JP2002520299A

JP2002520299A - ポリヌクレオチドワクチン配合物

Info

Publication number: JP2002520299A
Application number: JP2000558850A
Authority: JP
Inventors: ボルキン，デイビツド・ビイー; エバンズ，ロバート・ケイ; ウルマー，ジエフリイ・ビイー; コウルフイールド，マイケル・ジエイ
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1998-07-09
Filing date: 1999-07-08
Publication date: 2002-07-09
Also published as: CA2336992A1; EP1094844A1; EP1094844A4; WO2000002591A1; AU4973199A

Abstract

(57)【要約】本発明は、核酸分子によってコードされる１つまたは複数の特定抗原の発現に相関するワクチン接種後の免疫応答の誘導が改善されるように生物学的に効果的な濃度で投与される、核酸分子および鉱物系アジュバントを含む新規なワクチン配合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願に対する相互参照本出願は、米国仮特許出願第６０／０３８，１９４号（１９９７年２月１４日
出願）の一部継続出願である米国特許出願第０９／０２３，８３４号（１９９８
年２月１３日出願）の一部継続出願である米国特許出願第０９／１１２，６５５
号（１９９８年７月９日出願）の一部継続出願である。

【０００２】連邦政府補助金による研究開発に関する言及なしマイクロフィッシュ添付物に対する参照なし

【０００３】発明の分野本発明は、核酸分子および実質的に核酸分子と結合しないアジュバントを含む
新規なワクチン配合物ならびにその使用方法に関する。

【０００４】発明の背景ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原または腫瘍抗原をコードする遺伝子を含
有するＤＮＡベクターは、筋肉内注射後、筋肉細胞および可能な他の細胞タイプ
においてそのようなそれぞれの抗原を発現することが明らかにされている。その
ようなネイクドＤＮＡベクターは、ポリヌクレオチドワクチン（ＰＮＶ）または
ＤＮＡワクチンとして知られるようになってきている。ネイクドＤＮＡを予防剤
として使用する技術が、脊椎動物へのワクチン接種のためにネイクドポリヌクレ
オチドが使用された国際特許公開ＷＯ９０／１１０９２（１９９０年１０月４日
）に報告された。

【０００５】例えば、体液性応答および細胞媒介応答の両方が、インフルエンザ抗原をコー
ドするＤＮＡプラスミドベクターがＰＮＶとして使用されたときに生じ、その後
の生きたウイルスの攻撃に対する同族的な保護および菌株にまたがる保護の両方
が得られることが明らかにされている。１回のワクチン接種によりこのようなタ
イプの両方の免疫応答が生成することにより、いくつかの既存のワクチン接種法
を上回る利点がもたらされる可能性がある。ＰＮＶを使用して抗体を産生させる
ことによって、抗体応答の継続期間を増大させることができ、そして臨床的に広
がっているウイルス株の正確な配列と、（組換えタンパク質に対する）天然タン
パク質の本来の翻訳後修飾およびコンフォメーションとをともに有する抗原を発
現させることができる。このような手段によりＣＴＬ応答を生成させることによ
って、菌株にまたがった保護という効果が、生の潜在的な病原性ベクターまたは
弱毒化ワクチンを使用することなく得られる。総説に関しては、Ｄｏｎｎｅｌｌ
ｙら、１９９７、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、６０：１６３〜１７２を参照の
こと。

【０００６】現在まで、ＰＮＶは、強力なウイルスプロモーターを有する細菌プラスミド、
目的とする抗原を発現するオープンリーディングフレームを含有するＤＮＡフラ
グメント、およびポリアデニル化／転写停止配列からなるＤＮＡプラスミドベク
ターの形態であった。このＤＮＡプラスミドベクターは、細菌宿主（大腸菌など
）において形質転換および増殖が行われ、次いで精製され、水溶液で宿主に注射
されている。このようなＰＮＶは、目的とする抗原が発現させられる宿主細胞（
筋肉細胞など）によって取り込まれる。プラスミドは、宿主細胞の複製および／
またはＰＮＶ構築物の宿主ゲノム組み込みを制限する真核生物の複製起点を有さ
ないように構築されている。

【０００７】ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：９５５１〜９５５５）は、リン酸カルシウムを用いて
共沈澱させ、マウスの肝細胞および脾臓細胞に腹腔内導入されたＤＮＡの発現を
示した。

【０００８】Ｗｏｌｆｆらによるその後の研究（１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４
６５〜１４６８）は、ＣａＰＯ_４を用いることなく（例えば、生理食塩水で）Ｄ
ＮＡ発現ベクターをマウスに筋肉内注射することによって、筋肉細胞によるＤＮ
Ａの取り込み、およびＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現がもたらさ
れることを示した。このプラスミドはエピソームに維持され、複製されなかった
（Ｗｏｌｆｆら、１９９２、ＨｕｍａｎＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１：３６
３〜３６９）。持続した発現が、ラット、魚および霊長類の骨格筋、ならびにラ
ットの心筋への筋肉内注射後に認められている。

【０００９】マウスにおけるＤＮＡ：カチオン性リポソーム複合体の静脈内注射は、クロー
ニングされたトランスジーンの全身的な発現をもたらすことがＺｈｕら（１９９
３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１：２０９〜２１１）により明らかにされた。

【００１０】ＰＮＶは、ポリヌクレオチドを金の微小粒子に吸着させて、高速度の衝撃注入
により細胞内に直接的に送達される粒子衝撃注入によって標的細胞に送達され得
ることが明らかにされている。この方法を使用して、免疫応答が、ヒト成長ホル
モン（Ｔａｎｇら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：１５２〜１５４）、イン
フルエンザＨＡ（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら、１９９３、ＤＮＡＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ．１２：７９１〜７９７；Ｆｙｎａｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１４７８〜１１４８２）、およびＨＩＶのｇｐ１２
０（Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎら、１９９３、ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：
７９１〜７９７）に対して誘導された。

【００１１】ＤＮＡワクチンの主張されている大きな利点の１つは、全細胞ワクチン、無細
胞ワクチンおよびサブユニットワクチンの場合に見られるようなアジュバントを
添加することなく、生理食塩水またはＰＢＳ溶液において目的とする構築物が直
接注入されることである。

【００１２】古典的な全細胞ワクチン、無細胞ワクチンおよびサブユニットワクチンの免疫
応答を増強するために歴史的に使用されているアジュバントには、リン酸アルミ
ニウム、水酸化アルミニウムおよびリン酸カルシウムなどの鉱物系化合物が含ま
れる。これらの特定の化合物は、ワクチンのアジュバントとして安全に使用され
ているという歴史のために当分野で知られており、現在、合衆国においてはヒト
における使用が承認されている唯一のアジュバントである。リン酸カルシウムは
、現在、欧州においてヒトにおける使用が承認されている。リン酸アルミニウム
アジュバントは、実際には非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムＡｌ（ＯＨ） _ｍ（ＰＯ_４）_ｎである。水酸化アルミニウムアジュバントは、実際にはオキシ水
酸化アルミニウム組成物ＡｌＯ（ＯＨ）である。リン酸アルミニウムは非晶質の
ヒドロキシリン酸アルミニウムゲルとして市販されている（これはＡｄｊｕ−Ｐ
ｈｏｓ（登録商標）として知られている）。これらのアジュバントは中性ｐＨで
異なる電荷を有している。ＡｌＯ（ＯＨ）は正の電荷を有し、リン酸アルミニウ
ムは負の電荷を有している（Ｇｕｐｔａら、１９９５年、第８章、２３１頁、ワ
クチン設計：サブユニットおよびアジュバントの検討、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅ
ｗｍａｎ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮｅｗＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ
））。ＡｌＰＯ_４をアジュバントとして含有するワクチンは、ＩｇＧ１抗体およ
びＩｇＥ抗体のレベルを増大させるのと同様に、ＩＬ−４およびＴ_Ｈ２型のヘル
パーＴ細胞応答を刺激することが知られている（ＶｏｇｅｌおよびＰｏｗｅｌｌ
、１９９５年、第７章、ワクチン設計：サブユニットおよびアジュバントの検討
、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮｅｗＹ
ｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ）、１４２頁）。水酸化アルミニウムは、オキシ水酸
化アルミニウムとして結晶形態で市販されている（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録
商標））が、ベーマイトとしても知られている。ＡｌＯ（ＯＨ）をアジュバント
として含むワクチンもまた、ＩｇＧ１抗体およびＩｇＥ抗体のレベルを増大させ
るのと同様に、ＩＬ−４、Ｔヘルパー−２サブセットを刺激することが知られて
いる（ＶｏｇｅｌおよびＰｏｗｅｌｌ、１９９５年、第７章、ワクチン設計：サ
ブユニットおよびアジュバントの検討、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐ
ｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮｅｗＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ）、１４６頁）
。

【００１３】市販ワクチンにおいて使用されている非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムゲ
ルおよびオキシ水酸化アルミニウムはともに調製が異なることもまた当分野では
知られている。Ｓｈｉｒｏｄｋａｒら（１９９０、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．７（１
２）：１２８２〜１２８８）は、９種の市販のアルミニウム含有アジュバントを
、Ｘ線回折、赤外分光法、電子顕微鏡およびエネルギー分散分光法で調べた。こ
の著者らは、リン酸アルミニウムの市販形態は非晶質のヒドロキシリン酸塩であ
り、水酸化アルミニウムの形態はオキシ水酸化アルミニウムすなわちベーマイト
であると再度言っている。

【００１４】効果的なアジュバント性は、目的とする抗原のアルミニウムアジュバントに対
する吸着に依存していることが知られている。研究により、静電力が効果的な吸
着に最も重要であることが示唆されている。Ｓｅｅｂｅｒら（１９９１、Ｖａｃ
ｃｉｎｅ、９：２０１〜２０３）は、静電力により、高い等電点を有する抗原が
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）に吸着し、これに対して、低い等電点を有する
抗原は（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標））に最も良く吸着し得るように重要
であることを示している。

【００１５】Ａｌ−Ｓｈａｋｈｓｈｉｒら（１９９４、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２（５）：４７
２〜４７４）は、予備生成されたアルミニウムアジュバントに対するタンパク質
の吸着がアジュバントの表面電荷特性に影響していることを明らかにしている。
従って、アジュバントとタンパク質の表面性状との両方の知識は、古典的な抗原
アジュバントワクチン配合物の性質を予測する際に重要である。

【００１６】上記に記載されているように、リン酸カルシウムは、従来のタンパク質ワクチ
ンに対するアジュバントとして問題なく使用されている別の鉱物塩である。リン
酸カルシウムをアジュバントとして使用することは知られており、Ｒｅｌｙｖｅ
ｌｄらにより最初に開示された（１９６４、Ｂｕｌｌ．ＷＨＯ、３０：３２１〜
３２５）。リン酸カルシウムアジュバントゲルの性状は、用いられるリン酸水素
二ナトリウムおよび塩化カルシウムの濃度ならびに混合速度によって制御されて
いる（すなわち、混合速度が小さいほど、カルシウム対リン酸の比が小さくなる
）。他のアジュバントの場合と同様に、目的とする抗原に対する結合は、増強さ
れた免疫原性に不可欠である。

【００１７】ネイクドＤＮＡベクター系ワクチンの使用における進歩にもかかわらず、目的
とする脊椎動物宿主における増強された免疫応答をもたらす薬学的配合物が明ら
かに求められている。本発明は、実質的にＤＮＡと結合することなく、脊椎動物
宿主にワクチン接種した後で免疫原性を増大させるアジュバントを含むＤＮＡワ
クチン配合物を開示することによってこの要求に取り組む。

【００１８】発明の要旨本発明は、核酸分子によってコードされる１つまたは複数の特定の抗原に対す
る免疫応答の効果的な誘導が促進されるように生物学的に効果的な濃度で提供さ
れる、核酸分子およびアジュバントを含む新規なワクチン配合物に関する。

【００１９】本発明の特定の実施形態は、アジュバントがＤＮＡ懸濁物中で負の電荷を有す
る鉱物系粒子を含むＤＮＡワクチン配合物に関する。このような粒子は、目的と
する核酸分子に対する結合を実質的に抑える十分な負電荷を有する。そのような
ＤＮＡ−アジュバント組成物は、ワクチン接種後の脊椎動物宿主の体内において
免疫応答を増大させ、かつＤＮＡワクチンのヌクレアーゼ消化を低下させること
ができる。

【００２０】本発明の好ましい実施形態は、リン酸アルミニウム系アジュバントの１つまた
は複数の形態から得られるＤＮＡ非結合性鉱物系アジュバントを含むＤＮＡワク
チン配合物に関する。

【００２１】本発明の特に好ましい実施形態は、リン酸アルミニウム系アジュバントが約０
．９のＰＯ_４／Ａｌモル比を有するＤＮＡワクチン配合物に関する。このような
アジュバントには、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）が含まれるが、これに限定
されない。

【００２２】本発明の別の実施形態は、リン酸カルシウム系アジュバントの１つまたは複数
の形態から得られるＤＮＡ非結合性鉱物系アジュバントを含むＤＮＡワクチン配
合物に関する。リン酸カルシウムとともに配合されたＤＮＡワクチンは、ＤＮＡ
が大きな割合で結合しない濃度でアジュバントが加えられたときに抗体応答を増
大させる。すなわち、リン酸カルシウムは、配合物が相当量の遊離ＤＮＡを含有
する場合におけるＤＮＡワクチンの効果的なアジュバントである。

【００２３】本発明の核酸分子には、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などの
デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）ならびにリボ核酸分子（ＲＮＡ）が含まれる。
本発明のワクチン配合物を含む核酸分子は、好ましくは、選択されたアジュバン
トに対する実質的な結合性を示さない。当然のことではあるが、当業者は、任意
のそのようなワクチン配合物において、本発明で使用される核酸分子の測定可能
ではあるが、生物学的に限定的な量が、選ばれたアジュバントに結合し得る可能
性が依然としてあることを承知している。

【００２４】ＤＮＡ構築物は、組換えウイルスベクターの形態で宿主に送達され得る（組換
えアデノウイルスベクター、組換えアデノ関連ベクター、組換えレトロウイルス
ベクター、組換えシンドビスウイルスベクターおよび組換えアルファウイルスベ
クターが含まれるが、これらに決して限定されない。これらはすべて当分野では
知られている）。ＤＮＡ構築物はまた、組換えＢＣＧまたはサルモネラなどの組
換え細菌ベクターによって送達され得る。あるいは、ＤＮＡは、ＤＮＡ−リポソ
ーム混合物として、当分野で知られているレシチンリポソームまたは他のリポソ
ームなどのリポソームと結合させることができる（例えば、国際特許公開ＷＯ９
３／２４６４０を参照のこと）。しかし、本発明の好ましいワクチン配合物は非
ウイルス性ＤＮＡベクターを含み、最も好ましくはＤＮＡプラスミド型ベクター
を含む。ＤＮＡ構築物の調製および精製に関する標準的な組換えＤＮＡ技術を使
用して、本明細書中に開示されている例示されたＰＮＶワクチン構築物において
用いられるＤＮＡポリヌクレオチド構築物が調製される。

【００２５】本発明のワクチン配合物を作製するために使用されるワクチンベクターには、
関連の方法を実施するために使用されるのと同様に、ＤＮＡプラスミドベクター
のＶ１、Ｖ１Ｊ、Ｖ１Ｊｎｅｏ、Ｖ１Ｊｎｓ、Ｖ１Ｊｐ、Ｖ１ＲおよびＶ１Ｊｎ
ｓ−ｔＰＡが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

【００２６】実施例の節には、赤血球凝集素（ＨＡ）、Ａ型インフルエンザの表面糖タンパ
ク質、Ａ型インフルエンザの核タンパク質、Ｂ型肝炎に由来するＨＢｓＡｇ表面
抗原、ならびにＨＩＶに由来するｇｐ１２０構築物およびｇａｇ構築物を発現す
るＤＮＡプラスミドベクターなどの様々なポリヌクレオチドワクチン構築物が例
示されている。従って、本明細書により、実施例の節において明示的に例示され
ていないさらなる構築物に関して本発明の核酸配合物を利用するために優れた指
針が当業者に提供されることは明らかである。従って、種々のＤＮＡ構築物を表
す数多くの他の構築物、送達様式、疾患および抗原の標的が、本発明のワクチン
配合物における使用のために考えられる。予防的処置または治療的処置のいずれ
かに受け入れられ得るウイルス性抗原投与または細菌性抗原投与の例には、イン
フルエンザ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩ
Ｖ）、結核、ヒト乳頭腫ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎が含まれ
るが、これらに限定されない。ガン、自己免疫異常および様々なアレルギーなど
の非感染性疾患に対する予防的処置、または最も考えられることには、それらの
治療的処置を提供することもまた本発明の範囲内である。さらに、本発明の配合
物が、狂犬病、ジステンパー、口蹄疫、炭疽病、ウシ単純ヘルペスおよびウシ結
核（これらに限定されない）を含む多数の獣医学的応用のいずれにも利用される
ことは当業者の範囲内である。

【００２７】本発明はまた、本発明のＤＮＡワクチン配合物を投与することによってヒトな
どの脊椎動物宿主における免疫応答を生成させる方法に関する。

【００２８】本明細書中で使用されている用語「ポリヌクレオチド」は、生きた脊椎動物細
胞に導入されたときに、細胞の装置に、そのようなポリヌクレオチドを含む遺伝
子によってコードされる翻訳産物を産生させ得るように不可欠な調節エレメント
を含有する核酸である。

【００２９】本明細書中で使用されている用語「結合を実質的に抑える」、「実質的に結合
しない」、または類似する表現は、少量の核酸がワクチン配合物内において実際
にアジュバントと結合し得るという概念を示す。しかし、そのような結合した物
質はいずれも、本発明のワクチン配合物の意図された生物学的結果に影響を及ぼ
さない。そのような結合に対する応答における生物学的活性の何らかの変化は、
脊椎動物宿主に投与される投薬量を少し上方に調節することによって容易に克服
され得る。

【００３０】本明細書中で使用されている用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが
結合するＤＮＡ鎖における認識部位をいう。プロモーターは、転写活性を開始し
て進めるためのＲＮＡポリメラーゼとの開始複合体を形成する。複合体は、「エ
ンハンサー」と呼ばれる活性化配列によって、あるいは「サイレンサー」と呼ば
れる阻害配列によって改変され得る。

【００３１】本明細書中で使用されている用語「リーダー」は、遺伝子とともに転写される
構造遺伝子の５’末端にあるＤＮＡ配列をいう。リーダーは、通常、プロ配列と
呼ばれることがあるＮ末端ペプチド伸長部を有するタンパク質をもたらす。細胞
外培地または膜のいずれかに分泌されることになるタンパク質の場合、一般には
疎水性であるこのシグナル配列によって、タンパク質は小胞体に導かれ、小胞体
からタンパク質は適切な目的地に放出される。

【００３２】本明細書中で使用されている用語「イントロン」は、遺伝子産物の一部をコー
ドしない遺伝子の１つまたは複数の部分をいう。イントロンは前駆体ＲＮＡから
除かれ、そのとき、得られるｍＲＮＡによって、個々のタンパク質が翻訳される
。

【００３３】用語「カセット」は、発現され得る核酸配列を含有する本発明の配列をいう。
カセットは、概念的にはカセットテープと類似している。各カセットは、それ自
身の配列を有する。従って、カセットを交換することによって、ベクターは異な
る配列を発現する。５’末端および３’末端における制限部位のために、カセッ
トは、挿入、除去または別のカセットとの置換を容易に行うことができる。

【００３４】用語「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」は、通常は遺伝子とともに転写
される構造遺伝子の３’末端にある配列をいう。この３’ＵＴＲ領域は、通常、
ポリＡ配列を含有する。３’ＵＴＲはＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻
訳される前に除かれる。

【００３５】用語「非コード領域」または「ＮＣＲ」は、構造遺伝子の３’ＵＴＲ領域に隣
接している領域をいう。ＮＣＲ領域は、転写停止シグナルを含有する。

【００３６】用語「ベクター」は、ＤＮＡフラグメントを宿主生物または宿主組織に導入す
ることができる特定の手段をいう。様々なタイプのベクターが存在し、それらに
は、ＤＮＡプラスミドベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、
レトロウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターなど）、ならびにバ
クテリオファージベクターおよびコスミドベクターを含む組換えベクターが含ま
れるが、これらに限定されない。

【００３７】用語「生物学的に効果的な量」は、十分なＰＮＶが注入されて適切なポリペプ
チドレベルが得られることを意味する。当業者は、このレベルは変動し得ること
を認識している。

【００３８】用語「遺伝子」は、独立したポリペプチドをコードする核酸セグメントをいう
。

【００３９】「薬学的」および「ワクチン」という用語は、免疫応答を誘導するために有用
な組成物を示すために交換可能的に使用される。

【００４０】図面の簡単な説明図１Ａおよび図１Ｂは、０．５μｇおよび１０μｇのＤＮＡＨＡ用量で１回
の注射を行った４週間後（図１Ａ）および１回の注射を行った８週間後（図１Ｂ
）のマウスにおける抗ＨＡ抗体力価の生成に対するリン酸アルミニウムの効果を
示す。

【００４１】図２Ａおよび図２Ｂは、０．５μｇ（図２Ａ）および１０μｇ（図２Ｂ）のＤ
ＮＡＨＡ用量でのリン酸アルミニウムの注射（●）および非注射（■）におけ
るＦＲ−９５０２ＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）の単回接種後のマ
ウスにおける抗ＨＡ抗体力価の経時変化測定を示す。

【００４２】図３Ａおよび図３Ｂは、ＦＲ−９５０２ＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／
９３）の単回接種後の抗ＨＡ抗体産生によって測定されるマウスにおける免疫応
答が様々なＤＮＡ用量により増強されることを示している。これらは、ＨＩ力価
（図３Ａ）またはＥＬＩＳＡ力価（図３Ｂ）によって測定された。

【００４３】図４は、５μｇおよび５０μｇのＤＮＡ用量でリン酸アルミニウムの存在下お
よび非存在下でＮＰプラスミドＤＮＡが接種された後のマウスにおける、１回の
注射を行った６週間後および２回の注射を行った３週間後の抗ＮＰ抗体応答の増
強を示す。

【００４４】図５Ａ（ＩＬ−２）、図５Ｂ（ＩＮＦ−γ）、図５Ｃ（ＩＬ−４）および図５
Ｄ（ＩＬ−１０）は、１回、２回または３回の注射により５ｍｃｇおよび５０ｍ
ｃｇのＤＮＡ用量でＮＰプラスミドＤＮＡが接種されたマウス（１回の注射を行
った６週間後および２回の注射を行った３週間後）の抗原再刺激脾臓細胞からの
それぞれのサイトカイン分泌に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【００４５】図６Ａ〜図６Ｄは、ＮＰプラスミドＤＮＡ接種をマウスに１回接種した後にお
ける細胞傷害性Ｔリンパ球応答に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。図６
Ａ（５μｇのＤＮＡ、注射した６週間後、インフルエンザ感染標的細胞）；図６
Ｂ（５μｇのＤＮＡ、注射した６週間後、ペプチドパルス処理標的細胞）；図６
Ｃ（５０μｇのＤＮＡ、注射した６週間後、インフルエンザ感染標的細胞）；お
よび図６Ｄ（５０μｇのＤＮＡ、注射した６週間後、ペプチドパルス処理標的細
胞）。

【００４６】図７は、Ｂ型肝炎表面抗原をコードするＤＮＡワクチン（Ｖ１Ｒ．Ｓ）のマウ
ス接種に対する抗体応答におけるリン酸アルミニウムの効果を示す。１μｇ用量
のＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標）を、免疫原性に関して４５μｇのリン
酸アルミニウム（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））の存在下または非存在下で
注射されたＶ１Ｒ．Ｓワクチンと比較した。マウスに、ＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨ
Ｂ（登録商標）（●）、アジュバントを含む１００μｇのＨＢＶＤＮＡ（◆）
、アジュバントを含まない１００μｇのＨＢＶＤＮＡ（■）、またはアジュバ
ントを含まない１μｇのＨＢｓＡｇ（タンパク質）（◇）を０日目および４２日
目に注射した。

【００４７】図８は、マウスに１回注射した６週間後のＨＢｓＡｇ抗体産生に対する、アジ
ュバントの存在下および非存在下で投薬されたＨＢＶＤＮＡワクチン（Ｖ１Ｒ
．Ｓ）の効果を示す。４５μｇのリン酸アルミニウム（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登
録商標））またはヒドロキシリン酸アルミニウムを、アジュバントの存在下およ
び非存在で１μｇ、１０μｇおよび１００μｇのＨＢＶＤＮＡとともに加えた
。

【００４８】図９は、図８に関して開示された投薬効果に関する４２日目における２回目の
用量の効果（６３日目での採血）を示す。

【００４９】図１０は、リン酸アルミニウムアジュバント（４５μｇ／１００μｌサンプル
）を含む配合物およびリン酸アルミニウムアジュバントを含まない配合物に関す
るＶ１Ｒ．Ｓを用いたＤＮＡワクチン接種に対して応答するＣＴＬ応答の誘導を
示す。

【００５０】図１１は、ＨＩＶのｅｎｖ／ｇａｇＤＮＡプラスミド構築物をマウスに接種
した後のｇｐ１２０抗体応答およびｇａｇ抗体応答に対するリン酸アルミニウム
またはリン酸化カルシウムの効果を示す。これらはＥＬＩＳＡアッセイによって
測定された。

【００５１】図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＦＲ−９５０２ＤＮＡを単回接種した後のアカゲ
サルにおける抗ＤＮＡ抗体力価の経時変化測定を示す。これらは、相乗平均ＨＩ
力価（図１２Ａ）または相乗平均ＥＬＩＳＡ（図１２Ｂ）によって測定された。

【００５２】図１３Ａおよび図１３Ｂは、ＢＡＬＢ／ｃマウスが１０μｇのＨＢＶＤＮＡ
ワクチン±リン酸アルミニウムで０日目および２１日目に免疫されたことを示す
。その８日後、脾臓細胞を採取して、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで、ＩＮＦ−γ（
図１３Ａ）またはＩＬ−２（図１３Ｂ）について個々に調べた。ＩＮＦ−γ応答
がＨＢｓペプチド［２８−３９］の５倍希釈物との一晩の培養によって誘発され
、ＩＬ−２応答がＨＢｓペプチド［１４６−１６０］の５倍希釈物との培養によ
って刺激された。これらの結果は、群あたりｎ＝５のマウスについて、平均値±
ＳＥのＳＦＣ／１０^６脾臓細胞として表されている。

【００５３】発明の詳細な説明本発明は、核酸分子によってコードされる１つまたは複数の特定の抗原に対す
る免疫応答の効果的な誘導が促進されるように生物学的に効果的な濃度で提供さ
れる、核酸分子およびアジュバントを含む新規なワクチン配合物に関する。

【００５４】本発明の特定の実施形態は、アジュバントがＤＮＡ懸濁物中で負の電荷を有す
る鉱物系粒子を含むＤＮＡワクチン配合物に関する。このような粒子は、目的と
する核酸分子に対する結合を実質的に抑える十分な負電荷を有する。そのような
ＤＮＡ−アジュバント組成物は、ワクチン接種後の脊椎動物宿主の体内において
免疫応答を増大させ、かつＤＮＡワクチンのヌクレアーゼ消化を低下させること
ができる。

【００５５】本発明の好ましい実施形態は、リン酸アルミニウム系アジュバントの１つまた
は複数の形態から得られるＤＮＡ非結合性鉱物系アジュバントを含むＤＮＡワク
チン配合物に関する。用語「リン酸アルミニウム」は、ＰＯ_４／Ａｌのモル比が
約０．３から約０．９まで変化する連続した一連のヒドロキシリン酸アルミニウ
ム組成物（ＨｅｍおよびＷｈｉｔｅ、１９９５、第９章、ワクチン設計：サブユ
ニットおよびアジュバントの検討、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅ
ｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮｅｗＹｏｒｋおよびＬｏｎｄｏｎ））の物質を表すた
めに当分野でしばしば使用されている。本明細書中に記されているように、本発
明のワクチン配合物において使用されるそのような様々なヒドロキシリン酸アル
ミニウムゲルを作製するための条件が数多く存在する。例えば、当業者は、Ｈｅ
ｍおよびＷｈｉｔｅ（上記、２４４頁〜２５５頁）が、得られるアジュバントの
表面電荷に影響を及ぼす特定の要因を記載していることに気付く。Ｈｅｍおよび
Ｗｈｉｔｅは、塩化アルミニウムなどのアルミニウムの親和性が弱いアルミニウ
ム塩を用いてリン酸アルミニウムアジュバントを作製することによって、硫酸ア
ニオンなどのアルミニウムに対する親和性がより大きなアルミニウム塩を使用す
る場合よりも大きなリン酸含有量を有するアジュバントが得られることを述べて
いる。混合速度、アジュバントを沈澱させるための速度および条件、加熱、なら
びに当業者に知られている他の物理的操作を制御することによって最終的なアジ
ュバント組成を変化させることも可能である。すなわち、アジュバントが正味の
負電荷を有し、かつ本発明のワクチン配合物中においてＤＮＡに実質的に結合し
ないことが予想されるようなＰＯ_４／Ａｌモル比を有するリン酸アルミニウム系
アジュバントを作製するための数多くの方法が知られており、利用することがで
きる。

【００５６】特に有利なリン酸アルミニウムアジュバントは、決して限定的なものではない
が、ＰＯ_４／Ａｌのモル比が約０．９である実質的に負の電荷を有するリン酸ア
ルミニウム系アジュバントである。例えば、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）は
、本発明のＤＮＡワクチン配合物において使用される特に好ましいアジュバント
を表す非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムゲルの市販形態である。この好ま
しさは、非晶質のヒドロキシリン酸アルミニウムであるＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登
録商標）が、本発明の配合物中においてＤＮＡと実質的に結合しないミクロンサ
イズの負荷電粒子から構成されているという事実に依存する。

【００５７】当業者は、アジュバントおよび古典的抗原に対するその結合能の性質が、アジ
ュバントが最初に沈澱させられる条件、沈澱条件、ｐＨ、温度およびイオン強度
によって達成されることことを承知している。当業者は、このような同じ種類の
成分操作を、様々なリン酸アルミニウム系アジュバントの表面電荷を変化させて
、本発明のＤＮＡワクチン配合物における使用に役立つアジュバントの表面電荷
を得るために利用できる。従って、例えば、ＰＯ_４／Ａｌのモル比が０．３によ
り近いヒドロキシリン酸アルミニウムを採用し、そして操作されたアジュバント
がＤＮＡ結合を実質的に抑える負の表面電荷を有するようにワクチン配合の条件
を変化させることは当業者の範囲内である。また、水酸化アルミニウムアジュバ
ント（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）など）を、アジュバントの沈澱条件、
配合物の緩衝剤条件、ｐＨ、温度およびイオン強度（これらに限定されない）を
含む条件を操作することによって操作することも本発明の範囲内である。そのよ
うなアジュバント操作の目的は、アジュバント−ＤＮＡの結合が実質的に妨げら
れるように負荷電の表面を有するアジュバントを作製することである。従って、
当業者によって、本明細書を検討した後において、アジュバント−ＤＮＡの実質
的な結合を阻害する負荷電アジュバントが、周知の容易に利用できる多数の手順
のいずれかにより作製され得ることが理解される。

【００５８】さらに、当業者は、リン酸アルミニウム系アジュバントの非商業的供給源が、
本発明のＤＮＡワクチン配合物における使用のために形成され得ることを承知し
ている。そのような方法には、塩化アルミニウムおよびリン酸三ナトリウムを混
合して、リン酸アルミニウムを作製することが含まれるが、これに決して限定さ
れない。再度ではあるが、当業者は、アジュバントおよび古典的抗原に対するそ
の結合能の性質は、アジュバントの沈澱条件、配合物の緩衝剤条件、ｐＨ、温度
およびイオン強度（これらに限定されない）を含む多数の要因によって左右され
ることを承知している。当業者は、このような同じ種類の成分操作を、様々な非
商業的形態のヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントの表面電荷を変化させ
て、本発明のＤＮＡワクチン配合物における使用に役立つアジュバントの表面電
荷を得るために利用することができる。より詳細には、このような負荷電アジュ
バントは、アジュバント−ＤＮＡの実質的な結合を阻害し、脊椎動物宿主にワク
チン接種したときに予想される免疫応答を促進する。本発明はまた、リン酸カル
シウム系アジュバントを含むＤＮＡワクチン配合物に関する。リン酸カルシウム
アジュバントゲルは、リン酸水素二ナトリウムおよび塩化カルシウムを混合する
という既知の方法で作製することができる。リン酸アルミニウム系アジュバント
に関して本明細書中に記されているように、本発明のワクチン配合物に好ましい
リン酸カルシウムアジュバントは、目的とするＤＮＡ構築物に対する結合を実質
的に抑えるように十分な負の表面電荷を有するアジュバントである。相当量の遊
離（すなわち、未結合）ＤＮＡが配合物中に依然として存在する限り、リン酸カ
ルシウムはＤＮＡワクチンの好適なアジュバントであることを示すデータが実施
例の第１０節に示されている。生物学的に活性な量の遊離ＤＮＡを配合物中にと
どめたまま、アジュバント効果を最大にするように最適なアジュバントおよびＤ
ＮＡの用量または用量範囲を決めることは当業者の範囲内である。本発明のＤＮ
Ａワクチン配合物は、約１ｍｃｇ〜約２０，０００ｍｃｇのアルミニウムまたは
カルシウムを（リン酸アルミニウム、リン酸カルシウムなどのアジュバント化形
態で）含有する。好ましくは約１０ｍｃｇ〜約１０，０００ｍｃｇであり、最も
好ましくは約２５ｍｃｇ〜約２，５００ｍｃｇである。特定の配合物には、この
範囲内の特定量（例えば、約２０ｍｃｇ、４５ｍｃｇ、９０ｍｃｇ、１００ｍｃ
ｇ、２００ｍｃｇ、４５０ｍｃｇ、７５０ｍｃｇ、９００ｍｃｇ、１，５００ｍ
ｃｇ、２，５００ｍｃｇ、３，５００ｍｃｇ、１０，０００ｍｃｇなど）が必要
とされ得るが、ここに列記されていない他の量を使用することができる。実施例
においてマウスに関して報告されているデータの大部分はＤＮＡワクチン配合物
の１００μｌ注射が用いられていることは注目される。従って、４５０ｍｃｇ／
ｍＬのアルミニウムを含む配合物は、４５ｍｃｇ用量のアルミニウムが投与され
、アジュバント用量として、４５０ｍｃｇ／ｍＬのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商
標）などと本明細書中では示されている。用語「ｍｃｇ」は、マイクログラムの
測定単位を表すために本明細書中では「μｇ」と交換可能に使用されていること
には留意しなければならない。

【００５９】本発明の核酸分子は、ゲノムＤＮＡおよび相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）などのデ
オキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）ならびにリボ核酸分子（ＲＮＡ）を含むことがで
きる。本発明のＤＮＡは、鉱物系アジュバントと会合するが、好ましくは結合し
ない。

【００６０】ＤＮＡ構築物は、組換えウイルスベクターの形態で宿主に送達され得る（その
ようなベクターには、組換えアデノウイルスベクター、組換えアデノ関連ベクタ
ー、組換えレトロウイルスベクター、組換えシンドビスウイルスベクターおよび
組換えアルファウイルスベクターが含まれるか、これらに決して限定されない。
これらはすべて当分野では既知である）。ＤＮＡ構築物はまた、組換えＢＣＧま
たはサルモネラなどの組換え細菌ベクターによって送達され得る。あるいは、Ｄ
ＮＡは、ＤＮＡ−脂質の複合体を得るために脂質と結合させることができ、ある
いはＤＮＡ−リポソームの混合物を得るために、当分野で既知のレシチンリポソ
ームまたは他のリポソームなどのリポソームの形態で脂質と結合させることがで
きる（例えば、国際特許公開ＷＯ９３／２４６４０を参照のこと）。

【００６１】しかし、本発明の好ましいワクチン配合物は非ウイルス性ＤＮＡベクターを含
み、最も好ましくはＤＮＡプラスミド型ベクターを含む。ＤＮＡ構築物の調製お
よび精製に関する標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、本明細書中に開示され
ている例示されたＰＮＶワクチン構築物において用いられるＤＮＡポリヌクレオ
チド構築物が調製される。目的とする遺伝子は、ポリヌクレオチドワクチン接種
のために最適化されている発現ベクターに連結される。外因性ＤＮＡは、転写プ
ロモーター、免疫原性エピトープ、転写ターミネーター、細菌の複製起点および
抗生物質耐性遺伝子などの必須なエレメントを残して、少なくとも部分的に除去
される。

【００６２】ワクチン接種体に導入される発現可能なＤＮＡの量は、ＤＮＡ構築物において
使用されている転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強さ、発現した遺伝
子産物の免疫原性に依存する。一般には、約１μｇから約５μｇ以上であり、好
ましくは約１０μｇ〜２ｍｇの免疫学的または予防的に効果的な用量が筋肉組織
内に直接投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を介する圧入、他の投与様式（
腹腔内送達、静脈内送達、吸入送達および経口的な送達など）もまた包含される
。追加免疫によるワクチン接種が行われ得ることもまた包含される。この場合、
ＤＮＡは、本発明のＤＮＡワクチンを配合するために使用されている鉱物系アジ
ュバントの正味の表面電荷に対してｐＨ、緩衝剤条件およびイオン強度が有し得
る作用を考慮して、無菌の生理食塩水または無菌の緩衝化生理食塩水（これらに
限定されない）などの生理学的に受容可能な溶液であることが望ましい。

【００６３】本発明を実施する際に使用されるワクチンベクターには、ＤＮＡプラスミドベ
クターのＶ１、Ｖ１Ｊ、Ｖ１Ｒ、Ｖ１Ｊｐ、Ｖ１Ｊｎｅｏ、Ｖ１ＪｎｓおよびＶ
１Ｊｎｓ−ｔＰＡが含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

【００６４】ワクチンベクターＶ１はｐＣＭＶＩＥ−ＡＫＩ−ＤＨＦＲ（Ｗｈａｎｇら、１
９８７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１７９６）から構築された。ＡＫＩ遺伝子およ
びＤＨＦＲ遺伝子が、ベクターをＥｃｏＲＩで切断して自己連結することによっ
て除かれた。このベクターはイントロンＡをＣＭＶプロモーター内に含有してい
ないので、イントロンＡが、内部のＳａｃＩ部位［１８５５位、Ｃｈａｐｍａｎ
ら、１９９１、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：３９７９における番号付け
に従う］を欠失させたＰＣＲフラグメントとして加えられた。ＰＣＲ反応のため
に使用されたテンプレートはｐＣＭＶｉｎｔＡ−Ｌｕｘであった。これは、ｈＣ
ＭＶ−ＩＥ１エンハンサー／プロモーターおよびイントロンＡを含むｐＣＭＶ６
ａ１２０（Ｃｈａｐｍａｎら（同上）を参照のこと）から得られるＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＮｈｅＩのフラグメントをｐＢＬ３のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｂａ
Ｉ部位に連結してｐＣＭＶＩｎｔＢＬを作製することによって作製された。ＲＳ
Ｖ−Ｌｕｘ（ｄｅＷｅｔら、１９８７、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７：７
２５）から得られる１８８１塩基対のルシフェラーゼ遺伝子フラグメント（Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ−ＳｍａＩのクレノウ充填処理）を、クレノウ充填処理してホスファ
ターゼ処理したｐＣＭＶＩｎｔＢＬのＳａｌＩ部位に連結した。イントロンＡを
挟むプライマーは、５’プライマーが、５’−ＣＴＡＴＡＴＡＡＧＣＡＧＡＧＣ
ＴＣＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号１）であり、３’プライマーが、５’−ＧＴ
ＡＧＣＡＡＡＧＡＴＣＴＡＡＧＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡＧ−３’（配列番号
２）である。ＳａｃＩ部位を除くために使用されたプライマーは、センスプライ
マーが５’−ＧＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＴＴＧ
ＧＧＣＴＣＧＣＡＣ−３’（配列番号３）であり、アンチセンスプライマーが５
’−ＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣＡＡＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＧＡＣＡ
ＣＡＴＡＣ−３’（配列番号４）である。ＰＣＲフラグメントをＳａｃＩおよび
ＢｇｌＩＩで切断し、同じ酵素で切断されたベクターに挿入した。

【００６５】Ｖ１Ｊ発現ベクターは、より規定された状況内にプロモーターおよび転写停止
エレメントを設置し、よりコンパクトなベクターを作製し、かつプラスミドの精
製収率を改善するために、ベクターＶ１からプロモーターおよび転写停止エレメ
ントを除くために作製され得る。Ｖ１Ｊは、Ｖ１ベクターおよび市販のプラスミ
ドであるｐＵＣ１８ベクターに由来する。Ｖ１をＳｓｐＩおよびＥｃｏＲＩの制
限酵素で消化して、２つのＤＮＡフラグメントを作製した。異種遺伝子の発現を
制御するＣＭＶｉｎｔＡプロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）転写停
止エレメントを含有するこれらの小さい方のフラグメントをアガロース電気泳動
ゲルから精製した。次いで、このＤＮＡフラグメントの両端を、別の「平滑末端
化」ＤＮＡフラグメントとの連結を容易にするために、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
酵素を使用して「平滑化」した。ｐＵＣ１８を発現ベクターの「骨格」とするた
めに選んだ。ｐＵＣ１８は、高収量のプラスミドを生成することが知られており
、配列および機能がよく特徴づけられており、かつサイズが小さい。ｌａｃオペ
ロン全体を、ＨａｅＩＩ制限酵素による部分消化によってこのベクターから除い
た。残ったプラスミドをアガロース電気泳動ゲルから精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑末端化し、仔ウシ小腸アルカリホスファターゼで処理して、上記の
ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨエレメントと連結した。ｐＵＣ骨格内においてプロモー
ターエレメントの２つの可能な向きのいずれかを示すプラスミドが得られた。こ
れらのプラスミドの一方は、はるかにより大きなＤＮＡ収量を大腸菌においても
たらし、Ｖ１Ｊと名付けられた。このベクターの構造は、接合領域の配列分析に
よって確認され、その後、Ｖ１と比較したときに、異種遺伝子の匹敵し得るか、
あるいはより大きな発現をもたらすことが明らかにされた。

【００６６】Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクターの構築には、アンピシリンは大規模な発酵において
望ましくない場合があるために、Ｖ１Ｊを有する細菌の抗生物質による選択のた
めに使用されるａｍｐ^ｒ遺伝子を除去することが必要である。ａｍｐ^ｒ遺伝子は
、Ｖ１ＪのｐＵＣ骨格から、ＳｓｐＩおよびＥａｍ１１０５Ｉの制限酵素で消化
することによって除かれた。残ったプラスミドをアガロースゲル電気泳動により
精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いで仔ウシ小腸アルカリホ
スファターゼで処理した。トランスポゾン９０３に由来し、ｐＵＣ４Ｋプラスミ
ド内に含有される市販のｋａｎ^ｒ遺伝子を、ＰｓｔＩ制限酵素を使用して切り出
し、アガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端
化した。このフラグメントをＶ１Ｊ骨格と連結して、いずれかの方向でｋａｎ^ｒ遺伝子を含み、Ｖ１Ｊｎｅｏ＃１およびＶ１Ｊｎｅｏ＃３と名付けられたプラス
ミドが得られた。これらのプラスミドのそれぞれは、制限酵素消化分析、接合部
領域のＤＮＡ配列決定によって確認され、Ｖ１Ｊと類似するほどの量のプラスミ
ドを産生することが明らかにされた。異種遺伝子産物の発現もまた、これらのＶ
１Ｊｎｅｏベクターの場合、Ｖ１Ｊと匹敵し得るほどであった。下記においてＶ
１Ｊｎｅｏとして示されるＶ１Ｊｎｅｏ＃３を選択した。これは、発現構築物と
して、Ｖ１Ｊ内のａｍｐ^ｒ遺伝子と同じ方向でｋａｎ^ｒ遺伝子を含有する。

【００６７】発現ベクターＶ１Ｊｎｓは、組み込み研究を容易にするためにＳｆｉＩ部位を
Ｖ１Ｊｎｅｏに加えることによって作製された。市販の１３塩基対のＳｆｉｉリ
ンカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）をベクターのＢＧＨ配列内
のＫｐｎＩ部位に加えた。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで線状化し、ゲル精製し、Ｔ
４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化して、平滑末端のＳｆｉＩリンカーと連結した。
クローン単離体を制限マッピングによって選び、リンカー部を挟んだ配列決定に
よって確認した。新しいベクターはＶ１Ｊｎｓと名付けられた。（ＳｆｉＩを有
する）Ｖ１Ｊｎｓにおける異種遺伝子の発現は、（ＫｐｎＩを有する）Ｖ１Ｊｎ
ｅｏ内の同じ遺伝子の発現と匹敵し得るほどであった。

【００６８】ＤＮＡワクチンベクターＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡは、異種のリーダーペプチド配列
を分泌型タンパク質および／または膜タンパク質に提供するために構築された。
プラスミドＶ１Ｊｎｓを、ヒト組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ
）のリーダーを含むように改変した。２つの合成された相補的なオリゴマーをア
ニーリングし、次いで、ＢｇｌＩＩ消化されたＶ１Ｊｎに連結した。センスオリ
ゴマーおよびアンチセンスオリゴマーは、５’−ＧＡＴＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＧ
ＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＧＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴ
ＧＴＧＧＡＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡＧＣＧＡ−３’（配列番号
５）、および５’−ＧＡＴＣＴＣＧＣＴＧＧＧＣＧＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＴＧＣ
ＴＣＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＣＴＣＴＴ
ＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号６）であった。センスオリゴ
マーにおいて、Ｋｏｚａｋ配列には下線が付されている。これらのオリゴマーは
、ＢｇｌＩＩ切断配列に対する連結に適合する突出塩基を有する。連結後、上流
側のＢｇｌＩＩ部位を破壊し、下流側のＢｇｌＩＩは連結のために残される。接
合部位および全ｔＰＡリーダー配列の両方をＤＮＡ配列決定によって確認した。
さらに、コンセンサスが最適化されたベクターＶ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位を有
するＶ１Ｊｎｅｏ）と一致させるために、ＳｆｉＩ制限部位を、Ｖ１Ｊｎ−ｔＰ
ＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫｐｎＩ部位に、ＫｐｎＩ部位をＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで平滑化し、次いでＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８、Ｎｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ）と連結することによって設置した。この
改変は制限消化およびアガロースゲル電気泳動によって確認された。

【００６９】さらに別のＤＮＡワクチンベクターであるＶ１Ｒを、本発明を実施するために
利用することができる。このＤＮＡワクチンベクターはＶ１Ｊｎｓの誘導体であ
る。このベクターは、Ｖ１ＪおよびＶ１Ｊｎｓによりもたらされる全体的な最適
化された異種遺伝子の発現特性および大きなプラスミド収量を依然として保持す
る、不必要なＤＮＡ配列を含まない最小サイズのワクチンベクターを得るために
有用である。（１）大腸菌の複製起点を含むｐＵＣ骨格内のいくつかの領域は、
細菌からのプラスミド収量に影響を及ぼすことなく除去できること；および（２
）カナマイシンオープンリーディングフレームに続くｋａｎ^ｒ遺伝子の３’領域
は、細菌ターミネーターがその位置に挿入される場合には除去できること；およ
び（３）（ＢＧＨエレメント内の元のＫｐｎＩ制限酵素部位に続く）ＢＧＨター
ミネーターの３’側半分の約３００ｂｐは、その調節機能に影響を及ぼすことな
く除去できることが明らかにされた。Ｖ１Ｒは、Ｖ１Ｊｎｓから、それぞれが、
ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＧＨターミネーター、複製起点およびカナマイ
シン耐性エレメントを示す３つのＤＮＡセグメントを合成するＰＣＲを使用する
ことによって構築された。各セグメントに関して特徴的な制限酵素を、ＰＣＲオ
リゴマーを使用する各セグメント端に加えた：ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨについて
はＳｓｐＩおよびＸｈｏＩ；ｋａｎ^ｒ遺伝子についてはＥｃｏＲＶおよびＢａｍ
ＨＩ；ｏｒｉ^ｒについてはＢｃｌＩおよびＳａｌＩ。これらの酵素部位は、それ
らがＰＣＲ由来ＤＮＡセグメントのそれぞれの方向性連結を可能にし、その結果
、それぞれの部位が喪失するために選ばれた：ＥｃｏＲＶおよびＳｓｐＩは、連
結に適合し得る平滑末端化ＤＮＡをもたらし、ＢａｍＨＩおよびＢｃｌＩは、Ｓ
ａｌＩおよびＸｈｏＩと同様な相補的な突出端をもたらす。ＰＣＲによってこれ
らのセグメントを得た後、各セグメントを上記の適切な制限酵素で消化し、次い
で、３つのＤＮＡセグメントのすべてを含有する１つの反応混合物中で一緒に連
結した。ｏｒｉ^ｒの５’末端は、この領域において通常見出されているＴ２ρ非
依存性ターミネーター配列を含み、その結果、それにより停止情報がカナマイシ
ン耐性遺伝子に提供され得るように設計された。連結産物を制限酵素消化（＞８
の酵素）ならびに連結接合物のＤＮＡ配列決定によって確認した。ＤＮＡプラス
ミド収量およびＶ１Ｒ内においてウイルス遺伝子を使用した異種発現は、Ｖ１Ｊ
ｎｓと類似しているようである。達成されたベクターサイズの正味の減少は１３
４６ｂｐであった（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３．５２ｋｂ）。Ｖ１
Ｒを合成するために使用されたＰＣＲオリゴマーを下記に示す（制限酵素部位に
は下線が付され、制限酵素部位が配列後の括弧において識別される）：（１）５
’−ＧＧＴＡＣＡＡＡＴＡＴＴＧＧＣＴＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＧＣＡＴＡＣＧ−
３’（配列番号７）［ＳｓｐＩ］；（２）５’−ＣＣＡＣＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡ
ＡＣＣＧＧＧＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号８）［Ｘｈｏ
Ｉ］（ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＧＨセグメントについて）；（３）５’−ＧＧＴＡＣ
ＡＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＡＡＡＡＴＣ−３’
（配列番号９）［ＥｃｏＲＶ］；（４）５’−ＣＡＣＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＡ
ＴＧＣＴＣＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＡＣＣ−３’（配列番号１０）［Ｂａｍ
ＨＩ］（カナマイシン耐性遺伝子セグメントについて）；（５）５’−ＧＧＴＡ
ＣＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＡＧＡＡＡＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧ−
３’（配列番号１１）［ＢｃｌＩ］；（６）５’−ＣＣＡＣＡＴＧＴＣＧＡＣＣ
ＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’（配列番号１２）［Ｓａ
ｌＩ］（大腸菌の複製起点について）。

【００７０】実施例には、赤血球凝集素（ＨＡ）、Ａ型インフルエンザの表面糖タンパク質
、Ａ型インフルエンザの核タンパク質、Ｂ型肝炎に由来するＨＢｓＡｇ表面抗原
、ならびにＨＩＶに由来するｇｐ１２０構築物およびｇａｇ構築物を発現するＤ
ＮＡプラスミドベクターなどの様々なポリヌクレオチドワクチン構築物が例示さ
れている。従って、本明細書により、実施例に明示的に例示されていないさらな
る構築物に関して本発明の核酸配合物を利用するための優れた指針が当業者に提
供されることは明らかである。従って、本明細書の教示を理解して、使用される
核酸分子のタイプ（ＤＮＡプラスミド、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、
レトロウイルスなどの組換えウイルスベクターなど）、ならびに発現されるウイ
ルス抗原または細菌抗原のタイプに関する任意の変化体が使用されるようにする
ことは当業者の範囲内である。予防的処置または治療的処置のいずれかに受け入
れられ得るウイルス性抗原投与または細菌性抗原投与の例には、インフルエンザ
、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、結核
、ヒト乳頭腫ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎が含まれるが、これ
らに限定されない。また、ガン、自己免疫異常および様々なアレルギーなどの非
感染性疾患に対する予防的処置または治療的処置を提供することも本発明の範囲
内である。ワクチン接種に対するこのような方法は、感染性病原体と同様に腫瘍
に対して適用することができる。なぜなら、ＣＤ８^＋ＣＴＬ応答が両方の病態生
理学的プロセスにとって重要であるからである（Ｔａｎａｋａら、１９８８、Ａ
ｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３５９）。従って、悪性変換プロセスに
とって極めて重要なタンパク質に対する免疫応答を誘発することは、ガンの防御
または免疫療法の効果的な手段であり得る。ウイルスタンパク質およびヒト成長
ホルモンＤＮＡの注射後に発現するタンパク質に対する高力価抗体を産生させる
ことは、他のベクターとは別々に、あるいは他のベクターと組み合わせて、抗体
応答および／またはＣＴＬ応答を誘導するワクチンを作製するための容易で非常
の効果的な手段であることを示唆している。本発明のＤＮＡワクチン配合物はま
た、狂犬病、ジステンパー、口蹄疫、炭疽病、ウシ単純ヘルペスおよびウシ結核
（これらに限定されない）を含む多数の獣医学的応用のいずれにも有用である。

【００７１】本発明の改善されたＨＳＶポリヌクレオチドワクチン配合物は、目的とするＨ
ＳＶ抗原を単独または組み合わせでコードする核酸ベクターを含む。そのような
ＨＳＶ抗原には、ｇＢ、ｇＤ、ΔｇＢ（ＨＳＶ−２のｇＢのアミノ末端７０７ａ
ａをコードする）およびΔｇＤが含まれるが、これらに限定されない。

【００７２】本発明のワクチン配合物はまた、ヒト免疫不全症ウイルス−１（ＨＩＶ−１）
の予防的処置に関し得る。ＨＩＶ−１は、後天性ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ
）および関連疾患の病因因子であることが知られている。ＨＩＶ−１は、レトロ
ウイルス科のＲＮＡウイルスであり、すべてのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇ
ａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’構成を示す。さらに、ＨＩＶ−１は、ｔａｔ
遺伝子およびｒｅｖ遺伝子を含む、調節機能または未知の機能を有する少数の遺
伝子を含む。ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１
６０）として翻訳され、次いで、細胞のプロテアーゼによって表面の１２０ｋＤ
ａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）および膜貫通の４１ｋＤａエンベロ
ープ糖タンパク質（ｇｐ４１）が生じるように切断されるウイルスのエンベロー
プ糖タンパク質をコードする。ｇｐ１２０およびｇｐ４１は会合したままであり
、ウイルス粒子上に、そしてＨＩＶ感染細胞表面に提示される。ｇｐ１２０は、
ヘルパーＴリンパ球、マクロファージおよび他の標的細胞の表面に存在するＣＤ
４レセプターに結合する。ｇｐ１２０がＣＤ４に結合した後、ｇｐ４１により、
ウイルスの進入にかかわる融合事象が媒介される。

【００７３】感染は、ウイルス粒子上のｇｐ１２０がＴ４リンパ球または他の標的細胞の表
面に存在するＣＤ４レセプターに結合したときに始まる。結合したウイルスは標
的細胞と合体し、そのＲＮＡゲノムを細胞の二本鎖ＤＮＡに逆転写する。ウイル
スＤＮＡは細胞核内の遺伝物質に取り込まれ、細胞核において、ウイルスＤＮＡ
により、新しいウイルスＲＮＡ、ウイルスタンパク質および新しいウイルス粒子
の産生が誘導される。新しいウイルスが標的細胞膜から出芽して、他の細胞に感
染する。

【００７４】ｅｎｖおよびｇａｇなどのＨＩＶの後期遺伝子の発現はｒｅｖ依存性であり、
ｒｅｖ応答性エレメント（ＲＲＥ）がウイルス遺伝子転写物に存在することが必
要である。分泌型のｇｐ１２０を、ｇｐ１２０のリーダーペプチドをｔＰＡ（組
織型プラスミノーゲン活性化因子）などの異種のリーダーペプチドと置換するこ
とによって、好ましくは、免疫グロブリンのリーダーペプチドなどの高発現する
哺乳動物タンパク質において見出されているようなリーダーペプチドによって置
換することによりｒｅｖの非存在下で生成させることができる。Ｖ１Ｊｎｓにク
ローニングされたｔＰＡ−ｇｐ１２０のキメラ遺伝子は、トランスフェクション
されたヒト横紋筋肉腫細胞株において分泌型ｇｐ１２０を効率的に発現する。モ
ノシストロン性ｇｐ１６０は、ｒｅｖ発現ベクターを添加することなくトランス
フェクションされたときにタンパク質を何ら産生しない。代表的な構築成分には
、ｔＰＡ−ｇｐ１２０ＭＮ、ｇｐ１６０ＩＩＩＢ、ｇａｇＩＩＩＢ；抗ｇａｇＣ
ＴＬの場合には、構造的変異（Ｖ１、Ｖ２および／またはＶ３のループ欠失ある
いは置換）を有するｔＰＡ−ｇｐ１２０ＩＩＩＢ、ｔＰＡ−ｇｐ１４０、ｔＰＡ
−ｇｐ１６０が含まれるが、これらに限定されない。

【００７５】その後のウイルス攻撃に対するポリヌクレオチドＨＩＶ免疫原の保護効力が、
複製しないプラスミドＤＮＡを用いた免疫化によって明らかにされている。これ
は、感染性因子が関与しておらず、ウイルス粒子の組み立てが必要とされず、そ
して抗原決定基の選択が可能であるために有利である。さらに、ｇａｇおよびプ
ロテアーゼならびにそれ以外のウイルス遺伝子産物のいくつかの配列が様々なＨ
ＩＶ株において保存されているために、クローニングされた遺伝子が得られた株
と同族であるＨＩＶの毒性株、ならびにクローニングされた遺伝子が得られた株
とは異種の株によるその後の攻撃に対する保護が可能となる。

【００７６】ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ発現ベクターをｉ．ｍ．注射することにより、
その後のウイルス攻撃に対する著しい保護的な免疫性の生成が得られている。特
に、ｇｐ１６０特異的抗体および一次ＣＴＬが得られている。保存されたタンパ
ク質に対する免疫応答は、変化しやすいエンベロープタンパク質の抗原性の変化
および変動にもかかわらず効果的であり得る。ＨＩＶ遺伝子産物はそれぞれがあ
る程度の保存性を示しているために、そしてＣＴＬが細胞内発現およびＭＨＣプ
ロセシングに応答して生成するために、多くのウイルス遺伝子は、ｇｐ１６０の
場合に達成される応答と類似する応答を生じさせることが予想される。従って、
本発明のＤＮＡワクチン配合物により、自己複製因子を必要とすることなく、株
にまたがった保護免疫性を誘導するための手段が提供される。

【００７７】ＤＮＡ構築物の作製および精製の容易さは、タンパク質精製の従来的な方法と
比べて好ましく、従って混合ワクチンの作製が容易になる。従って、例えば、ｇ
ｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１または任意の他のＨＩＶ遺伝子をコードする多
数の構築物を調製し、混合して、同時に投与することができる。タンパク質発現
はＤＮＡ注射後に維持されているために、持続したＢ細胞メモリーおよびＴ細胞
メモリーが増強され、それにより長期間の体液性免疫性および細胞媒介免疫性を
生じさせることができる。

【００７８】本発明のワクチン配合物を含む核酸−アジュバントに対するさらなる成分を含
むこともまた本発明の範囲内である。例えば、ＨＩＶＤＮＡ−アジュバントに
基づく配合物もまた、抗原性タンパク質、ならびにサポニンなどのさらなる既知
のアジュバントを含み、脊椎動物宿主における免疫応答をさらに増強させること
ができる。そのような成分を本発明のワクチン配合物に加えることは当業者の範
囲内である。

【００７９】結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対する免疫応答をもたらすＤＮＡ
ワクチン構築物を含むＤＮＡ配合物を使用することも本発明の範囲内である。好
ましい抗原は、Ａｇ８５Ａ抗原、Ａｇ８５Ｂ抗原またはＡｇ８５Ｃ抗原である。
ワクチン構築物には、（１）ｔＰＡのシグナル配列と融合した成熟型のＡｇ８５
Ａ、Ａｇ８５ＢまたはＡｇ８５Ｃのいずれかのコード領域を含む構築物；（２）
シグナル配列を有しない成熟型のＡｇ８５Ａ、Ａｇ８５ＢまたはＡｇ８５Ｃのコ
ード領域を含有する構築物；（３）それ自身のシグナル配列を含有する成熟型の
Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５ＢまたはＡｇ８５Ｃのコード領域を含有する構築物が含ま
れるが、これらに限定されない。

【００８０】本発明のワクチン配合物は、Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３株のＨＡをコードする
ＤＮＡプラスミドを用いて例示される。しかし、当業者は、目的とする抗原をコ
ードするさらなるインフルエンザ遺伝子を使用することができる。そのような遺
伝子には、ヒトインフルエンザウイルスの核タンパク質、塩基性ポリメラーゼ１
、非構造タンパク質１、赤血球凝集素、マトリックス１、ヒトインフルエンザウ
イルス単離体Ａ／ＰＲ／８／３４の塩基性ポリメラーゼ２、ヒトインフルエンザ
ウイルス単離体Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５３／８９の核タンパク質、ヒトインフ
ルエンザウイルス単離体Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１の赤血球凝集素遺伝子、ま
たはヒトインフルエンザウイルス単離体Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４６／９０の赤血球
凝集素遺伝子が含まれるが、必ずしもこれらに限定されない。

【００８１】本発明のワクチン配合物は、Ａ／Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｔｅｘａｓ／９１）およびＢ
（Ｂ／Ｐａｎａｍａ／９０）（これらに限定されない）を含む他の臨床株のＨＡ
を発現するＤＮＡプラスミド構築物と、変化および変動した抗原に対する群共通
的な保護を得るために利用され得るＡ（Ｂｅｉｊｉｎｇ／８９；Ｈ３Ｎ２）株お
よびＢ株の内部の保存されたインフルエンザの核タンパク質（ＮＰ）およびＭ１
（マトリックス）をコードするＤＮＡ構築物との組み合わせを含み得ることもま
た当業者には知られている。ＨＡＤＮＡは、ＨＡを生成して、ＨＡに対する中
和抗体をもたらすことによって機能する。これはタイプ特異的であり、現行のラ
イセンスされたタンパク質型ワクチンと比較して、変化した株に対する保護範囲
が若干増大している。ＮＰ構築物およびＭ１構築物により、潜在的により少ない
ウイルス負荷量で、かつ病気からの回復を促進させる、株にまたがった保護をも
たらすＣＴＬの生成が得られる。（筋肉細胞内におけるエピソーム型、非複製型
、非組み込み型の）ＤＮＡ構築物の予想される持続性は、現行のワクチンと比較
して、保護の増大した継続時間をもたらすことが予想される。

【００８２】本発明は、脊椎動物宿主（特に、ヒト）における免疫応答を生成させる方法に
関する。この場合、ワクチン配合物が、腸内経路および非経口的経路などのＤＮ
Ａワクチンの分野で知られている任意の手段で宿主に投与される。このような送
達経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入または鼻腔内送達、経
口的送達、舌下投与、皮下投与、経皮投与、皮膚を介した投与、皮膚を通した投
与、または任意の形態の粒子衝撃導入が含まれるが、これらに限定されない。好
ましい送達方法は、筋肉内注射、鼻腔内送達、および経口に基づく送達である。
特に好ましい方法は筋肉内送達である。粒子衝撃導入に関しては、本明細書中に
概略されているアルミニウムアジュバントまたはリン酸カルシウムアジュバント
を使用することにより、金ビーズで、あるいは圧縮成形粒子として弾道学的に送
達されるＤＮＡによって産生される免疫応答が改善される。本発明の配合物を、
アルミニウムアジュバントまたはカルシウムアジュバントと混合されたＤＮＡコ
ーティング金ビーズの同時の弾道学的送達として、あるいはアジュバントの皮下
注射または筋肉内注射を行い、その後、アジュバントの注射部位またはその近く
へのＤＮＡの「遺伝子銃」送達として送達することは当業者の範囲内である。下
記の実施例は、本発明をさらに明らかにするために提供されている。しかし、本
発明は実施例の細部に限定されない。

【００８３】実施例１アルミニウムアジュバントに対するプラスミドＤＮＡのインビトロ結合実験を、様々なアルミニウムアジュバントのプラスミドＤＮＡに対する結合能
を調べるために設計した。６種類の異なるアルミニウム塩を調べた。これには、
水酸化アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム（３ｍＭ、６ｍＭ、１２ｍ
Ｍまたは２４ｍＭのリン酸ナトリウムの存在下で沈澱）およびＡｄｊｕ−Ｐｈｏ
ｓ（登録商標）が含まれる。水酸化アルミニウム（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録
商標））およびＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）はＳｕｐｅｒｆｏｓＢｉｏｓ
ｅｃｔｏｒ社（デンマーク）から購入した。ヒドロキシリン酸アルミニウムアジ
ュバントは、３ｍＭ、６ｍＭ、１２ｍＭおよび２４ｍＭのリン酸ナトリウムにお
いて硫酸アルミニウムカリウムをそれぞれ沈澱させることによって調製された。
この結合研究の結果を表１にまとめる。ＦＲ−９５０２は、ＨＡ（Ａ／Ｇｅｏｒ
ｇｉａ／９３）をコードする遺伝子を有するＶ１Ｊｐ型ＤＮＡプラスミドベクタ
ーである。ＦＲ−９５０２プラスミドは、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を除
いて、すべてのアルミニウム塩に結合する。これらの結果は、２℃〜８℃におい
て、５ｍｃｇ／ｍＬまたは１００ｍｃｇ／ｍＬのいずれかのプラスミドＤＮＡお
よび４５０ｍｃｇ／ｍＬのアルミニウムアジュバントが使用される１５分、１６
時間または７２時間のインキュベーション時間に基づいた。リン酸アルミニウム
を除くすべてのアジュバントの場合、結合研究を生理食塩水中で行った。なぜな
ら、リン酸塩の存在はアジュバントの表面電荷を変化させて、一層、リン酸アル
ミニウムのようにするからである（ＨｅｍおよびＷｈｉｔｅ、１９９５年、第９
章、ワクチン設計：サブユニットおよびアジュバントの検討、Ｐｏｗｅｌｌおよ
びＮｅｗｍａｎ編、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ（ＮｅｗＹｏｒｋおよびＬｏｎ
ｄｏｎ））。リン酸アルミニウムに関する結合研究を、免疫応答を調べるために
設計されたその後の動物研究におけるＰＢＳコントロールとのより良好な比較で
きるようにＰＢＳ中で行った。サンプルを遠心分離し、上清の一部を採取して、
１％アガロースゲルに負荷した。電気泳動後のゲルを臭化エチジウムで染色する
ことによって、溶液中の総プラスミド量が標準との比較により明らかにされる。
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）とインキュベーションした後ではプラスミドＤ
ＮＡのスーパーコイル含有量の著しい変化がないこともまた認められた。従って
、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）などのリン酸アルミニウム系アジュバントに
対するプラスミドＤＮＡの著しい結合は、ゲル中のスーパーコイル状ＤＮＡの定
量に基づいて、３日後でさえ認められなかった。対照的に、１５分での部分的な
結合および３日後でのＤＮＡの完全な結合が、試験したＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（
登録商標）および様々なヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントについて認
められた。

【００８４】

【表１】

【００８５】５ｍｃｇ／ｍＬおよび１００ｍｃｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを、ＰＢＳ緩衝
液において４５０ｍｃｇ／ｍＬのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓの存在下および非存在下、
２℃〜８℃で１０日間インキュベーションした。次いで、ＤＮＡの一部をアガロ
ースゲル電気泳動に供して、臭化エチジウム染色した。デンシトメトリーを使用
して、ゲルの写真ネガを走査し、ＤＮＡの結合状態ならびにスーパーコイル型、
開環型および線状型の量をＤＮＡ標準品と比較して求めた。これらの結果は、リ
ン酸アルミニウムの存在下および非存在下で、５ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡサンプル
中のＤＮＡは９６％がスーパーコイル状であるが、１００ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡ
サンプル中のＤＮＡは９５％がスーパーコイル状であることを示していた。従っ
て、リン酸アルミニウムの存在により、ＤＮＡの安定性はこの期間において変化
していなかった。リン酸アルミニウムの存在下および非存在下における５ｍｃｇ
／ｍＬのＤＮＡサンプルに由来するＤＮＡを含有するゲルレーンは、それぞれ、
１５．０ｎｇおよび１５．１ｎｇのＤＮＡを含有した。リン酸アルミニウムの存
在下および非存在下における１００ｍｃｇ／ｍＬのＤＮＡサンプルに由来するＤ
ＮＡを含有するゲルレーンは、それぞれ、１４．９ｎｇおよび１３．７ｎｇのＤ
ＮＡを含有した。従って、１０日間のインキュベーション期間におけるリン酸ア
ルミニウムに対するＤＮＡの明らかな結合はなかった。

【００８６】実施例２リン酸アルミニウムによるマウス血清およびヒト血清におけるヌクレアーゼの
阻害本節では、マウス血清およびヒト血清に存在する内因性ヌクレアーゼを阻害す
るリン酸アルミニウムの能力が調べられる。リン酸アルミニウムは負の表面電荷
を有しているので、筋肉内注射後、ヌクレアーゼがリン酸アルミニウムに結合し
て、インビボでのＤＮＡの寿命を長くし得ることが推測され得る。結果は、５ｍ
ｃｇ／ｍＬのＤＮＡおよび１０％ヒト血清または２．５％マウス血清のいずれか
を含有するＰＢＳ溶液に４５０ｍｃｇ／ｍＬのリン酸アルミニウム（Ａｄｊｕ−
Ｐｈｏｓ（登録商標））を加えることによって、ＤＮＡのヌクレアーゼ消化の著
しい阻害が生じたことを示している。結果はまた、１０％ウシ血清において、種
々のタンパク質が、リン酸アルミニウムの非存在下よりも、リン酸アルミニウム
の存在下でＤＮＡに結合したことも示唆している（これは１％アガロースゲルで
の移動度の変化により示唆される）。

【００８７】下記の実施例３は、マウスにおける免疫応答に対するリン酸アルミニウム（Ａ
ｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））の効果を示している。この目的のために、これ
らのヌクレアーゼ阻害実験を繰り返した。実験条件は、リン酸アルミニウム濃度
を９００ｍｃｇ／ｍＬに２倍にすることの評価を除いて前段落に記載されている
のと同じであった。これらのデータにより、リン酸アルミニウムはヒト血清およ
びマウス血清の両方においてヌクレアーゼ活性を阻害するという結果、およびリ
ン酸アルミニウム濃度を増大させることによって阻害度が大きくなるという結果
の以前の結果が確認される。より低いヌクレアーゼ活性がリン酸アルミニウム（
Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））／血清の混合物の上清に存在していたことも
また明らかにされている。これらのデータは、リン酸アルミニウム／血清混合物
の上清中のより低いヌクレアーゼ活性により明らかにされているように、これら
のヌクレアーゼタンパク質がＰＢＳ中においてリン酸アルミニウムに結合し、そ
の結果、その活性が阻害されていることを示唆している。

【００８８】実施例３ＨＡＤＮＡワクチン効力に対するアルミニウム塩の効果マウスにおけるインビボ効力の研究により、ＤＮＡのリン酸アルミニウム配合
物は、ＰＢＳ中のネイクドＦＲ−９５０２のＨＡＤＮＡよりも実質的により大
きな効力（４倍〜１１倍）を有しているが、水酸化アルミニウムまたはヒドロキ
シリン酸アルミニウムと配合されたＨＡＤＮＡは、ＰＢＳ中のＨＡＤＮＡよ
りも低い応答をもたらしたことが明らかにされている（表２）。これは、数多く
の前記の実験に基づいて、すべてのマウスが血清変換しなかった極端な用量（０
．５μｇ）およびすべてのマウスが血清変換した適度な用量（１０μｇ）の試験
されたＦＲ−９５０２のＨＡＤＮＡの２用量を１回投与した４週間後および８
週間後においては正しかった。重要なことは、この配合物は、より低い用量でと
もにより大きな効力を有し、そしてより大きな用量では応答が最大値に達したと
考えられる。

【００８９】

【表２】

【００９０】雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹／群）にＦＲ−９５０２のＨＡＤＮＡ（Ａ
／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を０．５μｇまたは１０μｇの用量で接種して、抗体
力価（ＨＩおよびＩｇＧＥＬＩＳＡ）を、１回の投与を行った４週間後および
８週間後に測定した。

【００９１】免疫グロブリンのアイソタイプを分析することによって、リン酸アルミニウム
（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））の増強作用は、ＨＡＤＮＡにより産生さ
れる抗体タイプの質的な差をもたらしていないことが明らかにされる（表３）。
アルミニウムアジュバントは、同時に注射されたタンパク質に対して、マウスに
おけるＩｇＧ１抗体の優勢を伴うことが多い強力なＴｈ−２タイプのヘルパーＴ
細胞応答を誘導しやすい。

【００９２】

【表３】

【００９３】リン酸アルミニウムの存在下および非存在下でＤＮＡを接種した８週間後のマ
ウス（１０匹／群）から得られた血清をＥＬＩＳＡによって免疫グロブリンのア
イソタイプについて分析した。

【００９４】実施例７に開示されるさらなる研究により、インフルエンザＨＡをコードする
プラスミドＤＮＡとともにリン酸アルミニウムが同時投与されることによって、
マウスにおける抗ＨＡ抗体の強度および継続時間が、ネイクドＨＡＤＮＡ単独
の強度および継続時間と比較して増強されたことが確認される。１回の接種を行
った４週間後、８週間後および１７週間後において、赤血球凝集阻害（ＨＩ）の
機能的アッセイにより測定される抗体力価は、ＨＡＤＮＡのリン酸アルミニウ
ム配合物でワクチン接種されたマウスではより大きかった。リン酸アルミニウム
およびＤＮＡの広範囲の用量が、ＨＩまたはＥＬＩＳＡで測定されたとしても、
マウスにおいて効果的であることが確認される。第２のインフルエンザ抗原（核
タンパク質、すなわちＮＰ）をコードするＤＮＡ構築物に対するリン酸アルミニ
ウムの増強効果もまたマウスにおいて調べられ、結果もまた実施例７に開示され
ている。前記のように、抗体応答は、ＤＮＡをリン酸アルミニウムと配合するこ
とによって５倍〜５０倍増強された。さらに、これらのマウスににおけるＮＰに
対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答は有害なほど影響されなかったことが示されて
いる。

【００９５】実施例４インビボでの遺伝子発現に対するリン酸アルミニウム（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（
登録商標））の効果インビボでの遺伝子発現に対する（Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標））の効果
を調べるための実験を行った。ヒト以外の霊長類において発現することが以前に
明らかにされている分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするプ
ラスミドを使用した。この実験では、ＰＢＳまたは４５０ｍｃｇ／ｍＬリン酸ア
ルミニウムを含有するＰＢＳのいずれかにおいて配合されたＳＥＡＰプラスミド
ＤＮＡの１ｍｃｇまたは１０ｍｃｇのいずれかをマウスに筋肉内注射した３日後
の血清中のＳＥＡＰレベルが比較された。１０匹のマウスが各群において使用さ
れた。結果は、リン酸アルミニウムの存在により、注射の３日後において、血清
中のＳＥＡＰレベルは著しい影響を受けていなかったことを示唆している。これ
らの結果は、リン酸アルミニウムで得られた免疫応答の増大は遺伝子発現の全体
的な増大の結果ではないと考えられることを示唆している。

【００９６】実施例１〜４は、リン酸アルミニウム系アジュバントおよびＨＡプラスミドＤ
ＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）をＰＢＳ中に含むＤＮＡワクチン配合物によ
り、マウスにおける発現したＨＡタンパク質に対する体液性免疫応答が実質的に
増大したことを明らかにしている（抗体力価の約４倍〜１１倍の増強）。これに
対して、ＤＮＡに結合することが示された水酸化アルミニウムアジュバントまた
はヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントとともに配合されたＨＡＤＮＡ
は、（ＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡ単独と比較して）ＨＡタンパク質に対する免
疫応答を阻害していた。種々なタイプのアルミニウムアジュバントに対するプラ
スミドＤＮＡのインビトロ結合研究により、プラスミドＤＮＡは、（ＰＢＳ中ま
たは０．９％生理食塩水中で）負荷電のリン酸アルミニウムに結合しないことが
明らかにされている。しかし、プラスミドＤＮＡは、生理食塩水中において、よ
り正に帯電した水酸化アルミニウムアジュバントに、そしてより正に帯電したヒ
ドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに結合する。従って、負の表面電荷を
有しやすいリン酸アルミニウム系アジュバントはＤＮＡワクチン配合物の効果的
な非結合性アジュバントである。

【００９７】実施例５ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに対するプラスミドＤＮＡのイン
ビトロ結合ヒドロキシリン酸アルミニウムに対するプラスミドＤＮＡの結合がリン酸塩緩
衝剤を加えることによって妨げられ得るかどうかを明らかにするために、下記の
表４に示される４種類の溶液を調製した。各溶液は、１００ｍｃｇ／ｍＬのプラ
スミドＤＮＡと、ヒドロキシリン酸アルミニウムとを含有した。

【００９８】

【表４】

【００９９】これらの溶液を調製し、ひっくり返すことによって混合して、４℃でインキュ
ベーションした。１５分間のインキュベーション後、溶液を微量遠心分離器で２
分間遠心分離して、アジュバントをペレット化した。上清の一部を採取し、ＰＢ
Ｓで２０倍に希釈して、４００ｎｍ〜２２０ｎｍのＵＶ吸光度測定に供した。上
清中のＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおける１．０の吸光度が５０ｍｃｇ／ｍＬの
ＤＮＡによって得られるという仮定に基づいて求めた。結果を下記の表５に示す
。

【０１００】

【表５】

【０１０１】これらの結果は、プラスミドＤＮＡの大部分が、０．９％生理食塩水中では１
５分以内にヒドロキシリン酸アルミニウムに結合したが、ＰＢＳ中ではアジュバ
ントに結合しなかったことを示している。上清の一部はまた、４℃で１５分間お
よび５日間のインキュベーションを行った後にアガロースゲル電気泳動で分析さ
れた。その結果は、１５分間のインキュベーション後、および５日間のインキュ
ベーション後における溶液２の上清には検出可能ＤＮＡが存在していないことを
示していた。しかし、溶液１、３および４の上清におけるＤＮＡ量の比較により
、４℃で５日間において、６ｍＭまたは１２ｍＭのいずれかのリン酸塩中ではア
ルミニウムアジュバントに対するＤＮＡの結合は著しくないことが示された。従
って、いくつかの配合物において、実質的にＤＮＡに結合し得ないアジュバント
をＤＮＡワクチン配合物において利用することは当業者の範囲内である。このよ
うなアジュバントは、このＤＮＡワクチン配合物内においてＤＮＡと実質的に結
合し得ないことをもたらすリン酸塩緩衝剤または他の緩衝剤を含むことによって
有用であり得る。

【０１０２】ＨＡ−Ｇｅｏｒｇｉａインフルエンザ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡによ
って惹起される免疫応答がヒドロキシリン酸アルミニウムにより増強され得るこ
とが、生理食塩水中およびＰＢＳ中の両方で配合された２つの実験で調べられた
。これらの結果（表６）により、ヒドロキシリン酸アルミニウムは、生理食塩水
において配合された場合には、インフルエンザＤＮＡワクチンに対する（ＨＡタ
ンパク質抗原に対する相乗平均力価に基づいて）免疫応答を増強しなかったが、
ＰＢＳにおいて配合された場合には免疫応答を増強したことが示されている。こ
れらの配合物上清のアガロースゲル電気泳動は、ＤＮＡが生理食塩水配合物中で
はヒドロキシリン酸アルミニウムに完全に結合していたが、ＰＢＳ配合物中では
結合していなかったことを示した。これらの結果は、ＤＮＡワクチンに対する免
疫応答を増強するためには、ＤＮＡは溶液中に存在しなければならず、そしてア
ルミニウムアジュバントに結合してはならないことを示している。

【０１０３】

【表６】

【０１０４】実施例６インフルエンザＤＮＡワクチンの効力に対するリン酸アルミニウムの効果１．インフルエンザＨＡのＤＮＡワクチン−雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹
／群）にＦＲ−９５０２のＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）を０．５
μｇまたは１０μｇの用量で接種して、１回の投与を行った４週間後および８週
間後に抗体力価（ＨＩおよびＩｇＧＥＬＩＳＡ）を測定した。コントロールに
は、ＰＢＳにおける０．５μｇまたは１０μｇのＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇ
ｉａ／９３）の接種が含められた。別途示されていない限り、ＡｌＰＯ_４がＨＡ
ＤＮＡと一緒に４５０μｇ／ｍｌで同時に投与された。図１Ａおよび図１Ｂの
ＨＡＤＮＡ効力は、赤血球凝集素阻害（ＨＩ）アッセイによってインビトロで
測定される中和抗体の産生として報告されている。これらのデータは、注射後の
４週間（図１Ａ）および８週間（図１Ｂ）において、ＨＡＤＮＡワクチン効力
の著しい増強が、４５０μｇ／ｍｌのＡｌＰＯ_４を含むＤＮＡワクチン配合物を
０．５μｇおよび１０μｇの両用量のＤＮＡとともに利用したときに測定されて
いることを示している。表７は、ＨＡのＥＬＩＳＡによって測定される、リン酸
アルミニウムアジュバントを加えることによる同様な増強を示している。

【０１０５】

【表７】

【０１０６】リン酸アルミニウムをアジュバントとして含むＨＡＤＮＡワクチン配合物は
、ＩｇＧ抗体プロフィルを著しく変化させなかった。上記に示されているように
、表３は、ＰＢＳ系およびＡｌＰＯ_４系のＤＮＡワクチン配合物（０．５μｇお
よび１０μｇの用量で注射後の４週間および８週間において測定されたとき）は
、ＨＡＤＮＡワクチン接種に応答した、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂお
よびＩｇＧ３の類似するアイソタイププロフィルが生じていることを示している
。ＨＡＤＮＡワクチン接種に対する体液性応答のプロフィルに加えて、マウス
における応答の継続時間もまた、配合物がＰＢＳまたはＡｌＰＯ_４を含有するか
どうかにかかわらず、ＨＡ中和抗体の上昇および低下は類似した経路に従ってい
ることを示している。図２Ａ（０．５μｇのＨＡＤＮＡ）および図２Ｂ（１０
μｇのＨＡＤＮＡ）のデータは、注射後の４週間、８週間および１７週間にお
けるＨＡ中和抗体の誘導を示している。ＰＢＳ系およびＡｌＰＯ_４系の両方のＤ
ＮＡワクチン配合物において、ＨＡ抗体の低下が注射後の８週間から注射後の１
７週間まで認められている。

【０１０７】さらなる実験は、ＤＮＡワクチン接種手順に対するアジュバントとしてのＡｌ
ＰＯ_４の最適な効果が、ＤＮＡおよびＡｌＰＯ_４が宿主に同時に投与されたとき
に生じていることを示している。表８では、ＡｌＰＯ_４がＤＮＡと同時に注射さ
れたとき、あるいはＤＮＡ免疫化の３日前からＤＮＡ免疫化の３日後までマウス
に投与されたときのＨＡＤＮＡの中和抗体誘発能が比較される。

【０１０８】

【表８】

【０１０９】類似する結果が、ＨＡ抗体産生がＨＡのＥＬＩＳＡアッセイで測定されたとき
に記録された。これらのデータは、ＤＮＡワクチンアジュバントとしてＡｌＰＯ _４が投与される最適な時期は、ＤＮＡワクチンが投与されるときであるか、また
はそれに実質的に近いときであることを示している。従って、本発明のＤＮＡ／
ＡｌＰＯ_４配合物は、ＤＮＡワクチン接種後のインビボでの体液性応答を刺激す
るための好ましい配合物を提供する。

【０１１０】さらなる実験により、ＡｌＰＯ_４が、当業者によって考えられ得る広範囲の濃
度にわたってアジュバントとして作用していることが明らかにされる。図３Ａお
よび図３Ｂは、ＨＡＤＮＡの様々な用量範囲内で同時に投与されるＡｌＰＯ_４の様々な濃度により、注射後の少なくとも４週間において増強された体液性応答
が促進されることを示している。広範囲のＡｌＰＯ_４用量範囲は、本明細書にお
いて開示および例示されているＤＮＡアジュバント効果を提供することにおいて
効果的であることはこれらの結果から明らかである。従って、本実施例に示され
ているデータは、ＡｌＰＯ_４が、ＤＮＡワクチン接種されたときに体液性応答を
著しく増大させるアジュバントとして作用していることを示している。この増大
した体液性応答は、アジュバントおよびＤＮＡの特定用量の組み合わせに依存し
ていない。むしろ、ＤＮＡ用量が大きいほど、マウスにおいて、約１０μｇのＤ
ＮＡの用量まで、少し顕著な抗体産生がもたらされる傾向を有するが、ＡｌＰＯ _４のアジュバント効果は、大きな用量範囲にわたって一定している。このデータ
は、ヒトおよび／または獣医学的な応用（これらに限定されない）を含む目的と
する宿主に対するＤＮＡおよびアジュバントの用量範囲を決定する際の当業者に
対する効果的な目安として役立つ。

【０１１１】２．インフルエンザＮＰのＤＮＡワクチン−雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（１０匹
／群）に、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の核タンパ
ク質（ＮＰ）をコードするＤＮＡプラスミドを０．５μｇまたは５０μｇの用量
で接種して、抗ＮＰ力価を、１回の注射を行った６週間後と、２回の注射を行っ
た３週間後に測定した。別途示されていない限り、ＡｌＰＯ_４が４５０μｇ／ｍ
ｌでＮＰＤＮＡとともに同時に投与された。ＮＰＤＮＡの力価が、相乗平均
ＥＬＩＳＡ力価として測定される抗ＮＰ抗体として図４に示されている。血清サ
ンプルを、細胞性免疫応答のために、屠殺したときに３匹のマウスの群から採取
した。これらのデータは、ＮＰＤＮＡプラスミド構築物の接種に応答した抗Ｎ
Ｐ抗体産生が、０．５μｇおよび５０μｇの両用量のＤＮＡとともに４５０μｇ
／ｍｌのＡｌＰＯ_４を含むＤＮＡワクチン配合物を利用したときに増大している
ことを示している。

【０１１２】図５Ａ（ＩＬ−２）、図５Ｂ（ＩＮＦ−γ）、図５Ｃ（ＩＬ−４）および図５
Ｄ（ＩＬ−１０）は、３匹／群から集められた脾臓細胞から測定されたとき、Ｎ
ＰＤＮＡプラスミド／ＡｌＰＯ_４ワクチン配合物のマウスへの接種は、同一用
量で注射されたＮＰＤＮＡプラスミド／ＰＢＳ配合物と比較してサイトカイン
分泌の著しい変化をもたらさなかったことを示している。

【０１１３】ＡｌＰＯ_４の添加または無添加の場合におけるＮＰＤＮＡプラスミド構築物
の接種に対する細胞性応答の程度を明らかにするために、細胞傷害性Ｔリンパ球
が、ＤＮＡで免疫化されたマウスあるいはＡ／ＰＲ／８／３４感染から回復した
マウスから作製された。コントロール培養物は、コントロールＤＮＡが注射され
たマウスおよび未注射のマウスから得られた。単一細胞懸濁物を群あたり３つの
脾臓のプールから調製し、赤血球を塩化アンモニウムによる溶解によって除き、
脾臓細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０
０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．０１ＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）およ
び２ｍＭのｌ−グルタミンが補充されたＲＰＭＩ１６４０で培養した。自己の放
射線照射された同数の刺激細胞を、１０μＭのＨ−２Ｋ^ｄ制限ペプチドエピトー
プＮＰ１４７−１５５（Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ、配列番号１３）を用いて６０分間パルス処理し、あるい
はインフルエンザ株Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／７３に感染させ、そして１０Ｕ／ｍ
ｌの組換えヒトＩＬ−２（ＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｕｆｆａｌ
ｏ、ＮＹ）を加えて、培養を５％ＣＯ_２および１００％の相対湿度において３７
℃で７日間維持した。細胞傷害性アッセイをＵｌｍｅｒら（１９９３、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５９：１７４５〜１７４９）の記載に従って行った。Ｎａ^５１ＣｒＯ
で標識された標的細胞を１０μＭの濃度の合成ペプチドＮＰ１４７−１５５でパ
ルス処理した。次いで、標的細胞を、９６ウエルプレートにおいて、示されたエ
フェクター：標的細胞の比でＣＴＬと混合し、５％ＣＯ２の存在下で３７℃で４
時間インキュベーションした。それぞれの細胞混合物から得られる上清の２０μ
ｌサンプルを、標的細胞から放出された^５１Ｃｒの量を測定するために計数した
。計数はＢｅｔａｐｌａｔｅシンチレーションカウンター（ＬＫＢ−Ｗａｌｌａ
ｃ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）で行った。６ＭＨＣｌの添加により放出され
る最大カウントおよびＣＴＬの非存在下で放出される自発的なカウントをそれぞ
れの標的調製物について測定した。特異的な溶解割合を、［（Ｅ−Ｓ）／（Ｍ−
Ｓ）］×１００に従って計算した（式中、Ｅは、エフェクター細胞の存在下で標
的細胞から放出される平均ｃｐｍを表し、Ｓは、培地のみの存在下で放出される
自発的なｃｐｍであり、Ｍは、２％トリトンＸ−１００の存在下で放出される最
大ｃｐｍである）。図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃおよび図６Ｄの結果は、ＮＰＤＮ
Ａプラスミド構築物の接種によるＣＴＬ応答の誘導に対するＡｌＰＯ_４が存在す
ることの最少の効果を示している。これらの研究において、ＢＡＬＢ／ｃマウス
には、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）をコードするＤＮＡが、ＰＢＳまたはＡ
ｌＰＯ_４において、５μｇまたは５０μｇのいずれかのプラスミドＤＮＡととも
に両肢の大腿四頭筋に注射された。特異的溶解％のレベルを、注射した６週間後
のマウスから得られるリンパ球培養物によって測定した。これらの結果は、ＣＴ
Ｌ応答が、ペプチドでパルス処理された細胞およびインフルエンザ感染細胞の両
方に関して両用量で類似していたことを示している。同様の結果が、２回の注射
を行った３週間後における５μｇまたは５０μｇの用量について得られた。

【０１１４】実施例７Ｂ型肝炎ＤＮＡワクチンの効力に対するリン酸アルミニウムの効果ＤＮＡ構築物−Ｂ型肝炎ウイルスの主要エンベロープタンパク質（ＨＢｓ）が
、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーターを、そのイントロ
ンＡ配列、クローニング用の（ＢｇｌＩＩを含む）多数の制限部位、およびウシ
成長ホルモンのポリアデニル化シグナル部位とともに含有するｐＵＣ１９プラス
ミドに由来するＶ１Ｊから得られた発現ベクターにサブクローニングされた。ａ
ｄｗサブタイプを発現するＨＢＤＮＡプラスミドベクターはＶ１Ｊｎｓ．Ｓで
ある。ａｙｗサブタイプを発現するＨＢＤＮＡプラスミドベクターはＶ１Ｒｎ
ｓ．Ｓであり、これは、ＨＢＶの全ゲノムを含有するｐＢＲ３２２プラスミドか
らＳ遺伝子をＶ１ＲのＢｇｌＩＩ制限部位にサブクローニングすることによって
調製された。Ｓ遺伝子の発現は、ＣｅｌｌＰｈｅｃｔキット（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）を使用するリン酸カルシウム媒介トランスフェクション、およびＡｕｚｙｍ
ｅＥＩＡキット（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｓ）を使用するＨＢｓＡｇの検出を行
うことによって、ＲＤ細胞（ヒト筋芽細胞細胞株）において確認された。

【０１１５】抗ＨＢｓのＥＩＡ（総抗体）−ＡＵＳＡＢＥＩＡキット（ＡｂｂｏｔｔＬ
ａｂｓ、Ｎ．Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）のマイクロタイタープレート修飾を使用し
て、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する抗体を定量した。Ｃｏｓｔａｒ社
のＥＩＡ９６ウエル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、
＃３５９１）を、４℃において、Ｔｒｉｓ−生理食塩水（ｐＨ９．５）中で４μ
ｇ／ｍｌの組換えＨＢｓＡｇ（調製：例えば、米国特許第４，７９６，２３８号
；同第４，９３５，２３５号；および同第５，１９６，１９４号）で一晩コーテ
ィングした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いで、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０
．１％アジ化物の１７５μｌ／ウエルで、室温で２時間あるいは４℃で一晩ブロ
ッキングした。５倍の連続希釈物を、各血清サンプルについて、プレートの８個
の連続したウエルにおいて（二連で）作製した。次いで、プレートを４℃で一晩
インキュベーションした。（ＴｉｔｅｒＴｅｃｈプレート洗浄機［ＩＣＮ、Ｈｕ
ｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ］を使用して）ＰＢＳによる３回の洗浄サイクルを行っ
た後、等量のビオチン結合ＨＢｓＡｇおよび抗ビオチン酵素結合物からなる発色
試薬（Ａｂｂｏｔｔ社のＡＵＳＡＢＥＩＡキット）をプレートの各ウエルに加
えた。室温で４時間後、プレートを５回洗浄し、次いでウエルあたり１００μｌ
のＯＰＤ基質（Ａｂｂｏｔｔ）を各ウエルに加えた。反応を、ウエルあたり５０
μｌの１ＮＨ_２ＳＯ_４を加えることによって３０分後に停止させた。光学密度
を、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社のマイクロプレートリーダー（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ、ＭｅｎｌｏＰａｒｋ、ＣＡ）を使用して４
９０ｎｍおよび６５０ｎｍで読み取った。抗ＨＢｓ力価（ｍｌＵ／ｍＬ単位）を
、４パラメーター近似アルゴリズムを使用して作製した標準曲線を使用して、Ｓ
ｏｆｔｍａｘコンピュータープログラム（バージョン２．３２）によって計算し
た。アッセイは種非依存性であるので、一連のヒト血清標準品（Ａｂｂｏｔｔ定
量キット）を使用して、力価がｍｌＵ／ｍＬ単位で参照用標準に対して定量化さ
れ得るように標準曲線を作製した。

【０１１６】抗ＨＢｓのＥＩＡ（アイソタイプ特異的）−マイクロタイタープレートを、上
記のように、ＨＢｓＡｇでコーティングし、ブロッキングした。５倍の連続希釈
物を、各血清サンプルについて、プレートの８個の連続したウエルにおいて（二
連で）作製した。次いで、プレートを４℃で一晩インキュベーションした。（Ｔ
ｉｔｅｒＴｅｃｈプレート洗浄機を使用して）ＰＢＳによる３回の洗浄サイクル
を行った後、マウスＩｇＧ１アイソタイプまたはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ
に特異的なアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン試薬（Ｓｏ
ｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍ
ｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を１：２０００の最終希釈で加えた。３７℃で２時間後、
ＴｉｔｅｒＴｅｃｈプレート洗浄機を使用してプレートを６回洗浄し、次いでウ
エルあたり６０μｌの酵素基質（１ｍｇ／ｍＬでＴｒｉｓ生理食塩水（ｐＨ９．
５）に溶解したｐ−ニトロフェニルホスフェート［ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａ
ｌＣｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ］）を各ウエルに加えた。室温で３０分後
、反応を、ウエルあたり６０μｌの３ＮＮａＯＨを加えることによって停止さ
せた。光学密度を、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ社のマイクロプレート
リーダーを使用して４０５ｎｍで読み取った。データを、Ｓｏｆｔｍａｘコンピ
ュータープログラムを使用して集めた。標準曲線を、ＩｇＧ１アイソタイプ（カ
タログ＃１６０２１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）また
はＩｇＧ２ａアイソタイプ（カタログ＃１６０１１Ｄ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
のマウスモノクローナル抗ＨＢｓ抗体を使用して作製した。

【０１１７】それぞれのアイソタイプ標準に対する抗体濃度を、以前の記載（Ｃａｕｌｆｉ
ｅｌｄおよびＳｈａｆｆｅｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
、７４：２０５〜２１５）に従って計算した。簡単に記載すると、力価を計算す
るために、０．１単位のＯＤ値を終点として定めた。ｌｏｇ５力価（ｔ）が、下
記の式を使用する補間によって求められる：ｔ＝ｘ−（（０．１−Ｌ）／（Ｈ−Ｌ）式中、Ｌ＝０．１未満のＯＤ値をもたらす最初のｌｏｇ５希釈物のＯＤ値；Ｈ＝
カットオフ（０．１）を超えてそれに最も近いｌｏｇ５希釈物のＯＤ値；ｘ＝Ｏ
Ｄ値がＬのウエルの数。

【０１１８】実験サンプルにおける抗体濃度（ｃ）が、下記の式により、実験ウエルの終点
力価を標準曲線の終点力価と比較することによって求められる：ｃ＝Ａｘ５^{（ｔ−ｓ）} 式中、Ａ＝標準品の抗体濃度；ｓ＝標準品のｌｏｇ５力価；ｔ＝未知物のｌｏｇ
５力価。例えば、標準品（１００ｎｇ／ｍｌ）のｌｏｇ５終点力価が２．６であ
り、未知物の値が３．４である場合、未知物の抗体濃度は下記にようになる：ｃ＝１００ｘ５^{（３．４−２．６）}＝３６２ｎｇ／ｍｌ。

【０１１９】細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ（ＣＴＬアッセイ）−ＣＴＬアッセイを、Ｕｌ
ｍｅｒら（１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４５〜１７４９）に報告さ
れているように、本質的には実施例６に記載されているように行った。簡単に記
載すると、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＨＢＶＤＮＡおよびリン酸アルミニウムか
らなるワクチン配合物またはネイクドＨＢＶＤＮＡを２回注射した。次いで、
エフェクター細胞の単一細胞懸濁物を調製し、ＨＢｓペプチド（２８−３９）で
パルス処理された同系の刺激細胞とともにインビトロで培養した。この細胞懸濁
物を、^５１Ｃｒ標識されたＰ８１５細胞に対するＣＴＬ活性について７日後にア
ッセイした。

【０１２０】同系の刺激細胞を、下記のように非免疫化ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単一
細胞懸濁物として調製した。赤血球を塩化アンモニウム緩衝液（ＧｉｂｃｏＢ
ＲＬ社のＡＣＫ緩衝液）で溶解した後、細胞を１２００ｒｐｍでの１０分間の遠
心分離（Ｊｏｕａｎ社の遠心分離器モデルＣＲ４２２）によって洗浄し、ＤＭＥ
Ｍ培養培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１１９６５−０９２）に再懸濁し、次いで２
，０００ｒａｄ〜４，０００ｒａｄが送達されるように^６０Ｃｏ線源を使用して
放射線照射した。次いで、細胞を１０μＭの最終濃度のＨ−２Ｋ^ｄペプチドＨＢ
ｓ（２８−３９）（ＣｈｉｒｏｎＭｉｍｅｔｏｐｅｓ、Ｃｌａｙｔｏｎ、Ｖｉ
ｃｔｏｒｉａ、オーストラリア）でパルス処理した。このペプチドは、Ｉｌｅ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｙ−
Ｓｅｒ−Ｌｅｕ［配列番号１４］（Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋら、１９９４、Ｊ．Ｖ
ｉｒｏｌ．６８：１４１８〜１４２５）の配列を有する。細胞を、１．５時間〜
２．５時間にわたって、およそ２０分毎に混合し、次いでＲＰＭＩ−１６４０培
地で３回洗浄した。エフェクター細胞を、記載されたように免疫化マウスの脾臓
から単一細胞懸濁物として調製し、次いで、ペプチドでパルス処理されたほぼ同
数の刺激細胞とともに３７℃（５％ＣＯ_２）で「Ｋ」培地において７日間同時に
培養した。

【０１２１】Ｐ８１５（Ｈ−２^ｄ）マウス肥満細胞腫細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、ＭＤ）を、１０ｍＬの容量中に約５×１０^５個／ｍＬの細胞を含有する７５ｃ
ｍ^２培養フラスコ（Ｃｏｓｔａｒ＃３３７６）に加えられた０．５ｍＣｉ〜１．
２ｍＣｉの^５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ＃ＣＪＳ．４）を用いて一晩
培養することによって放射能標識した。標識された細胞を１２００ｒｐｍで５分
間遠心分離し、上清を吸引によって除いた。細胞を洗浄し、計数し、ＤＭＥＭ培
養培地に約１０^６細胞／ｍｌで再懸濁し、次いで１０μＭのＨＢｓ（２８−２９
）ペプチドを用いて、しばしば混合しながら３７℃で２時間〜３時間パルス処理
した。次いで、標的細胞を洗浄し、置床するために１ｍＬあたり１０^５細胞に調
節した。一方、７日間の再刺激培養から得られたエフェクター細胞を集め、洗浄
して、１ｍＬあたり、６０×１０^５個、３０×１０^５個、１５×１０^５個および
７．５ｘ１０^５個の細胞でＶ底マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３８
９８）の三連ウエルに加えた。^５１Ｃｒ標識された標的細胞を、６０：１、３０
：１、１５：１および７．５：１のエフェクター：標的の比が得られるように１
００μｌの「Ｋ」培地において１０^４細胞／ウエルで加えた。０．２ｍＬの培地
で培養される標的細胞のみを含有する三連のウエルは、自発的な^５１Ｃｒ放出に
対するコントロールとして使用され、これに対して、１．０％トリトンＸ−１０
０界面活性剤（Ｓｉｇｍａ＃Ｔ６８７８）を含有する０．２ｍＬの培地で培養さ
れる標的細胞を含有する三連のウエルは、最大^５１Ｃｒ放出に対するコントロー
ルとして使用された。プレートを５％ＣＯ_２インキュベーターにおいて３７℃で
４時間インキュベーションし、次いで１２００ｒｐｍで５分間遠心分離して、残
存している標的細胞をペレット化した。次いで、上清（２０μｌ）を、Ｉｍｐａ
ｃｔマルチチャンネルピペッター（ＭａｔｒｉｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｏ
ｗｅｌｌＭＡ、モデル＃６６２２）を使用して集め、次いでＢｅｔａｐｌａｔ
ｅフィルターマット（Ｗａｌｌａｃ＃１２０５−４０２）に移した。マットを乾
燥し、次いでプラスチックバッグに移して、約１１ｍｌのシンチレーション液を
加えた後、バッグを密封した。Ｂｅｔａｐｌａｔｅモデル１２０５シンチレーシ
ョンカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を使用して、元の９６ウエルプレートの各ウエ
ルに対応するマット上の各スポットに含有される放射活性^５１Ｃｒを定量した。
特異的溶解％を、実施例７に示されるようにして求めた。

【０１２２】Ｖ１Ｒ．Ｓに対するリン酸アルミニウムのアジュバント効果−下記のものが接
種されたマウスにおける抗ＨＢｓ抗体産生を比較する研究を行った：（１）市販
のＢ型肝炎ワクチン（ＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標））；（２）アジュ
バントを伴わない精製されたＢ型肝炎表面抗原；および（３）リン酸アルミニウ
ムを伴うＶ１Ｒ．Ｓ、および（４）リン酸アルミニウムを伴わないＶ１Ｒ．Ｓ。
動物を、実施例６に記載されているように用いた。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに、
プラスミドＤＮＡ構築物Ｖ１Ｒ．Ｓを、１００μｇの用量で、４５０μｇ／ｍｌ
リン酸アルミニウムの存在下またはアジュバントの非存在下で接種した。コント
ロールとして、１μｇのＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標）および１μｇの
ＨＢｓＡｇがマウスに接種され、採血が、接種後の２１日目、４２日目および６
３日目に行われた。抗ＨＢｓ抗体産生を図７に示す。ＨＢＶＤＮＡワクチン（
これはＢ型肝炎ウイルスの表面抗原をコードする）に対する抗体応答は、リン酸
アルミニウムとの配合により約１００倍増強された。アジュバント化ＤＮＡワク
チンは、ＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標）で誘導されるのと同等の応答を
もたらす。

【０１２３】ＡｌＰＯ_４の存在下におけるＨＢＤＮＡ投薬割合−Ｖ１Ｒ．ＳＤＮＡを、
一定濃度（４５０μｇ／ｍｌ）のアルミニウムアジュバント（リン酸アルミニウ
ムおよびヒドロキシリン酸アルミニウム）とともに３用量レベル（１．０μｇ、
１０μｇおよび１００μｇ）で配合して、マウスにおける抗ＨＢｓ抗体の誘導能
について調べた。図８は、ワクチンを１回注射した６週間後において、リン酸ア
ルミニウムと配合された１０μｇ用量のＨＢＶＤＮＡワクチンに対する応答が
、１００μｇのネイクドＤＮＡワクチンで誘導された応答よりも優れていたこと
を示している。図９は、一定濃度（４５０μｇ／ｍｌ）のアルミニウムアジュバ
ントとともに３用量レベル（１．０μｇ、１０μｇおよび１００μｇ）で配合さ
れたＤＮＡによる０日目および４２日目におけるマウスのそのような注射を示し
ている。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける抗ＨＢｓ抗体をその３週間後の実験の６３
日目に調べた。図７に示されるデータと比較することによって、リン酸アルミニ
ウムと配合されたＤＮＡワクチンの２回目の用量で追加免疫することにより、抗
ＨＢｓ力価の＞１０倍の増大が得られた。図７に示される単回投薬と一致して、
リン酸アルミニウムと配合されたＨＢＶＤＮＡワクチンの１０μｇ用量に対す
る応答は、１００μｇのネイクドＤＮＡワクチンで誘導された応答よりも優れて
いた。水酸化アルミニウムまたはヒドロキシリン酸アルミニウムのアジュバント
を用いた生理食塩水におけるＤＮＡの配合は、アルミニウムアジュバントが飽和
し、遊離のＤＮＡが存在する条件下では１００μｇ用量のＤＮＡでのみ有利であ
った。ＤＮＡが水酸化アルミニウムまたはヒドロキシリン酸アルミニウムに完全
に結合することが知られているＤＮＡのより低い用量では、その応答は、ネイク
ドＤＮＡの等しい用量で得られる応答よりも低い。

【０１２４】ＣＴＬ応答のＨＢＶＤＮＡ／ＡｌＰＯ_４誘導−ＨＢＶＤＮＡワクチンおよ
びリン酸アルミニウムアジュバントを２回注射した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾
臓細胞をインビトロにおいてＨＢｓペプチド（２８−３９）で再刺激し、次いで
、^５１Ｃｒ標識されたＰ８１５細胞に対するＣＴＬ活性について７日後にアッセ
イした。図１０は、リン酸アルミニウムの存在下または非存在下でのＨＢＶＤ
ＮＡワクチンの配合により、同等のＣＴＬ応答が得られたことを示している。Ｈ
Ｂｓペプチドでパルス処理されなかったコントロールＰ８１５細胞の溶解は見ら
れなかった。このことは、ＨＢｓペプチドでパルス処理された細胞の溶解は、標
的細胞を無差別に溶解することが予想されるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞より
もむしろ特異的なＣＴＬの活性化の結果であったことを示している。従って、ネ
イクドＤＮＡワクチン接種の１つの大きな利点（すなわち、ＣＴＬ応答の誘導）
は、ＤＮＡがリン酸アルミニウムと配合されたときに維持される。

【０１２５】実施例８低応答マウスで試験されたＨＢｓＤＮＡワクチンに関するリン酸アルミニウム
のアジュバント効果大部分のヒトは、現行のＢ型肝炎ワクチンの標準的な３用量法に対して非応答
性である（Ａｌｐｅｒら、１９８９、Ｊ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：７０８
〜７１２）。この問題は、前臨床動物モデルにおいてリン酸アルミニウムアジュ
バントを使用して検討された。低応答マウス（Ｃ３Ｈ）または高応答マウス（Ｂ
ＡＬＢ／ｃ）が、リン酸アルミニウムの存在下または非存在下で配合されたＨＢ
ｓＤＮＡワクチンの１．０μｇ、１０μｇまたは１００μｇの２用量で免疫化さ
れた。表９に示されているように、ＤＮＡワクチンをリン酸アルミニウムと配合
することにより、従来のＨＢｓタンパク質ワクチンの１μｇ用量に対する応答と
等価な抗ＨＢｓ抗体応答を、１００μｇのＤＮＡが投与された高応答マウス（Ｂ
ＡＬＢ／ｃ）および低応答マウス（Ｃ３Ｈ）の両方において生成させることがで
きる。アルミニウムアジュバントの非存在下では、ＤＮＡワクチンに対する応答
は、約１．０ｍＩＵ／ｍＬの検出限界のすぐ上方である６．３ｍＩＵ／ｍＬにす
ぎなかったことは注目される。従って、リン酸アルミニウムアジュバントは、細
胞媒介抗体応答を誘導するＤＮＡワクチンの能力とともに、タンパク質系ワクチ
ンの所望される属性（すなわち、高抗体力価の誘導）を合わせ持つ（実施例７を
参照のこと）。

【０１２６】

【表９】

【０１２７】実施例９ＨＩＶＤＮＡワクチンの効力に対するリン酸アルミニウムの効果ＤＮＡプラスミドＶ１Ｊｎｓ／ｔＰＡ／ｏｐｔｇａｇを、国際特許公開ＷＯ
９７／３１１５（これは参考として本明細書中に援用される）に記載されるベク
ターＶ１Ｊｎｓから構築した。Ｖ１Ｊｎｓにおいて最適化されたｇａｇ配列を下
記のように構築した：異種のリーダーペプチド配列を分泌型タンパク質および／
または膜タンパク質に提供するために、Ｖ１Ｊｎを、ヒト組織特異的プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーを含むように改変した。２つの合成された
相補的なオリゴマーをアニーリングし、次いで、ＢｇｌＩＩ消化されたＶ１Ｊｎ
に連結した。これらのオリゴマーは、ＢｇｌＩＩ切断配列への連結に適合し得る
突出塩基を有する。連結後、上流側のＢｇｌＩＩ部位を破壊し、下流側のＢｇｌ
ＩＩはその後の連結のためにそのままにする。接合部位ならびに全ｔＰＡリーダ
ー配列の両方をＤＮＡ配列決定によって確認した。さらに、本発明者らのコンセ
ンサス最適化ベクターＶ１Ｊｎｓ（＝ＳｆｉＩ部位を有するＶ１Ｊｎｅｏ）と一
致させるために、ＳｆｉＩ制限部位を、Ｖ１Ｊｎ−ｔＰＡのＢＧＨターミネータ
ー領域内のＫｐｎＩに、ＫｐｎＩ部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そ
の後ＳｆｉＩリンカー（カタログ＃１１３８、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓ）と連結することによって配置した。この改変を制限消化およびアガロ
ースゲル電気泳動によって確認した。

【０１２８】遺伝子セグメントを、同一の翻訳配列を有するが、Ｌａｔｈｅ（１９８５、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２）によって規定され、そして国際特許公
開ＷＯ９７／３１１５に記載される代わりのコドン使用を有する配列に変換した
。ＨＩＶのｇａｇ遺伝子セグメントの発現を増大させるために下記に記載されて
いる方法論は、哺乳動物細胞においてこの遺伝子を効率的に発現させることがで
きないと知られていることは全体的な転写物組成の結果であるという仮説に基づ
いていた。従って、同じタンパク質配列をコードする代わりのコドンを使用する
ことにより、ｇａｇの発現に対する制約を除くことができる。用いられる具体的
なコドン置換法は下記にように記載することができる。

【０１２９】１．適したオープンリーディングフレームに必要なコドンの設置を同定する。

【０１３０】２．ヒト遺伝子により認められる使用頻度に関して野生型コドンを比較する。

【０１３１】３．コドンが最も一般的に用いられていない場合には、そのコドンを、ヒト細
胞における高発現に最適なコドンで置換する。

【０１３２】４．遺伝子セグメント全体が置換されるまでこの手順を繰り返す。

【０１３３】５．新しい遺伝子配列を、これらのコドン置換により生じた所望されない配列
（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライスシング認識部位の不適切
な生成、望ましくない制限酵素部位など）について調べ、これらの配列を除くコ
ドンに置き換える。

【０１３４】６．合成遺伝子セグメントを組み立て、改善された発現について試験する。

【０１３５】これらの方法を使用して、発現に最適なコドン使用から完全に構成される遺伝
子を生成するＨＩＶｇａｇに必要な下記の合成遺伝子セグメントを作製した。
当業者は、類似するワクチン効力または遺伝子の増大した発現が手順の小さな変
化により、あるいは配列の小さな変化により達成され得ることを理解している。

【０１３６】ＤＮＡプラスミドＶ１Ｊｎｓ／ｔＰＡ／ｇｐ１４０ｏｐｔＡを、最適化するた
めに上記のように、詳しくは、ＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ９７／３１１５号に記
載されているように構築した。

【０１３７】雌性Ｂａｌｂ／Ｃマウス（１０匹／群）に、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔＰＡ／ｇｐ１４０
ｏｐｔＡおよびＶ１Ｊｎｓ／ｔＰＡｏｐｔｇａｇを１０μｇ（それぞれの構築
物の５μｇ）または１００μｇ（それぞれの構築物の５０μｇ）の用量で接種し
た。リン酸アルミニウム（２％溶液からのＡｌＰＯ_４）またはＣａＰＯ_４（２７
．５ｍｇ／１００ｍｌの貯蔵液）を、ＡｌＰＯ_４については１１μｇの最終的な
量で、ＣａＰＯ_４については１９μｇの最終的な量で加えた。コントロールには
、アジュバントおよび／または無ＤＮＡあるいはアジュバントを伴わないＤＮＡ
との接種配合物が含まれた。

【０１３８】図１１は、接種されたマウスにおけるｇｐ１２０抗体応答およびｇａｇ抗体応
答に対するＨＩＶのｅｎｇ／ｇａｇＤＮＡワクチン配合物に関する様々なアジュ
バントの効果を示す。抗体産生はＥＬＩＳＡによって測定された。ＨＢＶＤＮ
Ａワクチンに関して実施例７に示されているように、ＡｌＰＯ_４の存在下および
非存在下におけるＣＴＬ応答はほぼ等しかった。従って、アジュバント化ＨＩＶ
ｅｎｖ／ｇａｇ配合物の使用により、特異的なＣＴＬ応答を促進するワクチン
の能力は低下しなかった。

【０１３９】実施例１０ＤＮＡワクチンのアジュバントとしてのリン酸カルシウムの用量応答関係性リン酸カルシウム（種々の濃度で）を、ＨＢＶＤＮＡワクチンのアジュバン
トとして標準的な濃度のリン酸アルミニウムと比較した。３用量レベル（１０μ
ｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬおよび１０００μｇ／ｍＬ）のＨＢＶＤＮＡワク
チンを、１０ｍｇ／ｍＬ、３．３ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬまたは０．３ｍ
ｇ／ｍＬのリン酸カルシウムあるいは０．４５ｍｇ／ｍＬのリン酸アルミニウム
を含有するように配合した。総量が０．１ｍＬの配合されたワクチンを、１．０
μｇ、１０μｇまたは１００μｇのＤＮＡワクチン投薬量が達成されるようにＢ
ＡＬＢ／ｃマウスの２カ所の筋肉内部位に注射した。表１０に示されているよう
に、３つの低濃度のリン酸カルシウムと配合されたＨＢＶＤＮＡは、１００μ
ｇのワクチン用量に対する抗ＨＢｓ応答を約１０倍増大させた。最も高い濃度の
リン酸カルシウムにおいては、わずかに７％のＤＮＡがアジュバントに対して未
結合のままであり、この配合物に対する応答は２倍未満の増大であった。１０μ
ｇ用量のＨＢＶＤＮＡが投与されたマウス集団においては、リン酸アルミニウ
ムは、１０μｇのネイクドＤＮＡが投与された群と比較して、応答を約４０倍増
大させる強力なアジュバント効果を有していた。対照的に、１ｍＬあたり、１０
ｍｇ、３．３ｍｇまたは１ｍｇのリン酸カルシウムと配合されたＤＮＡは、ネイ
クドＤＮＡに対する応答の１０分の１未満の応答を誘導した。最少濃度のリン酸
カルシウム（０．３ｍｇ／ｍＬ）と配合されたＤＮＡワクチンが投与された群に
おいてのみ、アジュバント効果が１０μｇの用量レベルのＤＮＡワクチンについ
て認められた。リン酸カルシウムを含有する別々に調製されたワクチン（１０μ
ｇのＤＮＡ用量）の分析により、未結合ＤＮＡの割合は、０．３ｍｇ／ｍＬ、１
．０ｍｇ／ｍＬ、３．３ｍｇ／ｍＬおよび１０ｍｇ／ｍＬのリン酸カルシウムを
含有するワクチンにおいて、それぞれ、７３％、２６％、１％および０％である
ことが示された。まとめると、これらの結果は、リン酸カルシウムは、配合物が
相当量の遊離ＤＮＡを含有する場合にのみ、ＤＮＡワクチンの効果的なアジュバ
ントであり得ることを示している。ＤＮＡ用量が極端である場合、またはリン酸
カルシウム濃度が過大である場合、ＤＮＡワクチン配合物に対する抗体応答は阻
害され得る。

【０１４０】

【表１０】

【０１４１】実施例１１初回刺激抗原としてのＨＢＶＤＮＡワクチン／リン酸アルミニウム配合物Ｂ型肝炎ＤＮＡワクチンの２回の用量（用量あたり１００μｇのＶ１Ｊｎｓ．
Ｓ２．Ｓ）で初回刺激されたマウスにおける抗ＨＢｓ抗体産生を比較する研究を
、（１）リン酸アルミニウムの存在下、（２）リン酸アルミニウムの非存在下、
および（３）ＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標）で行った。これらの初回刺
激免疫原の後に、Ｖ１Ｊｎｓ．Ｓ２．２またはＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録
商標）のいずれかでの追加免疫が行われた。表１１には、追加免疫前および追加
免疫後のＨＢｓ抗体力価が示されている。ＤＮＡ／ＡｌＰＯ_４で初回刺激し、そ
の後、ＲｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標）で追加免疫することによって、Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｖａｘＨＢ（登録商標）による追加免疫の前の（リン酸アルミニウ
ムの非存在下での）ＤＮＡ初回刺激と比較した場合、ＨＢｓ抗体の約３００倍の
増大が得られたことを示している。

【０１４２】

【表１１】

【０１４３】実施例１２モルモットにおける単純ヘルペスＤＮＡワクチンの効力に対するリン酸アルミ
ニウムの効果ＨＳＶ−２糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）のアミノ末
端７０７アミノ酸をそれぞれコードするＶ１Ｊｎｓ：ｇＤプラスミドおよびＶ１
Ｊｎｓ：ΔｇＢプラスミドがＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら（１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１４１４〜１１４２０）に記載さ
れている。ワクチンを、Ｖ１Ｊｎｓ：ｇＤＤＮＡおよびＶ１Ｊｎｓ：ΔｇＢ
ＤＮＡを無菌ＰＢＳに希釈するか、またはＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）を４
５０μｇ／ｍＬの最終的なアルミニウム濃度で含有する無菌ＰＢＳに希釈するこ
とによって調製した。ワクチンを、穏やかに攪拌することによって十分に混合し
、次いで４℃で２４時間貯蔵した。注射直前に、ワクチン配合物を穏やかに攪拌
した。最初の免疫化を行ったときの体重が４５０ｇ〜５５０ｇの雌性Ｄｕｎｃａ
ｎＨａｒｔｌｅｙモルモット（ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ
；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、６μｇのＶ１Ｊｎｓ：ｇＤ＋２０μｇ
のＶ１Ｊｎｓ：ΔｇＢを９０μｇのアルミニウムの存在下または非存在下で含有
する２００μｌ総量（１００μＬ／大腿四頭筋）を注射した。動物は５週間目に
追加免疫された。４週間目および８週間目に得られる血清を、ｇＤ特異的ＥＬＩ
ＳＡおよびｇＢ特異的ＥＬＩＳＡ（ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら、１９９６、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１４１４〜１１４２０）を
使用して１：３０〜１：３０，０００の範囲の１０倍希釈物でアッセイした。終
点力価を、ＯＤ_４５０シグナルが同じ希釈における免疫前血清のシグナルよりも
＞０．０５である場合に血清希釈物は陽性と見なされることを除いて前記のよう
にして求めた（ＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１１４１４〜１１４２０）。これらの結果を表１
２に示す。

【０１４４】

【表１２】

【０１４５】実施例１３霊長類におけるインフルエンザＤＮＡワクチンの効力に対するリン酸アルミニ
ウムの効果アカゲサル−いずれかの性の５頭の若い成体アカゲサル群に、インフルエンザ
Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３（Ｈ３Ｎ２）のＨＡをコードし、リン酸塩緩衝
化生理食塩水に溶解されたか、または５００ｍｃｇ／ｍＬもしくは１０００ｍｃ
ｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムアジュバントを含むリン酸塩緩衝化生理食塩水に
溶解されたＶ１Ｊｎｓ−ＨＡ／Ｇｅｏｒｇｉａプラスミドの５００ｍｃｇ／ｍＬ
を含有する０．５ｍＬの溶液を両方の三頭筋に筋肉内注射した。別のコントロー
ル群には、ＨＡＤＮＡおよびアルミニウムが反対側の腕に投与された。免疫化
を時間０で行い、８週目に再度行った。動物から２週間間隔で採血し、血清を、
Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３に対する抗体について、赤血球凝集阻害（図１
２Ａ）およびＥＬＩＳＡ（図１２Ｂ）によって試験した。ＤＮＡと組み合わせた
リン酸アルミニウムアジュバントを使用することによって、抗体力価は、ＤＮＡ
単独またはＤＮＡおよびアジュバントが反対側の腕に投与された動物と比較して
増大していた。繰り返された測定の分散分析は、アルミニウムと混合されたＤＮ
Ａが投与された群の集められた抗体力価が、アルミニウムが投与されなかった群
またはアルミニウムおよびＤＮＡが反対側に腕に投与された群の集められた抗体
力価よりも著しく大きいことを示していた（Ｐ＜０．０５）。

【０１４６】チンパンジー−いずれかの性の４頭の成体チンパンジーに、インフルエンザＡ
／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３（Ｈ３Ｎ２）のＨＡをコードし、リン酸塩緩衝化
生理食塩水に溶解されたか、または５００ｍｃｇ／ｍＬのリン酸アルミニウムア
ジュバントを含むリン酸塩緩衝化生理食塩水に溶解されたＶ１Ｊｎｓ−ＨＡ／Ｇ
ｅｏｒｇｉａプラスミドの５００ｍｃｇ／ｍＬを含有する１．０ｍＬの容量を一
方の三頭筋に筋肉内注射した。免疫化を時間０で行い、そして６週目および１２
週目に行った。血清を２週間間隔で採取し、ＨＩ（ウイルス中和）およびＥＬＩ
ＳＡによって抗体についてアッセイした。表１３は、より大きな抗体応答が、ア
ルミニウムアジュバントとともにＤＮＡが投与された２頭の動物において認めら
れたこと、すなわち、アルム群の２頭のうち、１頭はＨＩ抗体の少なくとも４倍
の増大を有し、２頭ともウイルス中和の４倍の増大を有したこと、これに対して
、ＨＡＤＮＡ単独が投与された２頭の動物はこれらの応答を示さなかったこと
を示している。

【０１４７】

【表１３】

【０１４８】実施例１４ヒトにおけるインフルエンザＤＮＡワクチンの効力に対するリン酸アルミニウ
ムの効果インフルエンザＡ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３（Ｈ３Ｎ２）のＨＡをコード
するＶ１Ｊｎｓ−ＨＡ／Ｇｅｏｒｇｉａプラスミド（ＩＤＶ）またはプラシーボ
を様々な投薬量のリン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ_４）の存在下および非存在下で
投与して、ＡｌＰＯ_４が免疫性を増強するかどうかを調べた。年齢が１８才〜４
５才の７８名の健康な被験者が１つの機関（ＪｏｈｎｓＨｏｐｋｉｎｓ大学）
に集められた。赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価が＞１／３２である被験者は除かれ
た。被験者は０日目ならびに２ヶ月目および６ヶ月目にワクチンが投与された。
このＤＮＡワクチンは、単独またはＡｌＰＯ_４との組み合わせで投与されたが、
一般には健康な成人においては十分に寛容であった。Ｖ１Ｊｎｓ−ＨＡ／Ｇｅｏ
ｒｇｉａプラスミドの用量は０μｇ〜５００μｇの範囲であり、リン酸アルミニ
ウムの用量は、この特定の研究においては０μｇ〜７００μｇの範囲であった。
本明細書中に記されているように、本発明を実施するときにＤＮＡおよびアジュ
バントのこのような別の組み合わせを用いることは当業者の範囲内である。その
ような別の組み合わせは、溶解性などの物理的パラメーターならびに患者に対す
る治療的影響および予防的影響に制限されるだけであり得る。表１４には、免疫
化された３週間後における抗体産生の少なくとも４倍の増大を示した被験者の割
合が示されている。ＤＮＡとともに７００μｇのＡｌＰＯ_４を添加することによ
り、ＨＩおよび中和抗体の応答を誘発するＤＮＡワクチンの能力が増強されたこ
とは明らかである。この点は、様々なＡｌＰＯ_４濃度の存在下または非存在下で
のＶ１Ｊｎｓ−ＨＡ／Ｇｅｏｒｇｉａプラスミドによる最初の用量（０日目）前
および２回目の用量の３週間後におけるＨＩおよび中和抗体の相乗平均力価の比
較を示す表１５にさらに示されている。従って、核酸分子と実質的に結合しない
アジュバント（リン酸アルミニウムなど）と一緒に使用される核酸分子を含むＤ
ＮＡワクチン配合物（インフルエンザＤＮＡワクチンなど）は、宿主の免疫応答
を顕著に増大させる。

【０１４９】

【表１４】

【０１５０】

【表１５】

【０１５１】実施例１５リン酸アルミニウムと配合されたＨＢｓＤＮＡワクチンに対する増強されたサ
イトカイン分泌Ｔ細胞の応答本実施例の場合、マウスは、大部分は実験開始時において６週齢〜８週齢であ
った。アジュバントの濃度をカルシウムまたはアルミニウムの含有量に基づいて
計算した。ワクチン配合物を、注射する１時間以内に、（生理食塩水中の）プラ
スミドＤＮＡを、０．８５％ＮａＣｌ中の様々な濃度のリン酸カルシウムまたは
リン酸アルミニウムと混合することによって調製した。本実施例において用いら
れたＨＢｓＤＮＡ構築物は実施例７に記載されている。本実施例で使用されたＢ
型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）は、ＨｂｓＡｇのａｄｗサブタイプの遺伝子を含
有するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅから得られた。特定
の実験においては、ＨＢｓＡｇは水酸化アルミニウムアジュバントとともに１０
μｇ〜２０μｇのＨＢｓＡｇ／４５０μｇアルミニウム／ｍＬで配合された。

【０１５２】サイトカイン産生に関するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。免疫化マウスの脾臓細胞
を、以前の方法［２５〜２７］を改変することによって、抗原性ペプチドによる
インビトロ再刺激時におけるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の分泌能についてアッセ
イした。簡単に記載すると、９６ウエルのポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤ
Ｆ）支持プレート（ＭＡＩＰＮＯＢ１０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒ
ｄ、ＭＡ）を、（ＩＦＮ−γ）に対する抗体（クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒ
ｍｉｎｇｅｎ＃１８１８１Ｄ）またはＩＬ−２に対する抗体（クローンＪＥＳ６
−１Ａ１２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃１８１６１Ｄ）でコーティングし、ＰＢＳ
で３回洗浄し、次いで、１０％の熱不活性化ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４
０培地でブロッキングした。細胞を、既知のＣＴＬエピトープ（ＩＰＱＳＬＤＳ
ＷＷＴＳＬ）に対応する規定されたペプチドまたは新しく同定されたヘルパーエ
ピトープ（ＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＧＫ）による再刺激のために０．１ｍＬ
の培地においてウエルあたり５×１０^５個で培養した。３７℃で１８時間〜２４
時間インキュベーションした後、プレートを、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を
含有するＰＢＳで６回洗浄した。発色抗体は、ビオチン化抗マウス（ＩＦＮ−γ
）のクローンＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ＃１８１１２Ｄ）またはビオ
チン標識抗マウスＩＬ−２のクローンＪＥＳ６−５Ｈ４（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ
＃１８１７２Ｄ）であった。プレートをさらに５回洗浄し、その後、ストレプト
アビジン−ＨＲＰ結合体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈＡｓｓｏｃ．、
Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ；＃７１００−０５）を加えた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅ
ｎで３回洗浄し、そしてＰＢＳで３回洗浄した後、スポットを３−アミノ−９−
エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ＃Ａ６９２６）で発色させた。スポットを、立
体顕微鏡を使用して計数した。

【０１５３】このＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、抗原性ペプチドによるインビトロ再
刺激が行われたときにインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）またはＩＬ−２を分
泌するＴ細胞の数を求めた。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１０μｇのＶ１Ｒ．ＳＤ
ＮＡ±リン酸アルミニウムで０日目および２１日目に免疫化した。８日後、脾臓
細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために集めた。ＩＦＮ−γ応答は、ＣＴＬの誘
導に加えて、ＣＤ８Ｔ細胞を刺激してＩＦＮ−γを産生するＨＢｓペプチド［
２８−３９］の存在下での一晩の培養によって誘発された。図１３Ａに示されて
いるように、ＨＢＶＤＮＡ＋リン酸アルミニウムで免疫化されたマウスは、Ｄ
ＮＡワクチン単独で免疫化されたマウスがもたらすよりも約５倍大きなＥＬＩＳ
ＰＯＴ値をもたらした。さらに、Ｔ細胞の親和性は、検出可能な応答が、ネイク
ドＤＮＡで免疫化されたマウスと比較して、ＨＢＶＤＮＡ＋リン酸アルミニウ
ムで免疫化されたマウスにおいて５倍〜１０倍低いペプチド濃度で誘発され得る
ために増大しているようであった。同様に、ＨＢＶ＋リン酸アルミニウムによる
免疫化は、ＨＢＶＤＮＡ単独の注射によって生じるよりも強いＩＬ−２のＥＬ
ＩＳＰＯＴ応答を誘発した（図１３Ｂ）。ＩＬ−２応答は、ＨＢｓタンパク質全
体を含む一組の（１アミノ酸ずつずらした）１５ｍｅｒペプチドをスクリーニン
グすることにより同定された１５ｍｅｒのＨＢｓペプチド［１４６−１６０］で
誘発された。このペプチドに対する応答はＣＤ４Ｔ細胞により媒介される（デ
ータは示さず）。ＩＦＮ−γのＥＬＩＳＰＯＴ応答の場合に認められているよう
に、ＨＢＶＤＮＡ＋リン酸アルミニウムによる免疫化は、ＨＢＶＤＮＡ単独
による免疫化によって生じるよりも大きな１５ｍｅｒペプチド親和性を有するＴ
細胞を誘発するようである。興味深いことに、アジュバントはまたＥＬＩＳＰＯ
Ｔの質を改善した。スポットのサイズおよび強度の両方が、ＨＢＶＤＮＡワク
チンに対するＩＦＮ−γおよびＩＬ−２のＴ細胞応答に関して増大した。

【０１５４】より高感度のＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ＤＮＡ±リン酸アルミニウ
ムに対するＴ細胞応答を測定することによって、このデータは、ＨＢＶペプチド
抗原に対する増強されたサイトカイン応答を例示している。ＨＢｓＡｇに対する
ＴＨ１サイトカイン応答を評価するためには、何もこれまで報告されていなかっ
たために、ＣＤ４Ｔ細胞エピトープを最初に同定することが必要であった。こ
れは、ＨＢＶＤＮＡワクチン−免疫マウスにおけるＩＬ−２応答を誘発し得る
ＴＨエピトープとしてＨＢｓ［１４６−１６０］が同定されるＨＢｓの全タンパ
ク質配列を網羅して重複する１５ｍｅｒ体からなるＨＢｓペプチド集団（ｐｅｐ
ｓｅｔ）をスクリーニングすることによって達成された。リン酸アルミニウムと
配合されたＨＢＶＤＮＡによるＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、ＥＬＩＳＰＯ
Ｔアッセイにおいてこのペプチドで再刺激されたときにＩＬ−２を産生するＴ細
胞の数および見かけの親和性をともに増大させた。同様に、ＨＢＶＤＮＡ＋リ
ン酸アルミニウムは、知られているＣＴＬエピトープのＨＢｓ［２８−３９］に
対するＩＦＮ−γＴ細胞応答の数および親和性を増強した。ＩＬ−４およびＩＬ
−５を含むＴＨ２サイトカイン応答は、ＨＢＶＤＮＡ±リン酸アルミニウムで
免疫化されたマウスにおいて検出されなかった。この発見と一致して、抗体応答
のアイソタイププロフィルもまたＴＨ１に特徴的であり、アジュバント化ＤＮＡ
ワクチンによる追加免疫によりこの応答が優先的に高められている。従って、本
実施例により、「アルム」アジュバントは、ＤＮＡワクチンの効力を、非常に効
き目のある生の弱毒化ウイルスワクチンに特徴的な細胞媒介免疫性を誘導するそ
の特徴的な能力に影響を及ぼすことなく増強できることが明らかにされる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】０．５μｇおよび１０μｇのＤＮＡＨＡ用量で１回の注射を行った４週間後
のマウスにおける抗ＨＡ抗体力価の生成に対するリン酸アルミニウムの効果を示
す。

【図１Ｂ】０．５μｇおよび１０μｇのＤＮＡＨＡ用量で１回の注射を行った８週間後
のマウスにおける抗ＨＡ抗体力価の生成に対するリン酸アルミニウムの効果を示
す。

【図２Ａ】０．５μｇ（図２Ａ）のＤＮＡＨＡ用量でのリン酸アルミニウムの注射（●
）および非注射（■）におけるＦＲ−９５０２ＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉ
ａ／９３）の単回接種後のマウスにおける抗ＨＡ抗体力価の経時変化測定を示す
。

【図２Ｂ】１０μｇ（図２Ｂ）のＤＮＡＨＡ用量でのリン酸アルミニウムの注射（●）
および非注射（■）におけるＦＲ−９５０２ＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ
／９３）の単回接種後のマウスにおける抗ＨＡ抗体力価の経時変化測定を示す。

【図３Ａ】ＦＲ−９５０２ＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）の単回接種後の抗
ＨＡ抗体産生によって測定されるマウスにおける免疫応答が様々なＤＮＡ用量に
より増強されることを示している。

【図３Ｂ】ＦＲ−９５０２ＨＡＤＮＡ（Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／９３）の単回接種後の抗
ＨＡ抗体産生によって測定されるマウスにおける免疫応答が様々なＤＮＡ用量に
より増強されることを示している。

【図４】図４は、５μｇおよび５０μｇのＤＮＡ用量でリン酸アルミニウムの存在下お
よび非存在下でＮＰプラスミドＤＮＡが接種された後のマウスにおける、１回の
注射を行った６週間後および２回の注射を行った３週間後の抗ＮＰ抗体応答の増
強を示す。

【図５Ａ】図５Ａ（ＩＬ−２）は、１回、２回または３回の注射により５ｍｃｇおよび５
０ｍｃｇのＤＮＡ用量でＮＰプラスミドＤＮＡが接種されたマウス（１回の注射
を行った６週間後および２回の注射を行った３週間後）の抗原再刺激脾臓細胞か
らのそれぞれのサイトカイン分泌に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図５Ｂ】図５Ｂ（ＩＮＦ−γ）は、１回、２回または３回の注射により５ｍｃｇおよび
５０ｍｃｇのＤＮＡ用量でＮＰプラスミドＤＮＡが接種されたマウス（１回の注
射を行った６週間後および２回の注射を行った３週間後）の抗原再刺激脾臓細胞
からのそれぞれのサイトカイン分泌に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図５Ｃ】図５Ｃ（ＩＬ−４）は、１回、２回または３回の注射により５ｍｃｇおよび５
０ｍｃｇのＤＮＡ用量でＮＰプラスミドＤＮＡが接種されたマウス（１回の注射
を行った６週間後および２回の注射を行った３週間後）の抗原再刺激脾臓細胞か
らのそれぞれのサイトカイン分泌に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図５Ｄ】図５Ｄ（ＩＬ−１０）は、１回、２回または３回の注射により５ｍｃｇおよび
５０ｍｃｇのＤＮＡ用量でＮＰプラスミドＤＮＡが接種されたマウス（１回の注
射を行った６週間後および２回の注射を行った３週間後）の抗原再刺激脾臓細胞
からのそれぞれのサイトカイン分泌に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図６Ａ】ＮＰプラスミドＤＮＡ接種をマウスに１回接種した後における細胞傷害性Ｔリ
ンパ球応答に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図６Ｂ】ＮＰプラスミドＤＮＡ接種をマウスに１回接種した後における細胞傷害性Ｔリ
ンパ球応答に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図６Ｃ】ＮＰプラスミドＤＮＡ接種をマウスに１回接種した後における細胞傷害性Ｔリ
ンパ球応答に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図６Ｄ】ＮＰプラスミドＤＮＡ接種をマウスに１回接種した後における細胞傷害性Ｔリ
ンパ球応答に対するリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図７】図７は、Ｂ型肝炎表面抗原をコードするＤＮＡワクチン（Ｖ１Ｒ．Ｓ）のマウ
ス接種に対する抗体応答におけるリン酸アルミニウムの効果を示す。

【図８】図８は、マウスに１回注射した６週間後のＨＢｓＡｇ抗体産生に対する、アジ
ュバントの存在下および非存在下で投薬されたＨＢＶＤＮＡワクチン（Ｖ１Ｒ
．Ｓ）の効果を示す。

【図９】図９は、図８に関して開示された投薬効果に関する４２日目における２回目の
用量の効果（６３日目での採血）を示す。

【図１０】図１０は、リン酸アルミニウムアジュバント（４５μｇ／１００μｌサンプル
）を含む配合物およびリン酸アルミニウムアジュバントを含まない配合物に関す
るＶ１Ｒ．Ｓを用いたＤＮＡワクチン接種に対して応答するＣＴＬ応答の誘導を
示す。

【図１１】図１１は、ＨＩＶのｅｎｖ／ｇａｇＤＮＡプラスミド構築物をマウスに接種
した後のｇｐ１２０抗体応答およびｇａｇ抗体応答に対するリン酸アルミニウム
またはリン酸化カルシウムの効果を示す。

【図１２Ａ】ＦＲ−９５０２ＤＮＡを単回接種した後のアカゲサルにおける抗ＤＮＡ抗体力
価の経時変化測定を示す。

【図１２Ｂ】ＦＲ−９５０２ＤＮＡを単回接種した後のアカゲサルにおける抗ＤＮＡ抗体力
価の経時変化測定を示す。

【図１３Ａ】ＢＡＬＢ／ｃマウスが１０μｇのＨＢＶＤＮＡワクチン±リン酸アルミニウ
ムで０日目および２１日目に免疫化されたことを示す。

【図１３Ｂ】ＢＡＬＢ／ｃマウスが１０μｇのＨＢＶＤＮＡワクチン±リン酸アルミニウ
ムで０日目および２１日目に免疫化されたことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者エバンズ，ロバート・ケイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者ウルマー，ジエフリイ・ビイーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者コウルフイールド，マイケル・ジエイアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 Ｆターム(参考） 4C084 AA13 NA14 ZA751 ZA752 ZB071 ZB072 ZB111 ZB112 ZB131 ZB132 ZB261 ZB262 ZB331 ZB332 4C085 AA03 AA38 BA09 BA55 BA69 BA78 BA88 BA89 BA92 CC21 EE06 FF01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）鉱物系の負荷電アジュバント；および（ｂ）少なくとも１つの抗原をコードするポリヌクレオチドワクチンを含む薬学的配合物であって、前記配合物の脊椎動物宿主への導入は、予防的ま
たは治療的な免疫応答が誘導されるように生物学的に効果的な量の前記抗原（１
つまたは複数）の発現をもたらす薬学的配合物。
【請求項２】前記鉱物アジュバントはリン酸アルミニウム系アジュバント
である、請求項１に記載の薬学的配合物。
【請求項３】前記リン酸アルミニウム系アジュバントのＰＯ_４／Ａｌモル
比は実質的に核酸分子と結合しない、請求項２に記載の薬学的配合物。
【請求項４】前記ＰＯ_４／Ａｌモル比は約０．９である、請求項３に記載
の薬学的配合物。
【請求項５】前記リン酸アルミニウム系アジュバントはＡｄｊｕ−Ｐｈｏ
ｓ（登録商標）である、請求項３に記載の薬学的配合物。
【請求項６】前記リン酸アルミニウム系アジュバントはＡｄｊｕ−Ｐｈｏ
ｓ（登録商標）である、請求項４に記載の薬学的配合物。
【請求項７】前記ポリヌクレオチドワクチンは前記抗原を発現し、その結
果、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトインフルエンザ、Ａ
型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、結核、腫瘍成長、自己免疫
異常およびアレルギーからなる群から選択される疾患または異常に対する予防的
または治療的な免疫応答を誘導する、請求項５に記載の薬学的配合物。
【請求項８】前記ポリヌクレオチドワクチンは前記抗原を発現し、その結
果、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトインフルエンザ、Ａ
型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、結核、腫瘍成長、自己免疫
異常およびアレルギーからなる群から選択される疾患または異常に対する予防的
または治療的な免疫応答を誘導する、請求項６に記載の薬学的配合物。
【請求項９】前記ポリヌクレオチドワクチンは前記抗原を発現し、その結
果、狂犬病、ジステンパー、口蹄役、炭疽病、ウシ単純ヘルペスおよびウシ結核
からなる群から選択される獣医学的な疾患または異常に対する予防的または治療
的な免疫応答を誘導する、請求項５に記載の薬学的配合物。
【請求項１０】前記ポリヌクレオチドワクチンは前記抗原を発現し、その
結果、狂犬病、ジステンパー、口蹄役、炭疽病、ウシ単純ヘルペスおよびウシ結
核からなる群から選択される獣医学的な疾患または異常に対する予防的または治
療的な免疫応答を誘導する、請求項６に記載の薬学的配合物。
【請求項１１】前記ポリヌクレオチドワクチンはＤＮＡプラスミドである
、請求項７に記載の薬学的配合物。
【請求項１２】前記ポリヌクレオチドワクチンはＤＮＡプラスミドである
、請求項８に記載の薬学的配合物。
【請求項１３】前記ポリヌクレオチドワクチンはＤＮＡプラスミドである
、請求項９に記載の薬学的配合物。
【請求項１４】前記ポリヌクレオチドワクチンはＤＮＡプラスミドである
、請求項１０に記載の薬学的配合物。
【請求項１５】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項３に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物に導入することを含む方法。
【請求項１６】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項４に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物に導入することを含む方法。
【請求項１７】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項５に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物に導入することを含む方法。
【請求項１８】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項６に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物に導入することを含む方法。
【請求項１９】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項１
５に記載の方法。
【請求項２０】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項１
６に記載の方法。
【請求項２１】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項１
７に記載の方法。
【請求項２２】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項１
８に記載の方法。
【請求項２３】前記導入方法は筋肉内である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】前記導入方法は筋肉内である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】前記導入方法は筋肉内である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】前記導入方法は筋肉内である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】前記鉱物アジュバントはリン酸カルシウム系アジュバント
である、請求項１に記載の薬学的配合物。
【請求項２８】前記ポリヌクレオチドワクチンは前記抗原を発現し、その
結果、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトインフルエンザ、
Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、結核、腫瘍成長、自己免
疫異常およびアレルギーからなる群から選択される疾患または異常に対する予防
的または治療的な免疫応答を誘導する、請求項２７に記載の薬学的配合物。
【請求項２９】前記ポリヌクレオチドワクチンは前記抗原を発現し、その
結果、狂犬病、ジステンパー、口蹄役、炭疽病、ウシ単純ヘルペスおよびウシ結
核からなる群から選択される獣医学的な疾患または異常に対する予防的または治
療的な免疫応答を誘導する、請求項２７に記載の薬学的配合物。
【請求項３０】前記ポリヌクレオチドワクチンはＤＮＡプラスミドである
、請求項２８に記載の薬学的配合物。
【請求項３１】前記ポリヌクレオチドワクチンはＤＮＡプラスミドである
、請求項２９に記載の薬学的配合物。
【請求項３２】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項２７に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物宿主に導入することを含む方法
。
【請求項３３】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項２８に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物宿主に導入することを含む方法
。
【請求項３４】脊椎動物宿主における免疫応答を誘導する方法であって、
請求項２９に記載の薬学的配合物を前記脊椎動物宿主に導入することを含む方法
。
【請求項３５】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項３
２に記載の方法。
【請求項３６】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項３
３に記載の方法。
【請求項３７】前記薬学的配合物の導入は、非経口的送達、吸入送達およ
び経口的送達からなる群から選択されるように前記宿主に導入される、請求項３
４に記載の方法。
【請求項３８】前記導入方法は筋肉内である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】前記導入方法は筋肉内である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】前記導入方法は筋肉内である、請求項３７に記載の方法。