. 따라서, 분열하는 세포는 형광 강도를 저하시킴으로써 용이하게 추적할 수 있다.
실험에는 C57BL/6 마우스를 사용했다. 모든 동물을 8개 그룹(각각 3마리)으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1) 인산염 완충액(100μl)
2) Ad5-null 108 PFU/마우스
3) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
4) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
5) Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
6) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
7) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
8) Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
2주 후, 동물을 안락사시켰다. 림프구는 피콜-유로그라핀(Ficoll-Urografin) 밀도 구배 원심분리에 의해 비장으로부터 단리되었다. 이어서, 단리된 세포를 CFSE 기술에 따라 CFSE로 염색하고(세포내 형광 염료 카복시 형광 디아세테이트 석신이미딜에스테르에 의한 시험관내 및 생체내에서 림프구 증식의 모니터링/Quah BJ, Warren HS, Parish CR Nat Protoc. 2007; 2(9), p:2049-2056), 항원의 존재하에서 배양했다. 이어서, 유세포 분석을 사용하여 세포를 분석했다. 수득된 결과를 도 1, 2, 3, 4에 제시한다. 따라서, 수득된 아데노바이러스 작제물은 항원 특이적 면역 반응(CD4+ 및 CD8+ 모두)을 유도한다고 결론지을 수 있었다.
실험 결과(도 1, 2, 3, 4)에 의해 제시된 바와 같이, 제1항, 제2항, 제3항, 제4항, 제5항에 따라 개발된 면역생물제는 사용된 용량에서 림프구의 증식을 효과적으로 자극한다.
실시예 10. SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 포유동물에 대한 연속 투여에 의해 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 및 26에 기반하는 개발된 면역생물제의 이용 방법.
실험은 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행했다. 면역생물제의 조합은 실시예 7 및 8에 기초하여 선택했다.
모든 동물을 31개 그룹(각각 3마리)으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1) 인산염 완충액(100μl) 및 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
2) Ad26-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
3) 인산염 완충액(100μl) 및 1주일 후 Ad26-null 108 PFU/마우스
4) Ad26-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-null 108 PFU/마우스
5) Ad5-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
6) 인산염 완충액(100μl) 및 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
7) Ad5-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
8) Ad5-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-null 108 PFU/마우스
9) Ad26-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
10) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
11) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
12) Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
13) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
14) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
15) Ad26-S-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
16) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
17) Ad26-S-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
18) Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
19) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
20) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
21) Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
22) Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
23) Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-G-CoV-2 108 PFU/마우스
24) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
25) Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
26) Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
27) Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
28) Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
29) Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
30) Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
31) Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
결과는 표 6 및 7에 제시되어 있다.
실험 그룹으로부터의 마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
2차 면역화 (1주일 후)
PBS Ad5-null Ad26-null
1차 면역화 PBS 0 0 0
Ad5-null 0 0 0
Ad26-null 0 0 0
실험 그룹으로부터의 마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
동물의 그룹 항체 역가의 기하 평균
Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-G 108 PFU/마우스 1:208064
Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 1:1321123
Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 1:832255
Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 1:1321123
Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 1:165140
Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 1:104032
Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 1:104032
Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 1:52016
Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 1:131072
Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 1:104032
Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-G-CoV-2 108PFU/마우스 1:165140
Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108PFU/마우스 1:208064
Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108PFU/마우스 1:660561
Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 1:416128
Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 1:208064
Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 1:65536
Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 1:131072
Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 1:165140
Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 1:208064
Ad26-S-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 1:208064
Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26- S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 1:165140
Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5 S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 1:165140
따라서, 실험 결과는, 상이한 아데노바이러스 벡터(인간 아데노바이러스 혈청형 5 및 26에 기반)를 포함하는 개발된 면역생물제에 의한 연속 면역화가 유사한 면역 섭생에 따라 수행된 1개 벡터에 의한 면역화보다 더 강력한 면역 반응을 유도할 수 있음을 충분히 확인시켜 주었다.
실시예 11. IFN-감마 유도에 의한 개발된 면역생물제 면역화의 유효성 평가
본 실험은, 아데노바이러스 작제물로 면역화시킨 C57/BL6 마우스의 비장세포를 SARS-CoV-2 바이러스 재조합 전장 S 단백질로 자극시킨 후의 배지에서 IFN-감마 농도의 증가에 의해 평가된 바와 같이, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스의 보호 항원 서열(단백질 S, S-del, S-Fc, RBD, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는 재조합 아데노바이러스에 기반하는 개발된 면역생물제에 의한 면역화의 유효성을 평가하기 위해 수행되었다.
마우스 IFN 감마 플래티늄 ELISA 키트(Affymetrix eBioscience, USA)를 사용하여 IFN-감마 수준을 측정했다.
ELISA 프로토콜. 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, 이어서 음성 대조군으로서 100㎕의 참조 용액 및 100㎕의 샘플 희석액을 첨가했다. 50㎕의 샘플 희석액을 각 웰에 넣고, 이어서 50㎕의 샘플(자극된 비장세포로부터의 배지)을 모든 웰에 첨가했다. 비오틴-접합 항체의 용액을 제조했다. 이 목적을 위해, 60㎕의 접합체를 5.94ml의 검정 완충액에서 희석했다. 이어서, 50㎕의 비오틴-접합된 항체 용액을 각 웰에 넣었다. 플레이트를 뚜껑으로 덮고, 진탕기에서 400rpm으로 2시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 서양고추냉이 퍼옥시다제와 접합된 스트렙트아비딘 용액을 제조했다. 이 목적을 위해, 60㎕의 접합체를 5.94ml의 검정 완충액에서 희석했다. 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, 서양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 스트렙트아비딘 용액 100㎕를 각각의 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트를 진탕기에서 400rpm으로 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅했다. 이어서, 플레이트 웰을 정상 강도의 세척 완충액으로 웰당 200㎕의 양으로 2회 세척하고, TMB 기질 100㎕를 각 플레이트 웰에 첨가하고, 플레이트를 암소하에 실온에서 10분 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 100μl의 정지 용액을 각 플레이트 웰에 첨가했다. 플레이트 분광 광도계(Multiskan FC, Thermo)를 사용하여 450nm의 파장에서 광학 밀도를 측정했다.
아데노바이러스 작제물에 의한 실험 동물의 면역화 후 15일차에 IFN-감마 생산의 측정 결과는 IFN-감마 농도의 증가(배)로서 도 5에 그래프로 제시되어 있고, 여기서 SARS-CoV-2 바이러스 재조합 전장 S 단백질로 자극시킨 세포는 무손상 세포와 비교된다.
연구 결과는, 수득된 작제물의 동물에 대한 투여 후, SARS-CoV-2 바이러스 재조합 S 단백질로 자극시킨 비장세포에서 IFN-감마 발현의 높은 수준의 유도가 계속되었음을 입증했고, 이는 특정 T-세포-매개 면역 반응이 형성되었음을 시사한다.
실시예 12. SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 포유동물에 대한 이들의 동시 투여에 의해, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1 및 서열번호 5로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(S 단백질 및 RBD-G의)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 개발된 면역생물제의 이용 방법.
실험은 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행했다. 면역생물제의 조합은 실시예 8 및 11에 기초하여 선택했다.
모든 동물을 17개 그룹(각각 5마리)으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1. 인산염 완충액(100μk)
2. Ad5-null 105 바이러스 입자/마우스
3. Ad5-null 106 바이러스 입자/마우스
4. Ad5-null 107 바이러스 입자/마우스
5. Ad5-null 108 바이러스 입자/마우스
6. Ad5-null 109 바이러스 입자/마우스
7. Ad5-null 1010 바이러스 입자/마우스
8. Ad5-null 5*1010 바이러스 입자/마우스
9. Ad5-null 1011 바이러스 입자/마우스
10. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 105 바이러스 입자/마우스
11. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 106 바이러스 입자/마우스
12. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 107 바이러스 입자/마우스
13. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 108 바이러스 입자/마우스
14. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 109 바이러스 입자/마우스
15. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1010 바이러스 입자/마우스
16. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 5*1010 바이러스 입자/마우스
17. Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1011 바이러스 입자/마우스
결과는 표 8 및 9에 제시되어 있다.
실험 그룹으로부터의 마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
동물 그룹 SARS-CoV-2의 S 단백질에 대한 항체 역가의 기하 평균
인산염 완충액 0
Ad5-null 105 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 106 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 107 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 108 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 109 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 1010 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 5*1010 바이러스 입자/마우스 0
Ad5-null 1011 바이러스 입자/마우스 0
실험 그룹으로부터의 마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
동물 그룹, 바이러스 입자/마우스 SARS-CoV-2의 S 단백질에 대한 항체 역가의 기하 평균
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 105 0
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 106 1:14263
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 107 1:99334
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 108 1:131072
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 109 1:172951
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1010 1:301124
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 5*1010 1:345901
Ad5-S-CoV-2 + Ad5-RBD-G-CoV-2 1011 1:524288
따라서, 실험 결과는, 개발된 면역생물제에 의한 동시 면역화가 106 바이러스 입자/마우스 내지 1011 바이러스 입자/마우스의 용량 범위에 걸쳐 SARS-CoV-2 당단백질에 대한 체액성 면역 반응을 유도하는 것을 충분히 확인했다. 따라서, 용량을 증량하면, 독성 효과가 발생할 때까지 포유동물의 혈액 중의 항체 역가가 증가하는 것이 명백하다.
실시예 13. SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 유효량으로 상이한 시간 간격에서 포유동물에게 연속 투여에 의한 개발된 면역생물제의 이용 방법.
이 실시예는, SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 1주의 시간 간격 또는 3주의 시간 간격으로 포유동물에게 이들의 연속 투여에 의해, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6으로부터 선택된 서열을 갖는 SARS-CoV-2의 보호 항원 서열(단백질 S, S-del, RBD, RBD-G, RBD-Fc의)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 개발된 면역생물제의 이용 방법을 기재한다.
실험은 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행되었다.
모든 동물을 28개 그룹(각각 3마리)으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1. 인산염 완충액(100μl) 및 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
2. Ad5-null 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
3. Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
4. Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
5. Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
6. Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
7. Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
8. Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
9. Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
10. Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
11. Ad26-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
12. Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
13. Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
14. Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 1주일 후 Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
15. 인산염 완충액(100μl) 및 3주일 후 인산염 완충액(100μl)
16. Ad5-null 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
17. Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
18. Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
19. Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
20. Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
21. Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
22. Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad5-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
23. Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
24. Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad26-S-del-CoV-2 108 PFU/마우스
25. Ad26-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad26-S-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
26. Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad26-RBD-CoV-2 108 PFU/마우스
27. Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad26-RBD-G-CoV-2 108 PFU/마우스
28. Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스 및 3주일 후 Ad26-RBD-Fc-CoV-2 108 PFU/마우스
결과는 표 10에 제시되어 있다.
마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
2차 면역화
1주일의 시간 간격 2주일의 시간 간격
PBS/PBS 0 0
Ad5-null/Ad5-null 0 0
Ad5-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2 1:32768 1:41285
Ad5-S-del-CoV-2/Ad5-S-del-CoV-2 1:41285 1:52016
Ad5-S-Fc-CoV-2/Ad5-S-Fc-CoV-2 1:82570 1:104032
Ad5-RBD-CoV-2/Ad5-RBD-CoV-2 1:65536 1:82570
Ad5-RBD-G-CoV-2/Ad5-RBD-G-CoV-2 1:65536 1:82570
Ad5-RBD-Fc-CoV-2/Ad5-RBD-Fc-CoV-2 1:65536 1:104032
Ad26-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2 1:26008 1:32768
Ad26-S-del-CoV-2/Ad26-S-del-CoV-2 1:52016 1:65536
Ad26-S-Fc-CoV-2/Ad26-S-Fc-CoV-2 1:26008 1:52016
Ad26-RBD-CoV-2/Ad26-RBD-CoV-2 1:20643 1:26008
Ad26-RBD-G-CoV-2/Ad26-RBD-G-CoV-2 1:41285 1:52016
Ad26-RBD-Fc-CoV-2/Ad26-RBD-Fc-CoV-2 1:13004 1:16384
따라서, 실험 결과는, 개발된 면역생물제에 의한 연속 면역화가 단일 면역화보다 높은 면역 반응 수준을 생성하는 것을 증명한다. 평균 수준의 전문가의 경우, 완성 생성물에 의한 면역화의 최종 섭생은 다년간의 연구에 기반하고, 환자의 표적 그룹, 이들의 연령, 역학적 상황 등의 다양한 요인에 따라 의사에 의해 빈번하게 조정되는 것은 명백하다.
실시예 14.
SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 유효량으로 1주일의 시간 간격으로 포유동물에게 연속 투여에 의한 개발된 면역생물제의 이용 방법.
이 실시예는, SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 1주일의 시간 간격으로 포유동물에게 이들의 연속 투여에 의해, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 개발된 면역생물제의 이용 방법을 기재한다.
실험은 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행되었다.
모든 동물을 9개 그룹(각 5마리 동물)으로 나누고, 근육내에 하기를 주사했다:
1. 인산염 완충액(100μl), 및 이어서 1주일 후 인산염 완충액(100μl), 및 이어서 1주일 후 인산염 완충액(100μl)
2. Ad5-null 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-null 108 PFU/마우스
3. Ad26-null 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-null 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-null 108 PFU/마우스
4. Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
5. Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
6. Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
7. Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
8. Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스
9. Ad26-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스, 및 이어서 1주일 후 Ad5-S-CoV-2 108 PFU/마우스
결과는 표 11에 제시되어 있다.
마우스의 혈액 혈청에서 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
동물의 그룹 항체 역가
PBS/PBS/PBS 0
Ad5-null/Ad5-null/Ad5-null 0
Ad26-null/Ad26-null/Ad26-null 0
Ad5-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2 1:150562
Ad5-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2 1:301124
Ad5-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2 1:228209
Ad26-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2 1:172950
Ad26-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2/Ad26-S-CoV-2 1:262144
Ad26-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2/Ad5-S-CoV-2 1:301124
따라서, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 서열을 함유하는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 혈청형 26에 기반하는 개발된 면역생물제에 의한 이 실험의 결과는 이 약제의 임의의 변이체의 연속 3회 투여가 1회 또는 2회 투여된 경우보다 항원에 대한 면역 반응의 보다 강력한 유도를 유발하는 것을 입증한다. 평균적 수준의 전문가의 경우, 개발된 면역생물제는, 독성 효과가 발생하는 수준까지 포유동물의 혈액에서 항체 역가의 증가를 유발하는 다중 투여 스케쥴에 따라 투여될 수 있음이 명백하다. 필요한 면역화의 회수는 표적 모집단 카테고리(국적, 연령, 직업 등)에 따라 상이할 수 있다. 면역화의 빈도는 비용-편익 평가에 의존한다.
실시예 15. SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해 유효량으로 상이한 경로에 의해 포유동물에게 1회 투여된 개발된 면역생물제의 이용 방법.
이 실시예는, SARS-CoV-2에 대한 특이적 면역을 유도하기 위해, 3개 경로(비강, 피하, 근육내)로 포유동물에게 1회 투여되는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 개발된 면역생물제의 이용 방법을 기재한다.
실험은 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행되었다.
모든 동물을 15개 그룹(각각 3마리)으로 나누고, 하기를 주사했다:
1. PBS 비강내
2. PBS 피하
3. PBS 근육내
4. Ad5-null 109 PFU/마우스 비강내
5. Ad5-null 109 PFU/마우스 피하
6. Ad5-null 109 PFU/마우스 근육내
7. Ad26-null 109 PFU/마우스 비강내
8. Ad26-null 109 PFU/마우스 피하
9. Ad26-null 109 PFU/마우스 근육내
10. Ad5-S-CoV-2 109 PFU/마우스 비강내
11. Ad5-S-CoV-2 109 PFU/마우스 피하
12. Ad5-S-CoV-2 109 PFU/마우스 근육내
13. Ad26-S-CoV-2 109 PFU/마우스 비강내
14. Ad26-S-CoV-2 109 PFU/마우스 피하
15. Ad26-S-CoV-2 109 PFU/마우스 근육내
결과는 표 12에 제시되어 있다.
마우스의 혈액 혈청 중의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질에 대한 항체 역가
동물의 그룹 항체 역가
PBS 비강내 0
PBS 피하 0
PBS 근육내 0
Ad5-null 비강내 0
Ad5-null 피하 0
Ad5-null 근육내 0
Ad26-null 비강내 0
Ad26-null 피하 0
Ad26-null 근육내 0
Ad5-S-CoV-2 비강내 1:16384
Ad5-S-CoV-2 피하 1:26008
Ad5-S-CoV-2 근육내 1:57052
Ad26-S-CoV-2 비강내 1:13004
Ad26-S-CoV-2 피하 1:24300
Ad26-S-CoV-2 근육내 1:43238
따라서, 본 실험의 결과는, 비강내, 근육내 또는 피하 투여 경로에 의해 SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역을 유도하기 위한 개발된 면역생물제의 이용 가능성을 확인시켜 준다.
청구된 기술적 해결책의 이점은 면역원성을 증강시킬 수 있지만, 동물에서 독성 효과를 유발하지 않는, 전장 단백질 유전자를 발현하는 이러한 용량의 재조합 아데노바이러스의 이용이다. 세포로부터 환경으로의 단백질 분비를 촉진하기 위해 리더 서열을 연결시킨 결과로서, SARS-CoV-2 바이러스 S 유전자의 수용체 결합 도메인의 면역원성이 추가로 증가하는 것도 이점으로서 간주될 수 있다. 투여된 항원에 대한 적절한 T 세포-매개 반응(CD4+ 및 CD8+ 모두)의 존재는 청구된 기술적 해결책의 추가 이점이다.
따라서, SARS-CoV-2 바이러스 S 보호 항원의 개발된 최적의 아미노산 서열을 코딩하는, 결실된 E1/E33 부위 및 통합된 유전자 작제물을 갖는 인간 아데노바이러스 혈청형 5를 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 면역생물제가 생성되었다.
또한, SARS-CoV-2 바이러스 S 보호 항원의 개발된 최적 아미노산 서열을 코딩하는, 결실된 E1/E3 및 통합된 유전자 작제물을 갖는 인간 아데노바이러스 혈청형 26을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 생물활성제가 생성되었다. 다양한 유형의 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질의 코딩 서열의 발현은 대상체의 신체에서 재조합 슈도-아데노바이러스 입자에 의해 보장된다.
개발된 면역생물제는 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의해 유발된 감염에 대한 효과적 인간 보호를 제공할 수 있는 항바이러스 백신으로서 전임상 시험에서의 사용을 검토할 수 있다. 이러한 백신의 생산 기술이 주장되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Federal State Budgetary Institution 짬National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F.Gamaleya쨩 of the Ministry of Health of the Russian Federation <120> Immunobiological agent and utilization method thereof for inducing specific immunity against severe acute respiratory syndrome virus SARS-CoV-2 (variants) <160> 5 <170> BISSAP1.3.6 <210> 1 <211> 1273 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 1 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val 1 5 10 15 Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe 20 25 30 Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu 35 40 45 His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp 50 55 60 Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp 65 70 75 80 Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu 85 90 95 Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser 100 105 110 Lys Thr Gln Ser Leu 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Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val 1090 1095 1100 Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr 1125 1130 1135 Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu 1140 1145 1150 Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp 1155 1160 1165 Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp 1170 1175 1180 Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu 1185 1190 1195 1200 Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Thr Met Val 1205 1210 1215 Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 1220 1225 1230 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 1235 1240 1245 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 1250 1255 1260 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 1265 1270 1275 1280 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 1285 1290 1295 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 1300 1305 1310 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 1315 1320 1325 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 1330 1335 1340 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 1345 1350 1355 1360 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 1365 1370 1375 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 1380 1385 1390 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 1395 1400 1405 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 1410 1415 1420 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 1425 1430 1435 1440 Leu Ser Pro Gly Lys 1445 <210> 4 <211> 236 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 4 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln 1 5 10 15 Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro 20 25 30 Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp 35 40 45 Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 50 55 60 Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr 65 70 75 80 Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val 85 90 95 Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys 100 105 110 Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val 115 120 125 Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr 130 135 140 Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu 145 150 155 160 Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn 165 170 175 Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe 180 185 190 Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu 195 200 205 Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys 210 215 220 Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe 225 230 235 <210> 5 <211> 291 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 5 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln 1 5 10 15 Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro 20 25 30 Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp 35 40 45 Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 50 55 60 Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr 65 70 75 80 Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val 85 90 95 Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys 100 105 110 Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val 115 120 125 Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr 130 135 140 Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu 145 150 155 160 Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn 165 170 175 Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe 180 185 190 Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu 195 200 205 Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys 210 215 220 Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Lys Leu Ser Ser 225 230 235 240 Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile 245 250 255 Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu 260 265 270 Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg 275 280 285 Leu Gly Lys 290 <210> 6 <211> 468 <212> PRT <213> SARS-CoV-2 <400> 6 Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Arg Val Gln 1 5 10 15 Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro 20 25 30 Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp 35 40 45 Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr 50 55 60 Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr 65 70 75 80 Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val 85 90 95 Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys 100 105 110 Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val 115 120 125 Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr 130 135 140 Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu 145 150 155 160 Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn 165 170 175 Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe 180 185 190 Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu 195 200 205 Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys 210 215 220 Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Thr Met Val Arg 225 230 235 240 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465

Claims (10)

  1. 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 18개 아미노산의 유전자 C'-말단 결실을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스의 S 보호 항원의 서열(서열번호 2)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제(immunobiological agent).
  2. 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 전장 S 보호 항원의 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열(서열번호 3)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제.
  3. 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 바이러스 리더 펩타이드 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 4)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제.
  4. 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 수포성 구내염 바이러스 당단백질의 막관통 도메인(transmembrane domain)을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 단백질 S 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 5)을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군 바이러스 SARS-CoV-2에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제.
  5. 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, 리더 펩타이드 서열 및 인간 IgG1 Fc-단편 서열을 갖는 SARS-CoV-2 바이러스 S 단백질 수용체-결합 도메인 서열(서열번호 6)를 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV-2) 바이러스에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제.
  6. 제1항 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 면역생물제와 조합하여, 포유동물 세포에서의 발현에 최적화된, SARS-CoV-2 바이러스의 S 단백질 유전자의 서열(서열번호 1)에 기초하는 SARS-CoV-2 바이러스 전장 S 보호 항원 서열을 함유하는, 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 중증 급성 호흡기 증후군(SARS-CoV-2) 바이러스에 의해 유발된 질환을 예방하기 위한 면역생물제.
  7. 제1항 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 하나 이상의 약제(agent)를 유효량으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스에 대한 특이적 면역의 유도 방법,
  8. 제7항에 있어서, 제1항 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 2개의 상이한 면역생물제 또는 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 2개의 상이한 면역생물제가 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 투여되는, 방법.
  9. 제7항에 있어서, 제1항 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 임의의 면역생물제 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 임의의 면역생물제가 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속적으로 투여되거나, 제1항 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 26에 기반하는 임의의 면역생물제 및 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5에 기반하는 임의의 면역생물제가 1주 초과의 시간 간격으로 포유동물에게 연속적으로 투여되는, 방법.
  10. 제7항에 있어서, 제1항 및/또는 제2항, 및/또는 제3항, 및/또는 제4항, 및/또는 제5항, 및/또는 제6항에 제시된 재조합 인간 아데노바이러스 혈청형 5 또는 혈청형 26에 기반하는 임의의 2개의 면역생물제가 포유동물에게 동시에 투여되는, 방법.
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