ES2117052T5

ES2117052T5 - Induccion de respuestas de linfocitos t citotoxicos.

Info

Publication number: ES2117052T5
Application number: ES92917479T
Authority: ES
Inventors: Syamal Raychaudhuri; William H. Rastetter
Original assignee: Idec Pharmaceuticals Corp
Current assignee: Idec Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1991-07-25
Filing date: 1992-07-24
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2012-07-24
Also published as: ZA925614B; DE69225710D1; JPH06509344A; FI940335A0; BG62240B1; SK8994A3; FI109335B; FI108114B; EP0596032B2; NO940218D0; US6270769B1; HU9400202D0; EP0596032B1; DE69225710T2; HU211299A9; JP3939746B2; PH30906A; NO317203B1; MX9204376A; ES2117052T3

Abstract

SE PRESENTAN METODOS Y COMPOSICIONES UTILES PARA INDUCIR UNA RESPUESTA CITOTOXICA DEL LINFOCITO T (CTL) EN UN HUMANO O UN ANIMAL DOMESTICO O AGRICOLAMENTE IMPORTANTE. EL METODO INCLUYE LOS PASOS DE SUMINISTRAR EL ANTIGENO AL CUAL SE DESEA LA RESPUESTA CTL Y SUMINISTRAR UNA FORMULACION DE ANTIGENO QUE COMPRENDE, CONSTA O CONSISTE ESENCIALMENTE DE DOS O MAS DETERGENTES ESTABILIZANTES, UN AGENTE FORMADOR DE MICELO, Y UN ACEITE. ESTA FORMULACION DE ANTIGENO ES PREFERIBLEMENTE CARENTE DE UN COMPONENTE PEPTIDO INMUNOESTIMULANTE, O TIENE NIVELES SUFICIENTEMENTE BAJOS DE DICHO COMPONENTE QUE NO DISMINUYAN LA DESEADA RESPUESTA CTL. ESTA FORMULACION SE SUMINISTRA COMO UNA EMULSION DE ACEITE EN AGUA ESTABLE.

Description

Inducción de respuestas de linfocitos T citotóxicos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a composiciones útiles para inducir respuestas mediadas por las células T citotóxicas en humanos, y animales domésticos o agrícolas.

Se cree que los linfocitos T citotóxicos (CTL) son el principal mecanismo de defensa del huésped en respuesta a una variedad de infecciones víricas y al desarrollo neoplástico o canceroso. Esta células eliminan las células infectadas o transformadas reconociendo fragmentos antigénicos asociados con diferentes moléculas (denominadas moléculas MHC de clase I) sobre las células infectadas o transformadas. Los CTL pueden ser inducidos experimentalmente mediante la carga citoplásmica de ciertos antígenos solubles dentro de las células específicas. La inmunización con el antígeno soluble solo es generalmente insuficiente para la inducción del linfocito T citotóxico específico.

Un método por el cual se puede inducir la respuesta de los CTL implica la utilización de técnicas de ingeniería recombinante para incorporar componentes críticos de un antígeno en cuestión en el genoma de un agente infeccioso benigno. El propósito de tal estrategia es generar respuestas del linfocito T citotóxico específicas del antígeno para el epitopo deseado sometiendo el huésped a una infección auto-limitante, suave. Se han descrito vectores quiméricos que utilizan el virus vaccinia, el de la polio, adeno- y retro-virus, así como bacterias tales como Listeria y BCG. Por ejemplo, Takahashi et al. 85 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 3105, 1988 describen la utilización del virus vaccinia recombinante que expresa el gen para gp160 de la envuelta de HIV como una herramienta potencial para la inducción de los linfocitos T citotóxicos.

Un segundo método por el cual se puede inducir una respuesta mediada por células implica la utilización de coadyuvantes. Si bien la técnica aparece repleta con la discusión sobre la utilización de coadyuvantes, no está claro en tal técnica si la inmunidad mediada por células era inducida y si tal inmunidad mediada por células incluía una respuesta de los linfocitos T citotóxicos. Las siguientes, no obstante, son representativas de varias publicaciones en este área.

Stover et al., 351 Nature 456, 1991 describen una respuesta de CTL a la \beta-galactosidasa utilizando BCG recombinante que contiene un gen de \beta-galactosidasa. No se detectó tal respuesta utilizando coadyuvante incompleto de Freund y \beta-galactosidasa.

Mitchell et al., 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 describen el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico con un coadyuvante denominado "DETOX" y productos lisados de melanoma alogénicos administrados cinco veces a lo largo de un período de seis semanas. En una pequeña proporción de los pacientes se observó un incremento en células T citolíticas. Los autores describen la necesidad de aumentar el nivel de producción de linfocitos T citotóxicos, y sugieren una terapia combinada de coadyuvante con Interleuquina-2, así como un pretratamiento con ciclofosfamida para disminuir el nivel de células T supresoras específicas del tumor que pudieran existir. El DETOX incluye endotoxina destoxificada (monofosforil lípido A) de Salmonella minnesota, esqueletos de paredes celulares de Mycobacterium phlei, aceite de escualeno y emulsionante.

Allison y Gregoriadis, 11 Immunology Today 427, 1990 observan que el único coadyuvante "autorizado para su uso" en vacunas humanas son las sales de aluminio (alum) que no logran consecuentemente una inmunidad mediada por células. Allison y Gregoriadis afirman que "hay, por lo tanto, una necesidad de desarrollar coadyuvantes con la eficacia del coadyuvante de Freund completo pero sin sus diferentes efectos secundarios tales como los granulomas". Ellos continúan hasta afirmar que existen tres posibles estrategias, por ejemplo, la utilización de liposomas; la utilización de coadyuvantes, denominados complejos inmunoestimulantes (ISCOM "por Immunostimulating Complexes" que incluyen saponina o Quil A (un triterpenoide con dos cadenas carbohidratadas), colesterol, y fosfatidilcolina) que están autorizados para su utilización en un vacuna para la influenza en caballos (Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); y la utilización de una emulsión (SAF®) de escualeno o Squalane (con o sin agente plurónico) y muramildipéptido (MDP). Se dice que el SAF logra una inmunidad mediada por células en ratones, aunque "se ha pensado durante mucho tiempo que los antígenos de la subunidades no pueden lograr las respuestas de las células T citotóxicas (CTL)".

Takahashi et al., 344 Nature 873, 1990, describen la inducción de los linfocitos T auxiliares y citotóxicos restringidos de la clase II mediante la utilización de ISCOM® con una inmunización subcutánea sencilla en ratones. Afirman que el coadyuvante de Freund, el coadyuvante de Freund incompleto, y la solución salina tamponada con fosfato no inducían la actividad de los linfocitos T citotóxicos contra las dianas en las que ellos estaban interesados. Afirman que, en contraste con los resultados con otras formas de antígeno protéico soluble exógeno, han demostrado que es posible cebar CTL CD8^{+} CD4^{-} restringidos de clase I del MHC específicos del antígeno mediante inmunización con proteína intacta exógena utilizando ISCOM®. Asimismo afirman que los experimentos descritos sugieren que puede ser posible lograr CTL humanos utilizando ISCOM® que contengan proteínas de HIV, y que las vacunas a base de ISCOM pueden lograr el objetivo largamente ambicionado de la inducción tanto de CTL como de anticuerpos mediante una proteína purificada.

Byars y Allison, 5 Vaccines 223, 1987 describen la utilización de SAF®-1 que incluye TWEEN® 80, PLURONIC® L121, y escualeno o Squalane, con o sin muramildipéptido, y sugieren que sus datos indican que la formulación con muramildipéptido será útil para vacunas humanas y veterinarias. Se proporcionaron dosis de refuerzo del coadyuvante sin el amildipéptido. Se dice que el muramildipéptido aumenta la producción de anticuerpo significativamente por encima de la utilización del coadyuvante sin el muramildipéptido. La inmunidad mediada por células se midió como una hipersensibilidad de tipo retardado mediante pruebas en la piel para determinar la inducción de células T auxiliares. Tal hipersensibilidad era más fuerte y más sostenida cuando se proporcionaba muramildipéptido en el coadyuvante. Se describen coadyuvantes similares en Allison et al., Patente Estadounidense 4.770.874 (donde se afirma que una combinación de muramildipéptido y poliol plurónico es esencial para lograr una potente respuesta mediada por células y humoral contra la ovalbúmina); Allison et al., Patente Estadounidense 4.772.466; Murphy-Corb et al., 246 Science 1293, 1989 (donde se afirma que la utilización de coadyuvantes combinados con muramildipéptido podría intensificar la inducción de las armas tanto humorales como celulares de la respuesta inmune); Allison y Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (donde se afirma que la inmunidad mediada por células es lograda por el SAF® (con muramildipéptido) como se muestra mediante la hipersensibilidad de tipo retardado, mediante las respuestas proliferativas de las células T a los antígenos, mediante la producción de Interleuquina-2, y mediante la lisis genéticamente restringida específica de células diana que portan el antígeno inmunizante); Allison y Byars, Immunopharmacology of Infectious Diseases: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191-201, 1987; Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1989; Kenney et al., 121 J. Immunological Methods 157, 1989; Allison y Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (donde se demostró que las sales de aluminio y las emulsiones de aceite mineral aumentan la formación de anticuerpos, pero no la inmunidad mediada por células; y las formulaciones de muramil-dipéptido demostraron provocar la inmunidad mediada por células); Byars et al., 8 Vaccine 49, 1990 donde se afirma que su formulación coadyuvante aumenta marcadamente las respuestas humorales, y en un grado menor aumenta las reacciones mediadas por células del antígeno para la hemaglutinina de la influenza); Allison y Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 que afirman que la función del muramildipéptido es inducir la expresión de las citoquinas y aumentar la expresión de los genes de la histocompatibilidad (MHC) principal; y que se obtenían mejores anticuerpos y respuestas celulares que con otros coadyuvantes, y que se espera averiguar si son eficaces en humanos estrategias similares); Allison y Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (que describe la inmunidad mediada por células utilizando SAF); Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (que proporciona una visión de conjunto de los diferentes coadyuvantes utilizados en la preparación de vacunas); Allison y Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (que afirma que la adición del muramildipéptido al coadyuvante aumenta marcadamente las respuestas mediadas por células para una variedad de antígenos, incluyendo las inmunoglobulinas monoclonales y los antígenos de virus); y Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1989 (que describe la utilización de SAF-1 para la preparación de una vacuna para el virus de Epstein-Barr).

Kwak et al., Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, pág. 163, 1990 describen la utilización de SAF sin muramildipéptido como coadyuvante para un idiotipo de linfoma de las células B en un humano. Específicamente, se administró con el idiotipo una emulsión de pluronic L121, Squalane, y TWEEN-80 al 0,4% en solución salina tamponada con fosfato. Ellos afirman que ``la adición de un coadyuvante deberá aumentar adicionalmente ... las respuestas humorales, y pueden facilitar también la inducción de respuestas celulares.

Entre otras preparaciones inmunológicas se incluyen los liposomas (Allison et al., Patentes Estadounidenses Núm. 4.053.585, y 4.117.113); péptidos cíclicos (Dreesman et al., Patente Estadounidense Núm. 4.778.784); Coadyuvante Completo de Freund (Asheron et al., 22 Immunology 465, 1972; Berman et al., 2 International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immunopotentiation 73, 1973; y Allison, Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOMs (Levtin et al., 87 Vaccines 209, 1987); coadyuvantes que contiene agentes de polímeros de bloques no iónicos formados con aceite mineral, un agente tensioactivo y TWEEN 80 (Hunter y Bennett, 133 J. Immunlogy 3167, 1984; y Hunter et al., 127 J. Immunology 1244, 1981); coadyuvantes compuestos de aceite mineral y agente emulsionante con o sin micobacterias eliminadas (Sánchez-Pescador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988); y otros coadyuvantes tales como un derivado lipofílico de muramil-tripéptido, y un muramildipéptido conjugado covalentemente a una proteína recombinante (id.).

Compendio de la invención

El solicitante ha descubierto composiciones seguras y ventajosas mediante las cuales se pueden inducir respuestas de los CTL en humanos y animales de importancia doméstica o agrícola. Las composiciones comprenden una formulación antigénica que tiene poca o ninguna toxicidad para los animales, y carece de un péptido inmunoestimulante, (v.g., muramildipéptido) cuya presencia disminuiría la respuesta celular deseada. Además, las composiciones son simples de utilizar y no requieren un trabajo extensivo in vivo para alterar las células existentes mediante técnicas de ADN recombinante para hacerlas inmunogénicas. Este descubrimiento es sorprendente puesto que era inesperado que tal respuesta de los CTL pudiera ser inducida por la utilización de tal formulación antigénica carente de péptidos inmunoestimulantes o sus equivalente. Los descubrimientos del solicitante permiten utilizar tales formulaciones antigénicas en un amplio espectro de estados de enfermedad, o como agentes profilácticos. Por ejemplo, tal administración de la formulación antigénica puede ser utilizada para el tratamiento de enfermedades virales en las que es importante la respuesta de los CTL, por ejemplo, en el tratamiento de la infección por HIV o influenza; asimismo puede ser ampliada para su utilización en el tratamiento de infecciones bacterianas, cáncer, infecciones por parásitos, y similares. Como agente profiláctico, la formulación antigénica con un antígeno adecuado es útil en la prevención por virus responsables de las enfermedades virales anteriormente mencionadas, concretamente la profilaxis de la infección por HIV, y también para la profilaxis de pacientes con riesgo de cáncer, por ejemplo tras la resección de un tumor primario.

La invención proporciona una composición que comprende un antígeno mezclado con una formulación antigénica microfluidificada que comprende:

(a) un detergente estabilizante que es polisorbato 80,

(b) un agente formador de micelas que es poloxamer 401, y

(c) un aceite biodegradable y biocompatible que es escualano, careciendo dicha formulación antigénica de un componente peptídico inmunoestimulante, e induciendo dicha composición a una respuesta T-linfocitaria citotóxica en un ser humano o un animal doméstico o agrícola, donde el antígeno no es una albúmina, un antígeno linfoma de células B, HIV gp160 o un derivado inmunológico del mismo, o glicoproteina D del herpes virus simplex o un fragmento inmunológico del mismo.

La invención proporciona composiciones de la invención para su utilización en el tratamiento terapéutico o profiláctico de un humano o un animal doméstico (v.g. gato o perro) o un animal agrícola (v.g. un caballo, vaca o cerdo) induciendo una respuesta de los CTL.

La formulación antigénica carece de cualquier componente peptídico inmunoestimulante, o tiene niveles tan suficientemente bajos de tal componente que no disminuye la respuesta celular deseada. La formulación es proporcionada en forma de una emulsión de aceite en agua estable. Esto es, cada uno de los diferentes componentes es elegido de manera que la emulsión permanezca en estado de emulsión durante un período de tiempo de al menos un mes, y preferiblemente durante más de un año, sin separación de fases. El antígeno y la formulación antigénica se mezclan para formar una mezcla mediante microfluidificación. La composición puede ser administrada al animal en una cantidad suficiente para inducir la respuesta de los CTL en el animal. Tal administración es requerida sólo una vez.

Por "detergente estabilizante" se entiende un detergente que permite que los componentes de la emulsión permanezcan en forma de una emulsión estable. El detergente es polisorbato 80 (TWEEN) (Sorbitan-mono-9-octadecanoato-poli(oxi-1,2-etanodiil); fabricado por ICI Americas, Wilmington, DE). El detergente se proporciona normalmente en una cantidad de aproximadamente el 0,05 al 0,5%, preferiblemente en aproximadamente el 0,2%.

El "agente formador de micelas" es capaz de estabilizar la emulsión formada con los otros componentes de manera que se forme una estructura similar a las micelas. El agente es poloxamer 401 (PLURONIC L121). El agente se proporciona preferiblemente en una cantidad entre 0,001 y 10%, más preferiblemente en una cantidad entre 0 0,001 y 5%.

El aceite promueve la retención del antígeno en emulsión de aceite-en-agua, es decir para proporcionar un vehículo para el antígeno deseado. El aceite es escualano. El aceite es preferiblemente proporcionado en una cantidad entre un 1 y un 10%, más preferiblemente entre un 2,5 y 5%. Es importante que el aceite sea biodegradable y biocompatible a fin de que el organismo pueda descomponer el aceite a lo largo del tiempo, y de manera que no sean evidentes efectos adversos, tales como granulomas, tras la utilización del aceite.

Es importante que la formulación anterior carezca de un componente peptídico, especialmente de un muramil-dipéptido (MDP). Tal péptido interferirá en la inducción de la respuesta citotóxica si es proporcionado en una cantidad mayor de aproximadamente 20 microgramos por administración de la formulación a humanos normales. Se prefiere que tales péptidos estén completamente ausentes de la formulación antigénica, a pesar de su aparente estimulación del compartimiento humoral del sistema inmune. Esto es, el solicitante ha descubierto que, aunque tales péptidos pueden intensificar la respuesta humoral, son desventajosos cuando se desea una respuesta de los linfocitos T citotóxicos.

El solicitante cree que las formulaciones anteriores son significativamente ventajosas sobre las formulaciones anteriores (incluyendo ISCOM, DETOX®, y SAF) para su utilización en humanos. A diferencia de tales formulaciones, la presente formulación incluye un agente formador de micelas, y no tiene péptidos, esqueletos de paredes celulares, o componentes de células bacterianas. La presente formulación también induce una respuesta de los CTL que o bien no existe con las formulaciones anteriores, o bien está significativamente intensificada en comparación con aquellas formulaciones.

Por "no tóxico" se entiende que se observan escasos o ningún efecto secundario de la formulación antigénica en el animal o humano tratado. Los expertos normales en las técnicas médicas o veterinarias reconocerán que este término tiene un amplio significado. Por ejemplo, en un animal o humano sustancialmente sano solo puede ser tolerada una ligera toxicidad mientras en un humano que padece una enfermedad terminal (con una esperanza de vida de menos de aproximadamente tres años) puede ser tolerada sustancialmente una mayor toxicidad.

En realizaciones preferidas, la formulación antigénica, es para ser utilizada en una administración única de la mezcla; la formulación es para el uso en el tratamiento de un humano o animal infectado con un virus y que padece uno o más de los síntomas (como definen generalmente los doctores en medicina en el campo relevante) de infección por el virus; y la formulación antigénica no es tóxica para el humano o animal. En otras realizaciones preferidas, el antígeno se elige entre las porciones antigénicas de los antígenos del HIV: gp120, gag, pol, Nef, Tat, y Rev; los antígenos de la malaria: proteína CS y proteína 2 de superficie de Esporozoito; los antígenos de la Hepatitis B: Pre-S1, Pre-S2, Ag de HBc y Ag de HBe; los antígenos de la influenza: HA, NP y Na; los antígenos de superficie de la Hepatitis A; los antígenos del Herpes virus: gp340 de EBV, gp85 de EBV, gB de HSV, gH de HSV, la proteína producto temprano de HSV, gB de citomegalovirus, gH de citomegalovirus, y proteína IE gP72; los antígenos de los virus respiratorios sincitiales; proteína F, proteína G, y proteína N; y los antígenos tumorales CEA de carcinoma, mucina asociada al carcinoma, carcinoma P21, carcinoma P53, melanoma MPG, melanoma p97, producto oncogénico Neu de carcinoma, producto génico p53 de carcinoma, antígeno de melanoma denominado MAGE, y proteína p21 ras mutada presente en una variedad de tumores malignos.

En otros aspectos relacionados, la invención ofrece composiciones para su utilización en el tratamiento de un paciente infectado por el virus HIV, que padece malaria, que padece influenza, que padece hepatitis, que padece un cáncer, infectado por un herpesvirus, o infectado por virus respiratorios sincitiales, entre cuyas composiciones se incluye un antígeno apropiado (v.g., seleccionado entre los enumerados antes) mezclado con una de las formulaciones antigénicas anteriores.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción de las realizaciones preferidas de la misma, y a partir de las reivindicaciones.

Descripción de las realizaciones preferidas

Primero se describirán brevemente los dibujos.

Dibujos

Las Figs. 1A - 1C son representaciones gráficas de los datos que comparan la inducción de los CTL por diferentes formulaciones de ovalbúmina; E:D representa la proporción de efector a diana en todas las Figuras.

Las Figs. 2A y 2B son representaciones gráficas de los datos que comparan la inducción de los CTL por diferentes formulaciones de \beta-galactosidasa;

La Fig. 3 es una representación gráfica de los datos que comparan la inducción de los CTL por ovalbúmina en un liposoma y en una formulación antigénica;

Las Figs. 4 y 5 son representaciones gráficas de los datos que muestran el efecto de merma en la célula de CD4 y CD8 tras la inducción de los CTL;

La Fig. 6 es una representación gráfica de los datos que muestran la inducción de los CTL por una mezcla de pluronic y TWEEN y un antígeno;

La Fig. 7 es una representación gráfica de los datos que muestran la inducción de los CTL con una mezcla de Squalane y TWEEN y un antígeno;

La Fig. 8 es una representación gráfica de los datos que muestran la inducción de los CTL por una mezcla de Squalane y pluronic y un antígeno;

La Fig. 9 es una representación gráfica de la inducción de los anticuerpos anti-gp120IIIb en monos con diferentes formulaciones antigénicas; y

Las Figs. 10A - 10B son representaciones gráficas de los datos que comparan la respuesta de los CTL específicos de gp120 en monos inmunizados con vaccinia-gp120 y gp120-AF.

Formulación antigénica

La formulaciones antigénicas útiles en esta invención se han descrito generalmente antes. Aquellos expertos normales en esta técnica reconocerán que se preparan fácilmente Formulaciones equivalentes y que se puede esperar que tengan propiedades equivalentes en la inducción de una respuesta de los CTL. Las propiedades de tales formulaciones son fácilmente probadas utilizando técnicas equivalentes a las descritas en los ejemplos más abajo.

Siguen ejemplos de la invención con la utilización de una formulación antigénica (AF) compuesta de aproximadamente el 15% de Squalane, (0,6% de TWEEN 80) y (0,0045-3,75% de pluronic) en una solución salina tamponada con fosfato (llamada STP). Específicamente, una emulsión de la AF incluía: 150 mg de Squalane, 0,045-37,5 mg de poloxamer 401 (PLURONIC L121), 6 mg de polisorbato 80 (TWEEN 80), 0,184 mg de cloruro de potasio, 0,552 mg de fosfato de potasio monobásico, 7,36 mg de cloruro de sodio, 3,3 mg de fosfato de sodio dibásico (anhidro), por 1 ml de agua, pH 7,4. Esta emulsión fue microfluidificada utilizando técnicas normalizadas (Microfluidics Model M110F) con un módulo de contra-presión a 11-14.000 psi con un retorno gradual a la presión atmosférica, enfriando y envasando en hielo húmedo.

En otros ejemplos, el antígeno se mezcló con el Squalane (S) microfluidificado, pluronic (P) y TWEEN 80 (T) para lograr una concentración final del 5% de Squalane, el 0,2% de TWEEN 80, y el 0,0015-1,25% de pluronic, respectivamente. Para determinar los subcomponentes necesarios para la inducción de una respuesta inmune específica del antígeno, se prepararon Squalane-TWEEN 80, pluronic-TWEEN 80 o Squalane-pluronic a la misma concentración que para la mezcla de tres componentes. Asimismo se prepararon pluronic, Squalane o TWEEN 80 individualmente para determinar el efecto del componente individual sobre la inducción de los CTL. También se realizaron sustituciones de TWEEN 20, TWEEN 40 o Zwittergent por TWEEN 80 para determinar el efecto de varios derivados de TWEEN sobre la inducción de los CTL en el sistema ova. Se realizaron sustituciones de Squalane en la formulación de tres componentes con Eicosane o Triacontane y se realizó la sustitución de copolímero pluronic en la misma formulación de tres componentes por PEG 1000, Pleuronic L62LF, y los Tetronics 1501 y 150R1. En cuanto a las formulaciones de dos componentes, se mezclaron varios análogos en diferentes combinaciones y se probó la inducción de los CTL específica para ova de las mismas. Existe una mezcla de colesterol - TWEEN 80, Squalane - TWEEN 20, Pristane - TWEEN 80 o aceite de oliva - TWEEN 80. Para un estudio de estabilización, se mezcló la mezcla microfluidificada de Squalane-TWEEN 80 con dextrosa hasta una concentración final del 5%. En todos los casos las combinaciones de excipientes fueron mezcladas en un microfluidificador para hacer una emulsión estable. En algunos experimentos, se mezclaron formulaciones de dos componentes con diversas concentraciones de MDP para las inducciones de la respuesta de los CTL y humoral. En la Tabla 1 se describe una lista exhaustiva de varias formulaciones utilizadas en este estudio. Solamente la formulación STP se encuentra dentro del ámbito de la invención, y los resultados de las otras formulaciones son para fines comparativos.

TABLA 1 Efecto de varias sustituciones en sistemas de tres o dos componentes

	Experimento #1	Experimento #2
Sustitución en formulaciones	Porcentaje de destrucción	Porcentaje de destrucción
de tres componentes	a E:D 100:1	a E:D 100:1
STP	88	10
Tween 40(T)	66	-^{a}
Tween 20 (T)	48	-
T1501 (P)	39	-
T150R1 (P)	30	-
Pluronic L62LF (P)	47	-
Eicosane (S)	-	41
PEG1000 (P)	-	24
Triacontane (S)	-	30
Zwittergent (T)	-	0

Sustitución en formulaciones
de dos componentes
ST	82	44
PT	77	-
SP	69	-
Colesterol(S) + Tween 80	38	-
Squalane + Tween 20 (T)	65	-
Pristane (S) + Tween 80	60	-
Aceite de oliva (S) + Tween 80	69	-

Formulación de
un componente
Pluronic L121	0	-
Squalane	0	-
Tween 80	0	-

Squalane + Tween 80 +
dextrosa al 5%	86	-
^{a}-; no asequible

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Se utilizó formulación coadyuvante Syntex (microfluidificada; SAFm) como coadyuvante de control y consta de dos partes: La parte I consta de solución salina tamponada con fosfato conteniendo una concentración final de Squalane al 5%, Pluronic al 1,25% y TWEEN 80 al 0,2% (vehículo o SAF-I). La parte II consta de N-Acetilmuramil-L-Threonil-D-Isoglutamina (Thr-MDP), un derivado del componente de la pared celular de micobacterium. Con fines de inmunización, el antígeno se mezcla con vehículo microfluidificado (parte I) para obtener una emulsión homogénea. Se añade MDP para hacer SAFm, y se somete a vórtice brevemente. La concentración de MDP en la mezcla fue variada para determinar si había una concentración óptima para la inducción de los CTL. Como coadyuvante de control, los ratones también fueron inmunizados con antígenos solubles mezclados con alum según el manual del fabricante (Pierce Chemical, Rockford, IL) o con Coadyuvante Completo de Freund (CFA).

La formulación antigénica STP se utiliza para la inducción de respuestas en linfocitos T citotóxicos en ratones. Los expertos normales en la técnica reconocerán que tal modelo de ratón es indicativo de que experimentos o tratamientos equivalentes inducirán de un modo similar respuestas de los linfocitos T citotóxicos en humanos, animales domésticos, o agrícolas. La cantidad de formulación antigénica y de antígeno útil para producir la respuesta celular deseada puede ser determinada empíricamente mediante procedimientos normalizados, bien conocidos por los expertos normales en la técnica, sin experimentación excesiva. Así, si se desea minimizar los efectos secundarios del tratamiento con tal mezcla los expertos normales en la técnica pueden determinar un nivel mínimo de tal mezcla para la administración a un humano, animal doméstico o agrícola con el fin de lograr una respuesta de los CTL, e inducir de ese modo la inmunidad para un antígeno deseado. En el uso normal, tal mezcla será inyectada mediante uno cualquiera de los numerosos procedimientos normalizados, pero es particularmente preferida en forma de inyección intramuscular en una localización que permitirá que la emulsión permanezca en forma estable durante un período de varios días a varias semanas.

Métodos

Los siguientes materiales y métodos fueron utilizados en los ejemplos proporcionados más abajo a menos que se advierta lo contrario:

Ratones

Se adquirieron ratones hembra C57BL/6 (H-2^{b}) y BALB/c (H-2^{b}) de Harlen Sprague (San Diego, California).

Antígenos

Se utilizó ovalbúmina (ova, Grado VII; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en forma nativa. Se utilizó \beta-galactosidasa (\beta-gal, Grado VIII; BRL) en forma nativa y después de hervir en NaOH 1 M durante 2 minutos para dar un producto digerido con álcali. Se adquirió gp120 recombinante de American Biotechnology.

Células tumorales y transfectantes

Las células tumorales utilizadas eran las líneas Ia EL4 (timoma C57BL/6, H-2^{b}) y P815 (mastocitoma DBA/2, H-2^{d}). La derivación del transfectante EL4 productor de ova, EG7-ova, es descrita previamente por Moore et al., 54 Cell 777, 1988. El transfectante productor de \beta-gal, P13.1, era derivado por electroporación de 10^{7} células P815 en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 10 mg de pCH110 linealizado con PstI (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) y 1 mg de pSV2 neo linealizado con PvuI (Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982) seguido de la selección en 400 \mug/ml del antibiótico G418. El transfectante C3-4 fue derivado de hibridoma BALB/c Igm 662 transfectando con un plásmido que codifica el gen \beta-gal fusionado al tercer y cuarto exón de la cadena pesada de la IgM (Rammensee et al., 30 Immunogenetics 296, 1989). La gp160IIIb que expresa el fibroblasto 3T3, 15-12, fue proporcionada por el Dr. Germain de NIH (Bethesda, MD). La línea de células T transfectadas K^{b} fue proporcionada por el Dr. Carbone, Monash University, Australia. Las líneas de células T transfectadas D^{d} y L^{d} fueron proporcionadas por el Dr. Ted Hensen, Washington University, St. Louis.

Inmunización

Se inmunizaron ratones intravenosamente con una suspensión de 200 \mul de 25 x 10^{6} esplenocitos, tras una carga citoplásmica como describen Moore et al., supra, y Carbone et al., J. Exp. Med. 169:603, 1989). Para la inmunización con la formulación ova-antígeno o la formulación \beta-gal-antígeno, se inyectaron 30 \mug de cada antígeno protéico por ratón en la almohadilla de la pata y la base de la cola subcutáneamente. Cada inyección constaba de 67 \mul de formulación antigénica microfluidificada (elaborada siguiendo procedimientos normalizados) y 30 \mug de antígeno protéico en un volumen final de 200 \mul. El volumen final se completó con HBSS, ver, el manual de Whittaker (Welkersville, MD). El MDP fue proporcionado a concentraciones entre 0 y 300 \mug. Donde se ha establecido, los ratones fueron inmunizados con antígenos solubles en CFA, o en alum en un volumen total de 200 \mul.

Estimulación in vitro de poblaciones efectoras

Células de bazo (30 x 10^{6}) de ratones normales o inmunizados que habían sido cebadas al menos 14 días antes fueron incubadas con 1,5 x 10^{6} EG7-ova (irradiados con 20.000 rad) para las respuestas a ova o 1,5 x 10^{6} células C3-4 (irradiadas con 20.000 rad) para la respuesta a \beta-gal en placas de 24 pocillos a 37ºC en 7% CO_{2}/aire. Todos los cultivos de tejido se realizaron en un medio completo que constaba de medio IMDM, ver, el manual de Whittaker (Welkersville, MD) suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10%, glutamina 2 mM, gentamicina y 2-mercaptoetanol 2 x 10^{-5} M. Para los experimentos de merma in vitro, se trataron células de bazo cebadas in vivo o estimuladas in vitro con anticuerpos monoclonales (mAbs) RL.172 (anti-CD4) o mAbs 3.168 (anti-CD8) para la eliminación de las células T CD4^{+} o CD8^{+} (Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665, 1980, y Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). El mAb RL.172 y el mAb 3.168 fueron obtenidos del Dr. Jonathan Sprent en Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Células de bazo (30 x 10^{6}) de ratones normales o inmunizados que habían sido cebadas al menos 21 días antes fueron incubadas con 1,5 x 10^{6} células 15-12 (tratadas con 200 \mug de mitomicina C durante 45 minutos por 10^{8} células), o con 500 \mug de péptido 18IIIb conteniendo el epitopo de los CTL dominante en ratones Balb/c en medios IMDM completos (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) conteniendo FCS pre-rastreado al 10% (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), glutamina 2 mM, gentamicina y 2-mercaptoetanol 2 x 10^{-5} M. Para la estimulación in vitro con péptidos, se cultivaron células de bazo en IMDM completo conteniendo sobrenadante con ConA al 5%.

Para los experimentos de merma, se trataron células de bazo cebadas in vivo o estimuladas in vitro con mAbs RL.172 (anti-CD4) o mAbs 3.168 (anti-CD8) en presencia de complemento de conejo poco tóxico (Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canadá) para la eliminación de las células T CD4^{+} o CD8^{+} (22, 23). El mAb RL.172 y el mAb 3.168 fueron un obsequio del Dr. Jonathan Sprent en Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, CA.

Análisis de citotoxicidad

Las células diana (1 x 10^{6}) fueron marcadas con cromato de sodio [Cr^{51}] 100 \muCi durante 60 minutos. Para las dianas pulsadas con péptidos, se añadieron 50 \mul de una solución peptídica de 1 mg/ml en HBSS durante el marcaje de las dianas con Cr^{51}. Después de lavar, se incubaron 10^{4} dianas marcadas y diluciones seriadas de las células efectoras en 200 \mul de RP10 durante 4 h a 37ºC. Se recogieron 100 \mul de sobrenadante y se determinó la lisis específica como: Porcentaje de lisis específica = 100 x {(liberación por los CTL - liberación espontánea) / (liberación máxima - liberación espontánea)}. La liberación espontánea en ausencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) era <25% de la liberación máxima por el detergente en todos los experimentos.

Determinación de las respuestas de los anticuerpos en ratones y monos

Cada uno de los 96 pocillos, de placas con el fondo en forma de U (Costar, Cambridge, MA) fue revestido con 150 ng de ova o gp120 en 5 \mul de HBSS y se incubaron durante la noche a 4ºC. Para la determinación de las repuestas de los anticuerpos anti-gp120 y anti-ova en ratones, se bloquearon las placas con BSA al 1% durante 1 hora. Se añadieron sueros en dilución seriada en un volumen de 25 \mul por pocillo y se incubaron durante 2 horas. Las placas se lavaron y se añadieron 50 \mul por pocillo de la dilución 1:1.000 de IgG de cabra anti-ratón conjugada con HRPO (SBT, Alabama) en BSA al 1%. Al cabo de 1 hora de incubación, las placas se lavaron y se añadieron 100 \mul de sustrato por pocillo. Se tomó la DO_{405} al cabo de 10 a 15 minutos. Para la determinación de la respuesta del anticuerpo anti-gp120 de mono, todas las etapas fueron iguales excepto el bloqueo de las placas y la dilución de los sueros que se realizaron en suero de cabra normal al 5% en solución salina equilibrada de Hank.

Síntesis peptídica

Los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias de aminoácidos 253-276 (Listado de Secuencia Núm. 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; donde se utiliza un código de una letra estándar para representar cada aminoácido) de la ovalbúmina (ova 253-276), las secuencias de aminoácidos 84-102 de la proteína básica de la mielina (MBP 84-102) (Listado de Secuencia Núm. 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP), y los péptidos sintéticos correspondientes a las secuencias de aminoácidos 308-322 (secuencia 18IIIb) de gp120, fueron ensambladas mediante síntesis peptídica en fase sólida utilizando un sintetizador Applied Biosystems 430A. Los aminoácidos fueron acoplados a través de anhídridos simétricos pre-formados con la excepción de la asparragina, la glutamina y la arginina que fueron acopladas en forma de ésteres de hidroxibenzotriazol. La eficacia del acoplamiento fue registrada mediante reacción con ninhidrina siguiendo el método de Kaiser et al., 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Los péptidos fueron liberados del soporte con HF siguiendo el procedimiento "low-high" descrito por Tam, et al. 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, y los péptidos fueron extraídos de la resina con ácido acético al 10%. tras la liofilización, los péptidos fueron desalados en una columna Sephadex® G-25, y las muestras de los péptidos purificadas después HPLC mediante cromatografía en fase reversa sobre una columna C-18 preparativa Vydac. Los péptidos purificados (98%) fueron solubilizados en HBSS a una concentración final de 10 mg/ml y diluidos a la concentración deseada en los medios completos.

Producto digerido con CNBr

Se trataron muestras de la proteína (v.g., \beta-galactosidasa) con un exceso molar de 100 veces de bromuro de cianógeno en una solución de ácido trifluoroacético 100 mM. La reacción se dejó continuar durante 18 horas a la temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC) con rotación. Siguiendo el tiempo de reacción prescrito, se separaron los fragmentos peptídicos del reactivo utilizando un aparato SEP-PAK C-18 (Waters), se hicieron eluir con acetonitrilo al 95%, y se liofilizaron.

Producto digerido con álcali

Se trataron muestras de la proteína (v.g., \beta-galactosidasa) con NaOH 1 N y se hirvieron durante 2 minutos, y los fragmentos peptídicos resultantes se separaron de los reactivos utilizando un aparato SEP-PAK C-18 (Waters), se hicieron eluir con acetonitrilo al 95%, y se liofilizaron.

Ejemplo 1 Cebado de los CTL restringidos de clase I

Moore et al., 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 y Carbone y Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1990, manifiestan que ratones inmunizados con células de bazo cargadas citoplásmicamente con ova soluble, fueron cebados para la respuesta de los CTL restringidos de clase I, específica para ova. El transfectante de EL4 que expresa ova EG7-ova fue empleado para la estimulación in vitro de linfocitos esplénicos cebados in vivo y también fue utilizado como diana para la eliminación mediada por CTL específica de ova. Este estudio también demuestra que los efectores CD8^{+} inducidos por el transfectante EG7-ova o por células del bazo cargadas citoplásmicamente con ova, reconocen un determinante mapeado por el péptido ova 258-276 en el contexto de H-2K^{b}, lisan EG7-ova, y también eliminan las células EL4 revestidas con ova 258-276. De ese modo, con el fin de evaluar si se puede inducir mediante un antígeno soluble una ruta de células T CD8^{+} restringidas de clase I endógena, se utilizó el sistema anterior para determinar si se pueden utilizar ciertas formulaciones antigénicas para dirigir el antígeno soluble dentro de la ruta restringida de
clase I.

a)ova

Se inmunizaron ratones C57BL/6 una vez con diferentes cantidades de ova (30 \mug - 1 mg por ratón) con o sin formulación antigénica. Los ratones fueron inyectados subcutáneamente y en la base de la cola. Se tomaron células del bazo de los ratones inmunizados al menos dos semanas después de la inmunización y se estimularon in vitro con los transfectantes EG7-ova. Una concentración de ova tan baja como 30 \mug resultaba tan eficaz como una dosis de 1 mg. Por lo tanto, los estudios de los CTL se realizaron de manera rutinaria con células de bazo de ratones cebados con 30 \mug de ova. Después de cinco días de cultivo in vitro con EG7-ova, se evaluó el cebado mediante la presencia de efectores específicos de ova susceptibles de lisar EG7-ova.

Los ratones inyectados con ova soluble en HBSS tan alta como 1 mg, no mostraban evidencia de cebado de los CTL (Fig. 1A). No obstante ratones inmunizados con 30 \mug en la formulación antigénica descrita antes (mostrada como AF en las Figuras) mostraban una significativa respuesta de los CTL específicos para el transfectante (Fig. 1C). Además, el grado de eliminación de EG7-ova por las células de bazo inmunizadas con ova-AF era comparable al de los ratones inmunizados con células de bazo cargadas con ova (Fig. 1B).

Se demostró que la especificidad del cebado de los CTL in vivo era específico del antígeno mediante la carencia de las células de bazo de ratones inmunizados con \beta-galactosidasa de manifestación de respuesta de los CTL secundarios in vitro cuando se estimulaban con EG7-ova. No se observó inducción de los CTL específica de ova.

b)\beta-galactosidasa

Se obtuvieron resultados similares utilizando otro antígeno protéico soluble, \beta-gal. Para analizar las respuesta de los CTL específica de \beta-gal, la diana utilizada fue el transfectante C3-4 que expresa \beta-gal derivado de BALB/c. Por lo tanto, para la determinación de una respuesta de los CTL específica, la cosecha se pospuso durante al menos ocho semanas antes de que los linfocitos del bazo fueran cosechados, y se cultivaron durante cinco días en presencia transfectantes C3-4 irradiados.

La Fig. 2B demuestra que 30 \mug de \beta-galactosidasa en AF inducían una potente respuesta de los CTL específica contra el transfectante. A una proporción efector-a-diana (E:T) de 3:1, los ratones inmunizados con \beta-gal-AF mostraban aproximadamente el 80% de eliminación de C3-4 específica. No obstante, sólo se lograba una eliminación del 20% de la misma diana con efectores aislados ratones inmunizados con \beta-gal en HBSS a la misma proporción E:D (Fig. 2A). Puesto que ni EL4 ni P815 expresan productos génicos de MHC de clase II y la lisis muestra una restricción singeneica, estos efectores específicos de ova y \beta-gal son MHC de clase I restringidos.

Para demostrar la utilidad de la formulación antigénica, se inmunizaron ratones con ova soluble encapsulada en dos tipos de liposomas, uno de los cuales era un liposoma sensible al pH. Una semana más tarde, se estimularon in vitro células del bazo, como se ha descrito antes, y se probaron frente a EG7-ova o EL4 marcadas con Cr^{51}. En la Fig. 3 se muestra un resultado representativo que demuestra que ova en liposomas no pudo cebar los ratones para la inducción sustancial de los CTL. Se observaron resultados similares cuando se inmunizaba ova en alum.

Ejemplo 2 Reconocimiento del epitopo por CTL

Carbone y Bevan, supra, demostraron que los CTL inducidos en ratones C57BL/6 por transfectantes EG7-ova, y por esplenocitos cargados con ova citoplásmicamente reconocen las células EL4 revestidas con el péptido ova 258-276. Para determinar si la ovalbúmina soluble en AF induce respuestas de los CTL similares, se prepararon células de bazo a partir de ratones inmunizados y se estimularon in vitro con EG7-ova. Los efectores fueron probados frente a células EL4 revestidas con el péptido ova 253-276, o con un péptido de control derivado de a proteína básica de la mielina (MBP 84-102). Los resultados demuestran que ova-AF cebaba los CTL con una especificidad similar a los cebados por transfectantes, o por ova cargada citoplásmicamente (Figs. 1A, 1B y 1C). Las células efectoras cebadas con ova-AF lisaban eficazmente EG7-ova, y células EL4 no transfectadas revestidas con 50 \mug/10^{8} células del péptido ova, pero no lisaban células EL4 revestidas con 50 \mug/10^{8} células de péptido MBP.

En el sistema de la \beta-galactosidasa, Carbone y Bevan, supra, indicaron que el transfectante que expresa \beta-gal y los linfocitos cargados citoplásmicamente con \beta-galactosidasa soluble, inducían los CTL que lisaban el transfectante que expresa \beta-gal y las células P815 no transfectantes revestidas con \beta-galactosidasa digerida con álcali. La \beta-galactosidasa soluble induce los CTL que tienen una especificidad similar cuando se inmunizan en AF (Fig. 2).

Ejemplo 3 Los CTL efectores son células T CD8^{+}

Se demostró que los antígenos protéicos solubles en AF inducen células T efectoras CD8^{+} como sigue. Se cultivaron esplenocitos de ratones inmunizados durante cinco días con transfectantes irradiados in vitro. Después, las células fueron cosechadas y mermadas en células T CD4^{+} o CD8^{+} utilizando anticuerpos monoclonales anti-CD4 o anti-CD8 más complemento. Las poblaciones mermadas fueron probadas después frente a EG7-ova-Cr^{51} en el sistema ova o a P13.1-Cr^{51} en el sistema \beta-gal. Los datos mostrados en la Fig. 4 indican que, en el sistema ova, la merma de células T CD8^{+} revocaba la actividad citolítica conferida por la población de células efectoras completa. No obstante, la merma de la población de células T CD4^{+} no tenía efecto alguno sobre la lisis de EG7-ova.

De un modo similar, en el sistema \beta-gal, la merma de células T CD8^{+} revocaba la actividad citolítica de las células de bazo inmunizadas con la formulación antigénica-\beta-gal (datos no mostrados).

Ejemplo 4 Ova soluble en AF ceba células T CD8^{+}

Para demostrar que ova-AF ceba las poblaciones de células T CD8^{+} in vivo, y que es crítico para la respuesta secundaria in vitro, se mermaron poblaciones CD4^{+} o CD8^{+} de bazos de ratones inmunizados con ova-AF y de ratones sencillos. Estas poblaciones tratadas fueron después estimuladas in vitro con EG7-ova solo, o combinado con células T CD4^{+} o CD8^{+} de ratones inmunizados con ova-AF, o en diferentes combinaciones de células T CD4^{+} o CD8^{+} de ratones inmunizados con ova-AF con células CD4^{+} o CD8^{+} de ratones sencillos. La Fig. 5 muestra que las células CD8^{+} cebadas (primed) son esenciales para la manifestación de una respuesta de los CTL secundaria in vitro. Estos datos también indican que para la respuesta de los CTL secundaria eficaz in vitro, se requieren células T CD4^{+}. Las células CD4^{+} no son necesarias para el cebado.

Los ejemplos anteriores demuestran el efecto de la formulación antigénica sobre la inducción de las respuestas de los CTL restringidos de clase I frente a antígenos protéicos solubles. La formulación antigénica mediaba el cebado de los CTL inducidos por el antígeno soluble, y tiene una actividad similar a la inducida por los transfectantes y por los esplenocitos cargados citoplásmicamente con ova soluble o \beta-gal. En el sistema de la ovalbúmina, EG7-ova, los esplenocitos cargados citoplásmicamente con ova, y ova-AF inducían: (a) CTL CD8^{+} restringidos de clase I; (b) CTL que reconocen dianas sensibilizadas con el péptido sintético 253-276 de ova; y (c) CTL de larga vida después de una sóla inmunización. En el sistema de la \beta-galactosidasa, \beta-gal-AF inducía CTL que reconocen el transfectante que expresa \beta-gal C3-4, y asimismo las células P815 no transfectadas sensibilizadas con \beta-gal digerida con álcali. Esto es análogo a lo que se había observado con CTL inducidos por la inmunización con células de bazo cargadas citoplásmicamente con \beta-galactosidasa. La inducción de CTL específicos de ova por la formulación antigénica es única debido a que ni ova encapsulado en un liposoma sensible al pH, ni en alum (datos no mostrados), pudieron inducir el cebado de los CTL in vivo.

Estos ejemplos indican que la formulación antigénica utilizada antes, y sus equivalentes, son útiles en la terapia humana y en el desarrollo de vacunas para la inducción de CTL en diversos cánceres y enfermedades virales.

Ejemplo 5

Este es un ejemplo específico para mostrar la utilización de la AF anterior en la producción de cebado de CTL restringidos de clase I mediante gp120 soluble de HIV.

La línea celular que expresa gp160 IIIB (15-12) fue producida en la línea celular 3T3 derivada de fibroblastos Balb/c. Fue obtenida de los Drs. Ron Germain y Jay Berzofsky, National Institute of Health, Bethesda, M.D. La línea celular que expresa gp160 fue empleada para la estimulación in vitro de linfocitos esplénicos cebados in vivo, y también se utilizó como diana para la inducción de los CTL específicos de gp160. En muchos experimentos, se utilizó el péptido 18IIIb que contiene el epitopo de CTL dominante para la estimulación in vitro. Para la re-estimulación del péptido en el cultivo, se añadió IL-2 en los medios. Ratones Balb/c fueron inmunizados una vez con 1 \mug de gp120 por ratón con o sin AF. Los ratones fueron inyectados subcutáneamente y en la base de la cola. Se tomaron células del bazo de los ratones inmunizados tres semanas después de la inmunización y se estimularon in vitro con transfectantes de gp160 irradiados o con el péptido 18IIIb. Al cabo de cinco días de cultivo in vitro, se evaluó el cebado mediante la presencia de efectores específicos susceptibles de lisar los transfectantes de gp160, y no las líneas celulares transfectantes. En algunos experimentos, se utilizaron células P815 infectadas con vac:gp160 como diana. Los resultados se muestran en la Tabla 4A, donde la respuesta de los CTL es potenciada con AF y gp120. Se deberá observar que en el sistema gp120, la formulación AF óptima para la inducción de los CTL específica de gp120 (tras una inmunización con 1 \mug de gp120 en AF) es la que no contiene o contiene un mínimo de pluronic. No obstante, cuando los ratones eran inmunizados múltiples veces con 5 \mug de gp120 en AF conteniendo una concentración más elevada de pluronic (3,75%), se vio una inducción sustancial de los CTL (datos no mostrados).

El siguiente ejemplo demuestra la utilización de formulaciones antigénicas fuera del ámbito de la invención con el uso de sólo uno o dos componentes. Estos ejemplos demuestran que las respuestas de los CTL pueden ser inducidas con sólo dos de los tres componentes anteriores.

Ejemplo 6 Determinación de los componentes críticos necesarios para la inducción de CTL

Para determinar si todos los componentes observados antes son necesarios para la inducción de los CTL específica del antígeno, se inmunizaron ratones con ovalbúmina en una formulación microfluidificada de diferentes combinaciones de dos de los tres componentes presentados en la AF anterior sustituyendo PBS en lugar del tercer componente. Las combinaciones de dos componentes utilizadas fueron las siguientes; Squalane/TWEEN en PBS, Squalane/Pluronic en PBS o Pluronic/TWEEN en PBS. Se incluyó otro conjunto de grupos donde los ratones eran inmunizados con ova formulada en un sistema de un componente i.e.. Squalane en PBS, Pluronic en PBS o TWEEN en PBS solo.

Las formulaciones de tres componentes anteriores constan de: 0,300 g de TWEEN 80 (Aldrich, WI), 1,785 g de Pluronic L121 (BASF, NJ), y 7,5 g de Squalane (Aldrich, WI), llevados hasta 50 ml con PBS.

Las formulaciones de dos componentes eran:

Squalane/TWEEN: 0,300 g de TWEEN 80, y 7,5 g de Squalane, llevados hasta 50 ml con PBS.

Pluronic/TWEEN: 1,875 g de Pluronic L121, y 0,300 g de TWEEN 80, llevados hasta 50 ml con PBS.

Pluronic/Squalane: 1,875 g de Pluronic L121, y 7,5 g de Squalane, llevados hasta 50 ml con PBS.

Las formulaciones de tres componentes, con concentraciones variadas de Pluronic eran:

Las concentraciones de Squalane y TWEEN se mantuvieron como antes pero se alteró la concentración de pluronic.

Para volúmenes de 50 ml

S (gramos)	T (gramos)	P (gramos)	P
7,5	0,300	0,75	1,5%
		0,075	0,15%
		0,0075	0,015%
		0,00075	0,0015%
		0,00091	0,018%
		0,00045	0,009%
		0,00017	0,003%

Las muestras fueron tratadas después a través de un microfluidificador, modelo 110T, Microfluidics Corp, y se embotellaron y almacenaron a 4ºC hasta su uso.

Se peso la ovalbúmina (ova Sigma, MO) y se llevó a 0,3 mg/ml de solución en HBSS (Whittaker, supra). La solución de 0,3 mg/ml de partida se combinó con las formulaciones de dos componentes en las siguientes cantidades: 5 partes de solución de Ovalbúmina 0,3 mg/ml, 3,3 partes de la formulación de dos componentes, y 1,7 partes de HBSS. De un modo similar, se mezclaron \beta-gal y gp120 de HIV con la AF.

La formulación se sometió a vórtice y se mantuvo en hielo hasta que fue inyectada. Todas las soluciones fueron combinadas justo antes de la inyección.

Cada ratón recibió 200 \mul de una formulación que contenía 30 \mul de ova mediante inyección subcutánea y en la base de la cola. Se dejó que los ratones descansaran durante al menos dos a cuatro semanas antes de la recolección del bazo.

Dos semanas después de las inmunizaciones, las células del bazo fueron preparadas y estimuladas in vitro con EG7-ova irradiado. A los cinco días de cultivo, se midió la presencia de CTL específicos de ova sometiendo a prueba frente a EG7-ova-Cr^{51} o EL4-Cr^{51} en un análisis de liberación del Cr^{51} de 4 horas. Los datos mostrados en las Figs. 6-8 demuestran que la Ovalbúmina formulada en el sistema de dos componentes microfluidificado puede cebar los CTL específicos de ova in vivo.

Los autores de la presente invención evaluaron adicionalmente la contribución relativa de los componentes individuales a su capacidad para inducir los CTL cuando se combinan con antígenos protéicos. Con propósitos de inmunización se mezcló antígeno soluble con excipientes microfluidificados para obtener una emulsión homogénea estable con tamaños de partícula que oscilan entre 250-300 nm. Para definir adicionalmente los componentes de la formulación de Squalane-TWEEN 80-pluronic (STP) responsable de la inducción de CTL, los autores de la presente invención inmunizaron ratones con ova en una mezcla de Squalane-TWEEN 80 (ST), una mezcla de pluronic-TWEEN 80 (PT) o una mezcla de Squalane-pluronic (SP) y como control en Squalane (S), TWEEN 80 (T) o pluronic (P). Los ratones también fueron inmunizados con ova-SAFm (conteniendo 70 \mug de MDP) u ova-alum como controles del coadyuvante. Para un control positivo, los ratones fueron inmunizados con células de bazo cargadas citoplásmicamente con ova soluble. También se pueden utilizar otras combinaciones y sustitutos, y los resultados se presentan en la Tabla 1. Los resultados demuestran que 30 \mug de ova combinados con STP o ST ceban la respuesta de los CTL restringidos de clase I en ratones. El cebado de los CTL específicos de ova por ova en STP o por ova en ST parece ser mejor que el inducido por células del bazo cargadas citoplásmicamente con ova soluble. ova en PT o en SP podía inducir respuestas de los CTL específicos en ratones pero de manera inconsistente y escasa. A diferencia de SAFm, la adición de MDP a la formulación de ST no comprometía la inducción de CTL específicos de ova en ratones (Tabla 2). No existía inducción de CTL específicos de ova cuando los ratones eran inmunizados con ova mezclada con los componentes individuales, S, P o T ni cuando los ratones eran inmunizados con ova-SAFm o ova-alum. Los ratones inmunizados con tanto como 1 mg de ova en (a) HBSS, (b) SAFm o (c) absorbidos a alum no cebaban los CTL específicos de ova.

TABLA 2 La inducción de la respuesta de CTL específicos de ova no es bloqueada por ST + MDP

1

Ejemplo 7 Componentes necesarios para la producción de anticuerpos específicos de ova

Se inmunizaron ratones tres veces a intervalos de 2 semanas con 30 \mug de ova en HBSS, STP, PT o SP. Como control positivo, también se inmunizaron ratones con ova-SAFm, puesto que se sabe que SAFm induce una potente repuesta de los anticuerpos. Siete días después de la segunda y tercera inmunizaciones, se desangraron los ratones y se sometió a prueba la respuesta de los anticuerpos específicos de ova de los sueros. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Estos indican que los ratones inmunizados con ova en STP, ST o en SAFm despliegan respuestas anti-ova similares al cabo de tres inmunizaciones.

TABLA 3 Inducción de respuesta de anticuerpos anti-ova

2

Ejemplo 8 Inducción de CTL específica de gp120 de HIV

Se utilizó gp120 IIIB de HIV como tercer sistema antigénico para determinar la inducción en STP u otras variaciones de formulaciones de 2 y 3 componentes. Los ratones fueron inmunizados con 1 \mug de gp120IIIb en SAFm o CFA (Coadyuvante Completo de Freund) (Tabla 4B). Tres semanas después de la inmunización, se prepararon las células del bazo y se estimularon in vitro con células 15-12 transfectantes tratadas con mitomicina o con el péptido 18IIIb. Al cabo de cinco días de cultivo, las células efectoras resultantes se probaron frente a vaccinia:gp160 IIIB, o células P815 infectadas con vaccinia parentales como diana. Los resultados demuestran que gp120-Squalane-TWEEN 80 inducía consecuentemente la respuesta de los CTL específicos de gp120 en ratones (Tablas 4A y 4B). Sin embargo, CFA o SAFm eran incapaces de inducir los CTL específicos de gp120 (Tabla 4B). En un estudio separado, se está sometiendo a prueba gp120 en ST con dosis variables de pluronic entre el 0,0015% y el 1,5% para la inducción de CTL.

TABLA 4A Inducción de la respuesta de CTL específica de gp120 en ratones

3

TABLA 4B Inducción de la respuesta de CTL específica de gp120 en ratones^{a}

4

Ejemplo 9 Inducción de la respuesta humoral específica de gp120 en ratones

Para la inducción de respuestas humorales específicas de gp120, se inmunizaron ratones con 1 \mug de gp120IIIb tres veces a intervalos de dos semanas. Los animales fueron desangrados y se sometió a prueba la presencia de anticuerpos IgG que detectaran gp120IIIb en un análisis ELISA en fase sólida. Los resultados del experimento 1 demuestran que gp120 en ST o PT son mejores inmunógenos que gp120-HBSS, gp120SAFm (Tabla 5), o gp120-STP. No obstante, los resultados del experimento 2 demuestran que gp120 en ST o STP (conteniendo concentraciones de pluronic del 1,5% o el 3,75%) pueden inducir respuestas de anticuerpos de elevado título.

TABLA 5 Inducción de la respuesta de anticuerpos anti-gp120

5

Ejemplo 10 Respuestas de anticuerpos específicas de gp120 en monos

Se inmunizaron monos (dos por grupo) con gp120-SAFm, gp120-SPT, gp120-ST, o gp120-HBSS. Como control, se inmunizaron un grupo de monos con vaccinia recombinante conteniendo gp160 IIIb. Los ratones fueron inmunizados a intervalos de dos semanas y desangrados dos semanas y tres semanas después de la segunda inmunización. Se diluyeron seriadamente los sueros pre-inmune e inmune de cada mono y se analizó su actividad anti-gp120 en un ELISA como se describe en materiales y métodos. Los datos (Figura 9) indican que los monos inmunizados con gp120-STP o gp120-SAFm inducían respuestas similares en monos. Un mono inmunizado con gp120-ST, inducía una respuesta anti-gp120 similar a la del grupo inmunizado con gp120-SAFm o gp120-SPT. Un mono inmunizado con gp120-ST no inducía una potente respuesta anti-gp120 después de dos inmunizaciones.

Ejemplo 11 Respuestas de CTL específica de gp120 en monos

Se inmunizaron monos con 30 \mug-50 \mug de gp120 de HIV en AF o en HBSS múltiples veces. Como control, también se inmunizaron monos con gp160 recombinante en vaccinia. Los resultados preliminares de los autores de la presente invención indican que 1/2 de los monos inmunizados con gp120-AF y 1/2 de los monos inmunizados con gp160:vaccinia mostraban una eliminación preferente de las células diana autólogas infectadas con vac:gp160 (Figs. 10A y 10B).

Otras realizaciones caen dentro de las siguientes reivindicaciones.

ISCOM, TWEEN, TEEPOL, EICOSANE, SAF, DETOX, PLURONIC y TETRONIC han sido reconocidos como Marcas de Fábrica Registradas. Se cree que estas han sido registradas en uno o más de los estados designados.

(1) INFORMACION GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: SYAMAL RAYCHAUDHURI

\hskip3.35cm

WILLIAM H. RASTETTER

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INDUCCIÓN DE RESPUESTAS DE LINFOCITOS T CITOTÓXICOS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Lyon & Lyon

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(B): CALLE: 611 West Sixth Street

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(C): CIUDAD: Los Ángeles

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(D): ESTADO: California

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(E): PAÍS: U.S.A.

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(F): CÓDIGO: 90017

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(v): FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:

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(A): TIPO MEDIO: 3.5'' Disquete, almacenamiento 1,44 Mb

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(B): ORDENADOR: IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: IBM P.C. DOS (Versión 5.0)

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(D): SOPORTE LÓGICO: WordPerfect (Versión 5.1)

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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: Total de las solicitudes anteriores, incluyendo la solicitud descrita más abajo: 1

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 07/735.069

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 25 DE JULIO, 1991

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(viii): INFORMACIÓN APODERADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Warburg, Richard J.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.327

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(C): NÚMERO REFERENCIA/ETIQUETA: 197/077

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A): TELÉFONO: (213) 489-1600

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(B): TELEFAX: (213) 955-0440

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(C): TELEX: 67-3510

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 24

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(B): TIPO: aminoácidos

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(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 1:

6

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NUM: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 19

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

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(C): CUALIDAD DE LA HEBRA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NUM: 2:

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7

Claims

1. Un procedimiento para producir una composición que comprende mezclar un antígeno con una formulación antigénica microfluidificada que comprende:

(a) un detergente estabilizante que es polisorbate 80,

(b) un agente formador de micelas que es poloxamer 401, y

(c) un aceite biodegradable y biocompatible que es escualano, careciendo dicha formulación antigénica de un componente peptídico inmunoestimulante, y estando formulada como una emulsión de aceite en agua estable, e induciendo dicha composición una respuesta linfocitaria T citotóxica en un ser humano o un animal doméstico o agrícola, donde el antígeno no es una albúmina, un antígeno linfoma de céluas B, HIV gp160 o un derivado inmunológico del mismo, o glicoproteína D del Herpes virus simplex o un fragmento inmunológico del mismo.

2. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, donde dicha formulación antigénica consta esencialmente de dicho detergente, agente, y aceite.

3. Un procedimiento como se reivindica en las reivindicaciones 1 ó 2, donde dicha formulación antigénica es no tóxica para humanos y animales domésticos y agrícolas.

4. Un procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho antígeno se elige entre los siguientes antígenos o porciones antigénicas de los mismos: los antígenos de HIV: gp120, gag, pol, Nef, Tat, y Ref; los antígenos de la malaria: proteína CS y proteína 2 de superficie de Esporozoito; los antígenos de la Hepatitis B: Pre-S1, Pre-S2, Ag de HBc y Ag de HBe; los antígenos de la influenza: HA, NP y NA; los antígenos de superficie de la Hepatitis A; los antígenos del Herpes virus: gp340 de EBV, gp85 de EBV, gB de HSV, gH de HSV, la proteína producto temprano de HSV, gB de citomegalovirus, gH de citomegalovirus, y proteína IE gP72; los antígenos del virus de papiloma humano E4, E6 y E7; antígenos de los virus respiratorios sincitiales; proteína F, proteína G, y proteína N, y los antígenos tumorales: CEA de carcinoma, mucina asociada al carcinoma, carcinoma P21, carcinoma P53, melanoma MPG, melanoma P97, antígeno MAGE, producto oncogénico Neu de carcinoma, producto génico p53 de carcinoma, antígeno específico de próstata (PSA) y antígeno asociado con la próstata y proteína p21 ras mutada.

5. Un procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el detergente se encuentra presente en la composición en una cantidad del 0,05 al 0,5%.

6. Un procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el aceite está presente en la composición en una cantidad del 1 al 10%.

7. La utilización de un antígeno y una formulación antigénica microfluidificada que comprende:

(a) un detergente estabilizante que es un polisorbato 80,

(b) un agente formador de micelas que es un poloxamer 401, y

(c) un aceite biodegradable y biocompatible que es escualano, careciendo dicha formulación antigénica de un componente peptídico inmunoestimulante, y estando formulada como una emulsión de aceite en agua estable, donde el antígeno no es una albúmina, un antígeno linfoma de células B, HIV gp160 o un derivado inmunológico del mismo, o glicoproteína D del herpes virus simplex o un fragmento inmunológico del mismo, en la fabricación de un medicamento para su utilización en el tratamiento terapéutico o profiláctico de un humano o un animal doméstico o agrícola induciendo una respuesta de los linfocitos T citotóxicos.

8. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 en la fabricación de un medicamento para su utilización en el tratamiento de un humano o animal doméstico o agrícola infectado con un virus y que padece uno o más síntomas de la infección de dicho virus.

9. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 u 8 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno de HIV para su utilización en el tratamiento de un paciente infectado con el virus HIV.

10. La utilización como se reivindica en la reivindicación 9, donde dicho antígeno de HIV se selecciona entre gp120, gp160, gag, pol, Nef, Tat y Ref.

11. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno asociado a la malaria para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece malaria.

12. La utilización como se reivindica en la reivindicación 11, donde dicho antígeno asociado a la malaria se selecciona entre la proteína CS y la proteína 2 de superficie del Esporozoito.

13. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 u 8 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno asociado con la influenza para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece influenza.

14. La utilización como se reivindica en la reivindicación 13, donde dicho antígeno asociado con la influenza se selecciona entre HA, NP y NA.

15. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 ú 8 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno asociado con la hepatitis para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece hepatitis.

16. La utilización como se reivindica en la reivindicación 15, donde dicho antígeno asociado con la hepatitis se selecciona entre el antígeno de superficie de la hepatitis A, Pre-S1, Pre-S2, Ag de HBc y Ag de HBe.

17. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno asociado con el cáncer para su utilización en el tratamiento de un paciente que padece cáncer.

18. La utilización como se reivindica en la reivindicación 17, donde dicho antígeno asociado con el cáncer se selecciona entre CEA de carcinoma, mucina asociada con el carcinoma, P21 de carcinoma, P53 de carcinoma, antígeno MAGE, melanoma MPG, melanoma p97, producto del oncogen Neu de carcinoma, producto del gen p53 de carcinoma y proteína ras 21 mutada.

19. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 ú 8 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno de herpesvirus para su utilización en el tratamiento de un paciente infectado con herpesvirus.

20. La utilización como se reivindica en la reivindicación 19, donde dicho antígeno de herpesvirus se selecciona entre gp340 de EBV, gp85 de EBV, gB de HSV, gH de HSV, la proteína producto temprano de HSV, gB de citomegalovirus, gH de citomegalovirus y la proteína IE gP72.

21. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 ú 8 en la fabricación de un medicamento que contiene un antígeno de los virus respiratorios sincitiales para su utilización en el tratamiento de un paciente infectado con virus respiratorios sincitiales.

22. La utilización como se reivindica en la reivindicación 21, donde dicho antígeno de virus respiratorios sincitiales se selecciona entre la proteína F, la proteína G y la proteína N.

23. La utilización como se reivindica en la reivindicación 7 para su utilización en el tratamiento profiláctico de un paciente.

24. Una composición que comprende un antígeno mezclado con una formulación antigénica microfluidificada que comprende:

(a) un detergente estabilizante que es un polisorbato 80,

(b) un agente formador de micelas que es un poloxamer 401, y

(c) un aceite biodegradable y biocompatible que es un escualano, careciendo dicha formulación antigénica de un componente peptídico inmunoestimulante, y estando formulada como una emulsión de aceite en agua estable e induciendo dicha composición a una respuesta linfocitaria T citotóxica en un ser humano o animal doméstico o agrícola, donde el antígeno no es una albúmina, un antígeno linfoma de células B, HIV pg160 o un derivado inmunológico del mismo, o glicoproteína D del herpes virus simplex o un fragmento inmunológico del mismo.

25. Un procedimiento como se reivindica en la reivindicación 24, donde dicha formulación antigénica consta esencialmente de dicho detergente, agente, y aceite.

26. Un procedimiento como se reivindica en las reivindicación 24 ó 25, donde dicha formulación antigénica es no tóxica para humanos y animales domésticos o agrícolas.

27. Un procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, donde dicho antígeno se selecciona entre los siguientes antígenos o porciones antigénicas de los mismos: los antígenos de HIV: gp120, gag, pol, Nef, Tat, y Ref; los antígenos de la malaria: proteína CS y proteína 2 de superficie de Esporozoito; los antígenos de la Hepatitis B: Pre-S1, Pre-S2, Ag HBc y Ag HBe; los antígenos de la influenza: HA, NP y Nal; los antígenos de superficie de la Hepatitis A; los antígenos del Herpesvirus: gp340 de EBV, gp85 de EBV, gB de HSV, gH de HSV, la proteína producto temprano de HSV, gB de citomegalovirus, gH de citomegalovirus, y proteína IE gP72; los antígenos del Herpes papiloma virus E4, E6 y E7; antígenos de los virus respiratorios sincitiales; proteína F, proteína G, y proteína N, y los antígenos tumorales: CEA de carcinoma, mucina asociada al carcinoma, P21 de carcinoma, P53 de carcinoma, MPG de melanoma, P97 de melanoma, antígeno MAGE, producto del oncogen Neu de carcinoma, producto del gen p53 de carcinoma, antígeno específico de próstata (PSA) y antígeno asociado con la próstata y proteína p21 ras mutada.

28. Un procedimiento como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, donde el detergente está presente en la composición en una cantidad del 0,05 al 0,5% y el aceite está presente en una cantidad del 1 al 10%.

29. La utilización de una composición como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28 en la fabricación de un medicamento para su utilización en el tratamiento terapéutico o profiláctico de un humano o un animal doméstico o agrícola induciendo una respuesta de los linfocitos T citotóxicos.