KR100478617B1 - 세포독성t-림프구반응을유도하는방법 - Google Patents

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레이쵸더리 샤말
에이치. 라스테터 윌리엄
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아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션
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Abstract

본 발명은 사람, 및 애완용 동물 및 가축에게서 세포독성 T-세포 중개 반응 (CTL)을 유도하기 위해 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 상기 방법은 CTL 반응에 바람직한 항원을 제공하는 단계, 및 안정화 청정제, 미셀-생성제 및 오일 중 2개 이상의 성분을 포함하거나 이들로 구성되는 항원 제형을 제공하는 단계를 포함한다. 항원 제형은 면역 자극 펩티드 성분이 결여된,, 바람직한 CTL 반응이 감소되지 않을 정도로 충분히 낮은 수준의 성분들을 갖는 것이 바람직하다. 상기 제형은 안정한 수중유 에멀션으로서 제공된다.

Description

세포독성 T-림프구 반응을 유도하는 방법 {INDUCTION OF CYTOTOXIC T-LYMPHOCYTE RESPONSES}
샤말 레이쵸더리(Syamal Raychaudhuri) 및 윌리암 에이치. 라스테터(William H. Rastetter)의 계류중인 1992년 7월 24일자 출원된 미합중국 특허출원 제 08/919,787호 및 1991년 7월 25일자 출원된 미합중국 특허 출원 제 07/735,069호(현재 포기되었음)이 본 출원에 참고문헌으로 인용되었다. 본 발명은 사람, 및 애완용 동물 및 가축에게서 세포독성 T-세포 중개 반응을 유도하는 데에 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
세포독성 T-림프구(CTL)는 다양한 바이러스 감염 및 종양 또는 암세포 성장에 반응하는 주요 숙주 보호 메카니즘인 것으로 믿어진다. 이들 세포는 감염되거나 형질전환된 세포 상의 여러 분자(클라스 I MHC 분자)와 관련된 항원 단편을 인식함으로써 감염되거나 형질전환된 세포를 제거한다. CTL은 특정 세포내에서 어떤 가용성 항원을 세포질에 주입시켜 실험적으로 유도할 수 있다. 가용성 항원만을 사용한 면역화는 일반적으로 특정 세포독성 T-림프구를 유도하는 데에는 불충분하다.
CTL 반응을 유도할 수 있는 하나의 방법은, 재조합 기술을 사용하여 양호한 감염 인자의 게놈 내에 당해 항원의 주요 성분을 혼입시키는 것이다. 이러한 방법에 의해, 숙주를 미약하게 자체 한계 감염 처리함으로써 원하는 에피토프에 대한 항원-특이적 세포독성 T-림프구 반응이 발생된다. 키메라 벡터는 우두, 소아마비, 아데노- 및 레트로-바이러스, 및 예를 들어, 리스테리아 및 BCG와 같은 박테리아를 사용하여 설명되었다. 예를 들어, 문헌 [Takahashi et al. 85 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 3105, 1988]에는, 세포독성 T-림프구의 유도를 위한 잠재적 도구로서 HIV gp160 엔빌로우프 유전자를 발현시키는 재조합 우두 바이러스를 사용하는 방법이 기술되어 있다.
세포 중개 반응을 유도할 수 있는 제 2 방법은 애쥬번트의 사용을 수반한다. 당분야에는 애쥬번트의 사용에 대한 논의가 충분히 이루어졌지만, 당분야에서는 세포 중개 면역성이 유도될 수 있는 지의 여부 및 이러한 세포 중개 면역성이 세포독성 T-림프구 반응을 유도하는 지의 여부는 분명하지 않다. 그러나, 하기의 문헌은 당분야에서의 대표적인 여러 공보이다.
스토버(Stover) 등의 문헌[351 Nature 456, 1991](본 출원에 대한 종래 기술인 것으로 인정되지 않음)에는 β-갈락토시다아제 유전자를 함유하는 재조합 BCG를 사용하는 β-갈락토시다아제에 대한 CTL 반응이 기술되어 있다. 불완전 프로인트 애쥬번트 및 β-갈락토시다아제의 사용에 의해서는 이러한 반응이 검출되지 않는다.
미첼(Mitchell) 등의 문헌[8 J. Clinical Oncology 856, 1990](본 출원에 대한 종래기술로서 인정되지 않음)에는 "DETOX"로 명명된 애쥬번트 및 동종 흑색종 용해질을 6주 동안 5회 투여하여 전이 흑색종 환자를 치료하는 방법이 기술되어 있다. 환자 중의 일부에서는 세포 용균 T-세포의 증가가 관찰되었다. 미첼 등은 세포독성 T-림프구의 수준을 증강시킬 필요성을 설명하였고, 애쥬번트와 인터루킨-2의 조합된 치료, 및 존재할 수 있는 종양 특이적 T-서프레서 세포의 수준을 감소시키기 위한 시클로포스파미드에 의한 사전 치료를 제시하였다. DETOX는 살모넬라 미네소타(Salmonella minnesota)로부터의 해독된 내독소(모노포스포릴액 A), 마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei)의 세포벽 구조물, 스쿠알렌 오일 및 유화제를 포함한다.
앨리슨(Allison) 및 그레고리아디스(Gregoriadis)의 문헌[11 Immunology Today 427](본 발명에 대한 종래기술인 것으로 인정되지 않음)에는, 사람 백신에서 "사용하도록 허용된" 유일한 애쥬번트가 알루미늄염(알룸)으로서, 이것은 세포 중개 면역성을 지속적으로 유도하지 않는 것으로 개시되어 있다. 앨리슨 및 그레고리아디스는 "육아종과 같은 여러 부작용 없이 프로인트 완전 애쥬번트의 효능을 갖는 애쥬번트를 개발할 필요성이 있음"을 규정하였다. 이들은 또한, 3가지 가능한 방법 예를 들어, 리포소옴의 사용 방법; 말에 대한 인플루엔자 백신에 사용하도록 허용된 면역 자극 복합체(사포닌 또는 퀼 A(Quil A)(2개의 탄수화물 사슬을 갖는 트리테르페노이드), 콜레스테롤 및 포스파티딜 콜린을 포함하는 ISCOM)로 명명된 애쥬번트의 사용 방법 [Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153]; 및 스쿠알렌 또는 스쿠알란(플루로닉 제제(pluronic agent)를 사용하거나 사용하지 않음) 및 무라밀 디펩티드(MDP)의 에멀션(SAF)의 사용 방법이 존재함을 언급하였다. SAF는 "서브유닛 항원이 세포독성 T-세포(CTL) 반응을 유도할 수 없다" 하더라도, 마우스에서는 세포 중개 면역성을 유도하는 것으로 여겨진다.
다카하시(Takahashi) 등의 문헌[344 Nature 873, 1990]에는, 마우스에서의 단일 피하 면역화와 함께 ISCOM의 사용에 의한 클라스 II 제한 헬퍼 및 세포독성 T-림프구 유도를 기술하고 있다. 이들은 프로인트 애쥬번트, 불완전 프로인트 애쥬번트 및 포스페이트 완충 염수가 관심있는 목표물에 대한 세포독성 T-림프구 활성을 유도하지 않음을 규정하였다. 이들은, 다른 형태의 외인성 가용성 단백질 항원을 사용한 결과와 대조적으로, ISCOM을 사용하여 외인성 무손상 단백질에 의한 면역화에 의해 항원 특이적 MHC 클라스 I 제한 CD8+ CD4- CTL을 제조할 수 있음을 규정하였다. 이들은 또한, 기술된 실험에 의해, HIV 단백질을 함유하는 ISCOM을 사용함으로써 사람 CTL을 유도할 수 있고, ISCOM-기본 백신이 정제된 단백질에 의해 CTL 및 항체 둘 모두를 유도하기 위한 오랜 목적을 달성할 수 있음을 규정하였다.
바이어즈(Byars) 및 앨리슨의 문헌[5 Vaccines 223, 1987]에는, 무라밀 디펩티드를 사용하거나 사용하지 않고 트윈 (TWEEN) 80, 플루로닉 (PLURONIC) L121, 및 스쿠알렌 또는 스쿠알란을 포함하는 SAF-1의 사용이 기술되어 있고, 이들의 데이터는 무라밀 디펩디드를 갖는 제형이 사람 및 동물 백신용으로 유용할 것임을 나타냄을 제시하였다. 애쥬번트의 추가 접종은 무라밀 디펩티드의 부재하에 제공된다. 무라밀 디펩티드는 무라밀 디펩티드의 부재하에 애쥬번트를 사용할 때 보다 항체 생성을 상당히 증가시키는 것으로 여겨진다. 세포 중개 면역성은 T-헬퍼 세포 유도를 측정하기 위한 피부 시험에 의해 지연된 타입 과민성으로서 측정된다. 이러한 과민성은 애쥬번트에 중에 무라밀 펩티드가 제공되는 경우에 더욱 강해지고 더욱 지속된다. 유사한 애쥬번트가 앨리슨 등의 미합중국 특허 제 4,770,874호(에그 알부민에 대한 강한 세포 중개 및 체액 반응을 유도하기 위해 무라밀 디펩티드 및 플루로닉 폴리올의 조합이 필수적임을 규정하고 있음); 앨리슨 등의 미합중국 특허 제 4,772,466호; 문헌[Murphy-Corb et al., 246 Science 1293, 1989](무라밀 디펩티드와의 조합된 애쥬번트의 사용이 면역 반응의 체액 및 세포 아암 둘 모두의 유도를 향상시킴을 규정하고 있음); 앨리슨 및 바이어즈의 문헌[87 Vaccines 56, 1987](지연된 타입 과민성, 항원에 대한 T-세포의 증식성 반응, 인터루킨-2의 생성, 및 면역 항원을 함유하는 목표 세포의 특이적 유전적으로 제한된 세포 용해소에 의해 나타나는 바와 같이, 세포 중개 면역성이 SAF(무라밀 디펩티드를 가짐)에 의해 유도됨을 규정하고 있음); 앨리슨 및 바이어즈의 문헌[Immunopharmacology of Infectious Disease: Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191-201, 1987]; 모오건(Morgan) 등의 문헌[29 J. Medical Virology 74, 1989]; 켄네이(Kenney) 등의 문헌[121 J. Immunology Methods 157, 1989]; 앨리슨 및 바이어즈의 문헌[95 J. Immunological Methods 157 1986](알루미늄염 및 광물유 에멀션은 세포 중개 면역성이 아니라 항체 생성을 증가시키는 것으로 입증되었고; 무라밀 디펩티드 제형은 세포 중개 면역성을 증가시키는 것으로 입증됨); 바이어즈 등의 문헌[8 Vaccine 49, 1990](본 출원에 종래 기술인 것으로 인정되지 않았으며, 애쥬번트 제형이 체액 반응성을 현저히 증가시키고, 더 작은 정도로, 인플루엔자 헤마글루티닌 항원에 대한 세포 중개 반응을 향상시키는 것으로 규정하고 있음); 앨리슨 및 바이어즈의 문헌[28 Molecular Immunoloy 279, 1991](본 출원에 대한 종래 기술인 것으로 인정되지 않았으며; 무라밀 디펩티드의 기능은 시토킨의 발현을 유도하고 대부분의 조직양립성(MHC) 유전자의 발현을 증가시키는 것이며; 다른 애쥬번트를 사용하는 것 보다 더 우수한 항체 및 세포 반응이 얻어지며, 유사한 방법이 사람에게 효과적인가를 확인하는 것이 기대됨을 규정하고 있음); 앨리슨 및 바이어즈의 문헌[Technology Advance in Vaccine Development 401, 1988](SAF를 사용하는 세포 중개 면역성을 설명함); 엡스타인(Epstein) 등의 문헌[4 Advance Drug Delivery Review 223, 1990](백신의 제조에 사용되는 여러 애쥬번트의 개관을 제공함); 앨리슨 및 바이어즈의 문헌[J. Immunological Methods 157, 1986](애쥬번트에 무라밀 디펩티드를 첨가하면, 단클론성 면역 글로불린 및 바이러스 백신을 포함하는 다양한 항원에 대한 세포 중개 반응이 현저히 증가함을 규정하고 있음); 및 모오건 등의 문헌[29 J. Medical Virology 74, 1989](엡스타인-바르 바이러스용 백신의 제조를 위한 SAF-1의 사용을 설명하고 있음)에 기술되어 있다.
곽(Kwak) 등의 문헌[Idiotype Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, p. 163, 1990](본 출원에 대한 종래 기술인 것으로 인정되지 않음)에는 사람의 B-세포 림프종 유전자형에 대한 애쥬번트로서 무라밀 펩티드의 부재하에 SAF의 사용이 기술되어 있다. 특히, 플루로닉 L121, 스쿠알란, 및 인산염 완충 식염 중의 0.4% 트윈-80의 에멀션이 유전자형과 함께 투여된다. 이들은 애쥬번트의 첨가가 체액 반응을 더욱 증가시키고, 또한 세포 반응의 유도를 촉진시킬 수 있음을 규정하고 있다.
다른 면역성 제조물은 리포조옴(앨리슨 등의 미합중국 특허 제 4,053,585호 및 제 4,117,113호); 고리형 펩티드(드리스맨 (Dreesman) 등의 미합중국 특허 제 4,778,784호); 프로인트 완전 애쥬번트(Asherson et al., 22 Immunology 465, 1972; Berman et al., International J. Cancer 539, 1967; Allison, 18 Immunopotentiation 73, 1973; and Allison, Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOM(Letvin et al., 87 Vaccines 209, 1987); 광물유, 계면활성제 및 트윈 80으로 생성된 비이온성 블록 공중합체를 함유하는 애쥬번트(Hunter and Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; and Hunter et al., 127 J. Immunology 1244, 1981); 치사된 마이코박테리아를 존재 또는 부재하에 광물유 및 유화제로 구성된 애쥬번트(Sanchez-Pescador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988); 및 무라밀 트리펩티드, 및 재조합 단백질에 공유 결합된 무라밀 디펩티드의 친유성 유도체와 같은 다른 애쥬번트(상기 참조)가 포함된다.
도면은 우선 간단하게 설명될 것이다.
도면
도 1a 내지 1c 및 4a 내지 4c는 여러 오발부민 제형에 의한 CTL 유도를 비교한 데이터의 그래프이며; E:T는 모든 도면에서 이펙터 대 목표물의 비를 나타낸다.
도 2a 및 2b는 여러 β-갈락토시다아제 제형에 의한 CTL 유도를 비교한 데이터의 그래프이다.
도 3은 리포소옴 중에서 그리고 항원 제형 중에서 오발부민에 의한 CTL 유도를 비교한 데이터의 그래프이다.
도 5 및 6은 CTL 유도에 대한 CD4 및 CD8 세포 감소의 효과를 나타내는 데이터의 그래프이다.
도 7은 gp120에 의한 CTL 유도를 나타내는 데이터의 그래프이다.
도 8은 플루로닉 및 트윈과 항원의 혼합물에 의한 CTL 유도를 나타내는 데이터의 그래프이다.
도 9는 스쿠알란 및 플루로닉과 항원의 혼합물에 의한 CTL 유도를 나타내는 데이터의 그래프이다.
도 10은 스쿠알란 및 플루로닉과 항원의 혼합물에 의한 CTL 유도를 나타내는 데이터의 그래프이다.
도 11은 CTL 반응에 대한 여러 항원 제형에 의한 OVA의 효과를 나타낸 데이터의 그래프이다.
도 12는 여러 항원 제형에 의한 원숭이의 항-gp120IIIb 항체의 유도를 나타내는 데이터의 그래프이다.
도 13은 애쥬번트 중의 가용성 E7 단백질로 일회 면역화시킨지 10일 후의 HOPE2 세포의 항-종양 활성을 도시한 도면이다.
도 14는 애쥬번트 중의 가용성 E7 단백질을 2회 면역화시킨 지 10일, 19일 후의 HOPE2 세포의 항-종양 활성을 도시한 도면이다.
항원 제형
본 발명에 유용한 항원 제형은 일반적으로 상기에 기술되어 있다. 당업자들은 균등 제형이 쉽게 제조되고, CTL 반응의 유도에서 균등한 성질을 갖는 것으로 예측될 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 제형은 이들의 성질에 대해 하기의 실시예에 기술된 것과 균등한 기술을 사용하여 쉽게 시험된다.
약 2.5% 스쿠알란, 5% 플루론산, 및 인산염 완충 염수중의 트윈 80으로 구성된 항원 제형(AF)의 사용과 관련한 본 발명의 실시예가 하기에 기술되어 있다. 특히, AF의 에멀션은 물 1㎖ 당 15㎎의 스쿠알란, 37.5㎎의 폴록사머 401(플루로닉 L121), 6㎎의 폴리소르베이트 80(트윈 80), 0.184㎎의 염화 칼륨, 0.552㎎의 일염기성 인산 칼륨, 7.36㎎의 염화 나트륨, 3.3㎎의 이염기성 인산 나트륨(무수물)을 포함한다(pH 7.4). 상기 에멀션은 대기압으로 점차적 회복되는 11,000 내지 14,000psi에서의 배압 모듈, 습윤 얼음 중에서의 냉각 및 충전에 의한 표준 기술(Microfluidics Model M110F)을 사용하여 미세유동화된다.
다른 실시예에서, 항원은 미세유동화된 스쿠알란(S), 플루로닉(P) 및 트윈 80(T)의 혼합물과 혼합되어, 각각 0.2% 트윈 80, 1.25% 플루로닉 및 5% 스쿠알란의 최종 농도를 달성시킨다. 항원 특이적 면역 반응 유도를 위해 필요한 하위 성분을 결정하기 위해, 스쿠알란-트윈 80, 플루로닉-트윈 80 또는 스쿠알란-플루로닉은 3-성분 혼합물에 대해 동일한 농도로 제조된다. 플루로닉, 스쿠알란 또는 트윈 80은 또한 개별적으로 제조되어 CTL 유도에 대한 각각의 성분의 효과를 결정한다. ova 계에서의 CTL 유도에 대한 여러 트윈 유도체의 효과를 결정하기 위해, 트윈 20, 트윈 60, 또는 트윈 80에 대한 쯔비터전트 (Zwittergent)의 치환이 또한 이루어진다. 3-성분 제형 중의 스쿠알렌의 치환은 에이코손(Eicoson) 또는 트리아코톤(Triaconton)에 의해 이루어지고, 동일한 3-성분 제형 중의 공중합체 플루로닉에 대한 치환은 PEG 1000, 프루로닉 L62LF 및 테트로닉스(Tetronics) 1501 및 150R1에 의해 이루어진다. 2-성분 제형으로서, 여러 조성물 중의 여러 유사체는 혼합되고 ova 특이적 CTL 유도에 대해 시험된다. 이들 유사체는 콜레스테롤-트윈 80, 스쿠알란-트윈 20, 프리스탄-트윈 80 또는 올리브유-트윈 80의 혼합물이다. 안정화 연구를 위해, 스쿠알란-트윈 80의 미세유동화 혼합물은 최종 농도가 5%가 될 때까지 덱스트로오스와 혼합된다. 모든 경우에, 부형제의 조합물은 미세유동화제와 혼합되어 안정한 에멀션을 제조한다. 일부 실험에서, 2-성분 제형은 CTL 및 체액 반응 유도를 위해 여러 농도의 MDP와 혼합된다. 하기의 표 1은 상기 연구에 사용된 여러 제형의 포괄적 리스트를 기재한 것이다.
표 1
3-성분계 또는 2-성분계에서의 여러 치환의 효과
3-성분 제형에서의 치환 E:T 100:1에서의 치사율
STP 84TWEEN 40 (T) 66TWEEN 20 (T) 48T1501(P) 0T150R1(P) 0플루로닉 L62LF(P) 47에이코산(S) *PEG1000(P) *트리아콘탄(S) *쯔비터전트(T) *
2-성분 제형에서의 치환
ST 76PT 45SP 26콜레스테롤(S) + TWEEN 80 0스쿠알란 + TWEEN 29(T) 65프리스탄(S) + TWEEN 80 42올리브유 + TWEEN 80 69
1-성분 제형
플루로닉 L121 0스쿠알란 0TWEEN 80 0
스쿠알란 + TWEEN 80 + 5% 덱스트로오스 86
* CTL 검정을 반복함
신텍스(Syntex) 애쥬번트 제형(미세유동화됨; SAFm)은 애쥬번트 대조군으로서 사용되며, 2개의 부분으로 구성된다. 부분 I은 최종 농도 5%의 스쿠알란, 1.25%의 플루로닉 및 0.2%의 트윈 80을 함유하는 인산염 완충 염수로 이루어진다(부형제 또는 I-SAF). 부분 II는 마이코박테리아 세포벽 성분의 유도체인 N-아세틸무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(Thr-MDP)로 이루어진다. 면역화를 위해, 항원은 미세유동화된 부형제(부분 I)과 혼합되어 균질 에멀션을 수득한다. MDP가 첨가되어 SAFm을 제조하고, 간단히 와동된다. 혼합물 중의 MDP 농도는 변동되어, CTL 유도에 대한 최적 농도를 결정한다. 애쥬번트 대조군으로서, 마우스는 또한 제조업자(일리노이주, 록포드에 소재하는 피어스 케미칼)의 추천에 따라 알룸과 혼합되거나, 프로인트 완전 애쥬번트(CFA)와 혼합된 가용성 항원에 의해 면역화된다.
상기 항원 제형은 마우스에서의 세포독성 T-림프구 반응의 유도를 위해 사용된다. 당업자들은 이러한 마우스 모델은 균등한 실험 또는 처리가 사람, 애완용 동물 및 가축에서의 세포독성 T-림프구 반응을 유사하게 유도하는 것을 나타냄을 인식할 것이다. 바람직한 세포 반응을 발생시키에 유용한 항원 제형 및 항원의 양은 부적당한 실험 없이, 당업자들에게 널리 공지된 표준 방법에 의해 실험적으로 결정될 수 있다. 이와 같이, 바람직한 경우, 이러한 혼합물로의 처리의 부작용을 최소화시키기 위해, 당업자들은 사람, 애완용 동물 또는 가축에 대한 투여를 위한 이러한 혼합물의 최소 수준을 결정하여 CTL 반응을 유도할 수 있고, 따라서 바람직한 항원에 대한 면역성을 유도할 수 있다. 정상적인 사용에서, 이러한 혼합물은 많은 표준 방법 중 어느 하나에 의해 주입될 것이지만, 수시간 또는 수주 동안 안정한 형태로 에멀션을 유지시킬 위치에서의 근내 주입이 특히 바람직하다.
방법
별도의 언급이 없는 한, 하기 실시예에서는 하기의 재료 및 방법을 사용한다.
마우스
C57BL/6(H-2b) 및 BALB/c(H-2d) 암쥐를 하알렌 스프라그(Harlen Sprague) (캘리포니아, 샌디에고)로부터 입수했다.
항원
오발부민(ova, 등급 VII; 미주리주 세인트 루이스의 시그마 케미칼 컴패니)을 원래의 형태로 사용했다. β-갈락토오시다아제(β-gal, 등급 VIII; BRL)를 원래의 형태로 사용하고, 1M NaOH 중에서 2분 동안 비등시킨 후에 알칼리로 절단했다. 재조합 gp120을 아메리칸 바이오테크놀로지로부터 입수했다.
종양 세포 및 트랜스펙턴트
사용한 종양 세포는 Ia- 라인 EL4(C57BL/6, H-2b) 및 P815(DBA/2, H-2d 비만 세포종이었다. ova-생성 EL4 트랜스펙턴트인 EG-ova의 유도는 이미 문헌[Moore et al., 54 Cell 777, 1988]에 기술되어 있다. β-gal-생성 트랜스펙턴트인 P13.1은 1㎖의 인산연 완충 식염(PBS) 중의 107개의 P815 세포를 10㎎의 PstI 비선형화 pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) 및 1㎎의 PvuI 비선형화 pSV2 neo(Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Genet. 327, 1982)로 전기영동시킨 후에, 400㎍/㎖의 항생제 G418 중에서 선택함으로써 유도시켰다. C3-4 트랜스펙턴트를 IgM 중쇄의 제 3 및 제 4 액손에 융합된 β-gal 유전자를 엔코딩하는 플라스미드로 트랜스펙팅시킴으로써 BALB/c 하이브리도마 Igm 662로부터 유도시켰다[Rammensee et al., 30 Immunogenetics 296, 1989]. gp160IIIb 발현 3T3 섬유아세포인 15-12를 NIH(Bethesda, MD)의 저메인(Germain) 박사로부터 제공받았다. Kb 트랜스펙팅된 L 세포주를 오스트레일리아의 모나쉬 유니버시티의 카르본(Carbone) 박사에 의해 제공받았다. Dd 및 Ld 트랜스펙팅된 L 세포를 세인트 루이스의 워싱톤 유니버시티의 테트 헨센(Ted Hensen) 박사로부터 제공받았다.
면역화
마우스를 문헌 [Moor et. al. supra, and Carbone et al., J. Exp. Med. 160:603, 1989]에 기술된 바와 같이 세포질내 주입시킨 후, 25 x 106개의 비장 세포의 200㎕의 현탁액으로 정맥내 면역시켰다. ova-항원 제형 또는 β-gal-항원 제형 면역화를 위해, 30㎕의 각각의 단백질 항원을 각각의 마우스의 발바닥 및 꼬리 베이스부(tailbase)에 피하 주사했다. 각각의 주사물은 200㎕의 최종 부피로 67㎕의 미세유동화된 항원 제형(표준 방법에 따라 제조됨) 및 30㎍의 단백질 항원으로 구성시켰다. 최종 부피는 HBSS에 의해 이루어졌다[참조 : Whittaker manual (Welkersville, MD)]. MDP는 0 내지 300㎍의 농도로 제공했다. 언급된 경우, 마우스를 200㎕의 최종 부피로 CFA 또는 알룸 중의 가용성 항원으로 면역시켰다.
이펙터 집단의 시험관내 자극
최소한 14일 전에 초기면역화시킨 정상 또는 면역화된 마우스로부터의 비장 세포(30ㅧ106)를, 37℃에서 7% CO2/공기 중에서 24-웰 플레이트에서 ova-반응을 위해 1.5ㅧ106개의 EG7-ova(20,000 rad로 조사됨)와 인큐베이팅시키거나, β-gal 반응을 위해 1.5ㅧ106개의 C3-4 세포(20,000rad로 조사됨)와 인큐베이팅시켰다. 모든 조직 배양을 10% 소 태아 혈청 (FCS), 2mM 글루타민, 젠타마이신 및 2ㅧ10-5 M 2-메르캅토에탄올로 보충시킨 IMDM 배지[참조 : Whittaker manual(Welkersville, MD)]로 구성된 완전 배지 중에서 수행한다. 시험관내 고갈 실험을 위해, 생체내에서 초기 면역화되거나 시험관내에서 자극된 비장 세포를 CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 제거를 위해, 단클론성 항체(mABs) RL.172(항-CD4) 또는 mABs 3.168(항-CD8)로 처리했다[Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665, 1980, Ceredig et al,. 314 Nature 98, 1985]. mABs RL.172 및 mAB 3.168을 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스크립스 클리닉 앤드 리서치 파운데이션(Scripps Clinic and Reaserch Foundation)의 조나단 스프렌트(Jonathan Sprent) 박사로부터 입수했다.
최소한 21일 전에 초기 면역화시킨 정상 또는 면역시된 마우스로부터의 비장 세포(30ㅧ106)를 10% 예비 스크리닝된 FCS(ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2mM 글루타민, 젠타마이신 및 2ㅧ10-5 M 2-메르캅토에탄올을 함유하는 완전 IMDM 배지(Irvine Scientific, Santa Ana, CA) 중에서 1.5ㅧ106개의 15-12 세포(108개의 세포에 대해 45분 동안 200ug의 미토마이신 C로 처리됨)와 인큐베이팅시키거나, Balb/c 마우스 중의 우세한 CTL 에피토프를 함유하는 500㎍의 18IIIb 펩티드와 인큐베이팅시킨다. 펩티드에 의한 시험관내 자극을 위해, 비장 세포를 5% ConA 상등액을 함유하는 완전 IMDM 중에서 배양시킨다.
생체내 고갈 실험을 위해, 생체내에서 초기 면역화되거나 시험관내에서 자극된 비장 세포를 CD4+ 또는 CD8+ T 세포(22,23)의 제거를 위해, 저독성 토끼 보체(Cederlane Laboratories, Ltd., Hornby Ontario, Canada)의 존재하에 mABs RL.172 (항-CD4) 또는 mABs 3.168(항-CD8)로 처리했다. mABs RL.172 및 mAB 3.168은 캘리포니아 라 졸라에 소재하는 스크립스 클리닉 앤드 리서치 파운데이션에서 조나단 스프렌트 박사로부터 입수했다.
세포독성 검정
표적 세포(1x106)를 60분 동안 100μCi[51Cr] 크롬산 나트륨으로 표지화시켰다. 펩티드 펄스화 목표 세포에 대해, HBSS 중의 50㎕의 1㎎/㎖ 펩티드 용액을 51Cr로 목표 세포를 표지화시키는 동안 첨가한다. 세척 후에, 104개의 표지화된 목표 세포, 및 이펙터 세포의 일련의 희석물을 37℃에서 4시간 동안 200㎕의 RP10 중에서 인큐베이팅시킨다. 100㎕의 상등액을 수집하고, 특정 세포 용균을 하기와 같이 결정한다: % 특정 세포 용균 = 100 ㅧ {(CTL에 의한 방출 - 자발적 방출) / (최대 방출 - 자발적 방출)}. 세포독성 T-림프구(CTL)의 부재하에 자발적 방출은 모든 실험에서 청정제에 의한 최대 방출의 25% 미만이다.
마우스 및 원숭이의 항체 반응의 측정
96-웰의 U 바닥 플레이트의 각각의 웰(Costar, Cambridge, MA)를 56ul의 HBSS 중의 150ng의 ova 또는 gp120으로 피복시키고, 4℃에서 밤새 인큐베이팅시켰다. 마우스의 항-gp120 및 항-ova 항체 반응의 측정을 위해, 플레이트를 1시간 동안 1% BSA로 블록킹시켰다. 일련의 희석된 혈청을 웰 1개당 25㎕ 부피로 첨가하고, 2시간 동안 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA 중에서 HRPO(SBT, Alabama)에 콘쥬게이팅된 염소 항-마우스 IgG의 50㎕의 1:1000 희석물을 각각의 웰에 첨가한다. 인큐베이팅 1시간 후에, 플레이트를 세척하고, 100㎕의 기질을 각각의 웰에 첨가했다. 10 내지 15분 후에 OD405를 취했다. 원숭이의 항-gp120 항체 반응의 측정을 위해, 플레이트의 블록킹 및 혈청의 희석을 행크의 밸런스 염용액 중의 5% 정상 염소 혈청 중에서 수행하는 것을 제외하고는, 모든 단계가 마우스에 대한 것과 동일하였다.
펩티드 합성
오발부민의 아미노산 서열 253-276(ova 253-276)(서열표 번호 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; 여기에서 표준 하나의 문자 코드는 각각의 아미노산을 나타내기 위해 사용됨)에 상응하는 합성 펩티드, 미엘린 염기성 단백질의 아미노산 서열 84-102(MBP 84-102)(서열 번호 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP)에 상응하는 합성 펩티드, 및 gp120IIIb의 아미노산 서열 308-322(18IIIb 서열)에 상응하는 합성 펩티드를 어플라이드 바이오계즈 430A 합성기를 사용하여 고체상 페티드 합성에 의해 어셈블링시켰다. 아미노산은 히드록시벤조트리아졸 에스테르로서 커플링되는 아스파라긴, 글루타민 및 아르기닌을 제외하고는 사전 형성된 대칭 무수물을 통해 커플링시켰다. 커플링 효과를 문헌[Kaiser et al. 34 Anal. Biochem. 595,1970]의 방법에 따라 닌히드린 반응에 의해 모니터링했다. 펩티드를 문헌[Tam, et al. 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983]에 기술된 "로우-하이" 공정에 따라 HF에 의해 지지체로부터 방출시키고, 펩티드를 10% 아세트산을 갖는 수지로부터 추출시켰다. 동결건조시킨 후에, 펩티드를 세파덱스(Sephadex) G-25 칼럼 상에서 탈염시킨 후, 펩티드의 샘플을 Vydac 정제 C-18 칼럼 상에서 역상 크로마토그래피에의해 HPLC 정제시켰다. 정제된 펩티드(98%)를 10㎎/㎖의 최종 농도로 HBSS 중에 용해시키고, 완전 배지 중에서 바람직한 농도로 희석시켰다.
CNBr 절단
단백질의 샘플(예를 들어, β-갈락토오시다아제)를 100mM 트리플루오로아세트산의 용액 중의 100배 몰과량의 브롬화 시아노겐으로 처리했다. 반응을 회전시키면서 실온(약 20℃)에서 18시간 동안 진행시켰다. 상기 반응 시간 후에, 펩티드 단편을 SEP-PAK C-18(워터스)를 사용하여 반응물로부터 분리시키고, 95% 아세토니트릴로 용리시키고, 동결건조시켰다.
알칼리 절단
단백질 샘플(예를 들어, β-갈락토시다아제)을 1N NaOH로 처리하고, 2분 동안 비등시키고, 생성된 펩티드 단편을 SEP-PAK C-18(워터스)를 사용하여 반응물로부터 분리시키고, 95% 아세토니트릴로 용리시키고, 동결건조시켰다.
발명의 요약
본 발명자는 CTL 반응을 사람 및 애완용 동물 및 가축에서 유도할 수 있는 안전하고 유용한 방법 및 조성물을 발견하였다. 상기 방법은 동물에 대한 독성이 거의 없고, 바람직한 세포 반응을 감소시키는 면역 자극 펩티드(예를 들어 무라밀 디펩티드)를 함유하지 않는 항원 제형의 사용을 수반한다. 그외에, 이러한 방법론은 사용이 간단하고, 재조합 DNA 기술에 의해 존재하는 세포를 변형시켜서 항원성을 증가시키는 대규모 생체내 작업을 필요로 하지 않는다. 이러한 발견은 이러한 CTL 반응이 면역 자극 펩티드 또는 이들의 균등물을 함유하지 않는 이러한 항원 제형의 사용에 의해 유도될 수 있다는 것이 예기치 못한 것이므로 놀라운 발견이다. 본 발명자의 발견은 광범위한 질환에서 또는 예방제로서 이러한 항원 제형의 사용을 가능하게 한다. 예를 들어, 이러한 항원 제형 투여는 CTL 반응이 중요한 바이러스성 질환의 치료 예를 들어, HIV 감염 또는 인플루엔자 감염의 치료에 이용될 수 있으며; 또한, 박테리아 감염, 암, 기생충 감염 등의 치료에 사용하는 것으로 확대될 수 있다. 예방제로서, 적합한 항원과 조합된 항원 제형은 상기 언급된 바이러스성 질환에 반응성인 바이러스에 의한 감염의 예방, 특히 HIV 감염의 예방에 유용하며 또한, 암의 위험 수준에서 예를 들어, 초기 종양의 절제 후에 환자의 예방을 위해 유용하다.
이와 같이, 제 1 일면에서, 본 발명은 사람 또는 애완용 동물(예를 들어, 고양이 또는 개) 또는 가축(예를 들어, 말, 소 또는 돼지)에 있어서 B-세포 림프종 항원 또는 에그 알부민과는 다른 항원에 대한 CTL 반응을 유도하기 위한 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 CTL 반응이 바람직한 항원을 제공하고, 안정화 청정제, 미셀-형성제 및 생물분해성 및 생체적합성 오일을 포함하거나 이들로 이루어지는 비독성 항원 제형을 제공하는 단계를 포함한다. 이러한 항원 제형은 어떠한 면역 자극 성분도 함유하지 않거나, 바람직한 세포 반응을 감소시키지 않는 충분히 저수준의 이러한 성분을 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 제형은 안정한 수중유 에멀션으로서 제공되는 것이 바람직하다. 즉, 여러 성분들 각각은 에멀션이 한달 이상 동안, 바람직하게는 일년 이상 동안, 상분리 없이 에멀션 상태로 유지될 정도로 선택된다. 상기 방법에서, 항원 및 항원 제형은 바람직하게는 미세유동화에 의해 서로 혼합되어 혼합물을 생성시키고, 이 혼합물은 동물에서 CTL 반응을유도하기에 충분한 양으로 동물에 투여된다. 이러한 투여는 단지 한번 필요하다.
용어 "안정화 청정제"는 에멀션의 성분들을 안정한 에멀션으로서 유지시키는 청정제를 의미한다. 이러한 청정제는 폴리소르베이트, 트윈 80(독일 빌밍톤에 소재하는 ICI 아메리카즈의 제품인 소르비탄-모노-9-옥타데케노에이트-폴리(옥시-1,2-에탄디일), 트윈 40, 트윈 20, 트윈 60, 쯔비터전트 3-12(Zwittergent 3-12), 티폴 (TEEPOL) HB7 및 스팬 (SPAN) 85를 포함한다. 이들 청정제는 약 0.05 내지 0.5%, 바람직하게는 약 0.2%의 양으로 제공되는 것이 일반적이다.
용어 "미셀-형성제"는 미셀-형 구조가 형성될 정도로 나머지 성분들로 형성된 에멀션을 안정화시킬 수 있는 제제를 의미한다. 이러한 제제는 마이크로파지를 보충하여 세포 반응을 향상시키기 위해 주입 자리에서 약간의 자극을 유발시키는 것이 바람직하다. 이러한 제제의 예로는 본원에 참고문헌으로 인용된 문헌 [BASF
Wyandotte publications, e.g., Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977, and Hunter et al., 129 J. Immunol 1244, 1981]에 기술된 중합체 계면활성제, 즉 PLURONIC L62LF, L101 및 L64, PEG1000, 및 TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301 및 130R1이 있다. 이러한 제제의 화학적 구조는 당분야에 널리 공지되어 있다. 바람직하게는, 이러한 제제는 헌터 및 벤네트의 문헌 [133, Journal of Immunology 3167, 1984]에 규정된 바와 같이 0 내지 2의 친수성-친유성 밸런스(HLB)를 갖도록 선택된다. 이러한 제제는 바람직하게는 0.5 내지 10%, 가장 바람직하게는 1.25 내지 5%의 양으로 제공된다.
오일은 수중유 에멀션 중의 항원의 보유를 촉진하도록, 즉 바람직한 항원에 대한 부형제를 제공하도록 선택되며, 에멀션이 실온(약 20 내지 25℃)에서 생성되거나, 에멀션의 온도가 실온으로 떨어졌을 때 생성되도록 65℃ 미만의 융점을 갖는 것이 바람직하다. 이러한 오일의 예로는 스쿠알렌, 스쿠알란, 에이코산, 테트라테트라콘탄, 글리세롤, 및 땅콩유 및 다른 식물성 오일이 있다. 오일은 바람직하게는 1 내지 10%, 가장 바람직하게는 2.5 내지 5%의 양으로 제공되는 것이 바람직하다. 오일은 신체가 시간이 경과함에 따라 오일을 분해시킬 수 있고, 오일을 사용할 때에 육아종과 같은 부작용을 일으키지 않도록 생물분해성 및 생체적합성인 것이 중요하다.
상기 제형에서는 펩티드 성분, 특히 무라밀 디펩티드(MDP)를 함유하지 않는 것이 중요하다. 이러한 펩티드는 정상적 사람 제형 투여에 대해 약 20㎍ 이상의 양으로 제공되는 경우에, CTL 반응의 유도를 방해할 것이다. 이러한 펩티드가 면역계의 체액 부분을 명백하게 자극함에도 불구하고, 이러한 펩티드는 항원 제형에 완전히 함유되지 않는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명자들은 이러한 펩티드가 체액 반응을 향상시킬 수 있을 지라도, 세포독성 T-림프구 반응을 원하는 경우에는 불리하다는 것을 발견하였다.
다른 관련된 일면에서, 항원 제형은 상기 3가지 성분 중 단지 2가지 성분으로부터 생성되고, 에그 알부민(또는 다른 알부민, 예를 들어 HSA, BSA 및 오발부민)을 제외한 어떠한 바람직한 항원(단백질, 폴리펩티드, 및 면역원성인 이들의 단편을 포함함)과도 함께 사용되어, 상기 동물 또는 사람에게서 CTL 반응을 유도한다.
본 발명자는 상기 제형이 사람에게 사용하기 위해 종래의 제형(ISCOM, DETOX 및 SAF) 보다 상당히 유용하다는 점을 믿는다. 이러한 제형과는 달리, 본 발명의 제형은 미셀-형성제를 포함하고, 펩티드, 세포벽 골격 또는 박테리아 세포 성분을 갖지 않는다. 본 발명의 제형은 또한 종래의 제형의 사용으로는 일어나지 않거나, 종래의 제형과 비교하여 상당히 향상된 CTL 반응을 유도한다.
용어 "비독성"은 처리된 동물 또는 사람에게서 항원 제형의 부작용이 거의 또는 전혀 관찰되지 않는 것을 의미한다. 의료 또는 수의 분야의 당업자들은 이러한 용어가 광범위한 의미를 가짐을 인지할 것이다. 예를 들어, 실질적으로 건강한 동물 또는 사람에게서는, 단지 약간의 독성이 허용될 수 있는 반면, 실제로 절박한 상태에 있는 사람에게서는 더 많은 독성이 허용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 항원 제형은 본질적으로 청정제, 제제 및 오일 중 2개 또는 3개의 성분으로 이루어지고; 방법은 본질적으로 혼합물(항원 및 항원 제형)을 사람 또는 동물에 단일 투여하는 것으로 이루어지며; 사람 또는 동물은 바이러스로 감염되고, 바이러스로부터의 감염 중 하나 이상의 증상(일반적으로 관련된 분야의 의사에 의해 규정됨)을 가지며; 항원 제형은 사람 또는 동물에 비독성이다.
다른 바람직한 구체예에서, 항원은 HIV 항원, 즉 gp160, gag, pol, Nef, Tat 및 Rev; 말라리아 항원, 즉 CS 단백질 및 스포로조아이트(Sporozoite) 표면 단백질 2; B형 간염 표면 항원, 즉 Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag 및 HBe Ag; 인플루엔자 항원, 즉 HA, NP 및 NA; A형 간염 표면 항원; 포진 바이러스 항원, 즉 EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV 초기 단백질 생성물, 사람 유두종 바이러스 항원(예를 들어, L1, E4, E6, E7 항원과 같은 HPV 항원, 특히 경부 암종과 관련하여 가장 통상적인 HPV 유형인 HPV16 및 18로부터의 E6 및 E7 항원, 첨형 콘딜로마(condyloma acuminata)와 관련하여 가장 통상적인 HPV 유형인 HPV6 및 HPV11로부터 유도된 E4 및 L1 항원; 전립선 특이적 항원(PSA), 즉 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH 및 IE 단백질 gp72; 호흡성 합포체성(RS) 바이러스 항원, 즉 F 단백질, G 단백질 및 N 단백질; 및 종양 항원, 즉 암종 CEA, 암종 관련 뮤신, 암종 P21, 암종 P53, 흑색종 MPG, 흑색종 p97, 및 암종 Neu 종양 유전자 생성물, 암종 p53 유전자 생성물, MAGE로 명명된 흑색종 항원, 및 다양한 악성 종양에 존재하는 돌연변이된 p21 ras 단백질의 항원성 부분으로부터 선택된다.
관련된 일면에서, 본 발명은 본질적으로 상기 기술된 항원 제형과 혼합된 항원을 포함하거나, 이것으로 구성된 조성물을 특징으로 하며, 항원은 상기 기재된 항원성 부분으로부터 선택된다.
다른 관련된 일면에서, 본 발명은 상기 항원 제형 중 하나와 혼합된 적합한 항원(예를 들어, 상기 기재된 것으로부터 선택된 항원)을 포함하는 조성물을 투여함으로써, HIV 바이러스로 감염된 환자, 말라리아에 걸린 환자, 유행성 감기에 걸린 환자, 간염에 걸린 환자, 암에 걸린 환자, 포진 바이러스로 감염된 환자, 경부암에 걸린 환자, 첨형 콘딜로마(생식기 사마귀)에 걸린 환자, 또는 호흡성 합포체성 바이러스로 감염된 환자를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 이들 항원 및 치료 방법은 단지 본 발명의 항원 제형에 사용될 수 있는 대표적인 항원 및 치료 방법이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 바람직한 구체예의 하기의 설명, 및 청구의 범위로부터 명백해질 것이다.
실시예 1 : 클라스 I 제한 CTL 초기 면역화
무어(Moore) 등의 문헌[113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989] 및 카르본 및 베반(Bevan)의 문헌[171 J. Exp. Medicine 377, 1990]에는 가용성 ova로 세포질이 증량된 비장 세포로 면역된 마우스가 ova 특이적 클라스 I 제한 CTL 반응을 위해 초기 면역화됨이 기술되어 있다. ova-발현 EL4 트랜스펙턴트 EG7-ova를 생체내 초기 면역화 비장 림프구의 시험관내 자극을 위해 사용하고, 또한 ova 특이적 CTL 중개 치사를 위한 표적으로서 사용했다. 상기 연구는 또한, EG7-ova 트랜스펙턴트에 의해 유도되거나 ova가 세포질에 주입된 비장 세포에 의해 유도된 CD8+ 이펙터가 H-2Kb, 용해 EG7-ova와 관련하여 펩티드 ova 258-276에 의해 맵핑된 결정소로서 인식되고, 또한 ova로 피복된 EL4 세포를 치사시킴을 나타냈다. 이와 같이, 내인성 클라스 I 제한 CD8+ T 세포 경로가 가용성 항원에 의해 유도될 수 있는 지의 여부를 평가하기 위해, 상기 계는 가용성 항원을 클라스 I 제한 경로 내로 운반하기 위해 특정 항원 제형이 사용될 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해 사용되었다.
a) ova
C57BL/6 마우스를 항원 제형을 사용하거나 사용하지 않고 다양한 양(마우스 1마리당 30㎍ 내지 1㎎)의 ova로 1회 면역화시켰다. 면역화시킨 지 최소한 2주 후에 면역화된 마우스로부터 비장 세포를 얻고, EG7-ova 트랜스펙턴트로 시험관내 자극시켰다. 30㎍ 만큼 낮은 ova 농도는 1㎎ 용량만큼 효과적이었다. 따라서, CTL 연구는 30㎍의 ova-초기 면역화시킨 마우스로부터의 비장 세포로 일상적으로 수행했다. EG7-ova에 의한 시험관내 배양 5일 후, EG7-ova를 용해시킬 수 있는 ova 특이적 이펙터의 존재에 의해 초기 면역화를 평가했다.
1㎎ 정도로 많은 양의 HBSS 중의 가용성 ova가 주입된 마우스는 CTL 초기 면역화의 징후를 나타내지 않았다(도 1A). 그러나, 상기 기술된 항원 제형 중의 30㎍ ova로 면역된 마우스(도면에서 AF로서 도시됨)는 상당한 트랜스펙턴트 특이적 CTL 반응을 나타냈다(도 1C). 또한, ova-AF 면역화된 비장 세포에 의한 EG7-ova 치사율의 정도는 ova가 주입된 비장 세포 면역화 마우스의 치사율에 필적한다(도 1B).
생체내에서 CTL 초기 면역화의 특이적이 항원 특이적이라는 점은 EG7-ova로 자극하는 경우에 시험관내에서의 2차 CTL 반응을 조절하기 위해 β-갈락토오시다아제 면역 마우스로부터의 비장 세포의 결핍에 의해 입증되었다. ova 특이적 CTL 유도는 관찰되지 않았다.
b) β-갈락토시다아제
다른 가용성 단백질 항원인 β-gal을 사용하여 유사한 결과를 수득했다. β-gal-특이적 CTL 반응을 검정하기 위해, 사용한 표적은 BALB/c 유도 β-gal-발현 C3-4 트랜스펙턴트였다. 가용성 β-gal에 의한 BALB/c 마우스의 면역화는 백그라운드 CTL 반응을 제공했다. 따라서, 특이적 CTL 반응의 측정을 위해, 수득은 비장 림프구를 수득하고 방사선 조사된 C3-4 트랜스펙턴트의 존재하에 5일 동안 배양되기 전 최소한 8주 동안 연기되었다.
도 2b는 AF 중의 3㎍의 β-갈락토시다아제가 트랜스펙턴트에 대해 강한 특이적 CTL 반응을 유도함을 나타냈다. 3:1의 이펙터 대 목표물(E:T) 비에서, β-gal-AF 면역화된 마우스는 약 80%의 특이적 C3-4 치사율을 나타냈다. 그러나, 동일한 표적의 단지 20% 치사율이 동일한 E:T 비에서 HBSS 면역된 마우스 중의 β-gal로부터 단리된 이펙터에 의해 달성되었다(도 2a). EL4 및 P815은 모두 클라스 II MHC 유전자 생성물을 발현시키지 않고 용해는 유전자 제한을 나타내므로, 상기 ova 및 β-gal 특이적 이펙터는 제한된 클라스 II MHC였다.
항원 제형의 유용성을 결정하기 위해, 마우스를 2가지 타입의 리포소옴 중에 캡슐화시킨 가용성 ova로 면역화시켰으며, 이중 하나는 pH 민감성 리포소옴이었다. 1주 후에, 비장 세포를 상기 기술된 바와 같이 시험관내에서 자극하고, 51Cr-표지화 EG7-ova 또는 EL4에 대해 시험했다. 도 3은 리포소옴 중의 ova가 실질적 CTL 유도를 위해 마우스를 초기 면역화시킬 수 없음을 나타내는 결과를 나타내는 것이었다. ova가 알룸 중에서 면역될 경우에 유사한 결과가 관찰되었다.
실시예 2 : CTL에 의한 에피토프의 인식
카르본 및 베반은 EG7-ova 트랜스펙턴트에 의해, 그리고 ova가 세포질에 주입된 비장 세포에 의해, C57BL/6 마우스에서 유도된 CTL이 펩티드 ova 258-276으로 피복된 EL4 세포를 인식함을 입증하였다. AF 중에서 가용성 오발부민이 유사한 CTL 반응을 유도하는 지의 여부를 결정하기 위해, 비장 세포를 면역된 마우스로부터 제조하고, 시험관내에서 EG7-ova로 자극했다. 이펙터를 펩티드 ova 253-276으로 피복되거나 미엘린 염기성 단백질(MBP 84-102)로부터 유도된 대조군 펩티드로 피복된 EL4 세포에 대해 시험했다. 결과는 ova-AF가 트랜스펙턴트에 의해 그리고 ova에 세포질에 주입되어 초기 면역화된 것과 유사한 특이성을 갖는 CTL을 초기 면역화시킴을 입증하였다(도 1A, 1B 및 1C). ova-AF 초기 면역화된 이펙터 세포는 EG7-ova, 및 ova 펩티드의 50㎍/108 세포로 피복된 비-트랜스펙팅된 EL4 세포를 효과적으로 용균시키지만, MBP 펩티드의 50㎍/108 세포로 피복된 EL4 세포는 용균시키지 않았다.
β-갈락토시다아제 계에서, 카르본 및 베반은 β-gal 발현 트랜스펙턴트 및 가용성 β-갈락토시다아제가 세포질에 주입된 비장 세포가 알칼리 절단 β-갈락토시다아제로 피복된 β-gal 발현 트랜스펙턴트 및 비-트랜스펙턴트 P815 세포를 용균시키는 CTL을 유도함을 제시하였다. 가용성 β-갈락토시다아제는 AF 중에서 면역화될 경우에 유사한 특이성을 갖는 CTL을 유도했다(도 2).
실시예 3 : CTL 이펙터는 CD8 + T 세포임
AF 중의 가용성 단백질 항원은 하기에 나타낸 바와 같이 CD8+ 이펙터 T 세포를 유도했다. 면역된 마우스로부터의 비장 세포를 5일 동안 시험관내에서 방사선 조사된 트랜스펙턴트와 배양시켰다. 그 후에, 세포를 수득하고, 단클론성 항-CD4 또는 항-CD8 항체 및 보체를 사용하여 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 고갈시켰다. 고갈된 집단을 ova 계에서 51Cr-EG7-ova, 또는 β-gal 계에서 51Cr-P13.1에 대해 시험했다. 도 4에 도시된 데이터는, ova 계에서, CD8+ T 세포의 고갈이 전체 이펙터 세포군에 의해 제공된 세포 용균 활성을 제거함을 제시했다. 그러나, CD4+ T 세포군은 EG7--ova의 용해에 대해 어떠한 작용도 하지 않았다.
유사하게, β-gal 계에서, CD8+ T 세포는 β-gal-항원 제형에 의해 면역화된 비장 세포의 세포 용균 활성을 제거하지 않았다.
실시예 4 : AF 초기 면역화 CD8 + 세포 중의 가용성 ova
ova-AF가 생체내에서 CD8+ T 세포군을 초기 면역화시키고 시험관내에서 이차 반응에 중요함을 결정하기 위해, CD4+ 또는 CD8+ 군을 ova-AF 면역화시킨 마우스의 비장 및 비손상 마우스로부터 고갈시켰다. 상기 처리된 군을 시험관내에서 EG7-ova만으로 자극하거나, EG7-ova를 ova-AF 면역화시킨 마우스로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 조합하여 자극하거나, 또는 ova-AF 면역화된 마우스로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 비손상 마우스로부터의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 여러 조합으로 자극했다. 도 5는 초기 면역화된 CD8+ 세포가 시험관내에서 이차 CTL 반응을 나타내기 위해 필수적임을 나타낸다. 상기 데이터는 또한, 시험관내에서 효과적인 이차 CTL 반응을 위해, CD4+ T 세포가 필요함을 제시한다. CD4+ T 세포는 초기 면역화을 위해서는 필요하지 않다. 마찬가지로, CD8+ T 세포는 시험관내에서 B-gal 특이적 이차 CTL 반응을 나타내기 위해 필요했다.
상기 실시예는 가용성 단백질 항원에 대한 클라스 I 제한 CTL 반응의 유도에 대한 항원 제형의 효과를 설명한다. 항원 제형은 가용성 항원 유도 CTL 초기 면역화을 중개하며, 활성은 트랜스펙턴트에 의해 그리고 가용성 ova 또는 β-gal이 세포질에 주입된 비장 세포에 의해 유도되는 것과 유사하였다. 오발부민 계에서, EG7-ova, ova가 세포질에 주입된 비장 세포, 및 ova-AF는 (a) 클라스 I 제한 CD8+ CTL; (b) ova 253-276 합성 펩티드로 민감화된 목표물을 인식하는 CTL; 및 단지 1회 면역 후에 장기간 활성인 CTL을 포함했다. β-갈락토시다아제 계에서, β-gal-AF는 β-gal 발현 트랜스펙턴트 C3-4, 및 또한 알칼리-절단된 β-gal로 민감화된 비-트랜스펙팅된 P815 세포를 인식하는 CTL을 유도했다. 이것은 β-갈락토시다아제가 세포질에 주입된 비장 세포에 의한 면역화에 의해 유도된 CTL을 사용하여 관찰되는 것과 유사하였다. 항원 제형에 의한 ova-특이적 CTL의 유도는, pH 민감성 리포소옴 중에 캡슐화된 ova도, 알룸 중에 캡슐화된 ova도 생체 내에서 CTL 초기 면역화을 유도하지 않기 때문에 독특한 것이었다.
상기 실시예는 상기에 사용된 항원 제형, 및 이것의 균등물이 사람의 치료에 유용하고, 다양한 암 및 바이러스성 질환에서의 CTL의 유도를 위한 백신 개발에 유용함을 제시한다.
실시예 5 :
본 실시예는 HIV로부터의 가용성 gp120에 의한 클라스 I 제한 CTL 초기 면역화를 발생시키는 데에 상기 AF의 사용을 예시하는 특정 실시예이다.
gp160 IIIB 발현 세포주(15-12)를 Balb/c 섬유아세포-유도 3T3 세포주로부터 생성시켰다. 상기 3T3 세포주는 매릴랜드, 베테스다에 소재하는 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰(National Institute of Health)의 롬 저메인(Ron Germain) 및 제이 베르조프스키(Jay Berzofsky) 박사로부터 입수하였다. gp160 발현 세포주를 생체내 초기 면역화 비장 림프구의 생체내 자극을 위해 사용하고, 또한 gp160 특이적 CTL 유도를 위한 목표물로서 사용했다. Balb/c 마우스를 AF를 사용하거나 사용하지 않고 마우스 1마리에 대해 10㎍의 gp160으로 1회 면역시켰다. 마우스를 발바닥 및 꼬리 베이스부에 피하 주사했다. 비장 세포를 면역 2주 후의 면역된 마우스로부터 취하고, 시험관내에서 방사선 조사된 gp160 트랜스펙턴트로 자극했다. 시험관내에서 배양 5일 후, 비-트랜스펙팅된 세포주가 아니라 gp160 트랜스펙턴트를 용균시킬 수 있는 특정 이펙트의 존재에 의해 초기 면역화를 평가했다. 결과를 도 7에 도시했으며, 여기에서 CTL 반응은 AF 및 gp120에 의해 효과가 증대되었다.
하기의 실시예는 단지 1 또는 2가지의 성분의 사용과 함께 본 발명의 항원 제형의 사용을 설명하는 것이다. 이들 실시예는 CTL 반응이 상기 3가지 성분 중 단지 2가지 성분의 사용으로 유도될 수 있음을 입증했다.
실시예 6 :
CTL 유도에 필요한 불가결한 성분의 결정
상기 기재된 성분들이 모두 항원 특이적 CTL 유도를 위해 필요한 지의 여부를 결정하기 위해, 마우스를 상기 AF 중에 존재하는 3가지 성분 중의 2가지 성분의 여러 조합물의 미세유동화된 제형 중의 오발부민으로 면역시켰다. 사용한 2-성분 조합물은 하기와 같았다 : PBS 중의 스쿠알란/트윈, PBS 중의 스쿠알란/플루로닉 또는 PBS 중의 플루로닉/트윈. 마우스가 1-성분계, 즉 단지 PBS 중의 스쿠알란, PBS 중의 플루로닉 또는 PBS 중의 트윈으로 제형화된 ova로 면역되는 경우에 또다른 세트의 그룹이 포함되었다. 상기 3-성분 항원 제형을 한 성분을 배제시킴과 동시에, 이를 대신하여 PBS를 함유하도록 변형시켰다.
상기 항원 제형은, 0.300g의 트윈 80(위스콘신주의 알드리치(Aldrich)사의 제품), 1.875g의 플루로닉 L121(뉴저지주의 BASF의 제품), 및 7.5g의 스쿠알란(위스콘신주의 알드리치사의 제품)으로 구성되며, PBS의 첨가로 50㎖가 된다.
2-성분 제형은 다음과 같다 :
스쿠알란/트윈 : 0.300g의 트윈 80 및 7.5g의 스쿠알란, PBS의 첨가로 50㎖가 됨.
플루로닉/트윈 : 1.875g의 플루로닉 L121 및 0.300g의 트윈 80, PBS의 첨가로 50㎖가 됨.
풀루로닉/스쿠알란 : 1.875g의 플루로닉 L121 및 7.5g의 스쿠알란, PBS의 첨가로 50㎖가 됨.
샘플을 미세유도화기(마이크로플루이딕스 코포레이셔의 모델 110T)로 처리하고, 병에 담고, 사용할 때까지 4℃에서 저장했다.
오발부민(미주리주의 시그마)을 칭량하고, HBSS(Whittaker) 중의 0.3㎎/㎖ 용액으로 제조했다. 0.3㎎/㎖ 원액을 하기의 양으로 2-성분 제형과 조합시켰다 : 5부의 오발부민 0.3㎎/㎖ 용액, 3.3부의 2-성분 제형, 및 1.7부의 HBSS.
제형을 와동시키고, 주입할 때 까지 얼음 상에 방치시켰다. 모든 용액을 주입 바로 전에 조합시켰다.
각각의 마우스의 2개의 발바닥 안쪽 둘 모두에 30㎕의 ova를 함유하는 200㎕의 하나의 제형을 주사하고, 모든 잔류 용액을 꼬리 말단에서 피하 주사했다. 마우스를 비장 수득 전 2 내지 4주 동안 안정시켰다.
면역시킨 지 2주 후에, 비장 세포를 취하고, 시험관내에서 방사선 조사된 EG7-ova로 자극시켰다. 배양 5일 후에, ova 특이적 CTL을 4시간 51Cr 방출 검정으로 51Cr-EG7-ova 또는 51Cr-EL4에 대해 시험함으로써 측정했다. 도 8 내지 10에 도시된 데이터는 미세유동화된 2-성분계 중에 제형화된 오발부민이 생체내에서 ova 특이적 CTL을 초기 면역화시킬 수 있음을 나타내는 것이다.
본 발명자들은 또한, 단백질 항원과 조합된 경우에 CTL을 유도하기 위한 활성에 대한 각각의 성분들의 상대 분포를 평가하였다. 면역화를 위해, 가용성 항원을 미세유동화된 부형제와 혼합시켜서 250 내지 300 nm의 입자 크기를 갖는 안정한 균질 에멀션을 수득하였다. CTL 유도에 대해 반응성인 스크알란-트윈 80-플루로닉(STP)의 성분을 추가로 규정하기 위해, 본 발명자들은 마우스를 스쿠알란-트윈 80(ST) 혼합물, 플루로닉-트윈 80(PT) 혼합물 또는 스쿠알란-플루로닉(SP) 혼합물 중의 ova, 및 대조군으로서 스쿠알란(S), 트윈 80(T) 또는 플루로닉(P) 중의 ova로 면역화시켰다. 마우스를 또한 애쥬번트 대조군으로서 ova-SAFm(70㎍의 MDP 함유) 또는 ova-알룸으로 면역시켰다. 포지티브 대조군으로서, 가용성 ova를 세포질에 주입시킨 비장 세포로 마우스를 면역시킨다. 다른 조합물 및 대체물을 또한 사용하고, 결과를 표 1에 기재하였다.
CTL 초기 면역화의 검출을 위해, 마우스를 한번 면역시켰다. 면역 2주 후에, 비장 세포를 5일 동안 방사선 조사된 EG7-ova(ova 발현 EL4 세포)와 혼합시키고, 51Cr-EG7-ova 또는 51Cr-EL4에 대해 시험한다. 결과(도 11)는 STP 또는 ST와 조합된 30㎍의 ova가 마우스에서 클라스 I 제한 CTL 반응을 초기 면역화시킴을 나타낸다. STP 중의 ova 또는 ST 중의 ova에 의한 ova 특이적 CTL의 초기 면역화는 가용성 ova가 세포질에 주입된 비장 세포에 의해 유도되는 것 보다 우수한 것으로 나타난다. PT 중의 ova 또는 SP 중의 ova는 마우스에서 ova 특이적 CTL 반응을 유도할 수 있지만, 지속적이지 않고 부족하다. SAFm과는 달리, ST 제형에 MDP를 첨가하면, 마우스에서 ova 특이적 CTL 유도가 감약되지 않는다(표 2). 마우스를 개별적 성분, 즉 S, P 또는 T와 혼합된 ova로 면역시키는 경우, 또는 그리고 마우스를 ova-SAFm 또는 ova-알룸으로 면역시키는 경우에도, ova 특이적 CTL 유도는 일어나지 않는다. (a) HBSS 중의 1㎎ 정도의 ova, (b) SAFm 중의 1㎎ 정도의 ova 또는 (c) 알룸에 흡수된 1㎎ 정도의 ova로 면역시킨 마우스는 ova 특이적 CTL을 초기 면역화시키지 않는다.
표 2
ova 특이적 CTL 반응의 유도는 ST + MDP에 의해 차단되지 않음
자극제 목표물** E-T ova-ST 하기 성분으로 면역화시킨 마우스에서의 % 세포독성
ova-ST ova-ST-MDP300㎍ 마우스 ova-ST-MDP72㎍ 마우스
EG7-ova EG7-ova 100:133:111:13:11:13:1 000000 1008633600 8267391300 766225300
* 마우스는 여러 제형 중의 30㎍ ova로 면역됨
** % 세포독성은 항원 비-발현 세포주에서 치사율을 뺌으로써 계산됨.
실시예 7 : ova 특이적 항체 생성을 위해 필요한 성분
마우스를 HBSS, STP, ST, PT 또는 SP 중의 30㎍의 ova로 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. SAFm은 강한 항체 반응을 유도하는 것으로 공지되어 있으므로, 양성 대조군으로서 마우스를 또한 ova-SAFm으로 면역화시켰다. 제 2 및 제 3 면역 7일 후에, 마우스로부터 채혈하여, 혈청을 ova 특이적 항체 반응에 대해 시험했다. 결과를 표 3에 기재하였다. 이 결과는 STP, ST 또는 SAFm 중의 ova로 면역시킨 마우스가 2회 면역 후에 유사한 항-ova 반응을 나타냄을 제시한다.
표 3
항-ova 항체 반응의 유도
30㎍ova/동물 제형 반응 마우스(#)/주입마우스(#) 1/희석혈청 역가
HBSS 0/3 < 1/20, < 1/20, < 1/20
STP 3/3 < 1/4860, > 1/4860, <1/4860
ST 3/3 > 1/4860, > 1/4860, > 1/4860
PT NA NA, NA, NA,
SP NA NA, NA, NA
SAF-M 3/3 1/4860, 1/4860, 1/4860
* NA ; 데이터 없음
실시예 8 : HIV gp120 특이적 CTL 유도
HIV gp120 IIIB를 STP, ST 또는 MP-T 중에서의 CTL 유도를 결정하기 위한 제 2 항원계로서 사용했다. 마우스를 HBSS, STP, PT 또는 ST 중의 1㎍의 gp120IIIb로 면역화시켰다. 대조군으로서, 마우스를 SAFm 또는 CFA(완전 프로인트 애쥬번트) 중의 1㎍의 gp120IIIb, 또는 MPL(모노포스포릴 지질 A) 및 TDM(트레할로스 디미콜라이트)를 함유하는 RIBI 애쥬번트계 중의 1㎍의 gp120IIIb로 면역화시켰다. 면역 3주 후에, 비장 세포를 준비하고, 이를 미토마이신 처리된 트랜스펙턴트 세포 15-12 또는 18IIIb 펩티드로 시험관내에서 자극했다. 배양 5일 후에, 생성된 이펙터 세포를 목표물로서 백시니아:gp160IIIB, 또는 양친 백시니아로 감염된 P815 세포에 대해 시험했다. 결과는 gp120-스쿠알란-트윈 80 제형은 마우스에서 gp120 특이적 CTL 반응을 유도하지만, gp120-스쿠알란-트윈 80 플루로닉 제형 또는 gp120-HBSS는 gp120 특이적 CTL 반응을 유도하지 않음을 나타냈다(표 4).
표 4
마우스에서 gp120 특이적 CTL 반응의 유도
자극제 표적** E-T 하기 성분으로 자극된 마우스에서의 % 세포독성*
gp120-HBSS gp120-ST gp120-STP
18IIIb/IL2 vac:gp120 100:133:111:13:1 232300 4238035 NA***NANANA
18IIIb/IL2 15-12 100:133:111:13:1 0000 50352718 0000
18IIIb/IL2 3T3 + 18IIIb 100:133:111:13:1 0000 59595729 13200
15-12 vac:gp120 100:133:111:13:11:1 35191200 846537220 NANANANANA
* 마우스는 여러 제형 중의 1㎍의 gp120III로 면역됨
** % 세포독성은 항원 비-발현 세포주에서 치사율을 뺌으로써 계산됨
*** NA ; 데이터 없음
실시예 9 : 마우스에서 gp120 특이적 체액성 면역 반응의 유도
gp120 특이적 체액성 면역 반응의 유도를 위해, 마우스를 1㎍의 gp120IIIb로 2주 간격으로 3회 면역화시켰다. 동물로부터 채혈한 후, 고체상 ELISA 검정으로 gp120IIIb를 검출하는 IgG 항체의 존재에 대해 시험했다. 결과는 gp120-ST가 gp120-HBSS, gp120SAFm(표 5) 또는 gp12--STP 보다 더 우수한 면역원임을 나타냈다.
표 5
항-gp120 항체 반응의 유도
1㎍ gp120/동물 제형 반응 마우스(#)/주입마우스(#) 1/희석혈청 역가
HBSS 0/3 < 1/20, < 1/20, < 1/20
STP 1/3 < 1/20, > 1/4860, <1/20
ST 3/3 > 1/4860, > 1/4860, > 1/4860
PT 3/3 > 1/4860, > 1/4860, > 1/4860
SP 2/3 < 1/20, 1/540, 1/540
SAF-M 2/3 1/180, > 1/4860, 1/540
실시예 10 : 원숭이에서의 gp120 특이적 항체 반응
원숭이(하나의 군에 대해 2마리)를 gp120-SAFm, gp120-STP, gp120-ST 또는 gp120-HBSS로 면역화시켰다. 대조군으로서, 일군의 원숭이를 gp160IIIb를 함유하는 재조합 백시니아로 면역화시켰다. 원숭이를 2주 간격으로 면역시키고, 제 2 면역 후 2주 및 3주 후에 채혈했다. 각각의 원숭이로부터 면역전 및 면역후 혈청을 연속적으로 희석시키고, 상기 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 ELISA 중에서 항-gp120 활성에 대해 검정했다. 데이터(도 12)는 gp120-STP 또는 gp120-SAFm으로 면역된 원숭이가 유사한 반응을 유도함을 나타냈다. gp120-ST로 면역된 하나의 원숭이는 gp120-STP 또는 gp120-SAFm으로 면역된 군과 유사한 항-gp120 반응을 유도했다. gp120-ST로 면역된 하나의 원숭이는 2회의 면역 후에 강한 항-gp120 반응을 유도하지 않았다.
실시예 11 : HPV 16 E7과 조합된 AF의 생체내 활성
1. 면역화를 위한 재조합 HPV 16 E7 단백질의 생성
(a) E7 유전자의 PCR 및 클로닝
HVP 16 E7 유전자를 카렌 보우스덴(Karen Vousden) 박사(루드빅 인스티튜트)로부터 입수한, 암종 세포주 CaSki로부터 유해한 E7 유전자를 엔코딩하는 플라스미드로부터 클로닝시켰다. 코딩 영역을 Bam HI 및 Sal I 클로닝 위치에 의해 플랭킹된 유전자의 5' 및 3' 말단을 엔코딩시키는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. E7 PCR 생성물을 pGEX-4T-1 발현 벡터(파마시아 바이오테크)내로 연결시켜서 pGEX.E7 발현 플라스미드를 생성시켰다. pGEX.E7 발현 플라스미드를 대장균 변종 XL1-블루(스트라타진)에 트랜스펙팅시킨다. E7의 서열을 생성된 콜로니의 플라스미드로부터 수득하였으며, 이것은 CaSki 세포로부터 수득한 E7 서열과 동일하였다.
(b) 세균내 발현 E7의 정제물의 생산
pGEX.E7 세균내 발현 플라스미드는 아미노-말단의 GST, 트롬빈 프로테아제 절단 위치 및 카르복시-말단의 E7 단백질로 구성된 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST) 융합 단백질을 엔코딩시켰다. E7 단백질을 pGEX-4T-1 벡터(파마시아 바이오테크)의 제조업자로부터의 제품 정보 인쇄물에 기술된 바와 같이 생산시키고 정제했다. 간단히 말해서, pGEX.E7 발현 플라스미드를 함유하는 박테리아는 배지에 이소프로필 b-D-티오갈락토시다아제를 첨가함으로써 융합 단백질을 발현시키도록 유도되었다. 세포를 수득하고 완만한 초음파 분해 처리에 의해 세포를 용균시켰다. 용균물을 글루타치온 세파로오스 4B(파마시아 바이오테크)에 적용시켰다. 융합 단백질이 매트릭스에 결합된 후에, 수지를 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거했다. 결합된 융합 단백질을 트롬빈으로 다이제스팅하여 GST 융합 파트너로부터 E7 단백질을 방출시켰다.
E7 단백질 제조물을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, E7 단백질 농도를 브래포드(Bradford) 분석(Biorad)에 의해 측정했다. 박테리아 배양기 1ℓ 당 9㎖의 가용성 E7 단백질을 수득했다.
2. X21 E7 트랜스펙턴트의 생성
HPV16 단백질을 코딩하는 서열(상기 참조)을 IDEC(독점) 진핵 세포 발현 플라스미드 INPEP4 내에 삽입시켰다. 상기 벡터 내에서, E7 발현을 사이토메갈로바이러스 프로모터/인핸서 전사 요소에 의해 제어했다. 또한, E7 코딩 서열의 첫 번째 3개의 누클레오티드를 제거하여, 바로 상류에 위치한 면역 글로불린 경쇄 리더 서열로 대체시켰다. 이때, E7 코드화 영역의 리딩 프레임(reading frame)은 이동되지 않는다. 마우스 세포주 X21 내로 트랜스펙팅한 후에, 각각의 G418 저항성 클론을 노오던 블롯 분석에 의해 시험하여, E7 전령 생성을 조사했다. 각각의 클론은 E7 전령의 검출을 나타냈다. 이들 클론 중 2개, 즉 4E7 및 1C7(각각 HOPE1 및 HOPE2)로부터의 세포 용균물의 웨스턴 블롯 분석을 수행하고, E7 단백질 생성을 입증했다.
3. E7/AF 가용성 항원 면역화의 생체내 활성
C3H 백그라운드의 암쥐(H2k/k, Harlen Sprague Dawley)를 본 연구에 사용했다. 동물을 "실험실 동물의 보호 및 사용에 대한 안내"(DHHS 공보 번호 NIH 86-23, Bethesda, MD:NIH, 1985)에 따라 사육하고, 임의로 음식 및 물을 섭취시켰다. E7 트랜스펙턴트 세포주 HOPE2(H2k/k)를 본 연구에 사용했다. 상기 종양 세포주를 시험관내에서 일련의 통과에 의해 유지시켰다.
상기 세포주는 반복된 시험관내 통과 후, 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되는 바와 같이, E7 항원을 세포질내에서 발현시키고 유지시키는 것으로 입증되었다. 종양은 150,000개의 시험관내 통과 세포의 피하 주사에 의해 동종 C3H 마우스에서 개시되었다.
종양을 2주 간격으로 수직 2차원 단위로 측정했다. 종양 부피(V)를 하기의 방정식에 따라 계산했다 :
V(㎣) = (LxW2)/2
상기식에서,
L = 가장 긴 축의 측정 길이 (㎜)
W = 수직축의 길이 (㎜)
표 6의 데이터는 종양에 걸린 마우스를 제시한다(주입된 동물의 총수에 대한 종양에 걸린 동물의 수). 도 13 및 14의 데이터는 각각의 처리군 및 대조군의 평균 종양 크기(㎣)를 제시한다. 각각의 처리군을 치료를 받지 않은 대조군과 비교했다. 치료는 HOPE2 세포의 접종 10일 후에, 처리는 종양의 대부분이 촉진할 수 있을 정도(약 50 내지 75㎣)일 때 시작했다. 치료는 AF 또는 알룸 애쥬번트 중의 가용성 E7 단백질에 의한 마우스의 면역화(전체 0.2㎖을 피하 투여)에 의해 개시시켰다. 각각의 마우스가 0.2㎖ 중의 30ug 또는 90ug의 E7 단백질을 수용하도록 면역화 바로 직전에, AF를 행크 밸런스 염용액(HBSS) 중의 E7 단백질과 60초 동안 혼합시켰다. 마우스 1마리당 0.2㎖ 중의 90ug의 E7 단백질을 수용하도록 알룸(피어스 케미칼 컴패니)을 제조업자의 지시에 따라 E7 단백질과 혼합시켰다. 제 2 처리군의 동물을 9일 후(종양 세포 접종 19일 후)에 제 2 면역화시켰다. 상기 기술한 바와 같이, 접종 바로 직전에 추가 면역화를 준비했다.
본 실시예(표 6 : Xp #233)에서, 종양 세포 접종 41일 후에, AF 중의 가용성 E7을 한번 주사(각각 30ug 또는 90ug)한 마우스 8마리 중 단지 4마리 및 5마리가 측정할 수 있는 종양을 가졌다. 대조적으로, 알룸 중의 E7 단백질로 면역시킨 마우스는 모두 (8/8) 활성적으로 성장하는 종양을 가졌다. 또한, 도 13에 도시한 바와 같이, 종양 성장의 상당한 억제가 대조군(비처리) 또는 알룸 처리군과 비교하여, AF 중의 E7 단백질로 면역시킨 처리군에서만 관찰되었다. 종양 성장의 억제(도 13) 또는 증가되는 종양 퇴화율(표 6)이 알룸 중의 E7의 한번 주사한 마우스에서는 관찰되지 않았다.
또한, 알룸 중의 E7을 2회 주사한 마우스에서 약간의 종양 성장 억제가 관찰되었지만, 종양 접종 10일 후 및 19일 후에 2회 면역된 처리군을 사용하여 유사한 결과가 관찰되었다(표 6 및 도 14).
결과는 종양에 걸린 마우스의 감소된 수 및 종양 성장의 억제에 의해 측정되는 바와 같이 상당한 항-종양 활성이 AF 중의 가용성 E7의 면역화 후에 관찰됨을 나타낸다. 대조적으로, 알룸 중의 가용성 E7 단백질의 1회 또는 2회 주사로 면역시킨 모든 동물은 종양이 성장하였다. 요약하면, AF 중의 가용성 E7 단백질에 의한 면역화는 알룸 중의 가용성 E7 면역화를 사용할 경우에는 관찰되지 않은 종양 세포 성장의 상당한 억제를 유발했다.
표 6
애쥬번트 중의 가용성 E7 면역화의 항-종양 활성
실시예 번호 처 리 투여량(ug/마우스) 종양에 걸린 동물a41일
223 대조군 - 7/8
223 AF 중의 E7 30ug x 1b 4/8
223 AF 중의 E7 90ug x 1 5/8
223 알룸 중의 E7 90ug x 1 8/8
223 AF 중의 E7 30ug x 2c 3/8
223 AF 중의 E7 90ug x 2 1/4
223 알룸 중의 E7 90ug x 2 8/8
a. 종양에 걸린 마우스의 수 / 접종된 마우스의 총수.
b. 모든 면역화는 이식 후 10일째에 시작됨.
c. 이식 후 10일째에 제 2 면역 (x 2).
다른 구체예는 하기의 청구의 범위에 기재되어 있다.

Claims (83)

  1. (a) 트윈(TWEEN) 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 티폴(TEEPOL) HB7, 및 스팬(SPAN) 85로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 청정제,
    (b) 플루로닉 중합체 계면활성제 및 테트로닉 중합체 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 미셀-형성제, 및
    (c) 스쿠알렌, 스쿠알란, 에이코산, 프리스탄, 테트라테트라콘탄, 트리아콘탄, 글리세롤, 콜레스테롤, 및 식물성 오일로 구성된 군으로부터 선택된 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 포함하고, 면역 자극 펩티드가 결여된, 안정한 수중유 에멀션으로서 제형화되는 미세 유동화 항원 제형과 혼합된 항원을 포함하는 조성물로서,
    사람, 가축 및 농업용 동물로 구성된 군으로부터 선택된 동물에 투여될 경우에 조성물 중에 함유된 항원에 대해 특이적인 세포독성 T-림프구 반응을 유도할 수 있는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 항원 제형이 청정제, 미셀-형성제, 및 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 항원 제형이 사람, 가축 및 농업용 동물에 비독성임을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 항원이 gp160, gag, pol, Nef, Tat, 및 Rev로 구성된 군으로부터 선택된 HIV 항원; CS 단백질 및 스포로조이트 표면 단백질 2로 구성된 군으로부터 선택된 말라리아 항원; Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag, 및 HBe Ag로 구성된 군으로부터 선택된 B형 간염 표면 항원; HA, NP, 및 NA로 구성된 군으로부터 선택된 인플루엔자 항원; A형 간염 표면 항원; EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV 초기 단백질 생성물, 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH, 및 IE 단백질 gP72로 구성된 군으로부터 선택된 포진 바이러스 항원; F 단백질, G 단백질, 및 N 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 호흡기 합포체 바이러스 항원; 및 암종 CEA, 암종 관련 무신, 암종 P21, 암종 P53, 흑색종 MPG, 흑색종 p97, 암종 Neu 종양 유전자 생성물, 암종 p53 유전자 생성물, 유두종 바이러스 항원, 전립선 특이적 항원 (PSA), 및 돌연변이된 p21 ras 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 항원 함유 조성물을 포함하는 혼합물을 가축 및 농업용 동물로 구성된 군으로부터 선택된 동물에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 동물에서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기 위한 방법으로서,
    상기 혼합물이 상기 동물에서 상기 혼합물에 함유된 항원에 대해 특이적인 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 동물에게 투여되는 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 혼합물을 동물에게 1회 투여하는 것을 필수적으로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, 동물이 바이러스로 감염되어 있거나, 바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 겪고 있음을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, HIV 바이러스로 감염된 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 HIV 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, HIV 항원이 gp160, gag, pol, Nef, Tat, 및 Rev로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 말라리아에 걸린 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 말라리아 관련 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 말라리아 관련 항원이 CS 단백질 및 스포로조이트 표면 단백질 2로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 인플루엔자에 걸린 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 인플루엔자 관련 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 인플루엔자 관련 항원이 HA, NP, 및 NA로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 간염에 걸린 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 간염 관련 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, 간염 관련 항원이 A형 간염 표면 항원, Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag, 및 HBe Ag로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 암에 걸린 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 암 관련 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 암 관련 항원이 암종 CEA, 암종 관련 무신, P21, 암종 P53, 흑색종 MPG, 흑색종 p97, 및 암종 Neu 종양 유전자 생성물, 암종 p53 유전자 생성물, 및 돌연변이된 p21 ras 단백질로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 포진 바이러스로 감염된 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 포진 바이러스 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 포진 바이러스 항원이 EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV 초기 단백질 생성물, 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH, 및 IE 단백질 gp72로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 호흡기 합포체 바이러스로 감염된 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 호흡기 합포체 바이러스 항원을 포함하며, 상기 환자에게서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 호흡기 합포체 바이러스 항원이 F 단백질, G 단백질, 및 N 단백질로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 플루로닉 중합체 계면활성제 및 테트로닉 중합체 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 미셀-형성제, 및
    (a) 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 티폴 HB7, 및 스팬 85로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 청정제, 또는
    (b) 스쿠알렌, 스쿠알란, 에이코산, 프리스탄, 테트라테트라콘탄, 트리아콘탄, 글리세롤, 콜레스테롤, 및 식물성 오일로 구성된 군으로부터 선택된 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함하고, 안정한 수중유 에멀션으로서 제형화되는 미세유동화 항원 제형과 혼합된 항원의 혼합물을 투여하는 것을 포함하여, 가축 또는 농업용 동물에서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하는 방법으로서,
    상기 혼합물이 상기 동물에서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 동물에게 투여되는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 가축 또는 농업용 동물이 바이러스로 감염되거나, 바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 겪고 있음을 특징으로 하는 방법.
  24. 플루로닉 중합체 계면활성제 및 테트로닉 중합체 계면활성제로 구성된 군으로부터 선택된 미셀-형성제, 및
    (a) 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80, 티폴 HB7, 및 스팬 85로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 청정제, 또는
    (b) 스쿠알렌, 스쿠알란, 에이코산, 프리스탄, 테트라테트라콘탄, 트리아콘탄, 글리세롤, 콜레스테롤, 및 식물성 오일로 구성된 군으로부터 선택된 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함하고, 안정한 수중유 에멀션으로서 제형화되는 미세유동화 항원 제형과 혼합된 항원을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 사람을 제외한 환자를 치료하는 방법으로서,
    상기 조성물이 상기 환자에서 세포독성 T-림프구 반응을 유도하기에 충분한 양으로 상기 환자에게 투여되는 방법.
  25. 제 22항 또는 제 24항에 있어서, 항원이 gp160, gag, pol, Nef, Tat, 및 Rev로 구성된 군으로부터 선택된 HIV 항원; CS 단백질 및 스포로조이트 표면 단백질 2로 구성된 군으로부터 선택된 말라리아 항원; Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag, 및 HBe Ag로 구성된 군으로부터 선택된 B형 간염 표면 항원; HA, NP, 및 NA로 구성된 군으로부터 선택된 인플루엔자 항원; A형 간염 표면 항원; EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV 초기 단백질 생성물, 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH, 및 IE 단백질 gp72로 구성된 군으로부터 선택된 포진 바이러스 항원; F 단백질, G 단백질, 및 N 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 호흡기 합포체 바이러스 항원; 및 암종 CEA, 암종 관련 무신, 암종 P21, 암종 P53, 흑색종 MPG, 흑색종 p97, 암종 Neu 종양 유전자 생성물, 암종 p53 유전자 생성물, 및 돌연변이된 p21 ras 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원의 항원성 부분으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 HIV 바이러스로 감염되어 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 HIV 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, HIV 항원이 gp160, gag, pol, Nef, Tat, 및 Rev로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 말라리아에 걸려 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 말라리아 관련 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 말라리아 관련 항원이 CS 단백질 및 스포로조이트 표면 단백질 2로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 인플루엔자에 걸려 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 인플루엔자 관련 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 인플루엔자 관련 항원이 HA, NP, 및 NA로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 간염에 걸려 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 간염 관련 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 간염 관련 항원이 A형 간염 표면 항원, Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag, 및 HBe Ag로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 암에 걸려 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 암 관련 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 암 관련 항원이 암종 CEA, 암종 관련 무신, 암종 P21, 암종 P53, 흑색종 MPG, 흑색종 p97, 암종 Neu 종양 유전자 생성물, 암종 p53 유전자 생성물, 및 돌연변이된 p21 ras 단백질로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 포진 바이러스로 감염되어 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 포진 바이러스 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 포진 바이러스 항원이 EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gH, HSV 초기 단백질 생성물, 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH, 및 IE 단백질 gP72로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 24항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 호흡기 합포체 바이러스로 감염되어 있고, 조성물이 미세유동화 항원 제형과 혼합된 치료적 유효량의 호흡기 합포체 바이러스 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 호흡기 합포체 바이러스 항원이 F 단백질, G 단백질, 및 N 단백질로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 22항 내지 제 24항 및 제 26항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제형이,
    (a) 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 및 트윈 80으로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 청정제; 및
    (b) 폴록사머 401, 플루로닉 L62LF, 플루로닉 L101, 플루로닉 L64, 테트로닉 1501, 테트로닉 150R1, 테트로닉 701, 테트로닉 901, 테트로닉 1301, 및 테트로닉 130R1으로부터 선택된 미셀-형성제를 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 22항 내지 제 24항 및 제 26항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제형이,
    폴록사머 401, 플루로닉 L62LF, 플루로닉 L101, 플루로닉 L64, 테트로닉 1501, 테트로닉 150R1, 테트로닉 701, 테트로닉 901, 테트로닉 1301, 및 테트로닉 130R1으로부터 선택된 미셀-형성제, 및
    스쿠알렌, 스쿠알란, 에이코산, 프리스탄, 테트라테트라콘탄, 트리아콘탄, 글리세롤, 콜레스테롤, 및 식물성 오일로 구성된 군으로부터 선택된 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 4항에 있어서, 유두종 바이러스 항원이 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, HPV18 E6 항원, HPV18 E7 항원, HPV6 E4 항원, HPV6 L1 항원, HPV11 E4 항원, 및 HPV11 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  43. 제 34항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 경부암에 걸려 있고, 조성물이 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, HPV18 E6 항원, HPV18 E7 항원, HPV6 E4 항원, HPV6 L1 항원, HPV11 E4 항원, 및 HPV11 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 유두종 바이러스 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 36항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 점형 콘딜로마에 걸려 있고, 조성물이 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, HPV18 E6 항원, HPV18 E7 항원, HPV6 E4 항원, HPV6 L1 항원, HPV11 E4 항원, 및 HPV11 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 유두종 바이러스 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 34항에 있어서, 사람을 제외한 환자가 전립선 암에 걸려 있고, 조성물이 전립선 특이적 항원을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 1항에 있어서, 청정제가 0.05 내지 0.5%의 양으로 제공됨을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 46항에 있어서, 청정제의 양이 0.2%임을 특징으로 하는 조성물.
  48. 제 1항에 있어서, 미셀-형성제가 0 내지 2의 친수성-친유성 밸런스를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제 1항에 있어서, 미셀-형성제가 폴록사머 401, 플루로닉 L62LF, 플루로닉 L101, 플루로닉 L64, 테트로닉 1501, 테트로닉 150R1, 테트로닉 701, 테트로닉 901, 테트로닉 1301, 및 테트로닉 130R1으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 조성물.
  50. 제 1항에 있어서, 미셀-형성제의 양이 0.5 내지 10%임을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제 50항에 있어서, 미셀-형성제의 양이 1.25 내지 5%임을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제 1항에 있어서, 오일이 60℃ 미만의 융점을 나타냄을 특징으로 하는 조성물.
  53. 제 1항에 있어서, 식물성 오일이 올리브유 또는 땅콩유임을 특징으로 하는 조성물.
  54. 제 1항에 있어서, 오일의 양이 1 내지 10%임을 특징으로 하는 조성물.
  55. 제 54항에 있어서, 오일의 양이 2.5 내지 5%임을 특징으로 하는 조성물.
  56. 제 1항에 있어서, 미세유동화 항원 제형이,
    (a) 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 및 트윈 80으로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 청정제;
    (b) 폴록사머 401, 플루로닉 L62LF, 플루로닉 L101, 플루로닉 L64, 테트로닉 1501, 테트로닉 150R1, 테트로닉 701, 테트로닉 901, 테트로닉 1301, 및 테트로닉 130R1으로 구성된 군으로부터 선택된 미셀-형성제; 및
    (c) 스쿠알란, 에이코산, 프리스탄, 트리아콘탄, 콜레스테롤, 및 식물성 오일로 구성된 군으로부터 선택된 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  57. 제 56항에 있어서, 미세유동화 항원 제형이,
    (a) 트윈 20, 트윈 40, 및 트윈 80으로 구성된 군으로부터 선택된 안정화 청정제;
    (b) 폴록사머 401인 미셀-형성제; 및
    (c) 스쿠알란인 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  58. 제 56항에 있어서, 미세유동화 항원 제형이,
    (a) 트윈 80인 안정화 청정제;
    (b) 폴록사머 401, 플루로닉 L62LF, 테트로닉 1501, 및 테트로닉 150R1으로 구성된 군으로부터 선택된 미셀-형성제; 및
    (c) 스쿠알란인 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  59. 제 56항에 있어서, 미세유동화 항원 제형이,
    (a) 트윈 80인 안정화 청정제;
    (b) 폴록사머 401인 미셀-형성제; 및
    (c) 스쿠알란, 에이코산, 프리스탄, 트리아콘탄, 콜레스테롤, 및 식물성 오일로 구성된 군으로부터 선택된 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  60. 제 56항에 있어서, 미세유동화 항원 제형이,
    (a) 트윈 80인 안정화 청정제;
    (b) 폴록사머 401인 미셀-형성제; 및
    (c) 스쿠알란인 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  61. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 제형이 사람을 제외한 동물 또는 환자에 비독성임을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 청정제가 0.05 내지 0.5%의 양으로 제공됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 청정제의 양이 0.2%임을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 미셀-형성제가 0 내지 2의 친수성-친유성 밸런스를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 미셀-형성제가 폴록사머 401, 플루로닉 L62LF, 플루로닉 L101, 플루로닉 L64, 테트로닉 1501, 테트로닉 150R1, 테트로닉 701, 테트로닉 901, 테트로닉 1301, 및 테트로닉 130R1으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 미셀-형성제의 양이 0.5 내지 10%임을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 미셀-형성제의 양이 1.25 내지 5%임을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 오일이 60℃ 미만의 융점을 나타냄을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 식물성 오일이 올리브유 또는 땅콩유임을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 오일의 양이 1 내지 10%임을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 오일의 양이 2.5 내지 5%임을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 청정제가 트윈 80이고, 미셀-형성제가 폴록사머 401임을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 오일이 스쿠알란이고, 미셀-형성제가 폴록사머 401임을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중의 입자 크기가 250 내지 300nm임을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 1항 내지 제 4항, 제 42항, 및 제 46항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물 중의 입자 크기가 250 내지 300nm임을 특징으로 하는 조성물.
  76. 제 22항 내지 제 24항, 제 26항 내지 제 39항, 및 제 43항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 난알부민 또는 B-세포 림프종 항원 이외의 항원임을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 1항 내지 제 4항, 제 42항, 및 제 46항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 난알부민 또는 B-세포 림프종 항원 이외의 항원임을 특징으로 하는 조성물.
  78. 제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 미세유동화 항원 제형이,
    (a) 트윈 80인 안정화 청정제;
    (b) 폴록사머 401인 미셀-형성제; 및
    (c) 스쿠알란인 생물분해성이고 생체적합성인 오일을 필수 성분으로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 항원이 난알부민 또는 B-세포 림프종 항원 이외의 항원임을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 78항에 있어서, 항원이 gp160, gag, pol, Nef, Tat, 및 Rev로 구성된 군으로부터 선택된 HIV 항원; CS 단백질 및 스포로조이트 표면 단백질 2로 구성된 군으로부터 선택된 말라리아 항원; Pre-S1, Pre-S2, HBc Ag, 및 HBe Ag로 구성된 군으로부터 선택된 B형 간염 표면 항원; HA, NP, 및 NA로 구성된 군으로부터 선택된 인플루엔자 항원; A형 간염 표면 항원; EBV gp340, EBV gp85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, HSV 초기 단백질 생성물, 사이토메갈로바이러스 gB, 사이토메갈로바이러스 gH, 및 IE 단백질 gp72로 구성된 군으로부터 선택된 포진 바이러스 항원; F 단백질, G 단백질, 및 N 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 호흡기 합포체 바이러스 항원; 및 암종 CEA, 암종 관련 무신, 암종 P21, 암종 P53, 흑색종 MPG, 흑색종 p97, 암종 Neu 종양 유전자 생성물, 암종 p53 유전자 생성물, 및 돌연변이된 p21 ras 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 종양 항원의 항원성 부분으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  81. 제 78항에 있어서, 항원이 바이러스 항원, 말라리아 관련 항원, 및 암 관련 항원으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 항원이 HIV 항원, 인플루엔자 관련 항원, 간염 관련 항원, 포진 바이러스 항원, 호흡기 합포체 바이러스 항원, 및 유두종 바이러스 항원으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  83. 제 81항에 있어서, 항원이 HPV16 E6 항원, HPV16 E7 항원, HPV18 E6 항원, HPV18 E7 항원, HPV6 E4 항원, HPV6 L1 항원, HPV11 E4 항원, 및 HPV11 L1 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 유두종 바이러스 항원임을 특징으로 하는 방법.
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