WO2022119481A1 - Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции - Google Patents

Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции Download PDF

Info

Publication number
WO2022119481A1
WO2022119481A1 PCT/RU2021/050415 RU2021050415W WO2022119481A1 WO 2022119481 A1 WO2022119481 A1 WO 2022119481A1 RU 2021050415 W RU2021050415 W RU 2021050415W WO 2022119481 A1 WO2022119481 A1 WO 2022119481A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
vaccine
genetic construct
protein
coronavirus
dna
Prior art date
Application number
PCT/RU2021/050415
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Антон Иосифович ОРЛОВ
Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ
Алексей Викторович Алексеев
Екатерина Алексеевна ФЕДОРОВА
Николай Николаевич КОЛМАКОВ
Евгений Леонидович ЧИРАК
Original Assignee
Антон Иосифович ОРЛОВ
Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ
Алексей Викторович Алексеев
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Антон Иосифович ОРЛОВ, Илья Владимирович ДУХОВЛИНОВ, Алексей Викторович Алексеев filed Critical Антон Иосифович ОРЛОВ
Publication of WO2022119481A1 publication Critical patent/WO2022119481A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/215—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the invention relates to molecular biology, biotechnology, medicine and can be used for the prevention and treatment of coronavirus.
  • Coronaviruses are a large family of viruses that cause illness ranging from the common cold to more serious illnesses such as Middle East Respiratory Syndrome (MERS-CoV) and Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS-CoV).
  • MERS-CoV Middle East Respiratory Syndrome
  • SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome
  • a novel coronavirus (nCoV, COVID-19, SARS-CoV-2) is a new strain that has not been previously identified in humans [https://www.who.int/en/health-topics/coronavirus/coronavirus].
  • a feature of this strain was the rapid spread, from person to person, as well as the complex course of the disease.
  • 2019-nCoV is a virus that has a major impact on public health, economics, and socio-political issues. Containment of COVID-19 should be the top priority for all countries [https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-mission-briefing-on- covid-19---4-march-2020].
  • the object of the present invention is to provide a coronavirus vaccine that is safe, fast and easy to manufacture and use, that is effective and low cost, and that can be used for both prevention and treatment of coronavirus, especially novel coronavirus.
  • fragments of coronavirus antigens - proteins M, S, N, E of the new coronavirus were chosen.
  • a hybrid protein has been developed.
  • the components of the hybrid protein are connected by flexible bridges, which makes it possible to achieve the full functioning of each component of the protein.
  • the developed protein is also effective against SARS due to cross-activity.
  • the vaccine be specifically immunogenic and protective against the coronavirus, and at the same time be safe from the point of view that it will not cause complications caused by the coronavirus, as well as other side effects.
  • S1 subunit aa01–aa550
  • RBD receptor binding domain
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • the hybrid protein developed by us uses a different fragment of the S1 subunit of glycoprotein S, which will make it possible to form an immune response, including to glycoprotein S, including preventing the penetration of the virus, but will not cause disruption of the functioning of body systems, including cardiovascular and respiratory .
  • a vaccine for the prevention and treatment of coronavirus in humans or animals, containing a genetic construct as an active agent in an effective amount, as well as a physiologically acceptable carrier and a buffer solution.
  • the genetic construct encodes the fusion protein described above.
  • a vaccine is also proposed for the prevention and treatment of coronavirus in humans or animals, containing the hybrid protein described above, or a hybrid protein also containing fragments of coronavirus antigens - proteins M, S, N, E of the new coronavirus, slightly shorter than the hybrid protein described above.
  • Analogues of the vaccine we offer have not been identified. We do not consider vaccines based on killed or attenuated strains of coronavirus to be analogues, due to significantly lower safety, including due to the presence of full-length protein S. All types of vaccines that do not contain live microorganisms are safer not only because of the absence of risks of infection, but also because - due to the absence of risks of side effects in people with mutations in the genes that determine the structure of molecules that are key for the correct functioning of the immune system. However, even with them, it is important not to cause the formation of side effects, including those described above, including due to the presence of a full-length S protein or an N-terminal fragment of its S1 subunit.
  • the technical result from the use of the invention is expressed, first of all, in a significant acceleration of the production of the vaccine, thanks to a simple, with the least requirements, the process of obtaining the active agent of the vaccine.
  • the speed of obtaining a vaccine plays a key role in defeating the infection, but it also has an economic effect - with quarantine measures, the economy will fall into a severe decline in a few months, and only quick and effective vaccination in the shortest possible time will be able to remove restrictions and prevent the economy is in deep decline.
  • the technical result from the use of the vaccine also lies in the action also against the mutated virus. It is achieved due to the absence in the structure of the full domain of the S-protein that binds to the receptor on the cell surface (with ACE2).
  • the technical result of using the vaccine is also to increase the safety of the vaccine.
  • the specified technical result is achieved mainly by the fact that the synthesized hybrid protein according to the invention does not contain fragments homologous to fragments of body molecules.
  • DNA as an active substance, which exists in the form of an episome and does not integrate into the genome, with which a protein is synthesized and, in one of the variants, then secreted from the cell.
  • the specified technical result is also achieved due to the presence in the used DNA of such regulatory sequences as a silencer and / or an insulator, in one of the variants of the invention, due to which control is also exercised over protein synthesis and, accordingly, over the effect: if necessary, it is possible to quickly stop or reduce gene expression.
  • the specified technical result is also achieved by the fact that the infectious agent as such is not used in production.
  • the technical result of using the vaccine also lies in the fact that the diagnosis of a new coronavirus is not difficult with existing test systems. That is, after vaccination, the test for antibodies does not give false positive results, in contrast to vaccines containing the full-length S - protein.
  • the reason for this effect is that the immune response is produced to fragments of the proteins of the vaccine coronavirus, to which it is not produced when it encounters the virus, or when vaccines based on the S-protein are administered.
  • the effectiveness of the vaccine is also based on the formation of such an immune response.
  • the technical result from the use of the vaccine also lies in the versatility of the remedy - both for prevention and treatment, and for a new coronavirus infection, and SARS. It is achieved by the formation of an immune response that is safe for the body, in which a cytotoxic response is developed, coupled with a humoral one. It is also achieved by the fact that the vaccine helps the immune system to correctly target - to specific fragments of the coronavirus, and the coronavirus does not go unnoticed by the immune system and is eliminated by a specific blow.
  • the technical result of using the vaccine based on the genetic construct according to the invention also lies in increased efficiency due to the fact that the hybrid protein is synthesized from it for a long time, and for several days to several weeks, depending on the structure of the genetic construct used. It is also achieved by the structure of the encoded fusion protein.
  • the technical result of using a vaccine based on a genetic construct also consists in simplifying and reducing the cost of vaccine production by avoiding the production and purification processes of protein preparations in vitro due to the fact that protein synthesis occurs in vivo.
  • the production, purification, and storage of DNA preparations is economically viable, they are stable, and they can be produced in large quantities at a lower cost.
  • the technical result of using the vaccine according to the invention containing plasmid DNA also lies in the antitumor effect due to the presence of CpG sequences in the structure of the used genetic construct. Given the increased burden on healthcare facilities and the overlay with the help of cancer patients, such an effect of the vaccine will be in great demand.
  • the technical result also consists in expanding the range of active substances and vaccines based on them against coronavirus. If you do not want to use analogues due to their shortcomings described above, or if the use of analogues is contraindicated, or if there is no access to them, this active substance or vaccine will provide protection against coronavirus. This technical result is achieved by using the active substance or vaccine of the present invention.
  • a method for obtaining a vaccine according to the invention which consists in amplifying a genetic construct - a linear DNA fragment - using PCR, purifying and mixing with a physiologically acceptable carrier and buffer solution.
  • the technical result of using the method for obtaining the developed vaccine is to obtain the vaccine as soon as possible.
  • the process of obtaining a purified preparation of a genetic construct - a linear DNA fragment - an active agent of the vaccine - takes only a few hours (from 2-3 hours)! No other type of coronavirus vaccine can be obtained in such a short time.
  • the technical result lies in the ease of obtaining a vaccine. It is achieved by the fact that the production of such a vaccine does not require the development of a multi-stage production technology, does not require long-term adjustment of the process stages, requires a minimum set of readily available reagents, does not require permits to work with pathogenic organisms, does not require significant investments in construction, repair of premises and equipment. Such a method can be carried out even in a standard laboratory dealing with DNA.
  • a genetic construct includes a polynucleotide encoding the developed fusion protein and elements that allow expression of the polynucleotide in the cells of the target organism.
  • the target organism is a human or animal.
  • the genetic construct may be a plasmid DNA for transient expression in mammalian cells, a virus-based vector, a linear DNA fragment containing a polynucleotide of the invention.
  • the technical result consists mainly in the induction of an immune response that does not cause side effects associated with the use of other fragments of the S protein of the new coronavirus, or a full-length such protein, in genetic constructs or coronavirus strains.
  • the technical result consists in a significant acceleration and simplification of obtaining the active substance of the coronavirus vaccine - a genetic construct. This is achieved, first of all, by the safety of the types of genetic constructs used and, accordingly, by the absence of strict requirements for working with them.
  • the technical result also lies in the fact that the genetic construct serves as a matrix for PCR to obtain a vaccine according to the invention.
  • the technical result consists in increasing the duration of the synthesis of the encoded protein and is achieved by the fact that the nucleotide sequence, which includes a fragment encoding the target protein, contains elements that determine the stability of mRNA and, accordingly, increase the half-life of mRNA, as a result of protein synthesis from one mRNA molecule carried out more times, and as a result, the amount of protein synthesized increases; and also by the fact that the nucleotide sequence of the hybrid protein is optimized in terms of codon composition for expression in the cells of the target organism - humans and animals, mammals, as a result, protein synthesis is more intense.
  • the novel coronavirus sequence itself is codon-optimized for expression in mammals, and the optimization can be done independently using software.
  • the technical result also consists in expanding the range of genetic constructs for the synthesis of immunogenic coronavirus antigens in the body.
  • Proposed polynucleotide encoding a hybrid protein, including protein fragments M, S, N, E of the coronavirus, connected by flexible bridges, characterized by the amino acid sequence of SEQ ID NO.:1.
  • the polynucleotide may also contain a fragment encoding a heterologous secretory sequence.
  • the technical result from the use of the polynucleotide proposed by us is mainly in obtaining a genetic construct, due to the use of which in a vaccine a person or animal forms a specific protective immune response to coronavirus, mainly to a new coronavirus.
  • the technical result of using the polynucleotide proposed by us also consists in expanding the range of polynucleotides for the synthesis of immunogenic coronavirus antigens in the body.
  • a prokaryotic recombinant cell is proposed for obtaining a genetic construct according to the invention - a producer.
  • the technical result of using the producer of the developed genetic construct is stable storage and reproduction of the genetic construct, as well as obtaining the developed genetic construct.
  • a polynucleotide, a genetic construct, a producer of a genetic construct, a method for producing a vaccine - all of these objects are used to obtain a vaccine according to the invention.
  • a group of inventions is proposed: a hybrid protein, a polynucleotide, a genetic construct, a recombinant cell, a vaccine based on a genetic construct for the prevention and treatment of coronavirus, which may also contain a hybrid protein, and a method for producing it.
  • a hybrid protein has been developed that includes immunogenic fragments of the M, S, N, E coronavirus proteins connected by flexible bridges, the protein is characterized by the amino acid sequence SEQ ID NO.:1.
  • a feature of the protein is that it does not have homology with proteins of organisms other than coronavirus, and also does not contain a full-length ACE2 binding site. This leads to an important advantage of a vaccine based on it - an additional aspect of the safety of the vaccine.
  • Such a protein will be synthesized in the cells of the target organism - human or animal - from the proposed genetic construct containing the proposed polynucleotide. Also, such a protein is also contained in one of the vaccine options.
  • Proposed polynucleotide encoding the developed hybrid protein Once the amino acid sequence of a protein is known, one skilled in the art will be able to obtain a nucleotide sequence for synthesis in the cells of the target organism. This can be either based on fragments of the natural nucleotide sequence of the virus proteins or a sequence artificially optimized in terms of codon composition. Codon optimization can be performed independently using information about the frequency of occurrence of codons in the target organism, for example, in a database [for example, Nakamura Y, Gojobori T, Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 2000 Jan 1;28(1):292], or using specialized programs, for example, presented on the website http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm or molbiol.ru or other resources.
  • the polynucleotide may not contain (for example, SEQ ID NO.:2) or contain (for example, from SEQ ID NO.:3-5) a heterologous secretory sequence optimized for codon composition for the target organism - for example, that of TPA (tissue-type plasminogen activator), HGH (human growth hormone), IGF (insulin-like growth factor), EPO (erythropoietin), but not limited to.
  • TPA tissue-type plasminogen activator
  • HGH human growth hormone
  • IGF insulin-like growth factor
  • EPO erythropoietin
  • a clear advantage of the proposed vaccine is the induction of an immune response profile, where the cytotoxic response is significantly manifested, in contrast to the immune response that is formed only on the injected protein antigen or SARS virus particle.
  • -CoV2 that is, both variants of the polynucleotide are suitable.
  • Each construct includes, in addition to the polynucleotide, elements that allow the expression of the polynucleotide in the cells of the target organism. Due to the fact that the active substance of the vaccine is precisely the genetic construct with which the synthesis of the antigen is carried out, it is possible to obtain an immune response profile in which the cytotoxic immune response will play a significant role, however, the antibody response will also be formed. Also, due to the duration of antigen synthesis in the body and in the absence of infectivity, the probability of causing the formation of an adequate immune response, with the formation of immunological memory, increases. The molecule itself also has an adjuvant effect.
  • a genetic construct is primarily a linear DNA fragment or a recombinant vector, which may be a viral or plasmid vector.
  • the recombinant vector must contain essential elements for the organisms to maintain and use it, together with the appropriate regulatory sequences. Regulatory sequences are nucleotide sequences that can affect gene expression at the level of transcription and/or translation, as well as the mechanisms that ensure the existence and maintenance of the functioning of the recombinant vector.
  • Essential for the prokaryotic system are the origin of replication, to maintain in the cell with an average, preferably high, copy number, and a marker gene for the possibility of selecting a producer strain.
  • Bacterial elements of plasmid DNA should not adversely affect expression in mammalian cells and cause side effects from the use of plasmid DNA.
  • Suitable origin of replication is pM1 (der.), ColE1 (der.) and F1, pUC and F1, but not limited to.
  • a suitable marker gene is a reporter gene or an antibiotic resistance gene, for example, ampicillin, preferably kanamycin, but is not limited to. There is evidence in the literature that the use of the ampicillin resistance gene as a marker gene may be undesirable due to the development of a reaction in patients to ampicillin, which is associated with the quality of DNA purification, but not with the element itself.
  • the essential elements of a recombinant vector for use in mammals are elements for effective functioning, for expression of the encoded gene, a promoter, including transcription initiation signals, an mRNA leader sequence, a termination sequence, and regulatory sequences.
  • the promoter is an important component of the vector that drives the expression of the gene of interest.
  • Classical promoters for recombinant drug component vectors are the human CMV/immediate-early or CMV-chicken- ⁇ actin (CAGG) promoter.
  • CMV promoters are used for most DNA vaccines because they mediate high levels of constitutive expression in a wide range of mammalian tissues [Manthorpe M, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993;4(4):419–431] and do not suppress downstream reading.
  • CMV promoter An increase in expression level is observed when the CMV promoter is changed, for example, by including HTLV-1R-U5 downstream from the cytomegalovirus promoter or when using the chimeric SV40-CMV promoter [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009;27(4):353–370].
  • An alternative to CMV promoters are tissue-specific host promoters that avoid constitutive expression of antigens in inappropriate tissues [Cazeaux N, Bennasser Y, Vidal PL, Li Z, Paulin D, Bahraoui E.
  • the promoter can be with appropriate regulatory sequences from natural promoters with their own regulatory elements (CaM kinase II,CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, tyrosine hydroxylase, kainate receptor subunit 1 and subunit B glutamate receptor, etc.), or synthetic promoters with regulatory sequences, to obtain the required expression pattern (the ratio of the duration and expression level) of the target gene at the transcriptional level.
  • CaM kinase II,CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, tyrosine hydroxylase, kainate receptor subunit 1 and subunit B glutamate receptor, etc. synthetic promoters with regulatory sequences, to obtain the required expression pattern (the ratio of the duration and expression level) of the target gene at the transcriptional level.
  • RNA polymerase to increase the level of expression by improving the interaction of RNA polymerase and DNA.
  • Regulatory sequences are nucleotide sequences that can affect gene expression at the level of transcription and/or translation, as well as the mechanisms that ensure the existence and maintenance of the functioning of a genetic construct.
  • the recombinant vector - plasmid or viral DNA of the present invention - contains from one of the above regulatory sequences, depending on the DNA variant based on the choice of promoter and the desired expression parameters of the target gene. Based on the state of the art, known and obvious variants of such elements and their use, the recombinant vector of the present invention may contain any combinations that meet the above conditions, in which the synthesis of the developed hybrid protein is carried out from it in the cells of the target organism - human or animal. When using a silencer or an insulator as part of a construct, it is possible to regulate the expression of the target gene.
  • the recombinant vector of the present invention in one embodiment further comprises such a regulatory element.
  • the recombinant vector of the present invention also contains such an important element as the mRNA leader sequence containing translation initiation signals, the start codon.
  • Translation initiation signals - Kozak sequence in eukaryotes [Kozak M. (1986) "Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes", Cell 44, 283-292].
  • the recombinant vector also contains a site, preferably sites, different, for cloning the target gene, for correct orientation of the target gene in the recombinant vector, and a site, preferably sites, for planting primers for its sequencing.
  • the recombinant vector also contains the polynucleotide described above.
  • the recombinant vector also contains a termination sequence containing sequentially a stop codon, a 3' untranslated region with a signal and a polyadenylation site, a stop codon, due to which mRNA stability is maintained and proper termination of transcription and export of mRNA from the nucleus is carried out.
  • Gene expression can be influenced by changing the termination sequence, which is necessary to maintain the stability of the mRNA, proper termination of transcription and export of mRNA from the nucleus, including its shortening.
  • Many modern DNA vaccines use the bovine growth hormone transcription terminator sequence [Montgomery DL, Shiver JW, Leander KR, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors.
  • polyA Polyadenylation
  • pVAX1 Invitrogen, Carlsbad, CA, the bovine growth hormone terminator region contains a homopurine region that is nuclease sensitive.
  • the recombinant vector of the present invention may contain any terminator sequence that meets the above conditions, at which the synthesis of the target protein in human or animal cells is carried out from it.
  • An example of a mammalian cell termination sequence is that of bovine growth hormone (BGH).
  • Preferred recombinant vectors for use in humans are those that have been tested in humans, containing the elements described above with the appropriate regulatory sequences, possibly modified to meet the stated criteria, thereby reducing the number of required studies for registration of the agent. However, it is also possible to use other recombinant vectors containing the required described elements.
  • the elements that ensure the expression of the gene that causes resistance to the antibiotic neomycin, as well as the replication of the plasmid in the form of an episome in mammalian cells do not function in the target organism, since such cells - the cells of the organism of introduction of such plasmid DNA - do not contain the SV40 large T antigen.
  • Vectors pcDNA3.1(+), pVAX, pCMV-3Tag3-a like many other plasmid vectors, do not contain transposons or elements responsible for transmissibility. Such DNA does not integrate into the genome and does not replicate in mammalian cells. All this certainly speaks of the safety of using funds based on it.
  • a virus-based vector in which a polynucleotide is cloned means a safe vector such as, for example, a recombinant adeno-associated virus, but is not limited to it.
  • a linear DNA fragment is a DNA fragment containing a promoter, an mRNA leader sequence, a polynucleotide described above, a termination sequence, including 1 or 2 stop codons, and regulatory sequences.
  • the requirements described above apply to the elements. Such elements are key, but other elements may be contained.
  • a hybrid protein is synthesized from such a fragment in the cells of the target organism. The sequence of arrangement of the described elements is clear to the average person skilled in the art.
  • Synthesis from a linear DNA fragment takes less time than from a plasmid or viral vector, but its production is much faster.
  • each genetic construct has its own advantages and can be applied in a given situation. For example, if vaccine doses are required in the shortest possible time - within a few hours (from 2-3 hours), then a linear DNA fragment will be used, if there is more time, then other options are possible.
  • a method for obtaining a vaccine against coronavirus based on a linear DNA fragment which consists in amplifying a linear DNA fragment using polymerase chain reaction - PCR, purifying impurities and mixing with a physiologically acceptable carrier and buffer solution.
  • This method of obtaining a vaccine is the fastest, and not a single vaccine registered in Russia is produced in this way.
  • this way of producing a vaccine meets the challenge of nature.
  • a vaccine based on plasmid DNA or a viral vector can be obtained by cultivating microorganisms - a prokaryotic recombinant producer cell, followed by isolation and purification of the genetic construct. This method will take longer (about 4-5 days), but it is also fast and applicable in the real realities of the new coronavirus.
  • a virus-based vaccine can be obtained by culturing mammalian cells containing a viral vector and possibly auxiliary plasmids, for example, for packaging viral particles, but not limited to, followed by isolation and purification of the virus.
  • This method will take more time and is more laborious and demanding on purity, since mammalian cells are often contaminated with other viruses, including pathogenic ones.
  • this method is also applicable in the current realities of the new coronavirus.
  • a vaccine based on a genetic construct and a fusion protein is obtained by mixing the previously obtained components.
  • Vaccines based on mRNA or attenuated or killed viruses are much more difficult and longer to manufacture, especially the first period - the development of a technology for obtaining a stable and active agent; the very production of mRNA, a molecule that is less stable than DNA, and ensuring its stability and activity in the GLF; work with a dangerous virus.
  • a prokaryotic recombinant cell is proposed for obtaining a genetic construct.
  • the prokarytic producer is, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis.
  • Escherichia coli Bacillus subtilis.
  • this is a bacterial strain of Escherichia coli DH5a or DH10B/R containing the vector pcDNA3.1(+), pVAX1, or pCMV-3Tag3-a, which contains the nucleotide sequence from SEQ ID NO.:2-5.
  • the pAAVK-EF1 ⁇ -MCS vector is a bacterial strain of Escherichia coli DH5a or DH10B/R containing the vector pcDNA3.1(+), pVAX1, or pCMV-3Tag3-a, which contains the nucleotide sequence from SEQ ID NO.:2-5.
  • the pAAVK-EF1 ⁇ -MCS vector the pAAVK-EF1 ⁇ -MC
  • a vaccine for the prevention and treatment of coronavirus is proposed, containing the above-described genetic construct as an active agent, in an effective amount, as well as a physiologically acceptable carrier and a buffer solution.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and buffer solutions are known in the art and include those described in various texts such as, for example, Remington's Pharmaceutical Sciences. Both a person and an animal, including domestic or farm animals, can act as a vaccine consumer.
  • the hybrid protein includes protein fragments M, S, N, E of the coronavirus connected by flexible bridges, and is characterized by the amino acid sequence SEQ ID NO.: 1 or 6.
  • agents containing genetic constructs (DNA) encoding the pathogen antigen, as a rule, is carried out in muscle tissue, and this construct enters somatic cells, where the expression of the target gene occurs.
  • the synthesized protein is exposed on the surface of the somatic cell with the help of class I MHC molecules, which causes the formation of cytotoxic T-lymphocytes.
  • class I MHC molecules which causes the formation of cytotoxic T-lymphocytes.
  • a secretory peptide is introduced into the protein, it is mainly secreted into the extracellular space, and the mechanism of the humoral immune response is realized.
  • other types of administration are possible, such as, but not limited to, intranasal administration.
  • the vaccine of the invention can be administered using electroporation to increase the efficiency of delivery to cells for polynucleotide expression.
  • the modeled hybrid protein consists of 482 a.a., with methionine at the N-terminus - 483 a.a., represented by the amino acid sequence SEQ ID NO:1.
  • Analysis of the amino acid sequence of this protein using the ProtParam program (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) showed that the fusion protein has a molecular weight of 53.5 kDa, pI 8.79, the protein is stable, the half-life is mammals about 2.8 hours. With methionine at the N-terminus - 53.7 kDa, pI 8.79, the protein is stable, the half-life in mammals is about 30 hours.
  • the fusion protein With the addition of the IGF secretory sequence (GKISSLPTQLFKCCFCDFLK), with methionine at the N-terminus, the fusion protein consists of 503 a.a., molecular weight 55.9 kDa, pI 8.83, the protein is stable. With the addition of the HGH secretory sequence (ATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA), with methionine at the N-terminus, the hybrid protein consists of 508 a.a., molecular weight 56.2 kDa, pI 8.76, the protein is stable. With the addition of the TPA secretory sequence (MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS), the fusion protein consists of 505 a.a., molecular weight 55.9 kDa, pI 8.77, the protein is stable.
  • the HGH secretory sequence ATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA
  • TPA secretory sequence MDAMKRGLCCVLLLC
  • a protein with a methionine at the N-terminus is synthesized, since translation always begins with a start codon. Further, methionine can be cleaved off naturally, for example, if the protein is secreted, as part of a secretory peptide.
  • the fusion protein represented by the amino acid sequence SEQ ID NO:6, consists of 424 a.a., with methionine at the N-terminus - 425 a.a.
  • Analysis of the amino acid sequence of this protein using the ProtParam program showed that the fusion protein has a molecular weight of 46.5 kDa, pI 9.61, the protein is stable, the half-life in mammals is about 100 hours. With methionine at the N-terminus - 46.6 kDa, pI 9.61, the protein is stable, the half-life in mammals is about 30 hours.
  • the nucleotide sequence of the gene was calculated, collinear to the amino acid sequences of the hybrid protein encoded by it, characterized by SEQ ID NO:1, with the target gene flanked by restriction sites, and also with the addition of the Kozak sequence before the start codon to initiate translation, after the start codon - in part of the variants - signal sequences, for example, TPA, hGH, IGF, EPO, or represented by a.o. MLLLLLLLLLLALALA, for the secretion of the synthesized protein from a eukaryotic cell, with simultaneous optimization of the codon composition for expression in human cells, the tool on the site molbiol.ru was used. Received, for example, the sequence characterized by SEQ ID NO.:4, as well as the sequence containing SEQ ID NO.:2.
  • nucleotide sequences of the new coronavirus were taken to obtain a genetic construct, since these sequences are expressed in mammals, the remaining fragments were optimized as described above. Received, for example, the nucleotide sequence characterized by SEQ ID NO.:3,5.
  • the calculated nucleotide sequences were synthesized chemically using an ASM-800 DNA synthesizer (BIOSSET, RF).
  • the synthesized genes were cloned in the eukaryotic expression vectors pVAX1 (Invitrogen), pcDNA3.1+ (Invitrogen), pCMV-3Tag3-a, at the restriction sites flanking the target genes, according to the instructions for the vector.
  • ligation reaction 3 ⁇ l of the synthesized DNA solution, 1 ⁇ l of the prepared vector solution, 5 ⁇ l of buffer for ligation x 2, and 1 ⁇ l of T4 ligase were taken. The reaction was carried out at +20 about C for 2 hours.
  • the mixture was heated at +95°C for 10 min and purified from salts by dialysis on nitrocellulose filters with a pore diameter of 0.025 ⁇ m (Millipore, USA). Dialysis was performed against a solution containing 0.5 mM EDTA in 10% glycerol for 10 min.
  • the cells were placed in 1 ml of SOC medium (2% bacto-trypton, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM glucose) and incubated for 40 min at +37° ⁇ .
  • SOC medium 2% bacto-trypton, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl 2 , 10 mM MgSO 4 , 20 mM glucose
  • E. coli cell clones containing the obtained plasmid DNA were detected on a selective medium containing LB-agar, 50 ⁇ g/ml kanamycin or ampicillin (depending on the plasmid).
  • Plasmid DNA was isolated from grown clones. Isolation of plasmid DNA was performed using the Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, USA). Purified recombinant plasmid DNA was verified by sequencing.
  • Possible options are the Escherichia coli DH10B/R or DH5a bacterial strain containing the vector pVAX1 (Invitrogen), pcDNA3.1+ (Invitrogen) or pCMV-3Tag3-a, which contains the nucleotide sequence from SEQ ID NO.:2-5.
  • Bacillus subtilis cells were also successfully used as a producer of the genetic construct.
  • E. coli producer cells grown on LB-agar in a Petri dish with the addition of kanamycin or ampicillin, depending on the plasmid DNA contained, was placed in 10 ml of a selective medium. Cells were grown for 12 hours at +37°C under constant stirring (250 rpm). The resulting cells were collected by centrifugation at 4000g. Further isolation and purification of plasmid DNA was carried out using the EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen), which makes it possible to obtain pyrogen-free DNA. The isolated plasmid DNA was analyzed by electrophoresis in 0.8% agarose gel, its concentration was measured using fluorimetry. Other methods of purification of plasmids were also used, in particular, chromatography.
  • the values determined in the experiment corresponded to the values of the ratios A260/A280 and A260/A230 for pure preparations, for all obtained preparations of plasmid DNA.
  • Protein impurities were also quantified in the resulting plasmid DNA preparations using the microBCA assay [Smith, P.K., et all, Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analyt. Biochem. 150, 76-85 (1985)], measuring the optical density of the resulting colored protein complexes with copper and bicinchoninic acid at a wavelength of 562 nm.
  • the sensitivity of the microBCA assay method is 0.5-20 ⁇ g/ml of protein. The concentration of total protein in none of the studied plasmid DNA preparations did not exceed the norm.
  • the content of bacterial lipopolysaccharide in plasmid DNA preparations was also determined using the LAL gel thrombus test with a sensitivity >0.25 EU/ml (ToxinSensor, GenScript, USA).
  • Amebocyte lysate from the horseshoe crab Limulus polyphemus served as the LAL reagent.
  • the LAL reagent specifically reacts with bacterial endotoxins; as a result of the enzymatic reaction, the reaction mixture changes proportionally to the endotoxin concentration.
  • the results were assessed by the presence or absence of a dense thrombus at the bottom of the tube by inverting the tube.
  • a gel thrombus was not formed in the study of a sample diluted 10 times for preparations of all obtained plasmid DNA, i.e. with a method sensitivity of 2.5 EU/ml, which, given the concentration of plasmid DNA in the sample, indicates an acceptable endotoxin clearance rate.
  • the output of plasmid DNA ranged from 3.5 mg to 5 mg per 1 liter of nutrient medium. The process took about 4 days.
  • the synthesized genes were cloned in a vector based on adeno-associated virus pAAVK-EF1 ⁇ -MCS (System Biosciences (SBI)).
  • a producer strain of this vector was created using E. coli (RecA-) cells, for example, DH10B/R or DH5a, by analogy with the protocol described in example 2.2.1 ..
  • Bacillus subtilis cells were also successfully used as a producer, and as a vector - other viral vectors.
  • a vector was isolated for use in mammals, all according to the instructions for the vector.
  • the output of the vector was from 2 mg to 3.2 mg per 1 liter of nutrient medium.
  • the AAV Helper-Free System was used. This is a three-plasmid system that includes (1) the pAAV-MCS plasmid into which the fusion gene flanked by ITR repeats has been cloned; (2) pAAV-RC plasmid containing rep and cap genes encoding replication proteins and viral capsid proteins, and an increase in the expression level of these genes leads to an increase in viral titers; and (3) a pHelper plasmid containing a set of adenoviral VA, E2A, and E4 genes required to achieve high titers of AAV in cells.
  • the E2A and E1B adenoviral proteins required for virus production are stably expressed in AAB-293 cells from a commercial system derived from HEK293 cells.
  • the synthesized genes were cloned in the pAAV-MCS vector. Created strain-producer of this vector, using cells of E. coli (RecA-), for example, DH10B/R or DH5a, by analogy with the protocol described in example 2.2.1. Bacillus subtilis cells were also successfully used as a producer.
  • AAV-293 cells were grown in 10-story cell factories (Cell culture flasks, 10-level CellStacks, with a total area of 6360 cm 2 (CellSTACK® 10-STACK, USA). storey factories, the cells were sequentially thawed, cultured in T25 flasks (EASY FLASK 25 V/C), then in T75 flasks (EASY FLASK 75 V/C), then in 2-storey cell factories with an area of 1272 cm 2 (Cell culture flasks CellSTACK 2-STACK, USA).
  • DMEM serum-free DMEM containing 50 ⁇ g/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin and 2 mM L-glutamine 2 hours before transfection.
  • a mixture of DNA and PEIpro reagent was prepared in the ratio of DNA ( ⁇ g) and reagent (ml) as 1:1.
  • a vector solution (for example, pAAV-MCSseqidno4, but not limited to) containing 1 mg of the vector was selected, solutions containing the packaging plasmids pAAV-RC plasmid and pHelper in the amount of 1 mg of each of the plasmids were added to it.
  • the volume of the final solution was adjusted to 150 ml by adding serum-free DMEM and mixed thoroughly.
  • 3 ml of the PEIpro reagent was transferred into a sterile vial with a capacity of 250 ml, the volume was adjusted to 150 ml by adding serum-free DMEM medium, and the resulting solution was also stirred.
  • 150 ml of the PEIpro reagent solution was added to 150 ml of the vector solution, the resulting solution was immediately thoroughly mixed with a vortex mixer, then the solution was incubated for 15 minutes at room temperature. After incubation, the resulting solution was added to a CF10 culture flask (10-storey cell factory) containing the cells to be transfected.
  • the medium was changed to complete growth medium containing growth medium DMEM, 4.5 g/l glucose, 10% FTS, 50 ⁇ g/ml penicillin, 50 ⁇ g/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine. Cells were incubated at 37°C and 5% CO 2 for 72 hours.
  • the resulting cell lysates were incubated for an hour at +37o ⁇ in the presence of 0.05 U/ ⁇ l of nuclease benzonase to remove DNA molecules, which could further interfere with the specific purification of viruses.
  • the resulting solution was centrifuged twice at a speed of 3000g for 15 min, the supernatant was transferred into clean 50-mL tubes, and then the virus purification was started.
  • Adeno-associated viruses were purified by affinity chromatography on 5 ml Hi-Trap Columns. Before applying to the column, the cell lysate containing viral particles was filtered through a membrane with a pore size of 0.45 ⁇ m, then applied to the column. The elution was carried out by adding 15 ml of pH2 elution solution. Immediately after the elution, the pH of the eluate was adjusted to neutral by adding a solution of 1M Tris-HCl, pH8.0.
  • plasmid DNA or a viral vector according to clause 2.3.1, or a fragment amplified from them.
  • a DNA fragment was amplified containing a promoter, a leader mRNA sequence, as well as regulatory sequences for these elements, a polynucleotide - a hybrid gene, a termination sequence.
  • the amplification may contain other elements, and the elements indicated in the previous sentence are key elements.
  • Amplification of the specified sequence was carried out in a volume of 50 ⁇ l, in thin-walled polypropylene tubes with a volume of 650 ⁇ l, containing 5 ⁇ l of 10-fold Taq buffer (700 mM Tris-HCl, pH 8.6/25oC, 166 mM (NH 4 ) 2 SO 4 ), 5 ⁇ l MgCl 2 (1.25 mM), 1 ⁇ l dNTP, 31.5 ⁇ l water, 1 ⁇ l forward and 1 ⁇ l reverse primers, 5 ⁇ l template DNA, and 0.5 ⁇ l Taq polymerase (Fermentas, Lithuania).
  • Taq buffer 700 mM Tris-HCl, pH 8.6/25oC, 166 mM (NH 4 ) 2 SO 4
  • 5 ⁇ l MgCl 2 (1.25 mM
  • 1 ⁇ l dNTP 31.5 ⁇ l water
  • 1 ⁇ l forward and 1 ⁇ l reverse primers 5 ⁇ l template DNA
  • the reaction mixture was heated for 5 min. at 95°C for DNA denaturation.
  • 30 ⁇ L of mineral oil Bayol F (Sigma, United States) was overlaid on the reaction mixture with a volume of 50 ⁇ L.
  • the amplification reaction was carried out in a C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, USA). 35 cycles were carried out: 95°C - 20 sec, 50-62°C (depending on the primers) - 20 sec, 72°C - 1 min.
  • an additional cycle was performed: 5 min at 72°C.
  • the PCR result was analyzed by agarose gel electrophoresis. With a positive result, preparative electrophoresis was performed.
  • Amplified DNA fragments were concentrated and purified by preparative electrophoresis in 0.8-1.2% agarose gel (Gibko BRL, USA).
  • a sample of the mixture after PCR was mixed with a sixfold buffer (0.25% bromophenol blue, 30% glycerol) (ThermoScientific, USA) and applied to the gel, 18 ⁇ l per well.
  • Electrophoresis was carried out in a horizontal apparatus in TAE buffer (40 mM Tris acetate, 2 mM EDTA pH 8.0, 0.5 ⁇ g/ml ethidium bromide) at a voltage of 5–10 V/cm.
  • the result of DNA separation was recorded in transmitted UV light (302 nm) using a Macrovue transilluminator (LKB, Sweden).
  • the length of the amplified fragment was determined from the logarithmic dependence of DNA mobility on the length of fragments in the marker.
  • the proprietary mixture of DNA fragments "GeneRuler 1000 bp DNA Ladder” (Fermentas, Lithuania) was used as markers.
  • a section of agarose containing a DNA band of the required size was excised, and the DNA fragment was purified using the DNA&Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, UK) according to the instructions.
  • the isolated genetic construct was used in mammals.
  • the fusion protein characterized by SEQ ID NO.:1 and the fusion protein characterized by SEQ ID NO.:6 were obtained using genetic engineering methods or synthesized chemically.
  • Aluminum hydroxide in the form of a powder, in an amount of 37 mg was added to 5 ml of a solution of a hybrid protein characterized by SEQ ID NO.: 1 or 6, with a concentration of 400 ⁇ g / ml, protein binding was carried out for 10 minutes, after which further breeding.
  • Physiological saline was used as the liquid medium. In total, each animal received 40 ⁇ g of the hybrid protein and 100 ⁇ g of one genetic construct, or only 100 ⁇ g of one genetic construct.
  • mice in each group Observation groups (15 mice in each group):
  • a scheme of two doses of the vaccine candidate was administered intramuscularly, into the quadriceps of the left limb of the mouse, with an interval of two weeks.
  • electroporation was performed after administration.
  • Group 20 received intranasal administration of the virus.
  • mice were withdrawn from the experiment 4 weeks after the last immunization by decapitation in accordance with the Methodological recommendations of the Ministry of Health of the USSR (1985).
  • spleens were taken under aseptic conditions.
  • the material of each group was pooled - the spleens of mice of one group were placed in IMDM nutrient medium (Gibco) and homogenized. T-lymphocytes were then isolated.
  • a suspension of splenocytes was filtered through a sterile gauze napkin, transferred into 15 ml polypropylene tubes (Sarshtedt, Austria), and resuspended in 10 ml of RPMI 1640 medium (Biolot, Russia). Splenocytes were pelleted by centrifugation at 1000 rpm. (acceleration ⁇ 400 g) for 7 minutes, the supernatant was discarded, and 1 ml of FACS Lysing Solution (Becton Dickinson) was added to the pellet to remove erythrocytes.
  • FACS Lysing Solution Becton Dickinson
  • the cells were resuspended using a vortex and incubated for 2 minutes at room temperature, then 10 ml of RPMI 1640 medium was added to the tube, and the cells were again sedimented by centrifugation at 1000 rpm. within 5 minutes.
  • the splenocyte sediment was washed once in 10 ml of RPMI 1640 medium, and the cells were transferred to RPMI 1640 medium and 10% fetal calf serum (Biolot).
  • the cell concentration was determined in a Goryaev chamber, then the splenocytes were transferred to a 96-well round-bottom plate ("SARSTEDT”) at 10 6 cells per well.
  • the resulting lymphocytes were stained for identification.
  • the content of each well of the plate was transferred to a 5 ml tube (Coulter, USA), adjusted to a volume of 4 ml with phosphate buffer (pH7.4), the cells were sedimented by centrifugation at 400 g for 5 minutes, the supernatant was removed and added to tube 2, 5 ⁇ l of antibodies labeled with a fluorescent dye, followed by a double wash with cold PBS buffer.
  • lymphocytes were stimulated with the DYSVLYNSASFSTFKCY peptide at a concentration of 40 ⁇ g/ ⁇ l, or with staphylococcal enterotoxin B (SEB), this sample was considered a positive control, or RPMI medium was added, and this sample was considered a negative control.
  • SEB staphylococcal enterotoxin B
  • the peptide is a fragment of the S protein of the new coronavirus used in the fusion protein, both encoded in the analyzed DNA and used in combined vaccine candidates.
  • the resulting lymphocytes were analyzed on a Gallios Navios flow cytometer (Beckman Coulter).
  • T cell subpopulation molecules CD3, CD4, CD8, as well as interferon gamma (IFN ⁇ ) and tumor necrosis factor (TNF ⁇ ) were analyzed.
  • the population gate (window) was set based on a combination of forward and side scatter and cell size. Data collection was performed using System II Software (Beckman Coulter). In each experiment, at least 50,000 cells were analyzed. Interferon enhances the presentation through MHC class 1, which has a positive effect on the fight against the pathogen.
  • T-helpers During stimulation with the peptide, the prevalence of T-helpers increased in the group of intact animals. In the groups of animals immunized with genetic constructs, when stimulated with the peptide, the prevalence of T-helpers became less than in the absence of stimulation.
  • T-lymphocytes recognize a previously encountered coronavirus protein fragment as part of a hybrid protein synthesized from the introduced DNA (and, in some vaccine variants, also present in the vaccine). Such results indicate the recognition by T-lymphocytes of the domains of the hybrid protein, including those synthesized in the body from the genetic construct, as well as the specificity of the immune response being formed.
  • CD4 is a marker present on both T-lymphocytes and monocytic cells.
  • CD8 is a marker present on both T lymphocytes and NKT cells.
  • NKT cells also carry the CD3 marker, are T cells, and have spontaneous cytotoxic functions similar to those of NK cells.
  • NKT cells also secrete cytokines, under the influence of which B-lymphocytes can transform into macrophages.
  • CD4+ T-lymphocytes are represented by Th1 and Th2.
  • Th1 and Th2 Many observations show the role of certain factors in determining the "switching" of the immune response towards Th1 or Th2.
  • One of the factors is the quality and dose of the antigen.
  • CD4+T-lymphocytes determined along the Th2 development pathway interact with B-lymphocytes, which causes a decrease in the activity of cytotoxic lymphocytes.
  • Th2 do not produce interferon gamma.
  • CD4+T-lymphocytes determined along the Th1 developmental pathway also interact with B-lymphocytes. However, in this case, there is no inhibition of the activity of CD8+ T-lymphocytes. In such a situation, a simultaneous increase in cytotoxic and humoral responses to the immunogen is possible. Th1 produce interferon gamma.
  • TNF ⁇ is important for resistance not only to infections, but also to cancer [Idriss HT, Naismith JH. TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structure-function relationship(s). Microsc Res Tech. 2000 Aug 1;50(3):184-95, as well as many other articles], and that the number of CD4 and CD8 T-lymphocytes producing TNF ⁇ increased in all groups of vaccinated animals.
  • IFN ⁇ also known antitumor effect [Shmelev V.A. Interferon-gamma, tumor necrosis factor, thymosin-alpha1 anti-infective and anti-tumor cytokines and drugs. Medpraktika-M. Moscow, 2008], and the number of T cells producing it also increased.
  • the antitumor activity of the developed constructs is mediated by the biological function, mainly of tumor necrosis factor TNF ⁇ , as well as interferon-gamma.
  • the genetic construct was injected in the amount of 250 ⁇ g, concentration 123 ⁇ g/ml, in a volume of 2 ml.
  • a combined preparation was administered, DNA with a hybrid protein, DNA in an amount of 100 ⁇ g, a hybrid protein in an amount of 100 ⁇ g, in a volume of 2 ml, with complete Freund's adjuvant, adjuvant - 1/10 of the volume of the solution for immunization.
  • Immunization was carried out twice, with an interval of two weeks, subcutaneously in the thigh, two weeks after the second immunization, blood was taken from the ear vein.
  • Antibody titers were measured in the blood serum of the studied animals.
  • the antibody titer of the sera of immunized animals was determined by enzyme immunoassay (ELISA).
  • ELISA enzyme immunoassay
  • the results were analyzed using the Microsoft Excel program.
  • HEK293 cells were cultured at 37° C. in a CO 2 incubator (5% CO 2 , 100% humidity) in DMEM containing 10% fetal calf serum, without antibiotics, with L-glutamine. Transfection by the calcium transfection method was performed at 70% monolayer confluency. Used 2 ⁇ g of plasmid pVAXseqidno4/5 or a linear construct amplified from it, encoding a hybrid protein SEQ ID NO.:1, in a volume of 5 ml of culture medium. 24 hours after transfection, the medium was replaced with a fresh one and the cells were cultured for 5 days.
  • the culture medium was collected and freed from dead cells and exfoliated from the substrate by centrifugation at 1000g for 10 minutes.
  • the supernatant proteins were separated electrophoretically (20 ⁇ l per lane) on a polyacrylamide gel under denaturing conditions and then transferred (semi-dry electrotransfer) to a nitrocellulose membrane for subsequent Western blot analysis.
  • the membrane was cut into fragments corresponding to the lanes, and each fragment was blocked with a 3% skimmed milk solution prepared in PBS with the addition of Tween-20 for 30 minutes. Then, the membrane fragments were independently incubated at +4°C for 16 h with sera obtained from healthy people and patients with different levels of anti-SARS-CoV-2 antibodies, confirmed by commercial tests.
  • the membranes were incubated with commercial anti-human IgG antibodies conjugated with horseradish peroxidase, and the binding sites were identified by the chromatographic reaction of peroxidase with 1-chloronaphthol.
  • the interval between primary and secondary immunizations at least 1-2 months, optimally at least 4-6 months, for optimal maturation of B-cell affinity. If the interval is shortened, the booster response may be less. However, in the current situation, given the results of the experiments, it is possible to carry out a secondary immunization 2-3 weeks after the first immunization.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для осуществления профилактики и лечения коронавирусной инфекции, главным образом, вызываемой 2019-nCoV. Предложена вакцина на основе генетической конструкции, кодирующей гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е нового коронавируса, а также в одном из вариантов дополнительно содержащая такой гибридный белок. Преимущества разработанной вакцины – быстрота и простота получения (от 2-3 часов); безопасность, за счет природы действующего вещества, а также отсутствия полного сайта связывания с ACE2 у синтезируемого с генетической конструкции гибридного белка, отсутствия его гомологии с белками организма; индукция профиля иммунного ответа, в немалой степени представленного цитотоксическим иммунным ответом, помимо гуморального; отсутствие затруднения диагностики 2019-nCoV; противоопухолевая активность; действие также против мутировавшего вируса.

Description

Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, медицине и может быть использовано для осуществления профилактики и лечения коронавируса.
Коронавирусы (КоВ) – многочисленное семейство вирусов, вызывающих болезнь от бытовой простуды до более серьезных заболеваний, таких как ближневосточный респираторный синдром (БВРС-КоВ) и тяжелый острый респираторный синдром (ТОРС-КоВ). Новый коронавирус (нКоВ, COVID-19, SARS-CoV-2) – это новый штамм, ранее у человека не выявлявшийся [https://www.who.int/ru/health-topics/coronavirus/coronavirus].
Особенностью данного штамма стала быстрая распространяемость, от человека к человеку, а также сложное течение болезни.
Первые случаи заражения COVID-19 зафиксированы в Китае в ноябре 2019 г. Однако уже на 04 марта 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности 93 090 случаев заболевания COVID-19 и 3198 смертей. Большая часть случаев и смертей – в Китае (80422 и 2984, соответственно), однако случаи коронавируса и смерти от него зафиксированы также в 76 странах мира [https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/20200304-sitrep-44-covid-19.pdf?sfvrsn=783b4c9d_2]. ВОЗ признала коронавирусную инфекцию пандемией.
На 03 апреля 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности 1 095 904 случаев заболевания COVID-19 и 58 814 смертей. Большая часть случаев и смертей – в США (275 744 и 7 086, соответственно), Италии (119 827 и 14 681, соответственно), Испании (119 199 и 11 198, соответственно), Германии (91 159 и 1 275, соответственно), в Китае (81 620 и 3 322, соответственно). На 22 ноября 2020 г. в мире зарегистрировано в общей сложности уже 58,5 миллионов случаев заболевания COVID-19 и порядка 1,4 млн смертей. Большая часть случаев и смертей – в США (12 млн и 260 тыс., соответственно), Индии (9 млн и 133 тыс., соответственно), Бразилии (6 млн и 169 тыс., соответственно). Случаи коронавируса и смерти от него зафиксированы уже в 218 странах и территориях мира [https://www.worldometers.info/coronavirus/]. Очевидно, что темпы распространения инфекции крайне высокие, несмотря на принимаемые меры.
Учитывая, что ежегодно в мире от осложнений, вызванных сезонными вирусами гриппа, умирает от 290 000 до 650 000 человек [https://www.worldometers.info/coronavirus/], число погибших от нового коронавируса значительно выше и выше даже числа умерших от заболеваний, связанных с ВИЧ (1,1 млн) и сравнимо с числом погибших от гепатита (1,3 млн), туберкулеза (1,4 млн), в 2015 году [https://www.who.int/docs/default-source/gho-documents/world-health-statistic-reports/v-4-17162-world-health-statistics-2017.pdf].
Среди наблюдаемых у заболевших состояний – ОРВИ, острое повреждение почек, сердечная недостаточность, дисфункция печени, аритмия, нередок летальный исход. Многим пациентам требовалась внешняя поддержка функции дыхания [Arabi, Y.M., Murthy, S. & Webb, S. COVID-19: a novel coronavirus and a novel challenge for critical care. Intensive Care Med (2020)]. Летальный исход на данный момент наблюдается у 3% [https://www.worldometers.info/coronavirus/?utm_campaign=homeAdUOA?Si,].
2019-nCoV - это вирус, оказывающий серьезное воздействие на здоровье населения, экономику и социально-политические вопросы. Сдерживание COVID-19 должно быть главным приоритетом для всех стран [https://www.who.int/dg/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-mission-briefing-on-covid-19---4-march-2020].
Поскольку это новое инфекционное заболевание, то на сегодняшний день зарегистрированной вакцины против нового коронавируса, прошедшей все 4 фазы клинических исследований, нет.
Также существует острая неудовлетворенная потребность в оптимальном лечении, включая специфическую противовирусную терапию, изучении роли модуляции иммунной системы и как лучше всего обеспечить поддержку отказавших систем органов. На момент написания указанной выше статьи Arabi Y.M. и соавторов было зарегистрировано более 160 рандомизированных и неслучайных исследований [http://www.chictr.org.cn/searchprojen.aspx и http://apps.who.int/trialsearch/default.aspx]. Для лечения COVID-19 используют различные средства, включая кортикостероиды, различные комбинации рибавирина, лопинавира/ритонавира, хлорохина, гидроксихлорохина, интерферонов и других агентов. Проводится РКИ с использованием ремдесивира при тяжелом течении COVID-19 (NCT04257656). [Arabi, Y.M., Murthy, S. & Webb, S. COVID-19: a novel coronavirus and a novel challenge for critical care. Intensive Care Med (2020)]. Лечение осуществляют также с использованием средств народной медицины.
Задачей настоящего изобретения является создание вакцины против коронавируса, безопасной, быстрой и простой при производстве и применении, которая имела бы эффективность и низкую стоимость, и которую можно применить и для профилактики, и лечения коронавируса, особенно нового коронавируса.
Из всех направлений разработки новых вакцин авторы настоящей группы изобретений считают наиболее перспективным использование вакцин, получаемых с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Однако их эффективность варьирует и обуславливается массой факторов, одними из самых важных из которых являются подбор компонентов и их форма (структура).
Для создания настоящего изобретения были выбраны фрагменты антигенов коронавируса – белков M, S, N, Е нового коронавируса. На их основе разработан гибридный белок. Компоненты гибридного белка соединены гибкими мостиками, что позволяет достигать полноценного функционирования каждого компонента белка. Разработанный белок эффективен также против SARS за счет перекрестной активности.
Важно, что разработанный гибридный белок за счет своей структуры не имеет гомологии с известными белками других организмов, кроме коронавируса, что обеспечивает специфичность их действия.
Важно, чтобы вакцина была специфически иммуногенна и протективна против коронавируса, и при этом безопасна также с точки зрения того, что не будет вызывать осложнения, вызываемые коронавирусом, а также иные побочные эффекты.
Важной особенностью вируса COVID-19 является то, что субъединица S1 (aa01–aa550) его гликопротеина S имеет RBD (рецептор-связывающий домен), который взаимодействует с рецептором клетки-хозяина, ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2). Проникновение коронавируса в клетку-хозяина и его захват происходит главным образом за счет N-концевого домена S1. Казалось бы, использование этого фрагмента как мишени для выработки иммунного ответа могло бы быть важным для блокирования проникновения вируса. Однако, при формировании антител к данному фрагменту, есть вероятность захвата ими молекул, и в результате недостаточности проникновения таких молекул организма в необходимые ткани, в результате эффект от такой вакцинации может быть совершенно небезопасным, за счет чего могут развиться указанные выше серьезные осложнения. Соответственно, использование вакцин, содержащих такой фрагмент, т.е. вакцин на основе ослабленного или убитого нового коронавируса, рекомбинантных вакцин, содержащих такой фрагмент белка S, является потенциально небезопасным.
Именно поэтому в разработанном нами гибридном белке использован иной фрагмент субъединицы S1 гликопротеина S, который позволит сформировать иммунный ответ в том числе на гликопротеин S, в том числе предотвратить проникновение вируса, однако не вызовет нарушение функционирования систем организма, в том числе сердечно-сосудистой и дыхательной.
Нами предложена вакцина для профилактики и лечения коронавируса у человека или животного, содержащая генетическую конструкцию в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор. Генетическая конструкция кодирует описанный выше гибридный белок.
Также предложена вакцина для профилактики и лечения коронавируса у человека или животного, содержащая дополнительно описанный выше гибридный белок или гибридный белок, также содержащий фрагменты антигенов коронавируса – белков M, S, N, Е нового коронавируса, немного короче описанного выше гибридного белка.
Аналоги предлагаемой нами вакцины не выявлены. Вакцины на основе убитых или аттенуированных штаммов коронавируса аналогами не считаем, ввиду значительно меньшей безопасности, в том числе обусловленной наличием полноразмерного белка S. Все виды вакцин, не содержащих живые микроорганизмы, являются более безопасными не только из-за отсутствия рисков инфицирования, но и из-за отсутствия рисков развития побочных явлений у людей с мутациями в генах, обуславливающих строение молекул, ключевых для корректного функционирования иммунной системы. Однако и с ними важно не вызвать формирование побочных эффектов, в том числе описанных выше, в том числе за счет наличия полноразмерного белка S или N-концевого фрагмента его субъединицы S1.
Технический результат от использования изобретения выражается, в первую очередь, в значительном ускорении производства вакцины, благодаря простому, с наименьшими требованиями, процессу получения действующего агента вакцины. С учетом распространяющейся стремительно инфекции скорость получения вакцины играет ключевую роль в победе над инфекцией, но также имеет экономический эффект – при карантинных мерах за несколько месяцев экономика впадет в сильнейший упадок, и только быстрая и эффективная вакцинация в кратчайшие сроки сможет позволить снять ограничения и не дать экономике прийти в сильный упадок.
Технический результат от использования вакцины также заключается в действии также против мутировавшего вируса. Достигается благодаря отсутствию в структуре полного домена S-белка, связывающегося с рецептором на поверхности клетки (с ACE2).
Технический результат от использования вакцины также заключается в увеличении безопасности вакцины.
Указанный технический результат достигается, главным образом, тем, что синтезируемый гибридный белок по изобретению не содержит фрагменты, гомологичные фрагментам молекул организма.
Указанный технический результат достигается тем, что в качестве действующего вещества используется ДНК, которая существует в виде эписомы и не интегрируется в геном, с которой синтезируется и в одном из вариантов затем секретируется из клетки белок.
Указанный технический результат также достигается тем, что используемая ДНК не реплицируется после введения в организм млекопитающего, что позволяет осуществлять контроль над количеством синтезируемого белка, и, соответственно, над эффектом.
Указанный технический результат достигается и за счет наличия в используемой ДНК таких регуляторных последовательностей, как сайленсер и/или инсулятор, в одном из вариантов изобретения, благодаря чему также осуществляется контроль над синтезом белка и, соответственно, над эффектом: при необходимости есть возможность в быстрый срок остановить, либо уменьшить экспрессию гена.
Указанный технический результат также достигается тем, что инфекционный агент как таковой не используется при производстве.
Указанный технический результат достигается в том числе в одном из вариантов тем, что используемый полинуклеотид содержит точные фрагменты генов, кодирующих белки коронавируса, соответственно действие такой генетической конструкции не будет неожиданным.
Технический результат выражается и в повышенной иммуногенности такой вакцины за счет природы используемых молекул. Так, показано, что сама по себе ДНК, наряду с введением иглой, действует как адъювант, что опосредует презентацию синтезируемых целевых антигенов, главным образом, с помощью MHC первого класса, что индуцирует, в свою очередь, формирование цитотоксического ответа. Также показано, что синтез одного внутриклеточного белка в больших количествах может способствовать активной презентации миофибриллами с помощью MHC первого класса [Hartikka J. et al. An improved plasmid DNA expression vector for direct injection into skeletal muscle // Hum. Gene Ther. 1996. Vol. 7, № 10. P. 1205–1217].
Технический результат от использования вакцины также заключается в том, что не затрудняется диагностика нового коронавируса существующими тест-системами. То есть после вакцинации тест на антитела не дает ложноположительных результатов, в отличие от вакцин, содержащих полноразмерный S - белок. Причина такого эффекта в том, что иммунный ответ вырабатывается на фрагменты белков коронавируса вакцины, на которые он не вырабатывается при встрече с вирусом, либо при введении вакцин, основанных на S-белке. На формировании такого иммунного ответа основана и эффективность вакцины.
Технический результат от использования вакцины также заключается в универсальности средства – и для профилактики, и лечения, и новой коронавирусной инфекции, и SARS. Достигается тем, что формируется безопасный для организма иммунный ответ, в котором развит цитотоксический ответ вкупе с гуморальным. Также достигается тем, что вакцина помогает иммунной системе корректно нацелиться – на конкретные фрагменты коронавируса, и коронавирус не остается незамеченным иммунной системой и элиминируется специфическим ударом.
Технический результат от использования вакцины на основе генетической конструкции по изобретению заключается также в повышенной эффективности благодаря тому, что гибридный белок длительно с нее синтезируется, причем в течение от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от строения используемой генетической конструкции. Также он достигается строением кодируемого гибридного белка.
Технический результат от использования вакцины на основе генетической конструкции также заключается в упрощении и удешевлении производства вакцины за счет избегания производства и процессов очистки белковых препаратов in vitro благодаря тому, что синтез белка происходит in vivo. Производство, очистка и хранение ДНК-препаратов экономически выгодно, они стабильны, их можно нарабатывать в больших количествах с меньшими затратами.
Технический результат от использования вакцины, содержащей дополнительно гибридный белок, заключается также в повышенной эффективности. Он достигается благодаря тому, что белковый компонент усиливает антигенность вакцины и ускоряет ее действие.
Технический результат от использования вакцины по изобретению, содержащей плазмидную ДНК, заключается также в противоопухолевом эффекте за счет наличия в структуре используемой генетической конструкции CpG-последовательностей. Учитывая повышенную нагрузку на учреждения здравоохранения и накладки с помощью онкобольным, такой эффект вакцины будет крайне востребован.
Технический результат также заключается в расширении спектра действующих веществ и вакцин на их основе против коронавируса. При нежелании использовать аналоги ввиду их вышеописанных недостатков, либо при противопоказаниях к применению аналогов, либо при отсутствии доступа к ним данное действующее вещество или вакцина позволит осуществить защиту против коронавируса. Указанный технический результат достигается тем, что используют действующее вещество или вакцину по настоящему изобретению.
В условиях пандемии крайне важно быстро и масштабно внедрять вакцинацию, поскольку это единственный способ защитить от распространения и тяжелого течения болезни, летальных исходов, а также снизить нагрузку на медицинские учреждения для доступности медицинской помощи для нуждающихся пациентов с иными болезнями или состояниями. Предложенная вакцина на данный момент удовлетворяет данному требованию, помимо высокой безопасности.
Нами предложен способ получения вакцины по изобретению, заключающийся в том, что амплифицируют генетическую конструкцию – линейный фрагмент ДНК - с использованием ПЦР, очищают и смешивают с физиологически приемлемым носителем и буферным раствором.
Технический результат от использования способа получения разработанной вакцины – в получении вакцины в кратчайшие сроки. Так, процесс получения очищенного препарата генетической конструкции - линейного фрагмента ДНК – активного агента вакцины - занимает всего несколько часов (от 2-3 часов)! Ни один иной тип вакцины против коронавируса невозможно получить в такие краткие сроки.
Технический результат также заключается в простоте получения вакцины. Он достигается тем, что для производства такой вакцины не требуется разработка многоступенчатой технологии производства, не требуется длительной наладки стадий процесса, требуется минимальный набор реагентов, которые легкодоступны, не требуются допуски к работе с патогенными организмами, не требуются значительные вложения в строительство, ремонт помещений и оборудование. Такой способ возможно осуществить даже в стандартной лаборатории, занимающейся работой с ДНК.
Предложена генетическая конструкция, включающая полинуклеотид, кодирующий разработанный гибридный белок, и элементы, позволяющие осуществить экспрессию полинуклеотида в клетках целевого организма. Целевой организм – человек или животное. Генетическая конструкция может быть представлена плазмидной ДНК для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, вектором на основе вируса, линейным фрагментом ДНК, содержащими полинуклеотид по изобретению.
Технический результат заключается, главным образом, в индукции иммунного ответа, не вызывающего побочных явлений, связанных с использованием иных фрагментов белка S нового коронавируса, либо полноразмерного такого белка, в генетических конструкциях, либо штаммах коронавируса.
Технический результат заключается в значительном ускорении и упрощении получения действующего вещества вакцины от коронавируса – генетической конструкции. Это достигается, в первую очередь, безопасностью используемых типов генетических конструкций и соответственно отсутствием жестких требований к работе с ними.
Технический результат заключается также в том, что генетическая конструкция служит матрицей для проведения ПЦР для получения вакцины по изобретению.
Кроме того, технический результат заключается в увеличении длительности синтеза кодируемого белка и достигается тем, что нуклеотидная последовательность, включающая фрагмент, кодирующий целевой белок, содержит элементы, обуславливающие стабильность мРНК и, соответственно, увеличивающие время полужизни мРНК, в результате синтез белка с одной молекулы мРНК осуществляется большее количество раз, а также в результате увеличивается количество синтезируемого белка; а также тем, что нуклеотидная последовательность гибридного белка оптимизирована по кодонному составу для экспрессии в клетках целевого организма – человека и животного, млекопитающих, в результате синтез белка идет интенсивнее. Последовательность нового коронавируса сама по себе является оптимизированной по кодонному составу для экспрессии в млекопитающих, а также оптимизация может быть осуществлена независимо, с использованием программного обеспечения.
При внедрении в практику это позволит использовать крайне малое количество вводимой плазмидной ДНК.
Технический результат заключается также в расширении спектра генетических конструкций для синтеза иммуногенных коронавирусных антигенов в организме.
Предложен полинуклеотид, кодирующий гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1. Полинуклеотид может также содержать фрагмент, кодирующий гетерологичную секреторную последовательность.
Технический результат от использования предлагаемого нами полинуклеотида – главным образом, в получении генетической конструкции, благодаря использованию которой в вакцине у человека или животного формируется специфичный протективный иммунный ответ на коронавирус, главным образом, на новый коронавирус.
Технический результат от использования предлагаемого нами полинуклеотида заключается также в расширении спектра полинуклеотидов для синтеза иммуногенных коронавирусных антигенов в организме.
Предложена прокариотическая рекомбинантная клетка для получения генетической конструкции по изобретению – продуцент.
Технический результат от использования продуцента разработанной генетической конструкции – в стабильном хранении и воспроизведении генетической конструкции, а также в получении разработанной генетической конструкции.
Полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент генетической конструкции, способ получения вакцины – все эти объекты используют для получения вакцины по изобретению.
В связи с тем, что проблема нового коронавируса стоит очень остро, а выведение на рынок препарата удается не многим, и реальную протективность покажет только время, данная группа изобретений позволит увеличить шансы в борьбе с данной инфекцией.
Предложена группа изобретений: гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, рекомбинантная клетка, вакцина на основе генетической конструкции для профилактики и лечения коронавируса, которая также может содержать гибридный белок, способ ее получения.
Разработан гибридный белок, который включает иммуногенные фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, белок охарактеризован последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1. Особенностью белка является то, что он не имеет гомологии с белками иных организмов, чем коронавируса, а также не содержит полноразмерный сайт связывания с ACE2. Это обуславливает важное преимущество вакцины на его основе – дополнительный аспект безопасности вакцины. Такой белок будет синтезироваться в клетках целевого организма – человека или животного, - с предложенной генетической конструкции, содержащей предложенный полинуклеотид. Также такой белок содержится и в одном из вариантов вакцины.
Предложен полинуклеотид, кодирующий разработанный гибридный белок. При известности аминокислотной последовательности белка специалист в данной области сможет получить нуклеотидную последовательность для синтеза в клетках целевого организма. Это может быть как основанная на фрагментах природной нуклеотидной последовательности белков вируса, так и оптимизированная искусственно по кодонному составу последовательность. Кодонную оптимизацию можно проводить самостоятельно, используя информацию о частоте встречаемости кодонов у целевого организма, например, в базе данных [например, Nakamura Y, Gojobori T, Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 2000 Jan 1;28(1):292], либо с использованием специализированных программ, например, представленной на сайте http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm или molbiol.ru или иных ресурсах.
Полинуклеотид может не содержать (например, SEQ ID NO.:2) или содержать (например, из SEQ ID NO.:3-5) гетерологичную секреторную последовательность, оптимизированную по кодонному составу для целевого организма – например, таковую TPA (tissue-type plasminogen activator), ГРЧ (гормон роста человека), IGF (инсулиноподобный фактор роста), EPO (эритропоэтина), но ими не ограничиваясь. В случае без секреторной последовательности иммунный ответ будет наиболее сдвинут в сторону цитотоксического. В другом случае, помимо цитотоксического, также будет в значительной степени индуцирован гуморальный - антительный иммунный ответ. Поскольку, особенно в условиях сложности тестирования на коронавирус, сложно оценить, заражен ли человек, то явным преимуществом предлагаемой вакцины является индукция профиля иммунного ответа, где цитотоксический ответ проявлен значительно, в отличии от иммунного ответа, формирующегося на вводимый только белковый антиген или вирусную частицу SARS-CoV2. То есть оба варианта полинуклеотида являются подходящими.
Предложена генетическая конструкция. Каждая конструкция включает, помимо полинуклеотида, элементы, позволяющие осуществить экспрессию полинуклеотида в клетках целевого организма. За счет того, что действующим веществом вакцины является именно генетическая конструкция, с которой осуществляется синтез антигена, возможно получить профиль иммунного ответа, в котором немалую роль сыграет цитотоксический иммунный ответ, однако и антительный ответ также будет формироваться. Также благодаря длительности синтеза антигена в организме и при этом отсутствии инфекционности, вероятность вызвать формирование иммунного ответа, адекватного, с формированием иммунологической памяти, возрастает. Сама по себе молекула также обладает адъювантным действием.
Под генетической конструкцией подразумевается прежде всего линейный фрагмент ДНК или рекомбинантный вектор, который может быть представлен вирусным, либо плазмидным вектором.
Рекомбинантный вектор должен содержать существенные для организмов его поддержания и использования элементы, вкупе с соответствующими регуляторными последовательностями. Регуляторные последовательности – нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования рекомбинантного вектора.
Существенными для прокариотической системы являются ориджин репликации, для поддержания в клетке со средней, предпочтительно высокой, копийностью, и маркерный ген для возможности селекции штамма-продуцента. Бактериальные элементы плазмидной ДНК не должны отрицательно влиять на экспрессию в клетках млекопитающих и обуславливать побочный эффект от применения плазмидной ДНК. Подходящий ориджин репликации представлен pM1 (der.), ColE1 (der.) и F1, pUC и F1, но не ограничивается ими. Подходящий маркерный ген представлен репортерным геном или геном устойчивости к антибиотику, например, ампициллином, преимущественно канамицином, но не ограничивается ими. В литературе имеются данные о том, что использование гена устойчивости к ампициллину в качестве маркерного гена может быть нежелательным в связи с развитием реакции у пациентов на ампициллин, что связано с качеством очистки ДНК, но не самим элементом.
Существенными элементами рекомбинантного вектора для использования у млекопитающих являются элементы для эффективного функционирования, для экспрессии закодированного гена, - промотор, в том числе сигналы инициации транскрипции, лидерная последовательность мРНК, терминирующая последовательность, регуляторные последовательности.
Промотор является важным компонентом вектора, который запускает экспрессию интересующего гена. Классические промоторы для рекомбинантных векторов -компонентов препаратов — это CMV человека/ немедленно-ранний или CMV-chicken-β actin (CAGG) промотор. Промоторы CMV используется для большинства ДНК-вакцин, так как они опосредуют высокие уровни конститутивной экспрессии в широком диапазоне тканей млекопитающих [Manthorpe M, Cornefert-Jensen F, Hartikka J, et al. Gene therapy by intramuscular injection of plasmid DNA: studies on firefly luciferase gene expression in mice. Hum. Gene Ther. 1993;4(4):419–431] и не подавляют прочитывание downstream. Увеличение уровня экспрессии наблюдают при изменении CMV промотора, например, включением HTLV-1R-U5 downstream от промотора цитомегаловируса или при использовании химерного SV40-CMV промотора [Williams JA, Carnes AE, Hodgson CP. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production. Biotechnol. Adv. 2009;27(4):353–370]. Альтернативой CMV промоторам служат тканеспецифические промоторы хозяина, которые позволяют избежать конститутивной экспрессии антигенов в неподходящих тканях [Cazeaux N, Bennasser Y, Vidal PL, Li Z, Paulin D, Bahraoui E. Comparative study of immune responses induced after immunization with plasmids encoding the HIV-1 Nef protein under the control of the CMV-IE or the muscle-specific desmin promoter. Vaccine. 2002;20(27–28):3322–3331].
Промотор может быть с соответствующими регуляторными последовательностями из природных промоторов со своими регуляторными элементами (CaM kinase II，CMV, nestin, L7, BDNF, NF, MBP, NSE, p-globin, GFAP, GAP43, тирозингидроксилаза, субъединица 1 каинатного рецептора и субъединица В глутаматного рецептора и другие), либо синтетических промоторов с регуляторными последовательностями, для получения необходимого характера экспрессии (соотношения продолжительности и уровня экспрессии) целевого гена на уровне транскрипции.
Возможные регуляторные последовательности по отношению к промотору:
- энхансер, для увеличения уровня экспрессии через улучшение взаимодействия РНК-полимеразы и ДНК.
- инсулятор, для модулирования функций энхансера,
- сайленсеры, либо их фрагменты, для снижения уровня транскрипции, например, для тканеспецифической экспрессии,
- 5` нетранслируемая область до промотора, включая интрон.
Регуляторные последовательности – нуклеотидные последовательности, способные повлиять на экспрессию гена на уровне транскрипции и/или трансляции, а также на механизмы, обеспечивающие существование и поддержание функционирования генетической конструкции. Рекомбинантный вектор - плазмидная или вирусная ДНК по настоящему изобретению - содержит от одной из вышеприведенных регуляторных последовательностей, в зависимости от варианта ДНК, основанного на выборе промотора и желаемых параметрах экспрессии целевого гена. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты таких элементов и их использования, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может содержать любые отвечающие вышеуказанным условиям комбинации, при которых с него осуществляется синтез разработанного гибридного белка в клетках целевого организма – человека или животного. При использовании сайленсера, либо инсулятора в составе конструкции возможно регулировать экспрессию целевого гена.
Иные регуляторные последовательности:
- нетранслируемая область downstream от промотора, включая интрон, для повышения стабильности мРНК и увеличения экспрессии целевого гена.
Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению в одном из вариантов дополнительно содержит такой регуляторный элемент.
Рекомбинантный вектор по настоящему изобретению содержит и такой важный элемент, как лидерную последовательность мРНК, содержащую сигналы инициации трансляции, старт-кодон. Сигналы инициации трансляции - последовательность Козак у эукариот [Kozak M. (1986) "Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes", Cell 44, 283-292].
Рекомбинантный вектор также содержит сайт, преимущественно сайты, разные, для клонирования целевого гена, для осуществления правильной ориентации целевого гена в рекомбинантном векторе, и сайт, преимущественно сайты, для посадки праймеров для его секвенирования.
Рекомбинантный вектор содержит и описанный выше полинуклеотид.
Рекомбинантный вектор также содержит терминирующую последовательность, содержащую последовательно стоп-кодон, 3` нетранслируемую область с сигналом и сайтом полиаденилирования, стоп-кодон, за счет которой сохраняется стабильность мРНК, и осуществляется надлежащее прекращение транскрипции и экспорт мРНК из ядра. На экспрессию генов можно повлиять путем изменения терминирующей последовательности, которая необходима для сохранения стабильности мРНК, надлежащего прекращения транскрипции и экспорта мРНК из ядра, в том числе ее укорачиванием. Во многих современных ДНК-вакцинах используют последовательность терминатора транскрипции бычьего гормона роста [Montgomery DL, Shiver JW, Leander KR, et al. Heterologous and homologous protection against influenza A by DNA vaccination: optimization of DNA vectors. DNA Cell Biol. 1993;12(9):777–783]. Полиаденилирование (полиА) необходимо для стабилизации транскрипта. Изменение последовательности полиА может привести к увеличению уровня экспрессии гена [Norman JA, Hobart P, Manthorpe M, Felgner P, Wheeler C. Development of improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine. 1997;15(8):801–803]. В плазмиде pVAX1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) область терминатора бычьего гормона роста содержит область гомопурина, которая чувствительна к нуклеазе. Показано, что альтернативная полиА последовательность может значительно улучшить стабильность плазмиды к нуклеазе [Azzoni AR, Ribeiro SC, Monteiro GA, Prazeres DMF. The impact of polyadenylation signals on plasmid nuclease-resistance and transgene expression. J Gene Med. 2007;9:392–402]. Введение двух стоп-кодонов перед 3` нетранслируемой областью позволяет увеличить эффективность терминатора транскрипции. Опираясь на существующий уровень техники, на известные и очевидные варианты такого элемента, рекомбинантный вектор по настоящему изобретению может содержать любую отвечающую вышеуказанным условиям терминирующую последовательность, при которой с него осуществляется синтез целевого белка в клетках человека или животного. Пример терминирующей последовательности для клеток млекопитающих - таковая бычьего гормона роста (BGH).
Могут содержаться и иные элементы, требуемые для функционирования экспрессионной системы.
Предпочтительными рекомбинантными векторами для использования у человека являются векторы, проверенные на людях, содержащие описанные выше элементы с соответствующими регуляторными последовательностями, возможно, модифицированные для соответствия заявленным критериям, что позволяет уменьшить количество требуемых исследований для регистрации средства. Однако возможно и использование иных рекомбинантных векторов, содержащих требуемые описанные элементы.
Проведено множество клинических исследований ДНК-вакцин, продемонстрировавших их безопасность.
На 2019 год количество проведенных клинических исследований в области генной терапии - 3001 шт. [http://www.abedia.com/wiley/countries.php], в том числе 184 исследования проведено в отношении инфекционных заболеваний. При этом 15% всех клинических исследований в области генной терапии проведено в отношении агентов на основе плазмидной ДНК, 8% - на основе аденоассоциированного вируса. Таким образом, данное направление является реальным и внедряемым.
В руководстве FDA (2007) заявлено, что исследования биораспределения вещества после его введения в организм могут быть отменены для ДНК-вакцин, производимых клонированием нового гена в плазмидный вектор, в отношении которого ранее документально установлено приемлемые биораспределение и профиль интеграции. В руководстве ВОЗ (2007) заявлено, что исследования биологического распределения и сохранения требуются, если еще не имеется значительный опыт работы с почти идентичным или аналогичным продуктом. В руководстве EMEA (2006) заявлено, что опыт работы с векторной системой позволит оптимизировать и сфокусироваться на доклинических исследованиях. Исследования по безопасности с использованием ДНК-векторов с различными клонированными генами продемонстрировали аналогичное биораспределение [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Duffy C, Nason M, Andrews C, Kong WP, Nabel GJ, Gomez PL. Biodistribution of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar, without integration, despite differing plasmid backbones or gene inserts.Toxicol Sci. 2006 Jun;91(2):610-9. Epub 2006 Mar 28.] и токсикологию [Sheets RL, Stein J, Manetz TS, Andrews C, Bailer R, Rathmann J, Gomez PL. Toxicological safety evaluation of DNA plasmid vaccines against HIV-1, Ebola, Severe Acute Respiratory Syndrome, or West Nile virus is similar despite differing plasmid backbones or gene-inserts. Toxicol Sci. 2006 Jun;91(2):620-30. Epub 2006 Mar 28]. Для плазмидной ДНК для применения у млекопитающих, кроме человека, требования менее строгие, в связи с чем возможно использование более широкого спектра плазмид.
Последовательность расположения описанных элементов в рекомбинантном векторе понятна среднему специалисту в данной области.
Касаемо вектора pcDNA3.1(+), элементы, обеспечивающие экспрессию гена, обуславливающего устойчивость к антибиотику неомицину, а также репликацию плазмиды в виде эписомы в клетках млекопитающих, не функционируют в целевом организме, поскольку такие клетки – клетки организма введения таких плазмидных ДНК - не содержат большой Т-антиген SV40. Векторы pcDNA3.1(+), pVAX, pCMV-3Tag3-a, как и многие другие плазмидные векторы, не содержат транспозонов, а также элементов, отвечающих за трансмиссивность. Такая ДНК не встраивается в геном и не реплицируется в клетках млекопитающих. Все это безусловно говорит о безопасности применения средств на его основе.
Под вектором на основе вируса, в котором клонирован полинуклеотид, - подразумевается безопасный вектор, такой как, например, рекомбинантный аденоассоциированный вирус, но им не ограничивается.
Под линейным фрагментом ДНК подразумевается фрагмент ДНК, содержащий промотор, лидерную последовательность мРНК, описанный выше полинуклеотид, терминирующую последовательность, в том числе 1 или 2 стоп-кодона, регуляторные последовательности. К элементам применимы описанные выше требования. Такие элементы являются ключевыми, но могут содержаться и иные элементы. С такого фрагмента в клетках целевого организма синтезируется гибридный белок. Последовательность расположения описанных элементов понятна среднему специалисту в данной области.
Синтез с линейного фрагмента ДНК идет менее длительно, чем с плазмидного или вирусного вектора, однако его получение – намного более быстрое. Таким образом, каждая генетическая конструкция имеет свои преимущества и может быть применена в той или иной ситуации. Например, если требуется наработка доз вакцины в кратчайший срок – в течение нескольких часов (от 2-3 ч), то будет использован линейный фрагмент ДНК, если есть больше времени, тогда возможны остальные варианты.
Соответственно предложен способ получения вакцины против коронавируса на основе линейного фрагмента ДНК, который заключается в амплификации линейного фрагмента ДНК с использованием полимеразной цепной реакции - ПЦР, очистке от примесей и смешивании с физиологически приемлемым носителем и буферным раствором. Такой способ получения вакцины является самым быстрым, и ни одна зарегистрированная в России вакцина не нарабатывается таким способом. Однако в условиях такой стремительно распространяющейся инфекции, как коронавирусная инфекция 2020 года, охватившая мир, только такой способ наработки вакцины отвечает брошенному природой вызову.
Вакцину на основе плазмидной ДНК или вирусного вектора возможно получить культивированием микроорганизмов - прокариотической рекомбинантной клетки-продуцента, с последующим выделением и очисткой генетической конструкции. Такой способ займет больше времени (около 4-5 дней), однако он также является быстрым и применимым в настоящих реалиях нового коронавируса.
Вакцину на основе вируса возможно получить культивированием клеток млекопитающих, содержащих вирусный вектор и возможно вспомогательные плазмиды, например, для паковки вирусных частиц, но ими не ограничиваясь, с последующим выделением и очисткой вируса. Такой способ займет больше времени и является более трудоемким и требовательным к чистоте, поскольку клетки млекопитающих нередко контаминируются и другими вирусами, в том числе патогенными. Тем не менее, такой способ также является применимым в настоящих реалиях нового коронавируса.
Вакцину на основе генетической конструкции и гибридного белка получают смешиванием предварительно полученных компонентов.
Все способы являются безопасными как для производства, так и применения вакцины, поскольку препарат новую коронавирусную инфекцию вызвать не может даже гипотетически.
Вакцины на основе мРНК или ослабленных или убитых вирусов – намного сложнее и дольше в производстве, в особенности первый период – разработка технологии получения стабильного и активного агента; сама наработка мРНК, - молекулы, которая менее стабильна, чем ДНК, и обеспечение ее стабильности и активности в ГЛФ; работа с опасным вирусом.
Предложена прокариотическая рекомбинантная клетка для получения генетической конструкции. Прокаритический продуцент представлен, например, Escherichia coli, Bacillus subtilis. В одном из вариантов это штамм бактерий Escherichia coli DH5a или DH10B/R, содержащий вектор pcDNA3.1(+), pVAX1, или pCMV-3Tag3-a, который содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO.:2-5. Либо вектор pAAVK-EF1α-MCS.
Предложена вакцина для профилактики и лечения коронавируса, содержащая описанную выше генетическую конструкцию в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор. Фармацевтически приемлемые носители и буферные растворы известны из уровня техники и включают те, которые описаны в различных текстах, таких как, например, Remington's Pharmaceutical Sciences. В качестве потребителя вакцины может выступать как человек, так и животное, в том числе из домашних или сельскохозяйственных животных.
Также предложена вакцина для профилактики и лечения коронавируса, содержащая дополнительно гибридный белок. Гибридный белок включает фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, и охарактеризован последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1 или 6.
Введение средств, содержащих генетические конструкции (ДНК), кодирующие антиген патогена, как правило, осуществляется в мышечную ткань, и данная конструкция попадает в соматические клетки, где происходит экспрессия целевого гена. Синтезированный белок экспонируется на поверхности соматической клетки с помощью молекул МНС класса I, что вызывает формирование цитотоксических Т-лимфоцитов. Однако при введении в состав белка секреторного пептида он, в основном, секретируется во внеклеточное пространство, и реализуется механизм гуморального иммунного ответа.
Авторы предлагают парентеральное введение вакцины, всех вариантов. В одном из вариантов – в случае вакцины на основе вируса – возможны и иные типы введения, например, интраназальное введение, но им не ограничиваясь. Также вакцину по изобретению можно вводить с использованием электропорации, для увеличения эффективности доставки в клетки для экспрессии полинуклеотида.
Авторами настоящего изобретения проведены лабораторные исследования, подтверждающие возможность реализации охарактеризованного изобретения. Полученные результаты исследований проиллюстрированы примерами (1-3).
Пример 1. Моделирование гибридного белка
Для моделирования белка были произведены следующие действия:
1. Поиск компонентов гибридного белка
2. Построение модели целого белка для определения ориентации доменов
3. Построение моделей для каждого домена (с использованием образцов 3D структур и ab initio)
4. Докинг моделей с использованием модели целого белка.
Для получения наиболее реалистичных результатов в автоматическом режиме использовали алгоритм I-Tasser для моделирования белков.
Смоделированный гибридный белок состоит из 482 а.о., с метионином на N-конце – 483 а.о., представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1. Анализ аминокислотной последовательности данного белка с помощью программы ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показал, что гибридный белок имеет молекулярную массу 53,5 кДа, pI 8,79, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 2,8 часов. С метионином на N-конце – 53,7 кДа, pI 8,79, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 30 часов. При добавлении секреторной последовательности IGF (GKISSLPTQLFKCCFCDFLK), с метионином на N-конце гибридный белок состоит из 503 а.о., молекулярная масса 55,9 кДа, pI 8,83, белок стабилен. При добавлении секреторной последовательности ГРЧ (ATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA), с метионином на N-конце гибридный белок состоит из 508 а.о., молекулярная масса 56,2 кДа, pI 8,76, белок стабилен. При добавлении секреторной последовательности TPA (MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS), гибридный белок состоит из 505 а.о., молекулярная масса 55,9 кДа, pI 8,77, белок стабилен.
При использовании иных секреторных сигналов показатели немного изменяются.
При экспрессии гибридного полинуклеотида в любой клетке синтезируется белок с метионином на N-конце, поскольку трансляция всегда начинается со старт-кодона. Далее метионин может отщепляться естественным путем, например, если белок секретируемый, в составе секреторного пептида.
Гибридный белок, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:6, состоит из 424 а.о., с метионином на N-конце – 425 а.о.. Анализ аминокислотной последовательности данного белка с помощью программы ProtParam (http://au.expasy.org/tools/protparam.html) показал, что гибридный белок имеет молекулярную массу 46,5 кДа, pI 9,61, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 100 часов. С метионином на N-конце – 46,6 кДа, pI 9,61, белок стабилен, период полужизни в млекопитающих около 30 часов.
Пример 2. Получение высокоочищенных генетических конструкций согласно изобретению
2.1. Получение полинуклеотида, кодирующего гибридный белок
Рассчитывали последовательность нуклеотидов гена, коллинеарную последовательности аминокислот кодируемого им гибридного белка, охарактеризованного SEQ ID NO:1, с фланкированием целевого гена сайтами рестрикции, а также с добавлением последовательности Козак перед старт-кодоном для инициации трансляции, после старт кодона – в части вариантов - сигнальной последовательности, например, TPA, ГРЧ, IGF, EPO, либо представленной а.о. MLLLLLLLLLLALALA, для секреции синтезируемого белка из эукариотической клетки, с одновременной оптимизацией по кодонному составу для экспрессии в клетках человека, использован инструмент на сайте molbiol.ru. Получили, например, последовательность, охарактеризованную SEQ ID NO.:4, а также последовательность, содержащую SEQ ID NO.:2.
В одном из вариантов вместо искусственной оптимизации взяли соответствующие нуклеотидные последовательности нового коронавируса для получения генетической конструкции, поскольку эти последовательности экспрессируются у млекопитающих, остальные фрагменты оптимизировали как описано выше. Получили, например, нуклеотидную последовательность, охарактеризованную SEQ ID NO.:3,5.
Рассчитанные нуклеотидные последовательности синтезировали химическим методом с помощью синтезатора ДНК ASM-800 (БИОССЕТ, РФ).
2.2. Получение плазмидной ДНК
2.2.1. Создание штамма-продуцента плазмидной ДНК
Синтезированные гены клонировали в эукариотических экспрессионных векторах pVAX1 (Invitrogen), pcDNA3.1+ (Invitrogen), pCMV-3Tag3-a, по рестрикционным сайтам, фланкирующим целевые гены, по инструкции к вектору.
На реакцию лигирования брали 3 мкл раствора синтезированной ДНК, 1 мкл раствора готового вектора, 5 мкл буфера для лигирования х 2 и 1 мкл Т4-лигазы. Реакцию проводили при +20оС в течение 2 часов.
После этого смесь прогревали при +95оС в течение 10 мин и очищали от солей диализом на нитроцелюлозных фильтрах с диаметром пор 0,025 мкм (Millipore, США). Диализ проводили против раствора, содержащего 0,5 мМ ЭДТА в 10% глицерине, в течение 10 мин.
Затем трансформировали клетки E.coli штамма DH10B/R (F-mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80dlacZΔM 15, ΔlacX74, deoR, recA1, endA1, araD139, Δ(ara,leu)769, galU, galKλ-, rpsL, nupG) и DH5a (F- Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-) полученными плазмидными ДНК методом электропорации с использованием электропоратора MicroPulser (BioRad). В данных штаммах обеспечивается повышенная стабильность вставки гена, предотвращается нежелательная рекомбинация, а также улучшается выход и количество плазмидной ДНК. К 12 мкл компетентных клеток добавляли 1 мкл диализованной лигазной смеси, помещали между электродами порационной ячейки и обрабатывали импульсом тока.
После трансформации клетки помещали в 1 мл SОС-cреды (2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза) и инкубировали в течение 40 мин при +37°С.
Проводили выявление клонов клеток E.coli, содержащих полученную плазмидную ДНК, на селективной среде, содержащей LB-агар, 50 мкг/мл канамицина, либо ампициллина (в зависимости от плазмиды).
Из выросших клонов выделяли плазмидную ДНК. Выделение плазмидной ДНК проводили с использованием набора Wizard Minipreps DNA Purification System (Promega, США). Очищенную рекомбинантную плазмидную ДНК проверяли с помощью секвенирования.
Секвенирование клонированных фрагментов проводили по методу Сэнджера.
Компьютерный анализ последовательностей ДНК проводили с использованием программ Chromas и BioEdit. Нуклеотидные последовательности исследованных фрагментов ДНК были выровнены относительно рассчитанных, была продемонстрирована идентичность синтезированных фрагментов рассчитанным. В результате были отобраны клоны клеток E.coli, содержащие полноразмерные последовательности целевых генов в составе плазмид - последовательности ДНК, кодирующие разработанный гибридный белок. Такие клоны использовали в качестве штамма-продуцента плазмид по изобретению. Возможные варианты - это штамм бактерий Escherichia coli DH10B/R или DH5a, содержащий вектор pVAX1 (Invitrogen), pcDNA3.1+ (Invitrogen) или pCMV-3Tag3-a, который содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO.:2-5.
В качестве продуцента генетической конструкции также успешно использовали клетки бактерии Bacillus subtilis.
2.2.2. Наработка плазмидной ДНК, кодирующей гибридный белок
Отдельную колонию клеток продуцента E.coli, выращенную на LB-агаре в чашке Петри с добавлением канамицина, либо ампициллина, в зависимости от содержащейся плазмидной ДНК, помещали в 10 мл селективной среды. Клетки растили в течение 12 ч. при +37оС в условиях постоянного перемешивания (250 об/мин.). Полученные клетки собирали центрифугированием при 4000g. Дальнейшее выделение и очистку плазмидной ДНК осуществляли с использованием набора EndoFree Plasmid Mega Kit (Qiagen), позволяющего получить апирогенную ДНК. Выделенную плазмидную ДНК анализировали электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле, измеряли ее концентрацию с помощью флуориметрии. Использовали также и иные способы очистки плазмид, в частности, хроматографию.
Определенные в эксперименте значения соответствовали значениям отношений А260/А280 и А260/А230 для чистых препаратов, для всех полученных препаратов плазмидной ДНК.
Также проводили количественное определение примесей белка в полученных препаратах плазмидных ДНК с помощью microBCA assay [Smith, P.K., et all, Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analyt. Biochem. 150, 76-85 (1985)], измеряя оптическую плотность образующихся окрашенных белковых комплексов с медью и бицинхониновой кислотой при длине волны 562 нм. Чувствительность метода microBCA assay составляет 0.5-20 мкг/мл белка. Концентрация тотального белка ни в одном из исследуемых препаратов плазмидной ДНК не превышала норму.
Определяли и содержание бактериального липополисахарида в препаратах плазмидных ДНК, с использованием гель-тромб варианта ЛАЛ-теста, с чувствительностью >0,25 EU/мл (ToxinSensor, GenScript, США). ЛАЛ-реагентом служил лизат амебоцитов подковообразного краба Limulus polyphemus. ЛАЛ-реактив специфически реагирует с бактериальными эндотоксинами, в результате ферментативной реакции происходит изменение реакционной смеси, пропорциональное концентрации эндотоксина. Результаты оценивали по наличию или отсутствию плотного тромба на дне пробирки путем переворачивания пробирки. Гель-тромб не образовался при исследовании образца, разведенного в 10 раз, для препаратов всех полученных плазмидных ДНК, т.е. при чувствительности метода 2,5 EU/мл, что, учитывая концентрацию плазмидной ДНК в образце, говорит о допустимом показателе очистки от эндотоксинов.
Выход плазмидной ДНК составил от 3,5 мг до 5 мг из 1 л питательной среды. Процесс занял около 4 дней.
2.3. Получение вирусного вектора или вируса, кодирующих гибридный белок
2.3.1. Получение вектора на основе вируса
Синтезированные гены клонировали в векторе на основе аденоассоциированного вируса pAAVK-EF1α-MCS (System Biosciences (SBI)). Создавали штамм-продуцент данного вектора, используя клетки E.coli (RecA-), например, DH10B/R или DH5a, по аналогии с протоколом, описанным в примере 2.2.1.. В качестве продуцента также успешно использовали клетки бактерии Bacillus subtilis, а в качестве вектора – иные вирусные вектора.
Далее выделяли вектор для использования у млекопитающих, все по инструкции к вектору. Выход вектора составил от 2 мг до 3,2 мг из 1 л питательной среды.
2.3.2. Получение вируса
Для наработки вирусов использовали систему «AAV Helper-Free System». Это трех-плазмидная система, которая включает в себя (1) плазмиду pAAV-MCS, в которую клонировали гибридный ген, фланкированный повторами ITR; (2) плазмиду pAAV-RC, содержащую rep и cap гены, кодирующие белки репликации и белки вирусного капсида, причем повышение уровня экспрессии этих генов приводит к повышению вирусных титров; и (3) плазмиду pHelper, содержащую набор аденовирусных генов VA, E2A и E4, необходимых для достижения высоких титров ААВ в клетках. Аденовирусные протеины Е2А и Е1В, требуемые для продукции вируса, стабильно экспрессируются в ААВ-293 клетках, входящих в состав коммерческой системы и происходящих из клеток HEK293.
Синтезированные гены клонировали в векторе pAAV-MCS. Создавали штамм-продуцент данного вектора, используя клетки E.coli (RecA-), например, DH10B/R или DH5a, по аналогии с протоколом, описанным в примере 2.2.1. В качестве продуцента также успешно использовали клетки бактерии Bacillus subtilis.
Далее выделяли вектор для получения вируса в клетках млекопитающих.
Клетки ААV-293 выращивали на 10-этажных клеточных фабриках (Флаконы для культивирования клеток, 10-уровневые CellStack, с общей площадью 6360 см2 (CellSTACK® 10-STACK, США). Для наращивания клеток в количестве, достаточном для засева на 10-этажные фабрики, производили последовательно размораживание клеток, культивирование во флаконах Т25 (EASY FLASK 25 V/C), затем во флаконах Т75 (EASY FLASK 75 V/C), далее на 2-этажных клеточных фабриках площадью 1272 см2 (Флаконы для культивирования клеток, двухуровневые CellSTACK 2-STACK, США). После окончания каждого этапа культивирования клетки снимали с подложки, подсчитывали их количества в аликвотах в камере Горяева, после чего определяли содержание живых клеток повторным подсчетом с красителем трипановым синим. Последовательно наращивали клетки для последующей наработки вирусов.
Клетки рассеивали на 4 10-этажные клеточные фабрики из расчета 6,3х107 клеток/ фабрику. Через 24 часа после рассева клеток и по достижении конфлюентности монослоя 60% была проведена трансфекция вектором с применением реагента «PEIpro reagent».
Среду роста меняли на бессывороточную среду DMEM, содержащую 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глютамина, за 2 часа до трансфекции. Для трансфекции клеток готовили смесь ДНК и «PEIpro» реагента в соотношении ДНК (мкг) и реагента (мл) как 1:1. Отбирали раствор вектора (например, pAAV-MCSseqidno4, но им не ограничиваясь), содержащий по 1 мг вектора, добавляли к нему растворы, содержащие паковочные плазмиды pAAV-RC plasmid и pHelper в количестве 1 мг каждой из плазмид. Объем конечного раствора доводили до 150 мл добавлением бессывороточной среды DMEM и тщательно перемешивали. В стерильный флакон вместимостью 250 мл переносили 3 мл реагента PEIpro, объем доводили до 150 мл добавлением бессывороточной среды DMEM, полученный раствор также перемешивали. Затем добавляли 150 мл раствора реагента PEIpro к 150 мл раствора вектора, незамедлительно тщательно перемешивали полученный раствор с помощью мешалки типа «вортекс», затем инкубировали раствор в течение 15 минут при комнатной температуре. После инкубации добавляли полученный раствор в культуральный флакон CF10 (10-этажная клеточная фабрика), в котором находились трансфецируемые клетки. Через 6 часов после трансфекции меняли среду на полную ростовую, содержащую среду роста DMEM, 4,5 г/л глюкозы, 10% ЭТС, 50 мкг/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глютамина. Инкубировали клетки при 37°С и 5% CO2 в течение 72 часов.
Вирусы, несущие нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO.:2-5, наработанные на AAV-293 клетках, выделяли методом замораживания-оттаивания. Для этого клетки промывали от клеточной среды, содержащей сыворотку, 500 мл раствора PBS. Клетки снимали с поверхности флакона добавлением 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Клетки повторно промывали от трипсина-ЭДТА добавлением раствора PBS, затем клетки ресуспендировали в 25 мл раствора 150 мM NaCl, 20 мM Tris, pH=8,0 и подвергали 5 циклам замораживания при -80ºС в низкотемпературном холодильнике и быстрого размораживания при +37ºС на водяной бане. Затем инкубировали полученные лизаты клеток в течение часа при +37ºС в присутствии 0,05 ед/мкл бензоназы нуклеазы для удаления молекул ДНК, которые в дальнейшем могут помешать специфичной очистке вирусов. Для удаления клеточного дебриса полученный раствор два раза центрифугировали при скорости 3000g, 15 мин, переносили надосадочную жидкость в чистые пробирки вместимостью 50 мл, после чего приступали к очистке вирусов.
Аденоассоциированные вирусы очищали с помощью аффинной хроматографии на 5-мл колонках «Hi-Trap Column». Перед нанесением на колонку лизат клеток, содержащий вирусные частицы, фильтровали через мембрану с размером пор 0,45 мкм, затем наносили на колонку. Элюцию проводили путем добавления 15 мл элюирующего раствора с pH2. Непосредственно после элюции значение pH в элюате доводили до нейтрального показателя с помощью добавления раствора 1М Tрис-HCl, pH8,0.
Выход рекомбинантных вирусов составил до 17*106 активных вирусных частиц. Сравнимые результаты получали и с иными вирусами.
2.4. Получение короткой линейной конструкции, кодирующей гибридный белок по изобретению
Для наработки короткой линейной конструкции использовали полученную по п.2.2.2. плазмидную ДНК, либо вирусный вектор по п.2.3.1, либо амплифицированный с них фрагмент. С использованием специфичных праймеров и ПЦР, с использованием в качестве матрицы указанной в предыдущем предложении ДНК, амплифицировали фрагмент ДНК, содержащий промотор, лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, полинуклеотид - гибридный ген, терминирующую последовательность. Амплификат может содержать и иные элементы, а указанные в предыдущем предложении элементы – ключевые.
Амплификацию указанной последовательности проводили в объеме 50 мкл, в тонкостенных полипропиленовых пробирках объемом 650 мкл, содержащих 5 мкл 10-кратного буфера Taq (700 mM Трис-HCl, pH 8.6/ 25ºC, 166 mM (NH4)2SO4), 5 мкл MgCl2 (1.25 мМ), 1 мкл дНТФ, 31,5 мкл воды, 1 мкл прямого и 1 мкл обратного праймеров, 5 мкл ДНК-матрицы и 0,5 мкл полимеразы Taq (Fermentas, Литва).
Реакционную смесь прогревали 5 мин. при 95°С для денатурации ДНК. Для предотвращения испарения на реакционную смесь объемом 50 мкл наслаивали 30 мкл минерального масла Bayol F (Sigma, США). Реакцию амплификации проводили в термоциклере С1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Проводили 35 циклов: 95°С – 20 сек, 50-62°С (в зависимости от праймеров) – 20 сек., 72°С – 1 мин. Для достраивания образовавшихся цепей ДНК проводили дополнительный цикл: 5 мин при 72°С.
Результат ПЦР анализировали электрофорезом в агарозном геле. При положительном результате проводили препаративный электрофорез.
Амплифицированные фрагменты ДНК концентрировали и очищали при помощи препаративного электрофореза в 0,8-1,2% агарозном геле (Gibko BRL, США). Пробу смеси после проведения ПЦР смешивали с шестикратным буфером (0,25% бромфеноловый синий, 30% глицерин) (ThermoScientific, США) и наносили на гель, по 18 мкл в лунку. Электрофорез проводили в горизонтальном аппарате в буфере ТАЕ (40 мМТрис-ацетат, 2 мМ ЭДTA pH 8,0, 0,5 мкг/мл бромистого этидия) при напряжении 5-10 В/см. Результат разделения ДНК регистрировали в проходящем УФ-свете (302 нм) трансиллюминатора Macrovue (LKB, Швеция). Длину амплифицированного фрагмента определяли по логарифмической зависимости подвижности ДНК от длины фрагментов в маркере. В качестве маркеров использовали фирменную смесь фрагментов ДНК "GeneRuler 1000 bp DNA Ladder"(Fermentas, Литва). Участок агарозы, содержащий полосу ДНК необходимого размера, вырезали, и фрагмент ДНК очищали с помощью набора DNA&Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, Великобритания) в соответствии с инструкцией.
Современные методы очистки ДНК, в частности с использованием диоксида кремния, позволяют избавиться от всей примесей и получить пригодную для использования у животных и человека ДНК. Также возможно очищать амплификат и без использования препаративного электрофореза, с использованием иных методик – например, хроматографией, на колонке. Таким образом, готовый для использования препарат возможно получить уже через 2-3 часа.
Также получали и иные генетические конструкции по изобретению, в том числе содержащие и иные компоненты, вдобавок к указанным выше ключевым, а также иные варианты полинуклеотида по изобретению, чем представленного SEQ ID NO:2-5, с таких конструкций в клетках млекопитающих экспрессируется полинуклеотид по изобретению.
Выделенную генетическую конструкцию использовали у млекопитающих.
Пример 3. Демонстрация эффективности разработанных вакцин
3.1. Изготовление вакцинных кандидатов
Гибридный белок, охарактеризованный SEQ ID NO.:1 и гибридный белок, охарактеризованный SEQ ID NO.:6, получали с использованием методов генной инженерии, либо синтезировали химически.
Генетические конструкции получали как описано выше.
Гидроксид алюминия, в форме порошка, в количестве 37 мг добавляли к 5 мл раствора гибридного белка, охарактеризованного SEQ ID NO.:1 или 6, с концентрацией 400 мкг/мл, осуществлялось связывание с белком в течение 10 мин., после чего осуществляли дальнейшее разведение. В качестве жидкой среды использовали физиологический раствор. Всего каждое животное получало по 40 мкг гибридного белка и 100 мкг одной генетической конструкции, либо только 100 мкг одной генетической конструкции.
3.2. Субпопуляционная структура Т-лимфоцитов
Группы наблюдения (по 15 мышей в каждой группе):
1 - интактные,
2-21 вакцина на основе:
2 - плазмидной ДНК pcDNA3.1(+)seqidno4
3 - плазмидной ДНК pCMV-3Tag3-aseqidno4
4 – вирусного вектора pAAVK-EF1α-MCSseqidno4
5 - короткой линейной конструкции, полученной амплификацией с вектора pcDNA3.1(+)seqidno4
6 – аденоассоциированного вируса, на основе pAAV-MCSseqidno4
7 - плазмидной ДНК pVAXseqidno4 и гибридного белка SEQ ID NO.:1
8 - плазмидной ДНК pVAXseqidno4 и гибридного белка SEQ ID NO.:6
9 - короткой линейной конструкции, полученной амплификацией с вектора pCMV-3Tag3-aseqidno4, и гибридного белка SEQ ID NO.:1
10 – вирусного вектора pAAVK-EF1α-MCSseqidno4 и гибридного белка SEQ ID NO.:6
11 - вируса, на основе pAAV-MCSseqidno4, и гибридного белка SEQ ID NO.:1
12 - плазмидной ДНК pVAXseqidno2
13 - плазмидной ДНК pCMV-3Tag3-aseqidno3
14 - аденоассоциированного вируса, на основе pAAV-MCSseqidno5
15 - короткой линейной конструкции, полученной амплификацией с вектора pcDNA3.1(+)seqidno3
16 - плазмидной ДНК pCMV-3Tag3-aseqidno3 и гибридного белка SEQ ID NO.:1
17 - плазмидной ДНК pCMV-3Tag3-aseqidno5 и гибридного белка SEQ ID NO.:6
18 - короткой линейной конструкции, полученной амплификацией с вектора pcDNA3.1(+)seqidno2, и гибридного белка SEQ ID NO.:1
19 - аденоассоциированного вируса pAAV-MCSseqidno2 и гибридного белка SEQ ID NO.:6
20 - аденоассоциированного вируса, на основе pAAV-MCSseqidno4, и/н введение
21 - короткой линейной конструкции, полученной амплификацией с вектора pcDNA3.1(+)seqidno3, в/м введение + электропорация
Использовали дозировку 50 мкг ДНК (и в случаях комбинированной вакцины + 20 мкг гибридного белка) на мышь на одно введение, в объеме 100 мкл, разводили PBS.
Для иммунизации лабораторных животных использовали схему двукратного введения по дозе вакцинного кандидата внутримышечно, в квадрицепс левой конечности мыши, с интервалом в две недели. В группе 21 после введения осуществляли электропорацию. В группе 20 осуществляли интраназальное введение вируса.
Мыши выведены из опыта через 4 недели после последней иммунизации путем декапитации в соответствии с Методическими рекомендациями МЗ СССР (1985). В день окончания опыта отбирали селезенки в асептических условиях. Материал каждой группы объединяли – селезенки мышей одной группы помещали в питательную среду IMDM (Gibco) и гомогенизировали. Затем выделяли Т-лимфоциты.
Взвесь спленоцитов фильтровали через стерильную марлевую салфетку, переносили в 15 мл полипропиленовые пробирки ("Sarshtedt", Австрия) и ресуспендировали в 10 мл среды RPMI 1640 ("Биолот", Россия). Спленоциты осаждали центрифугированием на 1000 об/мин. (ускорение ~400 g) в течение 7 минут, супернатант сливали, и для удаления эритроцитов к осадку добавляли 1 мл FACS Lysing Solution (Becton Dickinson). Клетки ресуспендировали с помощью вортекса и инкубировали 2 минуты при комнатной температуре, затем в пробирку добавляли 10 мл среды RPMI 1640, и снова осаждали клетки центрифугированием при 1000 об/мин. в течение 5 минут. Осадок спленоцитов отмывали единожды в 10 мл среды RPMI 1640, и клетки переводили на среду RPMI 1640 и 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку ("Биолот"). Концентрацию клеток определяли в камере Горяева, затем спленоциты переносили в 96-луночный круглодонный планшет ("SARSTEDT") в количестве 106 клеток на лунку.
Полученные лимфоциты окрашивали для идентификации. Содержимое каждой лунки планшета переносили в 5 мл пробирку ("Coulter", США), фосфатным буфером (pH7,4) доводили до объема 4 мл, клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 5 минут, супернатант удаляли, и добавляли в пробирку 2,5 мкл антител, меченных флуоресцентным красителем, с последующей двукратной отмывкой холодным PBS буфером. Использовали моноклональные антитела (Caltag Laboratories, США), конъюгированные с красителями против клеточных антигенов: APC (Molecular Probes, США) для индикации живых клеток, Alexa Fluor 700 (Molecular Probes, США) для индикации лимфоцитов, FITC (ThermoFisher Scientific, США) для индикации CD4+ Т-лимфоцитов, PE-PC5.5 (Abcam, США) для индикации CD8+ Т-лимфоцитов, PE (Abcam, США) для индикации Т-лимфоцитов, продуцирующих интерферон гамма, TNFα. Исходная концентрация антител во всех экспериментах - 100 мкг/мл. Конъюгацию проводили по инструкции производителя красителя.
Далее проводили стимуляцию полученных лимфоцитов пептидом DYSVLYNSASFSTFKCY в концентрации 40 мкг/мкл, либо стафилококковым энтеротоксином В (SEB), данную пробу считали положительным контролем, либо вносили среду RPMI, и данную пробу считали отрицательным контролем. Пептид представляет собой фрагмент белка S нового коронавируса, использованного в гибридном белке, как закодированном в анализируемой ДНК, так и использованном в комбинированных вакцинных кандидатах. Полученные лимфоциты анализировали на проточном цитометре Gallios Navios (Beckman Coulter).
Анализировали уровни экспрессии молекул субпопуляции Т-клеток: CD3, CD4, CD8, а также интерферона гамма (IFNγ) и фактора некроза опухоли (TNFα). Гейт (окно) популяции устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. Сбор данных производили с использованием программы System II Software (Beckman Coulter). В каждом эксперименте проводили анализ не менее 50 тысяч клеток. Интерферон способствует усилению презентации через MHC 1 класса, что положительно сказывается на борьбе с патогеном.
При стимуляции пептидом во всех группах, кроме группы интактных животных, наблюдали увеличение относительного содержания CD4 и CD8 Т-лимфоцитов. В ряде групп увеличивалось количество CD4 Т-лимфоцитов, продуцирующих IFNγ, а также продуцирующих и IFNγ, и TNFα. При этом в большинстве групп наблюдали увеличение количества CD8 Т-лимфоцитов, продуцирующих оба цитокина, в нескольких группах – продуцирующих только IFNγ. Что интересно, количество CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, продуцирующих TNFα, увеличилось во всех группах.
Различия между группами наблюдали в соотношении CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, в том числе продуцирующих цитокины, и в количестве. В группах комбинированных вакцин, где использован также гибридный белок, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1 или SEQ ID NO.:6, количество CD4 Т-лимфоцитов больше превалировало над количеством и CD8 Т-лимфоцитов, чем в группах вакцин на основе ДНК. При этом в группах вакцин на основе ДНК количество CD8 Т-лимфоцитов, синтезирующих IFNγ, в общей массе после стимуляции было меньше, чем количество таких CD4 Т-лимфоцитов.
Наибольший прирост количества Т-лимфоцитов, синтезирующих IFNγ, выявлен при исследовании групп на основе плазмидных и линейных ДНК.
При стимуляции пептидом превалирование Т-хелперов увеличилось в группе интактных животных. В группах же животных, иммунизированных генетическими конструкциями, при стимуляции пептидом превалирование Т-хелперов становилось меньше, чем при отсутствии стимуляции.
Это может говорить о том, что после двукратной иммунизации разработанной генетической конструкцией, при экспозиции белков нового коронавируса Т-лимфоцитам в иммунизированном организме будет индуцирован профиль иммунного ответа, в котором цитотоксический ответ будет проявлен сильнее, чем при иммунизации совместно с белком, либо полноценной вирусной частицей коронавируса, либо ее белковыми фрагментами. Полученные в настоящем исследовании данные демонстрируют соответственно и терапевтический потенциал разработанных вакцин, в особенности на основе плазмидной ДНК и линейных конструкций.
Также полученные результаты демонстрируют, что Т-лимфоциты узнают ранее встречавшийся фрагмент коронавирусного белка в составе гибридного белка, синтезированного с введенной ДНК (и в части вариантов вакцин также имеющегося в вакцине). Такие результаты говорят об узнаваемости Т-лимфоцитами доменов гибридного белка, в том числе синтезируемого в организме с генетической конструкции, а также о специфичности формируемого иммунного ответа.
Электропорация не усиливала ответ, и, вероятно, целесообразно использовать меньшие дозы генетической конструкции при таком введении.
При оценке результатов также важно учитывать следующее.
CD4 – маркер, присутствующий и на Т-лимфоцитах, и на клетках моноцитарного ряда. CD8 – маркер, присутствующий и на Т-лимфоцитах, и на NKT-клетках. NKT-клетки несут и маркер CD3, они относятся к Т-клеткам, а также имеют спонтанные цитотоксические функции, похожие на таковые NK-клеток. NKT-клетки также выделяют цитокины, под действием которых В-лимфоциты могут трансформироваться в макрофаги.
Как известно, CD4+ Т-лимфоциты представлены Th1 и Th2. Во многих наблюдениях показана роль определенных факторов в детерминировании «переключения» иммунного ответа в сторону Th1 или Th2. Одними из факторов являются качество и доза антигена.
СD4+Т-лимфоциты, детерминированные по пути развития Th2, осуществляют взаимодействие с В-лимфоцитами, что вызывает снижение активности цитотоксических лимфоцитов. Th2 не вырабатывают интерферон гамма.
СD4+Т-лимфоциты, детерминированные по пути развития Th1, также осуществляют взаимодействие с В-лимфоцитами. Однако в данном случае не наблюдается ингибирование активности CD8+Т-лимфоцитов. В такой ситуации возможно одновременное увеличение цитотоксического и гуморального ответов на иммуноген. Th1 вырабатывают интерферон гамма.
Полученные результаты позволяют предположить, что разработанные варианты вакцины на основе ДНК, а также с добавлением гибридного белка, вызывают формирование в немалой степени выраженного цитотоксического иммунного ответа, и при встрече с фрагментом патогена позволяет такой ответ усилить, что делает крайне привлекательным их использование в качестве действующего вещества противокоронавирусной вакцины. Поскольку, особенно в условиях сложности тестирования на коронавирус, сложно оценить, заражен ли человек, то явным преимуществом предлагаемой вакцины является индукция такого профиля иммунного ответа.
Кроме того, нужно учитывать, что TNFα важен для устойчивости не только к инфекциям, но и к раку [Idriss HT, Naismith JH. TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structure-function relationship(s). Microsc Res Tech. 2000 Aug 1;50(3):184-95, а также множество иных статей], а также то, что количество CD4 и CD8 Т-лимфоцитов, продуцирующих TNFα, увеличивалось во всех группах вакцинированных животных. Для IFNγ также известно противоопухолевое действие [Шмелев В.А. Интерферон-гамма, фактор некроза опухолей, тимозин-альфа1-противоинфекционные и противоопухолевые цитокины и препараты. Медпрактика-М. Москва, 2008], и количество Т-клеток, его продуцирующих, также возрастало.
Таким образом, можно сделать вывод о противоопухолевой активности разработанных конструкций, опосредованной биологической функцией, главным образом, фактора некроза опухоли – TNFα, а также интерферона-гамма.
3.3. Индукция синтеза специфичных антител
Иммунизацию кроликов, возраст 9 месяцев, проводили подготовленными и описанными выше вакцинными кандидатами. Вводили генетическую конструкцию в количестве 250 мкг, концентрация 123 мкг/мл, в объеме 2 мл. Либо вводили комбинированный препарат, ДНК с гибридным белком, ДНК в количестве 100 мкг, гибридный белок в количестве 100 мкг, в объеме 2 мл, с полным адъювантом Фрейнда, адъювант – 1/10 от объема раствора для иммунизации.
Иммунизацию проводили двукратно, с интервалом в две недели, подкожно в бедро, через две недели после второй иммунизации осуществляли забор крови из ушной вены.
Осуществляли забор цельной крови у всех исследуемых животных в объеме 200-300 мкл из ретроорбитального синуса. Кровь инкубировали в термостате при 37ºС в течение 30 мин, после чего осуществляли центрифугирование в течение 10 мин при 2000 g. Отбирали сыворотки, не задевая тромба, в отдельную пробирку. Для избегания гемолиза сыворотки получали не позже, чем через 2 ч после отбора крови. Для хранения пробирки замораживали и оставлялись при температуре минус 20 ºС.
Измеряли титры антител в сыворотке крови исследованных животных. Титр антител сывороток иммунизированных животных определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты анализировали с использованием программы Microsoft Excel.
Выявлено, что все вакцинные кандидаты вызывали формирование высокого титра антител. Титр антител при введении вакцин, описанных под номерами 2-21 в примере 3.2., был от 1:16 000 до 1:64 000, что является достаточно высоким показателем. При введении вакцины на основе генетической конструкции электропорацией титры антител были выше в группе с линейной конструкцией.
Также продемонстрирована безопасность предлагаемых иммуногенов: животные всех групп выжили, в процессе испытаний побочные эффекты не наблюдали.
3.4. Исследование способности синтезируемого гибридного белка связываться с антителами к коронавирусу у людей
Клетки HEK293 культивировали при 37оС в СО2-инкубаторе (5% СО2, влажность 100%) в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, без антибиотиков, с L-глутамином. Трансфекцию методом кальциевой трансфекции проводили при 70% конфлюентности монослоя. Использовали 2 мкг плазмиды pVAXseqidno4/5 или линейной конструкции, амплифицированной с нее, кодирующей гибридный белок SEQ ID NO.:1, в объеме 5 мл культуральной среды. Через 24 часа после трансфекции заменяли среду на свежую и культивировали клетки в течение 5 суток.
Культуральную среду собирали и освобождали от мертвых и отслоившихся с подложки клеток центрифугированием при 1000g в течение 10 минут. Белки надосадка разделяли электрофоретически (20 мкл на дорожку) в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях, а затем переносили (полусухим электропереносом) на нитроцеллюлозную мембрану для последующего Вестерн-блот анализа. Мембрану нарезали на фрагменты, соответствующие дорожкам, и каждый фрагмент блокировали с помощью 3%-ного раствора обезжиренного молока, приготовленного на PBS с добавлением Tween-20, в течение 30 минут. Затем фрагменты мембраны независимо инкубировали при +4оС в течение 16 ч с сыворотками, полученными от здоровых людей и больных с разным уровнем анти-SARS-CoV-2 антител, подтвержденными коммерческими тестами.
После инкубации и отмывки от сывороток, мембраны инкубировали с коммерческими антителами против человеческих IgG, коньюгированными с пероксидазой хрена, и выявляли места связывания по хроматографической реакции пероксидазы с 1-хлор-нафтолом.
При инкубации мембран с сыворотками пациентов, позитивных на антитела против Covid-19, проявлялись две полосы разной степени интенсивности, соответствующие молекулярным весам мономера и димера рекомбинантного белка, такие же полосы идентифицированы при инкубации с сыворотками иммунизированных генетической конструкцией по изобретению (и + рекомбинантным белком) кроликов. Сыворотки от здоровых людей не открывали полосы на мембране, демонстрируя отсутствие неспецифического связывания с рекомбинантным белком.
Таким образом, продемонстрирована индукция специфичного иммунного ответа при использовании вакцин на основе заявляемых генетических конструкций - линейной конструкции, вирусного вектора, плазмидной ДНК, вируса, - при использовании полинуклеотидов по изобретению, в том числе и с фрагментом, кодирующим секреторную последовательность, и без него, а также на основе вакцин, дополнительно содержащих гибридный белок, и при режимах введения как стандартном, так и с использованием электропорации, и при интраназальном введении вируса.
Также выявлена способность разработанных вакцин к индукции Т-клеток, синтезирующих противовирусные и противоопухолевые цитокины.
Для индукции длительного ответа, связанного с реакцией герминативных центров, у человека интервал между первичной и вторичной иммунизациями целесообразно делать не менее, чем 1-2 месяца, оптимально – не менее 4-6 месяцев, для оптимального созревания аффинности В-клеток. При сокращении интервала бустерный ответ может быть меньше. Однако в текущей ситуации, учитывая полученные результаты опытов, можно проводить вторичную иммунизацию спустя 2-3 недели после первой иммунизации.
Проведены также иные исследования, в том числе с использованием иных количеств генетической конструкции (и гибридного белка), демонстрирующие эффективность разработанной вакцины, всех вариантов, для профилактики и терапии нового коронавируса. Исследование в терапевтической модели также успешно проведено. Все исследованные варианты вакцин индуцировали спад инфекции, легкое течение и скорое выздоровление, отсутствие побочных эффектов.
Также продемонстрирована безопасность предлагаемой вакцины: животные всех групп кандидатных вакцин выжили (и были выведены из эксперимента принудительно - мыши), в процессе испытаний побочные эффекты не наблюдали.
<110> Духовлинов И.В., Орлов А.И., Алексеев А.В.
<120> Вакцина для проф. и леч. коронавир. инфекции
<160> 6
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 482
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> домен
<222> с 1 по 69 аминокислотный остаток
<223> домен М, с 91 по 160 аминокислотный остаток белка М нового коронавируса
<220>
<221> домен
<222> с 76 по 345 аминокислотный остаток
<223> домен S, с 111 по 380 аминокислотный остаток белка S нового коронавируса
<220>
<221> домен
<222> с 352 по 411 аминокислотный остаток
<223> домен N, с 301 по 360 аминокислотный остаток белка N нового коронавируса
<220>
<221> домен
<222> с 418 по 482 аминокислотный остаток
<223> домен E, с 6 по 70 аминокислотный остаток белка E нового коронавируса
<400> 1
Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg
1 5 10 15
Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro
20 25 30
Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val
35 40 45
Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His
50 55 60
Leu Gly Arg Cys Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Ser Lys Thr Gln
65 70 75 80
Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys
85 90 95
Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys
100 105 110
Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala
115 120 125
Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu
130 135 140
Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys
145 150 155 160
Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn
165 170 175
Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val
180 185 190
Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala
195 200 205
Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr
210 215 220
Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe
225 230 235 240
Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys
245 250 255
Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr
260 265 270
Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr
275 280 285
Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly
290 295 300
Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg
305 310 315 320
Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser
325 330 335
Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Trp
340 345 350
Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met
355 360 365
Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr
370 375 380
Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln
385 390 395 400
Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser Val Leu Leu Phe
420 425 430
Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala Ile Leu Thr Ala
435 440 445
Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn Val Ser Leu Val
450 455 460
Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn Leu Asn Ser Ser
465 470 475 480
Arg Val
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 1446
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> полинуклеотид, опт. по кодон.сост. для млекопитающих, кодирующий гибридный белок
<400> 2
tggctgtcct acttcatcgc ctccttccgg ctgttcgccc ggacccggtc catgtggtcc 60
ttcaaccccg agaccaacat cctgctgaac gtgcccctgc acggcaccat cctgacccgg 120
cccctgctgg agtccgagct ggtgatcggc gccgtgatcc tgcggggcca cctgcggatc 180
gccggccacc acctgggccg gtgcgacggc ggcggcggcg gcggcgactc caagacccag 240
tccctgctga tcgtgaacaa cgccaccaac gtggtgatca aggtgtgcga gttccagttc 300
tgcaacgacc ccttcctggg cgtgtactac cacaagaaca acaagtcctg gatggagtcc 360
gagttccggg tgtactcctc cgccaacaac tgcaccttcg agtacgtgtc ccagcccttc 420
ctgatggacc tggagggcaa gcagggcaac ttcaagaacc tgcgggagtt cgtgttcaag 480
aacatcgacg gctacttcaa gatctactcc aagcacaccc ccatcaacct ggtgcgggac 540
ctgccccagg gcttctccgc cctggagccc ctggtggacc tgcccatcgg catcaacatc 600
acccggttcc agaccctgct ggccctgcac cggtcctacc tgacccccgg cgactcctcc 660
tccggctgga ccgccggcgc cgccgcctac tacgtgggct acctgcagcc ccggaccttc 720
ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgacgccg tggactgcgc cctggacccc 780
ctgtccgaga ccaagtgcac cctgaagtcc ttcaccgtgg agaagggcat ctaccagacc 840
tccaacttcc gggtgcagcc caccgagtcc atcgtgcggt tccccaacat caccaacctg 900
tgccccttcg gcgaggtgtt caacgccacc cggttcgcct ccgtgtacgc ctggaaccgg 960
aagcggatct ccaactgcgt ggccgactac tccgtgctgt acaactccgc ctccttctcc 1020
accttcaagt gctacggcgg cggcggcggc ggctggcccc agatcgccca gttcgccccc 1080
tccgcctccg ccttcttcgg catgtcccgg atcggcatgg aggtgacccc ctccggcacc 1140
tggctgacct acaccggcgc catcaagctg gacgacaagg accccaactt caaggaccag 1200
gtgatcctgc tgaacaagca catcgacgcc tacggcggcg gcggcggcgg ctccgaggag 1260
accggcaccc tgatcgtgaa ctccgtgctg ctgttcctgg ccttcgtggt gttcctgctg 1320
gtgaccctgg ccatcctgac cgccctgcgg ctgtgcgcct actgctgcaa catcgtgaac 1380
gtgtccctgg tgaagccctc cttctacgtg tactcccggg tgaagaacct gaactcctcc 1440
cgggtg 1446
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 1527
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> полинуклеотид на основе вир. послед-ей, кодир. гибр. белок, с добавл. секр. послед. ИГФ, послед. Козак и стоп-код.
<400> 3
gccgccacca tggggaagat ttctagtctg cctacccagc tgtttaagtg ttgcttttgt 60
gattttctga agttgatgtg gctcagctac ttcattgctt ctttcagact gtttgcgcgt 120
acgcgttcca tgtggtcatt caatccagaa actaacattc ttctcaacgt gccactccat 180
ggcactattc tgaccagacc gcttctagaa agtgaactcg taatcggagc tgtgatcctt 240
cgtggacatc ttcgtattgc tggacaccat ctaggacgct gtgacggagg aggaggagga 300
ggagattcga agacccagtc cctacttatt gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa 360
gtctgtgaat ttcaattttg taatgatcca tttttgggtg tttattacca caaaaacaac 420
aaaagttgga tggaaagtga gttcagagtt tattctagtg cgaataattg cacttttgaa 480
tatgtctctc agccttttct tatggacctt gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt 540
agggaatttg tgtttaagaa tattgatggt tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct 600
attaatttag tgcgtgatct ccctcagggt ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg 660
ccaataggta ttaacatcac taggtttcaa actttacttg ctttacatag aagttatttg 720
actcctggtg attcttcttc aggttggaca gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat 780
cttcaaccta ggacttttct attaaaatat aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta 840
gactgtgcac ttgaccctct ctcagaaaca aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa 900
aaaggaatct atcaaacttc taactttaga gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt 960
cctaatatta caaacttgtg cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct 1020
gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat 1080
aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggaggag gaggaggagg atggccgcaa 1140
attgcacaat ttgcccccag cgcttcagcg ttcttcggaa tgtcgcgcat tggcatggaa 1200
gtcacacctt cgggaacgtg gttgacctac acaggtgcca tcaaattgga tgacaaagat 1260
ccaaatttca aagatcaagt cattttgctg aataagcata ttgacgcata cggaggagga 1320
ggaggaggat cggaagagac aggtacgtta atagttaata gcgtacttct ttttcttgct 1380
ttcgtggtat tcttgctagt tacactagcc atccttactg cgcttcgatt gtgtgcgtac 1440
tgctgcaata ttgttaacgt gagtcttgta aaaccttctt tttacgttta ctctcgtgtt 1500
aaaaatctga attcttctag agtttga 1527
<210> SEQ ID NO: 4
<211> 1535
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> полинуклеотид, кодир. гибр. белок, опт. по код.сост., с добавл. секр. послед. ИГФ, послед. Козак, стоп-кодон. и сайтов рестр.
<400> 4
ggatccgccg ccaccatggg gaagatttct agtctgccta cccagctgtt taagtgttgc 60
ttttgtgatt ttctgaagtg gctgtcctat ttcatcgcct ctttccggct gtttgcccgg 120
acaagatcca tgtggtcttt taacccagag acaaatatcc tgctgaacgt gccactgcac 180
ggaaccatcc tgacacggcc tctgctggag agcgagctgg tcatcggagc cgtgatcctg 240
aggggacacc tgagaatcgc aggacaccac ctgggcagat gcgacggagg aggaggagga 300
ggcgatagca agacacagtc cctgctgatc gtgaacaatg ccaccaacgt ggtcatcaag 360
gtgtgcgagt tccagttttg taacgaccca tttctgggcg tgtactatca caagaacaat 420
aagtcttgga tggagagcga gttcagagtg tacagctccg ccaacaattg tacatttgag 480
tacgtgagcc agcccttcct gatggacctg gagggcaagc agggcaactt taagaatctg 540
agggagttcg tgtttaagaa tatcgatggc tacttcaaga tctattctaa gcacaccccc 600
atcaacctgg tgcgcgacct gcctcagggc tttagcgccc tggagcccct ggtggatctg 660
cctatcggca tcaacatcac caggttccag acactgctgg ccctgcaccg ctcttacctg 720
acacctggcg actctagctc cggatggacc gcaggagcag cagcatacta tgtgggctac 780
ctgcagccaa ggacctttct gctgaagtat aacgagaatg gcaccatcac agacgcagtg 840
gattgcgcac tggaccccct gagcgagaca aagtgtacac tgaagtcctt caccgtggag 900
aagggcatct atcagacatc taattttcgg gtgcagccta ccgagagcat cgtgagattc 960
ccaaacatca caaatctgtg cccctttggc gaggtgttca acgccaccag gttcgccagc 1020
gtgtacgcct ggaataggaa gcgcatctcc aactgcgtgg ccgactactc tgtgctgtat 1080
aattctgcca gcttctccac ctttaagtgt tatggaggag gaggaggagg atggcctcag 1140
atcgcccagt ttgccccatc tgccagcgcc ttctttggca tgtcccgcat cggcatggag 1200
gtgaccccat ctggcacatg gctgacctac acaggcgcca tcaagctgga cgataaggac 1260
cccaatttca aggatcaggt catcctgctg aacaagcaca tcgatgcata cggcggcggc 1320
ggaggaggca gcgaggagac aggcacactg atcgtgaact ccgtgctgct gttcctggcc 1380
tttgtggtgt tcctgctggt gaccctggcc atcctgacag ccctgagact gtgcgcctac 1440
tgctgtaaca tcgtgaacgt gagcctggtg aaaccatctt tctatgtcta ctctcgggtc 1500
aaaaatctga actcatctcg ggtctgataa ctcga 1535
<210> SEQ ID NO: 5
<211> 1542
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> полинуклеотид на основе вир. послед-ей, кодир. гибр. белок, с добавл. секр. послед. ГРЧ,послед. Козак и стоп-код.
<400> 5
gccgccacca tggccaccgg ctcccggacc tccctgctgc tggccttcgg cctgctgtgc 60
ctgccctggc tgcaggaggg ctccgccttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc 120
agactgtttg cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc 180
aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc 240
ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac 300
ggaggaggag gaggaggaga ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact 360
aatgttgtta ttaaagtctg tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat 420
taccacaaaa acaacaaaag ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat 480
aattgcactt ttgaatatgt ctctcagcct tttcttatgg accttgaagg aaaacagggt 540
aatttcaaaa atcttaggga atttgtgttt aagaatattg atggttattt taaaatatat 600
tctaagcaca cgcctattaa tttagtgcgt gatctccctc agggtttttc ggctttagaa 660
ccattggtag atttgccaat aggtattaac atcactaggt ttcaaacttt acttgcttta 720
catagaagtt atttgactcc tggtgattct tcttcaggtt ggacagctgg tgctgcagct 780
tattatgtgg gttatcttca acctaggact tttctattaa aatataatga aaatggaacc 840
attacagatg ctgtagactg tgcacttgac cctctctcag aaacaaagtg tacgttgaaa 900
tccttcactg tagaaaaagg aatctatcaa acttctaact ttagagtcca accaacagaa 960
tctattgtta gatttcctaa tattacaaac ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc 1020
accagatttg catctgttta tgcttggaac aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat 1080
tattctgtcc tatataattc cgcatcattt tccactttta agtgttatgg aggaggagga 1140
ggaggatggc cgcaaattgc acaatttgcc cccagcgctt cagcgttctt cggaatgtcg 1200
cgcattggca tggaagtcac accttcggga acgtggttga cctacacagg tgccatcaaa 1260
ttggatgaca aagatccaaa tttcaaagat caagtcattt tgctgaataa gcatattgac 1320
gcatacggag gaggaggagg aggatcggaa gagacaggta cgttaatagt taatagcgta 1380
cttctttttc ttgctttcgt ggtattcttg ctagttacac tagccatcct tactgcgctt 1440
cgattgtgtg cgtactgctg caatattgtt aacgtgagtc ttgtaaaacc ttctttttac 1500
gtttactctc gtgttaaaaa tctgaattct tctagagttt ga 1542
<210> SEQ ID NO: 6
<211> 424
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> домен
<222> с 1 по 121 аминокислотный остаток
<223> домен М, с 60 по 180 аминокислотный остаток белка М нового коронавируса
<220>
<221> домен
<222> с 128 по 202 аминокислотный остаток
<223> домен S, с 306 по 380 аминокислотный остаток белка S нового коронавируса
<220>
<221> домен
<222> с 209 по 353 аминокислотный остаток
<223> домен N, с 216 по 360 аминокислотный остаток белка N нового коронавируса
<220>
<221> домен
<222> с 360 по 424 аминокислотный остаток
<223> домен E, с 6 по 70 аминокислотный остаток белка E нового коронавируса
<400> 6
Val Thr Leu Ala Cys Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp
1 5 10 15
Ile Thr Gly Gly Ile Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met
20 25 30
Trp Leu Ser Tyr Phe Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg
35 40 45
Ser Met Trp Ser Phe Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro
50 55 60
Leu His Gly Thr Ile Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val
65 70 75 80
Ile Gly Ala Val Ile Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His
85 90 95
Leu Gly Arg Cys Asp Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala
100 105 110
Thr Ser Arg Thr Leu Ser Tyr Tyr Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Phe
115 120 125
Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro
130 135 140
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
145 150 155 160
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
165 170 175
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
180 185 190
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
195 200 205
Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu
210 215 220
Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr
225 230 235 240
Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr
245 250 255
Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro
260 265 270
Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly
275 280 285
Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala
290 295 300
Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser
305 310 315 320
Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp
325 330 335
Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala
340 345 350
Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val
355 360 365
Asn Ser Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr
370 375 380
Leu Ala Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile
385 390 395 400
Val Asn Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val
405 410 415
Lys Asn Leu Asn Ser Ser Arg Val
420

Claims (18)

  1. Гибридный белок, включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:1.
  2. Полинуклеотид, кодирующий гибридный белок по п.1.
  3. Полинуклеотид по п.2, охарактеризованный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO.:2
  4. Полинуклеотид по п.2, отличающийся тем, что также содержит фрагмент, кодирующий гетерологичную секреторную последовательность.
  5. Полинуклеотид по п.4, отличающийся тем, что гетерологичная секреторная последовательность выбрана из таковой TPA, EPO, ГРЧ или IGF.
  6. Полинуклеотид по п.5, охарактеризованный нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO.:3-5.
  7. Генетическая конструкция, включающая полинуклеотид по любому из пп.2-6 и элементы, позволяющие осуществить его экспрессию в клетках целевого организма.
  8. Генетическая конструкция по п.7, отличающаяся тем, что представлена рекомбинантным вектором для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих, содержащим прокариотические ориджин репликации и маркерный ген, эукариотические сильный промотор и лидерную последовательность мРНК, а также регуляторные последовательности для указанных элементов, от одного сайта для клонирования гена интереса и от одного сайта для посадки от одного праймера для анализа состава рекомбинантного вектора, полинуклеотид по любому из пп.2-6 и терминирующую последовательность.
  9. Генетическая конструкция по п.8, отличающаяся тем, что представлена плазмидной ДНК из pcDNA3.1(+), pVAX1, pCMV-3Tag3-a, в плазмидной ДНК клонирован полинуклеотид по любому из пп.2-6.
  10. Генетическая конструкция по п.7, отличающаяся тем, что представлена линейным фрагментом ДНК, содержащим промотор, лидерную последовательность мРНК, регуляторные последовательности для указанных элементов, полинуклеотид по любому из пп.2-6, терминирующую последовательность.
  11. Генетическая конструкция по п.7 или 8, отличающаяся тем, что представлена вектором на основе вируса, в векторе клонирован полинуклеотид по любому из пп.2-6.
  12. Генетическая конструкция по п.11, отличающаяся тем, что представлена аденоассоциированным вирусом, в котором клонирован полинуклеотид по любому из пп. 2-6.
  13. Прокариотическая рекомбинантная клетка, содержащая генетическую конструкцию по любому из пп.7-9,11,12, для получения такой генетической конструкции.
  14. Прокариотическая рекомбинантная клетка по п.13, представленная штаммом бактерий Escherichia coli DH5a, содержащим вектор из pcDNA3.1(+), pVAX1, pCMV-3Tag3-a, который содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO.:2-5.
  15. Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции у человека или животного, содержащая генетическую конструкцию по любому из пп. 7-12 в качестве активного агента, в эффективном количестве, а также физиологически приемлемый носитель и буферный раствор.
  16. Вакцина по п.15, отличающаяся тем, что дополнительно содержит гибридный белок по п.1 или включающий фрагменты белков M, S, N, Е коронавируса, соединенные гибкими мостиками, охарактеризованный последовательностью аминокислот SEQ ID NO.:6.
  17. Вакцина по п.15 или 16, где генетическая конструкция представлена вектором из pcDNA3.1(+), pVAX1, pCMV-3Tag3-a, который содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.:4.
  18. Способ получения вакцины для профилактики и лечения коронавирусной инфекции, заключающийся в том, что амплифицируют генетическую конструкцию по п.10 с использованием ПЦР, очищают и смешивают с физиологически приемлемым носителем и буферным раствором.
PCT/RU2021/050415 2020-12-03 2021-12-03 Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции WO2022119481A1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA202092658 2020-12-03
EA202092658 2020-12-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022119481A1 true WO2022119481A1 (ru) 2022-06-09

Family

ID=81854309

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2021/050415 WO2022119481A1 (ru) 2020-12-03 2021-12-03 Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2022119481A1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2720614C1 (ru) * 2020-04-23 2020-05-12 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
CN111533790A (zh) * 2020-05-09 2020-08-14 中山大学 基于马赛克策略的冠状病毒抗原的构建方法及其应用
CN111537721A (zh) * 2020-04-16 2020-08-14 杭州泰熙生物技术有限公司 SARS-COV-2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111537721A (zh) * 2020-04-16 2020-08-14 杭州泰熙生物技术有限公司 SARS-COV-2 Spike蛋白在新冠肺炎检测中的应用
RU2720614C1 (ru) * 2020-04-23 2020-05-12 федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
CN111533790A (zh) * 2020-05-09 2020-08-14 中山大学 基于马赛克策略的冠状病毒抗原的构建方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2747762C1 (ru) Вакцина для профилактики или лечения коронавирусной инфекции на основе генетической конструкции
CN110951756A (zh) 表达SARS-CoV-2病毒抗原肽的核酸序列及其应用
AU682344B2 (en) Recombinant poxvirus and streptococcal M protein vaccine
WO2021224946A1 (en) Coronavirus vaccine through nasal immunization
CN110845604B (zh) 非洲猪瘟预防和/或治疗性中和抗体、其制备方法与应用
WO1995027069A1 (en) Alphavirus rna as carrier for vaccines
Cai et al. Production of pharmaceutical-grade plasmids at high concentration and high supercoiled percentage
Svanholm et al. Amplification of T‐cell and antibody responses in DNA‐based immunization with HIV‐1 Nef by co‐injection with a GM‐CSF expression vector
CA2304125A1 (en) Attenuated vif dna immunization cassettes for genetic vaccines
JP2001515468A (ja) ポリヌクレオチドワクチン製剤
JPH05505616A (ja) 天然のコンホメーションを保持している精製ｇｐ１２０組成物
WO2017113050A1 (zh) 猪圆环病毒2型的外鞘蛋白质的制备方法及含该外鞘蛋白质的医药组合物
WO2023138333A1 (zh) 一种重组新型冠状病毒蛋白疫苗、其制备方法和应用
WO2022119481A1 (ru) Вакцина для профилактики и лечения коронавирусной инфекции
CN113476600B (zh) Avc-29作为疫苗佐剂的用途以及含有该佐剂的疫苗组合物
Vasileva et al. Immunogenicity of full-length and multi-epitope mRNA vaccines for M. Tuberculosis as demonstrated by the intensity of T-cell response: A comparative study in mice
CN116478296A (zh) 截短的呼吸道合胞病毒f蛋白及其用途
RU2615440C2 (ru) Гибридный белок, ДНК, генетическая конструкция, рекомбинантная клетка, вакцина на основе гибридного белка для профилактики и лечения туберкулеза (варианты)
JP2002520299A (ja) ポリヌクレオチドワクチン配合物
WO2002078732A1 (en) A noval vaccine formulation consisting of dna vaccine inactivated virus
WO2019059817A1 (en) VACCINE BASED ON FUSION PROTEIN AND PLASMIDIC DNA
CN116904489B (zh) 一种鸭坦布苏病毒核酸疫苗及应用
CN115043915B (zh) 一种增强新冠病毒变异株免疫原性的方法及其应用
JP2002513581A (ja) ネコｃｄ８０、ネコｃｔｌａ−４またはネコｃｄ８６をコードする外来ｄｎａを発現する組換えウイルスおよびその使用
TWI633114B (zh) 豬第二型環狀病毒之外鞘蛋白質的製備方法及含該外鞘蛋白質的醫藥組合物

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21901139

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21901139

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1