RU2129439C1 - Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических т-лимфоцитов, способ индуцирования и способ лечения болезни - Google Patents
Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических т-лимфоцитов, способ индуцирования и способ лечения болезни Download PDFInfo
- Publication number
- RU2129439C1 RU2129439C1 RU94038046/14A RU94038046A RU2129439C1 RU 2129439 C1 RU2129439 C1 RU 2129439C1 RU 94038046/14 A RU94038046/14 A RU 94038046/14A RU 94038046 A RU94038046 A RU 94038046A RU 2129439 C1 RU2129439 C1 RU 2129439C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- protein
- composition according
- agent
- ova
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 106
- 230000004044 response Effects 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 230000006698 induction Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 title claims description 40
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title abstract description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 79
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 72
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 27
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000007402 cytotoxic response Effects 0.000 claims abstract 2
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 32
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 claims description 23
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 claims description 18
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims description 18
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 18
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 12
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 12
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 10
- 239000000693 micelle Substances 0.000 claims description 9
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 claims description 8
- 229920002359 Tetronic® Polymers 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 6
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 6
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims description 6
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims description 6
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 6
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 claims description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 5
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 claims description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 4
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 claims description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 3
- -1 eicosan Chemical compound 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 claims description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 3
- KMXFZRSJMDYPPG-UHFFFAOYSA-N n-Tetratetracontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC KMXFZRSJMDYPPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 claims description 3
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 claims description 3
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 claims description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 229920002046 Pluronic® L 62 LF Polymers 0.000 claims description 2
- PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N Sorbitan trioleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PRXRUNOAOLTIEF-ADSICKODSA-N 0.000 claims description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 2
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 claims description 2
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 claims description 2
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims 2
- VAMFXQBUQXONLZ-UHFFFAOYSA-N icos-1-ene Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCC=C VAMFXQBUQXONLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 101710142246 External core antigen Proteins 0.000 claims 1
- 102100029974 GTPase HRas Human genes 0.000 claims 1
- 101710091881 GTPase HRas Proteins 0.000 claims 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 claims 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 claims 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 claims 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 claims 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims 1
- 101710192036 Sporozoite surface protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 claims 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 claims 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 claims 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 60
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 32
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 30
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 25
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 21
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 20
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 13
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 11
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 10
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 9
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 7
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 7
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 7
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 5
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 4-isocyanato-4'-methyldiphenylmethane Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1CC1=CC=C(N=C=O)C=C1 UZOVYGYOLBIAJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 3
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 101000957351 Homo sapiens Myc-associated zinc finger protein Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102100038750 Myc-associated zinc finger protein Human genes 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N icosane Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N (4R)-4-[[(2S,3R)-2-[acetyl-[(3R,4R,5S,6R)-3-amino-4-[(1R)-1-carboxyethoxy]-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound C(C)(=O)N([C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)O)C(N)=O)C1[C@H](N)[C@@H](O[C@@H](C(=O)O)C)[C@H](O)[C@H](O1)CO YHQZWWDVLJPRIF-JLHRHDQISA-N 0.000 description 1
- XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N (4as,6as,6br,8ar,9r,10s,12ar,12br,14bs)-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,12a-hexamethyl-9-[(sulfooxy)methyl]-1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11,12,12a,12b,13,14b-icosahydropicene-4a-carboxylic acid Chemical compound C1C[C@H](O)[C@@](C)(COS(O)(=O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CCC(C)(C)C[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C XBZYWSMVVKYHQN-MYPRUECHSA-N 0.000 description 1
- KTTCLOUATPWTNB-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[4-(6,7-dimethoxy-3,4-dihydro-1h-isoquinolin-2-yl)butylcarbamoyl]-4-methylphenoxy]ethyl methanesulfonate Chemical compound C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CCN1CCCCNC(=O)C1=CC(C)=CC=C1OCCOS(C)(=O)=O KTTCLOUATPWTNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 2-[[2-[[6-amino-2-[[2-[[2-[[5-amino-2-[[2-[[1-[2-[[6-amino-2-[(2,5-diamino-5-oxopentanoyl)amino]hexanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)p Chemical compound C1CCN(C(=O)C(CCCN=C(N)N)NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CCC(N)=O)C1C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 KISWVXRQTGLFGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 2H-benzotriazol-4-ol Chemical class OC1=CC=CC2=C1N=NN2 JMTMSDXUXJISAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XJQRWGXKUSDEFI-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- PVBBEKPHARMPHX-DCAQKATOSA-N Glu-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O PVBBEKPHARMPHX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N Glu-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ILWHFUZZCFYSKT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SYAYROHMAIHWFB-KBIXCLLPSA-N Glu-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SYAYROHMAIHWFB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N His-Phe-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N SGLXGEDPYJPGIQ-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 108010048209 Human Immunodeficiency Virus Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- ZZHGKECPZXPXJF-PCBIJLKTSA-N Ile-Asn-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZZHGKECPZXPXJF-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N Ile-Val-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N APQYGMBHIVXFML-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000047918 Myelin Basic Human genes 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- 108700020354 N-acetylmuramyl-threonyl-isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N Pro-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FHJQROWZEJFZPO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WLJPJRGQRNCIQS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- VULNJDORNLBPNG-SWRJLBSHSA-N Thr-Glu-Trp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N)O VULNJDORNLBPNG-SWRJLBSHSA-N 0.000 description 1
- MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N Thr-Pro-Pro Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 MROIJTGJGIDEEJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- VENKIVFKIPGEJN-NHCYSSNCSA-N Val-Met-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N VENKIVFKIPGEJN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000005243 fluidization Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N gentamicin Chemical class O1C(C(C)NC)CCC(N)C1OC1C(O)C(OC2C(C(NC)C(C)(O)CO2)O)C(N)CC1N CEAZRRDELHUEMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009215 host defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002998 immunogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002434 immunopotentiative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004073 interleukin-2 production Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940038774 squalene oil Drugs 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000012646 vaccine adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229940124931 vaccine adjuvant Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/001103—Receptors for growth factors
- A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001148—Regulators of development
- A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
- A61K39/001151—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin p53
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001154—Enzymes
- A61K39/001164—GTPases, e.g. Ras or Rho
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
- A61K39/00117—Mucins, e.g. MUC-1
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00118—Cancer antigens from embryonic or fetal origin
- A61K39/001182—Carcinoembryonic antigen [CEA]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
- A61K39/00119—Melanoma antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/015—Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
- A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицинской иммунологии. Сущность изобретения состоит в создании антегенной композиции, содержащей антиген, стабилизирующий детергент и дополнительные компоненты. Композиция обладает способностью при введении в организм индуцировать цитотоксический эффект Т-лимфоцитов. Описан также способ индуцирования такого ответа. Изобретение содержит также способы лечения инфекций вирусной и невирусной природы. Технический результат изобретения заключается в расширении арсенала средств и методов борьбы с инфекцией различного происхождения. 3 с. и 35 з.п.ф-лы, 5 табл., 9 ил.
Description
Эта заявка является частичным продолжением заявки США, серийный номер 07/735069, поданной 25 июля 1991 г., озаглавленной "Индукция ответов цитотоксических Т-лимфоцитов", Syamal Raychaudhuri и William H. Rastetter. Это изобретение относится к методам и композициям, пригодным для индукцирования опосредованных цитотоксическими Т-лимфоцитами, ответов у людей и у домашних или сельскохозяйственных животных.
Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), как считают, являются главным механизмом защиты хозяина при ответе на ряд вирусных инфекций и опухолевый или раковый рост. Эти клетки удаляют инфицированные или трансформированные клетки путем распознавания антигенных фрагментов в соединении с различными молекулами (названных МНС молекулами класса 1) на инфицированных или трансформированных клетках. ЦТЛ могут индуцироваться экспериментально путем цитоплазматической нагрузки определенными растворимыми антигенами в специфических клетках. Иммунизация одним растворимым антигеном обычно недостаточна для специфической индукции цитотоксических Т-лимфоцитов.
Один из методов, при помощи которого может индуцироваться ответ ЦТЛ, включает применение методик рекомбинантной инженерии для внедрения определяющих компонентов рассматриваемого антигена в геном слабого инфекционного агента. Целью такой стратегии является создание антиген-специфических ответов цитотоксических Т-лимфоцитов на желаемый эпитоп, путем вызова у хозяина легкой, самоограничивающей инфекции. Химерные векторы были описаны при использовании вирусов коровьей оспы, полно-, адено- и ретровирусов, так же, как и бактерий, таких как Listeria и БЦЖ. Например, Takahashi et al., 85 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1988, описывает рекокмбинантый вакцинный вирус, экспрессирующий оболочечный ген HIV др. 160, в качестве потенциального средства для индукции цитотоксических Т-лимфоцитов.
Второй метод, с помощью которого может индуцироваться клеточно опосредованный ответ, включает использование адъювантов. Поскольку эта область, как видно, изобилует спорами по применению адъювантов, неясно индуцировался ли клеточно опосредованный иммунитет при таком способе, и включал ли такой клеточно опосредованный иммунитет ответ цитотоксических Т-лимфоцитов. Следующие, однако, являются характерными публикациями в этой области знаний.
Stover et al., 351 Nature 456, 1991 (не признан прототипом по отношению к настоящей заявке) описывает ответ ЦТЛ на батагалактозидазу при использовании рекомбинантной БЦЖ, содержащей ген бетагалактозидазы. Никакого подобного ответа не обнаружено при использовании неполного адъюванта Фрейнда и бета-галактозидазы.
Mitchell et al. , 8 J. Clinical Oncology 856, 1990 (который не признан прототипом для настоящего изобретения) описывает лечение больных с метастатической меланомой адъювантом, названным "ДЕТОКС" и лизатами аллогенной меланомы, вводимыми пять раз за шестинедельный период. У небольшой части больных наблюдалось увеличение числа цитологических Т-клеток. Авторы описывают необходимость повышения уровня продукции цитотоксических Т-лимфоцитов и предлагают комбинированную терапию адъювантом с интерлейкином-2 также, как и предварительное лечение циклофосфамидом, чтобы снизить уровень специфических для опухоли Т-супрессорных клеток, которые могут присутствовать. ДЕТОКС включает детоксифицированный эндотоксин (монофосфорильный липид A) из Salmonella minnesota каркасы клеточных стенок Mycobactirium phlei скваленовое масло и эмульгатор.
Allison и Gregoriadis, 11 Immunlogy Today 427, 1990 (который не признан прототипом для настоящего изобретения) отмечает, что единственным адъювантом "разрешенным для применения" в человеческих вакцинах являются соли алюминия (алюм), которые не вызывают стойкого клеточно опосредованного иммунитета.
Allison и Gregoriadis утверждают, что "существует потребность в разработке адъювантов с эффективностью полного адъюванта Фрейнда, но без его различных побочных эффектов, таких, как гранулемы". Они далее утверждают, что существует три возможных стратегии, например, использование липосом; использование адъювантов, называемых имуностимлуирующими комплексами (ISCOM, которые включают сапонин или Quil A (тритерпеноид с двумя углеводными цепями), холестерол и фосфатидилхолин), которые разрешены для использования в противогриппозной вакцине для лошадей (Morein et al., Immunological Adjuvants and Vaccines, Plenum Press, 153); и использование эмульсии (SAF) сквалена или скважина (с или без плюрониевого агента) и мурамил-дипептида (MDP), SAF, как сказано, вызывает клеточно опосредованный иммунитет у мышей, хотя "долго считали, что субъеденичные антигены не могут вызвать ответов цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ); Takahashi et al., 344 Nature 873, 1990, описывают индукцию ограниченных классом II хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов путем использования ISOM при единственной подкожной иммунизации у мышей. Они сообщают, что адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда и физиологический раствор с фосфатным буфером не индуцируют активность цитотоксических Т-лимфоцитов против мишеней, в которых они заинтересованы. Они заявляют, что в противоположность результатам, полученным с другими формами экзогенных растворимых белковых антигенов, они показали, что возможно примировать антиген-специфические МНС классом 1 ограниченные, C 8+ 4- ЦТЛ путем имунизации экзогенным интактным белком при использовании ISCOM. Они также сообщают, что описанные эксперименты наводят на мысль, сто возможно вызвать продукцию человеческих ЦТЛ путем использования белков HIV, содержащих ISCOM, и что вакцины на основе ISCOM могут достичь давно желанной цели индукции как ЦТЛ, так и антител с помощью очищенного белка.
Byars и Allison, 5 Vaccines 223, 1987 описывают использование SAF-1, который включает ТВИН 80, PLURONIC L12 и скален или сквален с мурамил-дипептидом или без него, и предполагают, что их данные показывают, что рецептура с мурамил-дипептидом будет пригодна для ветеринарных вакцин и вакцин для людей. Вторичные инъекции адъюванта давали без мурамил-дипептида. Мурамил-дипептид, как сказано, значительно увеличивает продукцию антител по сравнению с использованием одъюванта без мурамил-дипептида. Клеточно опосредованный иммунитет определялся как гиперчувствительность замедленного типа путем кожных проб, чтобы определить индукцию Т-хелперных клеток. Такая гиперчувствительновсть была сильнее и более длительна, когда адъювант снабжался мурамил-дипептидом. Аналогичные адъюванты описаны Allison et al., патент США 4770874 (где сообщается, что комбинация мурамил-дипептида и плюрониевого полиола необходима, чтобы вызвать сильный клеточно опосредованный или гуморальный ответ на яичный альбумин); Allison и др., патент США 4772466; Murphy - Cord и др., 246 Science 1293, 1989 (где сообщается, что использование комбинированных адъювантов с мурамил-дипептидом могло усиливать индукцию как гуморальной, так и клеточной ветвей иммунного ответа); Allison and Byars, 87 Vaccines 56, 1987 (где заявляется, что клеточно опосредованный иммунитет вызывается SAF (с мурамил-дипептидом), как показано по гиперчувствильности замедленного типа, пролиферативным ответам Т-клеток на антиген, по продукции интерлейкина-2 и по специфическому генетически ограниченному лизису мишеневых клеток, несущих иммунизирующий антиген); Allison and Byars, Immunophamacology of Infectious Diseases; Vaccine Adjuvants and Modulators of Non-Specific Resistance 191 - 201, 1987; Morgan et al., 29, J. Medical Virology 74, 1989; Kenney et al., 121 J. Immunological Methods 157, 1989; Allison and Byars, 95 J. Immunological Methods 157, 1986 (где показано, что соли алюминия и эмульсии минерального масла увеличивают образование антител, но не усиливает клеточно опосредованный иммунитет; и рецептуры с мурамил-дипептидом, как показано, вызывают клеточно опосредованный иммунитет); Byars et al. , 8 Vaccine 49, 1990 (не признано прототипом для настоящей заявки), где заявляется, что их рецептура адъюванта заметно увеличивает гуморальные ответы и, в меньшей степени, усиливает клеточно опосредованные ответы на гемаглютинин гриппа);
Allison and Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (не признана прототипом для настоящей заявки; которая сообщает, что функция мурамил-дипептида состоит в индукции экспрессии цитокинов и усилении экспрессии основных генов гистосовместимости (МНС); и что получены лучшие антительyые и клеточные ответы, чем с другими адъювантами, и что предполагают установить эффективна ли подобная стратегия у людей); Allison and Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (которая описывает клеточно опосредованный иммунитет при использовании SAF); Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (которая представляет обзор по различным адъювантам, использованным при получении вакцин); Alison and Byars, 95 J. Immolological Methods 157, 1986 (которая устанавливает, что добавление мурамил-дипептида к адъюванту заметно усиливает клеточно опосредованные ответы на ряд антигенов, включая моноклональные иммуноглобулины и вирусные антигены); и Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1980 (которая описывает использование SAF-1 для приготовления вакцины из вирусов Эпштейна-Барра).
Allison and Byars, 28 Molecular Immunology 279, 1991 (не признана прототипом для настоящей заявки; которая сообщает, что функция мурамил-дипептида состоит в индукции экспрессии цитокинов и усилении экспрессии основных генов гистосовместимости (МНС); и что получены лучшие антительyые и клеточные ответы, чем с другими адъювантами, и что предполагают установить эффективна ли подобная стратегия у людей); Allison and Byars, Technology Advances in Vaccine Development 401, 1988 (которая описывает клеточно опосредованный иммунитет при использовании SAF); Epstein et al., 4 Advance Drug Delivery Reviews 223, 1990 (которая представляет обзор по различным адъювантам, использованным при получении вакцин); Alison and Byars, 95 J. Immolological Methods 157, 1986 (которая устанавливает, что добавление мурамил-дипептида к адъюванту заметно усиливает клеточно опосредованные ответы на ряд антигенов, включая моноклональные иммуноглобулины и вирусные антигены); и Morgan et al., 29 J. Medical Virology 74, 1980 (которая описывает использование SAF-1 для приготовления вакцины из вирусов Эпштейна-Барра).
Kwak et al., Idiotipe Networks in Biology and Medicine, Elsevier Science Publishers, p. 163, 1990 (не признана прототипом настоящей заявки) описывает использование SAF без мурамил-дипептида в качестве адъюванта для идиотипа B-клеточной лимфомы у людей. В частности, эмульсия плюрониевого L 121, скалана и 0.4% ТВИН-80 в физиологическом растворе с фосфатным буфером вводилась вместе с идиотипом. Они сообщают, что "добавление адъюванта должно, к тому же, усиливать гуморальные ответы и может также облегчить индукцию клеточных ответов.
Другие иммунологические препараты включают липосомы (Allison et al., патенты США 4053585 и 4117113); циклические пептиды (Dreesman et al., патент США 4778784); полный адъювант Фрейнда (Asherson et al., 22 Immunology 465, 1972; Berman et al., 2 International J. Canser 539, 1967; Allicon. 18 Immunopotentiation 73, 1973; и Allison, Non-Specific Factors Influencing Host Resistance 247, 1973); ISCOM (Letvin et al., 87 Vaccines 209, 1987); адъюванты, содержащие неионные блокирующие полимерные агенты, соединенные с минеральным маслом, поверхностно активным агентом и ТВИН-80 (Hunter and Bennett, 133 J. Immunology 3167, 1984; и Hunter etl al., 127 J. Immunology 1244, 1981); адъюванты, составленные из минерального масла и эмульгирующего средства с убитыми микобактериями или без них (Sancher - Percador et al., 141 J. Immunology 1720, 1988); и другие адъювант, такие как липофильное производное мурамил-трипептида и мурамил-дипептид, ковалентно связанный с рекомбинантным белком (id).
Кратное изложение изобретения
Заявитель открыл безопасный и обладающий рядом преимуществ способ и композиции, с помощью которых ответы ЦТЛ могут индуцироваться у людей и домашних или сельскохозяйственных животных. Способ включает использование антигенной рецептуры, которая обладает слабой токсичностью для животных или вообще ее не имеет, и в которой отсутствует иммуностимулирующий пептид (например, мурамил-дипептид), присутствие которого снижало бы желаемый клеточный ответ. Кроме того, методология проста для использования и не требует объемной работы, для изменения существующих клеток при помощи методик рекомбинантной ДНК, чтобы сделать их иммуногенными. Это открытие удивительно, так как не ожидалось, что подобные ответ ЦТЛ мог бы вызываться при применении такой антигенной рецептуры с отсутствием иммуностимулирующих пептидов или их эквивалента. Данные, полученные заявителем, дают возможность использования таких антигенных рецептур при широком спектре болезненных состояний или в качестве профилактических средств. Например, введение таких антигенных рецептур может использоваться при лечении вирусных заболеваний, при которых важен ответ ЦТЛ, например при лечении HIV инфекции или группа; оно может быть также расширено, чтобы использоваться при лечении бактериальных инфекций, рака, паразитарных инфекций и тому подобного. В качестве профилактического средства антигенная рецептура с подходящим антигеном применена для предупреждения инфекции, вызываемой вирусами, ответственными за вышеупомянутые вирусные заболевания, особенно для профилактики HIV инфекции, а также для профилактики у больных с риском рака, например, после резекции первичной опухоли.
Заявитель открыл безопасный и обладающий рядом преимуществ способ и композиции, с помощью которых ответы ЦТЛ могут индуцироваться у людей и домашних или сельскохозяйственных животных. Способ включает использование антигенной рецептуры, которая обладает слабой токсичностью для животных или вообще ее не имеет, и в которой отсутствует иммуностимулирующий пептид (например, мурамил-дипептид), присутствие которого снижало бы желаемый клеточный ответ. Кроме того, методология проста для использования и не требует объемной работы, для изменения существующих клеток при помощи методик рекомбинантной ДНК, чтобы сделать их иммуногенными. Это открытие удивительно, так как не ожидалось, что подобные ответ ЦТЛ мог бы вызываться при применении такой антигенной рецептуры с отсутствием иммуностимулирующих пептидов или их эквивалента. Данные, полученные заявителем, дают возможность использования таких антигенных рецептур при широком спектре болезненных состояний или в качестве профилактических средств. Например, введение таких антигенных рецептур может использоваться при лечении вирусных заболеваний, при которых важен ответ ЦТЛ, например при лечении HIV инфекции или группа; оно может быть также расширено, чтобы использоваться при лечении бактериальных инфекций, рака, паразитарных инфекций и тому подобного. В качестве профилактического средства антигенная рецептура с подходящим антигеном применена для предупреждения инфекции, вызываемой вирусами, ответственными за вышеупомянутые вирусные заболевания, особенно для профилактики HIV инфекции, а также для профилактики у больных с риском рака, например, после резекции первичной опухоли.
Таким образом, в первом аспекте, изобретение показывает способ индуцирования ответа ЦТЛ у людей или домашних (например, кошки или собаки) или важных для сельского хозяйства животных (например, лошади, коровы или свиньи) на антигены, кроме антигена B-клеточной лимфомы или яичного альбумина. Способ включает стадии получения антигена, по отношению к которому желателен ответ ЦТЛ и получение нетоксичной антигенной рецептуры (формы), которая включает, состоит или по существу состоит из стабилизирующего детергента, образующего мицеллы средства и биодеградируемого и биосовместного масла. В этой антигенной рецептуре предпочтительно отсутствует какой-либо иммуностимулирующий пептидный компонент или имеются достаточно низкие уровни такого компонента, которые не снижают желаемый клеточный ответ. Эта рецептура предпочтительно представляют собой стабильную эмульсию масло-в-воде. То есть каждый из различных компонентов выбирается так, чтобы эмульсия оставалась в эмульгированном состоянии в течение периода по крайней мере одного месяца и, предпочтительно, в течение более чем одного года без разделения фаз. При этом способе антиген и антигенная рецептура смешиваются вместе для образования смеси (предпочтительно путем микропсевдоожижения), и эта смесь вводится животному в количестве достаточном, чтобы индуцировать ответ ЦТЛ в животного. Необходимо лишь одно такое введение.
Под "стабилизирующим детергентом" подразумевается детергент, который позволяет компонентам эмульсии сохраняться в виде стабильной эмульсии. Такие детергенты включают полисорбат, 80 (ТВИН) (сорбитан-моно-9-октадеценоат-поли-(окси-1,2-этандиил); производимый ICI Americas, Wilmington, DE), ТВИН 40, ТВИН 20, ТВИН 60, Zwittergent 3-12, TEEPOL HB7, и SPAN 85. Эти детергенты даются обычно в количестве примерно 0.05 до 0.5%, предпочтительно, в количестве примерно 0.2%.
Под "образующим мицеллы веществом" подразумевается вещество, способное стабилизировать эмульсию, образованную с другими компонентами, так что образуется мицеллоподобная структура. Такие средства предпочтительно вызывают некоторое раздражение в месте инъекции, чтобы побудить макрофаги вызвать клеточный ответ. Примеры таких средств включают полимерные сурфактанты, описанные в BASF Wyandotte publications, например, Schmolka, 54 J. Am. Oil. Chem. Soc. 110, 1977, и Hanter et al., 129 J. Immunol 1244, 1981, обе включены здесь в виде ссылки, PLURONIC L 62 LF, L 101, и L 64, L 121, PEG 1000, и TETRONIC 1501, 150R1, 701, 901, 1301, и 130R1. Химические структуры таких агентов хорошо известны в данной области. Предпочтительно агент выбирается так, чтобы иметь гидрофильоно-липофильное соотношение (HLB) между 0 и 2, как определено у Hunter И Bennet, 133 Journal of Immunology 3167, 1984. Вещество предпочтительно дается в количестве между 0.001 и 10%, наиболее предпочтительно в количестве между 0.001 и 5%.
Масло выбирается так, чтобы способствовать сохранению антигена в эмульсии масло-в-воде, то есть обеспечивать носитель для желаемого антигена, и предпочтительно, имеет температуру плавления меньше, чем 65oC, такую, что эмульсия образуется или при комнатной температуре (примерно от 20 до 25oC), или как только температура эмульсии снижается до комнатной температуры. Примеры таких масел включают сквален, сквалан, EICOSANE, тетратетраконтан, глицерол и арахисовое масло или другие растительные масла. Масло предпочтительно дается в количестве между 1 и 10%, наиболее предпочтительно между 2.5 и 5%. Важно, чтобы масло было биодеградируемым и биосовместимым так, чтобы организм мог разрушить масло через некоторое время и так, чтобы не появлялось никаких побочных эффектов, таких, как гранулемы, при использовании масла.
Важно, чтобы в вышеупомянутой рецептуре пептидный компонент, в частности, мурамил-дипептид (MDP) отсутствовал. Такой пептид будет влиять на индукцию ответа ЦТЛ, если он дается в количестве больше, чем примерно 20 микрограмм на нормальную человеческую дозу введения препарата. Предпочтительно, чтобы такие пептиды полностью отсутствовали в антигенном препарате, несмотря на явную стимуляцию ими гуморального отдела иммунной системы. То есть заявитель обнаружил, что, хотя такие пептиды могут усиливать гуморальный ответ, они неблагоприятны, когда желателен ответ цитотоксических Т-лимфоцитов.
В других связанных аспектах, антигенная рецептура (препарат) создается из только двух из вышеназванных трех компонентов и используется с любым желаемым антигеном (термин, который включает белки, полипептиды и их фрагменты, которые являются иммуногенными), за исключением яичного альбумина (или других альбуминов, например, HSA, BSA и овальбумин), чтобы индуцировать ответ ЦТЛ у вышеназванных животных или людей.
Заявитель полагает, что вышеприведенные препараты обладают значительными преимуществами над предшествующими препаратами (включая ISCOMS, DETOX и SAF) для применения у людей. В отличие от таких препаратов, настоящий препарат включает образующее мицеллы вещество и, в то же время, не имеет в составе пептидов, остовов клеточных стенок или компонентов бактериальных клеток. Настоящий препарат также индуцирует ответ ЦТЛ, который или не наблюдался при применении предшествующих препаратов, или значительно выше по сравнению с этими препаратами.
Под "нетоксичный" подразумевается, что наблюдается небольшое побочное действие или его отсутствие у лечившегося животного или человека. Специалисты в области медицины или ветеринарии поймут, что этот термин имеет широкое значение. Например, по существу здорового животного или человека может допускаться только легкая токсичность, тогда как у человека, страдающего заболеванием в терминальной стадии (с предполагаемой продолжительностью жизни меньше, чем, примерно, три года) может допускаться существенно большая токсичность.
В предпочтительных примерах осуществления антигенный препарат состоит по существу из двух из трех этих детергента, вещества и масла; способ состоит по существу в единственном введении смеси (антиген плюс антигенная рецептура) человеку или животному; человек или животное инфицированы вирусом и испытывают один или более симптомов (которые в основном определяются врачами - специалистами в соответствующей области) инфекции, вызванной вирусом; и антигенный препарат является нетоксичным для людей и животных.
В других предпочтительных примерах осуществления антиген выбирается из HIV антигенов: gp 160, gag, pol, Nef, Tat и Rev; малярных антигенов; белка CS и спорозонтного поверхностного белка 2; поверхностных антигенов гепатита B: Pre - S1, Pre - S2, HBc Ag, и HBc Ag; антигенов вируса гриппа: HA, NP и NA; поверхностных антигенов гепатита A; антигенов вируса герпеса: EBV gp 340, EBV gp 85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, раннего белкового продукта HSV, цитомегаловирусного gB, цитомегаловирусного gH и IE белка gP72; антигенов респираторно-синцитиального вируса: белка F, белка G и белка N; и опухолевых антигенов CEA карциномы, карциномного муцина, P21 карциномы, P53 карциномы, MPG меланомы, p97 меланомы и онкогенного продукта Neu карциномы, продукта гена p53 карциномы, антигена меланомы, называемого MAGE, и мутированного белка p21 ras, присутствующего в ряде злокачественных опухолей.
В смежном аспекте изобретение описывает композицию, включающую, состоящую или, по существу, состоящую из антигена, смешанного с антигенной рецептурой, описанной выше, и антиген выбирается из этих антигенных частей, перечисленных выше.
В других смежных аспектах изобретение описывает способы лечения больного, инфицированного вирусом HIV, страдающих малярией, гриппом, гепатитом, больных раком, инфицированных вирусом герпеса, инфицированных респираторным синцитиальным вирусом, путем введения композиции, включающей соответствующий антиген (например, выбранный из перечисленных выше), смешанный с одной из вышеназванных антигенных рецептур.
Другие характерные черты и преимущества изобретения будут очевидны из последующего описания предпочтительных его воплощений и из формулы изобретения.
Описание предпочтительных примеров осуществления
Фиг. 1A и 1C являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ различными овальбуминовыми препаратами; E : T представляет отношение клеток эффекторов к клеткам-мишеням на всех фигурах.
Фиг. 1A и 1C являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ различными овальбуминовыми препаратами; E : T представляет отношение клеток эффекторов к клеткам-мишеням на всех фигурах.
Фиг. 2A и 2B являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ различными β-алактозидазными препаратами.
Фиг. 3 являются графическим представлением данных сравнения индукции ЦТЛ овальбумином в липосомах и в антигенном препарате.
Фиг. 4 и 5 являются графическим представлением данных, показывающих действие CD4 и CD8 клеточного истощения на индукцию ЦТЛ.
Фиг. 6 являются графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью плюронцевого агента и ТВИН и антигена.
Фиг. 7 являются графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью сквалана и ТВИН и антигена.
Фиг. 8 являются графическим представлением данных, показывающих индукцию ЦТЛ смесью скавалана и плюрониевого агента и антигена.
Фиг. 9 являются графическим представлением индукции анти- gp 120111b антител у обезьян при помощи различных антигенных рецептур; и
Фиг. 10A - 10B являются графическим представлением данных сравнения gp 120-специфического ответа ЦТЛ у обезьян, иммунизированных вирусом коровьей оспы - gp 120 и gp 120-AF.
Фиг. 10A - 10B являются графическим представлением данных сравнения gp 120-специфического ответа ЦТЛ у обезьян, иммунизированных вирусом коровьей оспы - gp 120 и gp 120-AF.
Антигенная рецептура
Антигенные рецептуры, применяемые в этом изобретении, в основном описаны выше. Специалисты в этой области поймут, что легко приготовить эквивалентные рецептуры и можно ожидать, то они будут иметь эквивалентные свойства в индукции ответа ЦТЛ. Такие рецептуры легко испытываются на их свойства с использованием методик, эквивалентных описанным в примерах ниже.
Антигенные рецептуры, применяемые в этом изобретении, в основном описаны выше. Специалисты в этой области поймут, что легко приготовить эквивалентные рецептуры и можно ожидать, то они будут иметь эквивалентные свойства в индукции ответа ЦТЛ. Такие рецептуры легко испытываются на их свойства с использованием методик, эквивалентных описанным в примерах ниже.
Далее следуют примеры изобретения с использованием антигенной рецептуры (AF), составленной из примерно 15% сквалана (0.6 ТВИН 80) и (0.0045 - 3.75% плюрониевого) в фосфатно-буферном физрастворе (Imed STP). В частности, эмульсия AF включала: 150 мг сквалана, 0.045 - 37.5 мг полоксамера 401 (PLURONIC L 121), 6 мг полисорбата 80 (TWEEN 80), 0.184 мг хлорида калия, 0.552 мг моноосновного фосфата калия, 7.36 мг хлорида натрия, 3.3 мг диосновного фосфата натрия (безводного) на 1 мл воды, pH 7.4. Эта эмульсия микропсевдоожижалась с использованием стандартной методики (Microfluidies Model M110F) в модуле обратного давления при 11 - 14000 psi (фунтов на квадратный дюйм) с постепенным возвратом к атмосферному давлению, с охлаждением и сохранением в тающем льду.
В других примерах антиген смешивался с мкропсевдоожиженной смесью сквалана (S), плюрониевого (P) и ТВИНа 80 (Т), чтобы достичь конечной концентрации в 5% сквалана, 0.2% ТВИН 80 и 0.0015 - 1.25% плюрониевого, соответственно. Чтобы определить суб-компоненты, необходимые для индукции специфического иммунного ответа, сквален-ТВИН 80, плюрониевый-ТВИН 80 или сквалан-плюрониевый готовили в тех же самых концентрациях, что и для трехкомпонентной смеси. Плюрониевый, сквалан или ТВИН 80 готовили также отдельно, чтобы определить действие отдельного компонента на индукцию ЦТЛ. Производились также замещения ТВИН 20, ТВИН 40 или Zwittergent вместо ТВИНИ 80, чтобы определить действие различных производных ТВИН на индукцию ЦТЛ в ova системе. Замены Сквалана на Eicosone или Triacontone в трехкомпонентной рецептуре и замены вместо плюрониевого сополимера на PEG 1000, Pleuronic L 62 LF и Tetronocs 1501 и 150 RL также производились в той же самой трехкомпонентной рецептуре. В качестве двухкомпонентных рецептур, смешивали различные аналоги в разных сочетаниях и испытывали на ova специфическую индукцию ЦТЛ. Ими были смесь холестерола - ТВИН 80, Сквален - ТВИН 20, Pristane - ТВИН 80 или оливковое масло - ТВИН 80. Для изучения стабилизации смесь Сквалана - ТВИН 80 после микропсевдоожижения смешивали с декстрозой до конечной концентрации в 5%. Во всех случаях комбинации наполнителей смешивали в приборе для микропсевдоожижения для получения стабильной эмульсии. В некоторых экспериментах двухкомпонентные рецептуры смешивали с разными концентрациями MDP для индукции гуморального ответа и ответа ЦТЛ. Таблица 1 представляет полный список различных рецептур, использованных при этом исследовании (см. в конце описания).
В качестве контроля адъюванта использовалась синтексная рецептура адъюванта (микропсевдооожиженная; SAFm) и состояла из двух частей. Часть I состоит из фосфатно-буферного физраствора, содержащего конечную концентрацию сквалана в 5%, 1.25% плюрониевого и 0.2% ТВИН 80 (носителя или 1-SAF). Часть II состоит из N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглютамина (Thr - MDP), производного компонента клеточной стенки микобактерий. Для целей иммунизации антиген смешивают с микропсевдоожиженным носителем (часть I), чтобы получить гомогенную эмульсию. MDP добавляется, чтобы приготовить SAFm и недолго интенсивно перемешивается. Концентрацию MDP в смеси изменяли, чтобы определить существует ли оптимум концентрации для индукции ЦТЛ. В качестве контроля для адъюванта мышей иммунизировали растворимыми антигенами, смешанными с алюминиевыми солями в соответствии с руководством производителя (Pierce Chemical, Rockford, IL) или с полным адъювантом Фрейнда (CFA).
Антигенная рецептура STP используется для индукции ответов цитотоксических лейкоцитов у мышей. Специалистам будет ясно, что такая мышиная модель является показателем того, что в эквивалентных экспериментах или при лечении будут подобным же образом вызываться ответы цитотоксических Т-лимфоцитов у людей, домашних животных и сельскохозяйственных животных. Количество антигенной рецептуры и антигена, пригодное для того, чтобы вызвать желаемый клеточный ответ, может быть определено эмпирически стандартными методами, хорошо известными специалистам в этой области, без ненужного экспериментирования. Таким образом, если желательно минимизировать побочные эффекты лечения такой смесью, специалисты могут определить минимальный уровень такой смеси, необходимый для введения человеку, домашнему или сельскохозяйственному животному, чтобы вызвать ответ ЦТЛ и тем самым вызвать иммунитет к желаемому антигену. При нормальном использовании такая смесь будет вводиться с помощью любой из ряда стандартных процедур, но особенно предпочтительна внутримышечная инъекция в месте, которое позволит эмульсии оставаться в стабильной форме в течение периода в несколько дней или несколько недель.
Следующие материалы и методы использовались в примерах, представленных ниже, если нет других указаний:
Мыши
Мыши-самки C57BL/6 (H-2b) и BALB/c (H-2) были куплены в Harlen Sprague (Can Diego, California).
Мыши
Мыши-самки C57BL/6 (H-2b) и BALB/c (H-2) были куплены в Harlen Sprague (Can Diego, California).
Антигены
Овальбумин (ova, сорт Vii; Sigma Chimical Co., St. Louis, MO) использовался в нативной форме. β-галактозидаза ( β-gal, сорт VIII; BRL) использовалась в нативной форме и после кипячения в 1 М NaOH в течение 2 мин, чтобы получить щелочной перевар. Рекомбинантный gp120 был куплен у American Biotechnology.
Овальбумин (ova, сорт Vii; Sigma Chimical Co., St. Louis, MO) использовался в нативной форме. β-галактозидаза ( β-gal, сорт VIII; BRL) использовалась в нативной форме и после кипячения в 1 М NaOH в течение 2 мин, чтобы получить щелочной перевар. Рекомбинантный gp120 был куплен у American Biotechnology.
Опухолевые клетки и трансфектанты
Использовали опухолевые клетки 1a линий EL4 (C57BL/6, H-2b тимома) и P815 (DBA/2, H-2d мастоцитома). Получение ovа-продуцирующего трансфектанта EL4, EG7-ova, описано ранее Moore et al, 54 CeJJ 777, 1988. Трансфектант, продуцирующий β-gel, P13.1, был получен путем электропорации 107 P815 клеток в 1 мл фосфатно-буферного физраствора (PBS) с 10 мг Pst I нормализованном pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc. , Pisсataway., NJ) и 1 мг Pvu I нормализованном pSV 2 neo (Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Genet 327, 1982) с последующей селекцией в среде с 400 мкг/мл антибиотика G418. Трансфетакт C3-4 получали из BALB/c гибридомы Igm 662 путем трансфекции плазмидой, кодирующей ген β-gal лигированные с третьим и четвертым экзоном тяжелой цепи Igm (Rammensee et al. , 30 Immunogenetics 296, 1989). Экспрессирующие p160111b фибробласты 3Т3, 15 - 12 были предоставлены доктором Germain из NIH (Bethesda, MD). Kb трансфицированная линия L-клеток была предоставлена доктором Carbone, Monash University, Australia. Db и Ld трансфицированные линии L-клеток были предоставлены доктором Ted Hensen, Washington University, St. Louis.
Использовали опухолевые клетки 1a линий EL4 (C57BL/6, H-2b тимома) и P815 (DBA/2, H-2d мастоцитома). Получение ovа-продуцирующего трансфектанта EL4, EG7-ova, описано ранее Moore et al, 54 CeJJ 777, 1988. Трансфектант, продуцирующий β-gel, P13.1, был получен путем электропорации 107 P815 клеток в 1 мл фосфатно-буферного физраствора (PBS) с 10 мг Pst I нормализованном pCH110 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc. , Pisсataway., NJ) и 1 мг Pvu I нормализованном pSV 2 neo (Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Genet 327, 1982) с последующей селекцией в среде с 400 мкг/мл антибиотика G418. Трансфетакт C3-4 получали из BALB/c гибридомы Igm 662 путем трансфекции плазмидой, кодирующей ген β-gal лигированные с третьим и четвертым экзоном тяжелой цепи Igm (Rammensee et al. , 30 Immunogenetics 296, 1989). Экспрессирующие p160111b фибробласты 3Т3, 15 - 12 были предоставлены доктором Germain из NIH (Bethesda, MD). Kb трансфицированная линия L-клеток была предоставлена доктором Carbone, Monash University, Australia. Db и Ld трансфицированные линии L-клеток были предоставлены доктором Ted Hensen, Washington University, St. Louis.
Иммунизация
Мышей иммунизировали внутривенно 200 мкл суспензии 25 • 106 спленоцитов после цитоплазматической нагрузки, как описано Moore et al., выше, и Carbone et al, J. Exp. Med. 169:603, 1989). Для иммунизации ova-антигенной рецептурой или β-gal-антигенной рецептурой, 30 мкг каждого белкового антигена на мышь вводилось в подушечку лапы и основание хвоста, подкожно. Каждая инъекция содержала 67 мкл микропседоожиженной антигенной рецептуры (изготовленной по стандартным процедурам) и 30 мкг белкового антигена в конечном объеме 200 мкл. До конечного объема доводили с помощью HBSS, смотрите Whittaker manual (Welkersville, MD). MDP давали в концентрациях между 0 и 300 мкг. Где указано, мышей иммунизировали растворимыми антигенами в CFA или в алюм в общем объеме 200 мкл.
Мышей иммунизировали внутривенно 200 мкл суспензии 25 • 106 спленоцитов после цитоплазматической нагрузки, как описано Moore et al., выше, и Carbone et al, J. Exp. Med. 169:603, 1989). Для иммунизации ova-антигенной рецептурой или β-gal-антигенной рецептурой, 30 мкг каждого белкового антигена на мышь вводилось в подушечку лапы и основание хвоста, подкожно. Каждая инъекция содержала 67 мкл микропседоожиженной антигенной рецептуры (изготовленной по стандартным процедурам) и 30 мкг белкового антигена в конечном объеме 200 мкл. До конечного объема доводили с помощью HBSS, смотрите Whittaker manual (Welkersville, MD). MDP давали в концентрациях между 0 и 300 мкг. Где указано, мышей иммунизировали растворимыми антигенами в CFA или в алюм в общем объеме 200 мкл.
Стимуляция in vitro популяций эффекторов
Клетки селезенки (30 • 106) от нормальных или иммунизированных мышей, которые были примированы по крайней мере 14 дней ранее, инкубировали с 1.5 • 106 EG7-ova (облученных 20 000 рад) для получения ответов на ova, или с 1.5 • 106 клеток С3-4 (облученных 20 000 рад) для получения ответа на β-gal в 24 ячеистых платах при 37oC в атмосфере с 7% CO2 воздухе. Все культуры тканей получали в полной среде, состоящей из среды IMDM, смотрите Whittaker Manual (Welkersville, MD), дополненной 10% плодной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ глютамина, гентамицинов и 2 • 10-5 М 2-меркаптоэтанола. Для экспериментов истощения in vitro примированные in vivo или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали моноклональными антителами (mAbs) RL. 172 (анти-CD 4) или mAbs 3.168 (анти-CD8) для удаления CD4+ или CD8+T-клеток (Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665, 1980, и Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). mAb RL, 172 и mAb 3.168 были получены от Dr. Jonathan Sprent из Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla, CA.
Клетки селезенки (30 • 106) от нормальных или иммунизированных мышей, которые были примированы по крайней мере 14 дней ранее, инкубировали с 1.5 • 106 EG7-ova (облученных 20 000 рад) для получения ответов на ova, или с 1.5 • 106 клеток С3-4 (облученных 20 000 рад) для получения ответа на β-gal в 24 ячеистых платах при 37oC в атмосфере с 7% CO2 воздухе. Все культуры тканей получали в полной среде, состоящей из среды IMDM, смотрите Whittaker Manual (Welkersville, MD), дополненной 10% плодной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ глютамина, гентамицинов и 2 • 10-5 М 2-меркаптоэтанола. Для экспериментов истощения in vitro примированные in vivo или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали моноклональными антителами (mAbs) RL. 172 (анти-CD 4) или mAbs 3.168 (анти-CD8) для удаления CD4+ или CD8+T-клеток (Sarmiento et al., 125 J. Immunol. 2665, 1980, и Ceredig et al., 314 Nature 98, 1985). mAb RL, 172 и mAb 3.168 были получены от Dr. Jonathan Sprent из Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla, CA.
Клетки селезенки (230 • 106) от нормальных и иммунизированных мышей были примированы по крайней мере за 21 день ранее и инкубировались с 1.5 • 106 клеток 15 - 12 (обработанных 200 мкг митомицина C в течение 45 минут на 108 клеток) или с 500 мкг пептида 18111b, содержащего доминантный эпитоп ЦТЛ Balb/c мышей в полной среде IMDM (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), содержащей 10% заранее отобранной FCS (ICN Flow; ICN Biochemicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 мМ глютамина, гентамицин и 2 • 10-5 М 2-меркаптоэтанола. Для стимуляции пептидами in vitro клетки селезенки культивировали в полной IMDM, содержащей 5% ConA супернатанта.
Для экспериментов истощения примированные in vivo или стимулированные in vitro клетки селезенки обрабатывали mAbs RL.172 (анти-CD4) или mAbs 3.168 (анти-CD8) в присутствии низкотоксичного кроличьего комплемента (Cederlane Laboratories, Ltd. , Hornby Ontario, Canada) для удаления CD4+ или CD8+ T-клеток (22, 23). mAb RL. 172 и mAb 3.168 были даром от Dr. Jonatham Sprent из Scripps Clinic and Research Founsation, La Jolla, CA.
Исследование цитотоксичности
Клетки-мишени (1 • 106) метили 10 мк Ci (51Cr) хромата натрия в течение 60 минут. Для получения пептидных импульсных мишений 50 мкл раствора пептида 1 мг/мл в HBSS добавляли во время мечения мишений 51Cr. После отмывания, 104 меченных мишеней и серийные разведения эффекторных клеток инкубировали в 200 мкл RP10 в течение 4 часов при 37oC. 100 мкл супернатанта собирали и определяли специфический лизис как: процент специфического лизиса = 100 • ((выделение при действии ЦТЛ - спонтанное выделение) / (максимальное выделение - спонтанное выделение)). Спонтанное выделение в отсутствие цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ) было < 25% максимального выделения с помощью детергента во всех экспериментах.
Клетки-мишени (1 • 106) метили 10 мк Ci (51Cr) хромата натрия в течение 60 минут. Для получения пептидных импульсных мишений 50 мкл раствора пептида 1 мг/мл в HBSS добавляли во время мечения мишений 51Cr. После отмывания, 104 меченных мишеней и серийные разведения эффекторных клеток инкубировали в 200 мкл RP10 в течение 4 часов при 37oC. 100 мкл супернатанта собирали и определяли специфический лизис как: процент специфического лизиса = 100 • ((выделение при действии ЦТЛ - спонтанное выделение) / (максимальное выделение - спонтанное выделение)). Спонтанное выделение в отсутствие цитотоксических T-лимфоцитов (ЦТЛ) было < 25% максимального выделения с помощью детергента во всех экспериментах.
Определение антительных ответов у мышей и обезьян
Каждую ячейку 96-ячеечных плат с U-образным дном (Costar, Cambridge, MA) покрывали 150 нг ova или gp 120 в 50 мкл HBSS и инкубировали в течение ночи при 4oC. Для определения анти-gp120 и анти-ova антительных ответов у мышей платы блокировали 1% BSA в течение 1 час. Добавляли серийно разведенную сыворотку в объеме 25 мкл на ячеку и инкубировали в течение 2 часов. Платы отмывали и добавляли 50 мкл на ячейку разведения 1:1000 козьего противомышеного IgG, конъюгированного с HRPO (Alabama), в 1% BSA. После 1 часа инкубации платы отмывали и добавляли 100 мкл субстрата на ячейку. Через 10 - 15 минут определялась OD405 (оптическая плотность при 405 нм). Для определения анти-gp120 антительного ответа у обезьян все стадии были такими же, за исключением того, что как блокирование плат, так и разведение сыворотки выполнялись с 5% нормальной козьей сывороткой в сбалансированном солевом растворе Хэнкса.
Каждую ячейку 96-ячеечных плат с U-образным дном (Costar, Cambridge, MA) покрывали 150 нг ova или gp 120 в 50 мкл HBSS и инкубировали в течение ночи при 4oC. Для определения анти-gp120 и анти-ova антительных ответов у мышей платы блокировали 1% BSA в течение 1 час. Добавляли серийно разведенную сыворотку в объеме 25 мкл на ячеку и инкубировали в течение 2 часов. Платы отмывали и добавляли 50 мкл на ячейку разведения 1:1000 козьего противомышеного IgG, конъюгированного с HRPO (Alabama), в 1% BSA. После 1 часа инкубации платы отмывали и добавляли 100 мкл субстрата на ячейку. Через 10 - 15 минут определялась OD405 (оптическая плотность при 405 нм). Для определения анти-gp120 антительного ответа у обезьян все стадии были такими же, за исключением того, что как блокирование плат, так и разведение сыворотки выполнялись с 5% нормальной козьей сывороткой в сбалансированном солевом растворе Хэнкса.
Пептидный синтез
Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 253-276 (Перечисление последовательностей No. 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; где используется стандартный однобуквенный код для представления каждой аминокислоты) овальбумина (ova 253 - 276), аминокислотных последовательностей 84 - 102 основного белка миелина (МВР 84 - 102) (Перечисление последовательностей No. 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP), и синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 308 - 322 (18111b последовательность) gp120111b собирали путем твердофазного пептидного синтеза с использованием синтезатора Applied Biosystems 430A. Аминокислоты соединялись посредством заранее образованных симметричных ангидридов, за исключением аспарагина, глютамина и аргинина, которые соединялись в виде гидроксибензотриазольных эфиров. Эффективность соединения контролировалась с помощью нингидриновой реакции по методу Kaiser et al. 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Пептиды освобождались от носителя с помощью HF, в соответствии с процедурой "низкий-высокий", описанной Tam, et. al., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, и пептиды экстрагировали из смолы 10% уксусной кислотой. После лиофилизации пептиды обессоливались на Sephadex G-25-колонке, и образцы пептидов затем очищали ВЭЖХ с обращением фазы на Vydac препаративной C-18 колонке. Очищенные пептиды (98%) растворяли в HBSS при колоночной концентрации 10 мг/мл и разводили до желаемой концентрации полной средой.
Синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 253-276 (Перечисление последовательностей No. 1: EQLESIINFEKLTEWTSSNVMEER; где используется стандартный однобуквенный код для представления каждой аминокислоты) овальбумина (ova 253 - 276), аминокислотных последовательностей 84 - 102 основного белка миелина (МВР 84 - 102) (Перечисление последовательностей No. 2: DENPVVHFFKNIVTPRTPP), и синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям 308 - 322 (18111b последовательность) gp120111b собирали путем твердофазного пептидного синтеза с использованием синтезатора Applied Biosystems 430A. Аминокислоты соединялись посредством заранее образованных симметричных ангидридов, за исключением аспарагина, глютамина и аргинина, которые соединялись в виде гидроксибензотриазольных эфиров. Эффективность соединения контролировалась с помощью нингидриновой реакции по методу Kaiser et al. 34 Anal. Biochem. 595, 1970. Пептиды освобождались от носителя с помощью HF, в соответствии с процедурой "низкий-высокий", описанной Tam, et. al., 21 J. Am. Chem. Soc. 6442, 1983, и пептиды экстрагировали из смолы 10% уксусной кислотой. После лиофилизации пептиды обессоливались на Sephadex G-25-колонке, и образцы пептидов затем очищали ВЭЖХ с обращением фазы на Vydac препаративной C-18 колонке. Очищенные пептиды (98%) растворяли в HBSS при колоночной концентрации 10 мг/мл и разводили до желаемой концентрации полной средой.
Расширение CNBr
Образцы белка (например, в-галактозидазы) обрабатывали 100-кратным молярным избытком бромида циана в растворе 100 мМ трифторуксусной кислоты. Давали пройти реакции в течение 18 часов при комнатной температуре (примерно 20oC) с ротацией. После предписанного времени реакции пептидные фрагменты отделяли от реагентов, применяя аппарат SEP-PAR (C-18 (Waters), элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизировали.
Образцы белка (например, в-галактозидазы) обрабатывали 100-кратным молярным избытком бромида циана в растворе 100 мМ трифторуксусной кислоты. Давали пройти реакции в течение 18 часов при комнатной температуре (примерно 20oC) с ротацией. После предписанного времени реакции пептидные фрагменты отделяли от реагентов, применяя аппарат SEP-PAR (C-18 (Waters), элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизировали.
Щелочное расщепление
Образцы белка (например, β-галактозидазы) обрабатывали 1N NaOH и кипятили в течение 2 минут, и полученные в результате пептидные фрагменты отделяли от реагентов, используя аппарат C-18 SEP-PAK (Waters), и элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизировали.
Образцы белка (например, β-галактозидазы) обрабатывали 1N NaOH и кипятили в течение 2 минут, и полученные в результате пептидные фрагменты отделяли от реагентов, используя аппарат C-18 SEP-PAK (Waters), и элюировали 95% ацетонитрилом и лиофилизировали.
Пример 1
Примирование ограниченных ЦТЛ класса 1
Moore et al. , 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 и Carbone и Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1991, показали, что мыши, иммунизированные клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными растворимым ova, примировали для ova специфического ответа ЦТЛ, ограниченных классом 1. Экспрессирующий ova трансфектант EL4, EG7-ova, использовался для стимуляции in vitro примированных in vivo селезеночных лимфоцитов и также использовали в качестве мишени для ova специфического, опосредованного ЦТЛ, разрушения клеток. Это исследование также показало, что CD8+ эффекторы, индуцированные EG7-ova трансфектантом или клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными ova, распознают детерминанту, картированную пептидом ova 258 - 273 в контексте H-2Kb, лизируют EG7-ova и также умерщвляет клетки EL4, покрытые оva 258 - 276. Таким образом, чтобы оценить, может ли индуцироваться растворимым антигеном эндогенный метаболизм ограниченных классом 1 CD8+ Т-клеток, использовались вышеописанная система, чтобы определить можно ли использовать определенные антигенные рецептуры, чтобы включить растворимый антиген в ограниченный метаболизм класса 1.
Примирование ограниченных ЦТЛ класса 1
Moore et al. , 113 UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. 1989 и Carbone и Bevan, 171 J. Exp. Medicine 377, 1991, показали, что мыши, иммунизированные клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными растворимым ova, примировали для ova специфического ответа ЦТЛ, ограниченных классом 1. Экспрессирующий ova трансфектант EL4, EG7-ova, использовался для стимуляции in vitro примированных in vivo селезеночных лимфоцитов и также использовали в качестве мишени для ova специфического, опосредованного ЦТЛ, разрушения клеток. Это исследование также показало, что CD8+ эффекторы, индуцированные EG7-ova трансфектантом или клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными ova, распознают детерминанту, картированную пептидом ova 258 - 273 в контексте H-2Kb, лизируют EG7-ova и также умерщвляет клетки EL4, покрытые оva 258 - 276. Таким образом, чтобы оценить, может ли индуцироваться растворимым антигеном эндогенный метаболизм ограниченных классом 1 CD8+ Т-клеток, использовались вышеописанная система, чтобы определить можно ли использовать определенные антигенные рецептуры, чтобы включить растворимый антиген в ограниченный метаболизм класса 1.
a) ova
Мышей C57 BL/6 иммунизировали однократно различными количествами ova (30 мкг - 1 мг на мышь) с антигенной рецептурой или без нее. Мыши получали подкожную инъекцию и в основание хвоста. Клетки селезенки брали от иммунизированных мышей по крайней мере через две недели после иммунизаций и стимулировали in vitro EG-7-ova трансфектантами. Такие низкие концентрации, как 30 мкг были также эффективны, как и доза в 1 мг. Поэтому исследования ЦТЛ обычно проводились с клетками селезенки от мышей, примированных 30 мкг ova. После пяти дней культивирования in vitro с EG7-ova примирование оценивали по наличию ova специфических эффекторов, способных к лизису EG7-ova.
Мышей C57 BL/6 иммунизировали однократно различными количествами ova (30 мкг - 1 мг на мышь) с антигенной рецептурой или без нее. Мыши получали подкожную инъекцию и в основание хвоста. Клетки селезенки брали от иммунизированных мышей по крайней мере через две недели после иммунизаций и стимулировали in vitro EG-7-ova трансфектантами. Такие низкие концентрации, как 30 мкг были также эффективны, как и доза в 1 мг. Поэтому исследования ЦТЛ обычно проводились с клетками селезенки от мышей, примированных 30 мкг ova. После пяти дней культивирования in vitro с EG7-ova примирование оценивали по наличию ova специфических эффекторов, способных к лизису EG7-ova.
У мышей, которым вводили растворимый ova в HBSS в такой высокой концентрации, как 1 мг, не обнаружено доказательств примирования ЦТЛ (фиг. 1A). Однако у мышей, имуннизированных 30 мкг ova в антигенной рецептуре, описанной выше (показанной как AF на фигурах) был показан значительный специфический ответ ЦТЛ на трасфектант (фиг. 1C). Кроме того, степень умерщвления EG7-ova иммунизированным ova-AF-клетками селезенки была сравнима с таковой клетками селезенки от мышей, иммунизированных клетками селезенки, нагруженными ova (фиг. 1B).
То, что специфичность примирования ЦТЛ in vivo была антигенспецифичной, было показано по отсутствию способности клеток селезенки от иммунизированных β-галактозидазой мышей проявлять вторичный ответ ЦТЛ in vitro при стимуляции EG7-ova. Не наблюдалось никакой ova специфической индукции ЦТЛ.
b) β-галактозидаза
Сходные результаты получены при использовании другого растворимого белкового антигена, β-gal. Для исследования β-gal-специфического ответа ЦТЛ использованной мишенью был происходящий от BALB/c, экспрессирующий β-gal трансфектант C3-4. Иммунизация мышей BALB/c растворимой β-gal создавало фон ответа ЦТЛ. Поэтому для определения специфичного ответа ЦТЛ отбор проб был отсрочен на по крайней мере восемь недель до того, как лимфоциты селезенки отбирали и культивировали в течение пяти дней в присутствии облученных трансфектантов C3-4.
Сходные результаты получены при использовании другого растворимого белкового антигена, β-gal. Для исследования β-gal-специфического ответа ЦТЛ использованной мишенью был происходящий от BALB/c, экспрессирующий β-gal трансфектант C3-4. Иммунизация мышей BALB/c растворимой β-gal создавало фон ответа ЦТЛ. Поэтому для определения специфичного ответа ЦТЛ отбор проб был отсрочен на по крайней мере восемь недель до того, как лимфоциты селезенки отбирали и культивировали в течение пяти дней в присутствии облученных трансфектантов C3-4.
Фиг. 2B показывает, что 30 мкг β-галактозидазы в AF индуцировали сильный специфический ответ ЦТЛ против трансфектанта. При соотношении эффекторов-к-мешеням (E : T) 3 : 1 иммунизированные β-gal-AF мыши продемонстрировали примерно 80% специфического умерщвления C3-4. Однако только 20% умерщвления той же самой мишени достигалось с эффекторами, выделенными от мышей, иммунизированные β-gal в HBSS, при том же самом соотношении E : T (фиг. 2A). Так как ни EL4 ни P815 не экспрессируют генные продукты МНС класса H, а лизис показывает сингенную рестрикцию, эти ova и β-gal специфические эффекты относятся к ограниченным классом 1 МНС.
Чтобы продемонстрировать полезность антигенонй рецептуры, мышей иммунизировали растворимым ova, инкапсулированным в два типа липосом, одни из которых были липосомы, чувствительные к pH. Через одну неделю клетки селезенки стимулировали in vitro, как описано выше, и испытывали против меченных 51Cr EG7-ova или EL4. Фиг. 3 показывает характерный результат, демонстрирующий, что ova в липосомах не могли примировать мышей для значительной индукции ЦТЛ. Сходные результаты наблюдались, когда иммунизировали ova в алюм.
Пример 2
Распознавание эпитопа ЦТЛ
Carbone и Bevan, выше, показали, что ЦТЛ, индуцированные у мышей C57 BL/6, трансфектантом EG7-ova и цитопламатически ova-нагружеными спленоцитами, распознают клетки EL4, покрытые пептидом ova 258 - 276. Чтобы определить индуцирует ли растворимый овальбумин в AF сходные ответы ЦТЛ, клетки селезенки получали от иммунизированных мышей и стимулировали in vitro EG7-ova. Эффекторы испытывали против клеток EL4, покрытых пептидом ova 253 - 276, или контрольным пептидом, полученным из основного белка миелина (МВР 84 - 102). Результаты показывают, что ova-AF примировал ЦТЛ со специфичностью, сходной со специфичностью ЦТЛ, примированных трансфектантами или цитоплазматически нагруженным ova (фиг. 1A, 1B, 1C). Примировали EG7-ova эффекторные клетки эффективно лизировали EG7-ovа и нетрансфицированные клетки EL4, покрытые 50 мкг/108 клеток ovа пептидом, но не лизировали клетки EL 4, покрытые 50 мкг/108 клеток пептида МВР.
Распознавание эпитопа ЦТЛ
Carbone и Bevan, выше, показали, что ЦТЛ, индуцированные у мышей C57 BL/6, трансфектантом EG7-ova и цитопламатически ova-нагружеными спленоцитами, распознают клетки EL4, покрытые пептидом ova 258 - 276. Чтобы определить индуцирует ли растворимый овальбумин в AF сходные ответы ЦТЛ, клетки селезенки получали от иммунизированных мышей и стимулировали in vitro EG7-ova. Эффекторы испытывали против клеток EL4, покрытых пептидом ova 253 - 276, или контрольным пептидом, полученным из основного белка миелина (МВР 84 - 102). Результаты показывают, что ova-AF примировал ЦТЛ со специфичностью, сходной со специфичностью ЦТЛ, примированных трансфектантами или цитоплазматически нагруженным ova (фиг. 1A, 1B, 1C). Примировали EG7-ova эффекторные клетки эффективно лизировали EG7-ovа и нетрансфицированные клетки EL4, покрытые 50 мкг/108 клеток ovа пептидом, но не лизировали клетки EL 4, покрытые 50 мкг/108 клеток пептида МВР.
В β-галактозидазной системе Carbone и Bevan, выше показали, что трансфектант, экспрессирующий β-gal, и спленоциты, цитоплазматически нагруженные растворимой β-галактозидазой, индуцировали ЦТЛ, которые лизировали экспрессирующие β-gal трансфектантные и нетрансфектантные клетки P815, покрытые расщепленной щелочью β-галактозидазой. Растворимая β-галактозидада индуцирует ЦТЛ, имеющие сходную специфичность, с той, которая получалась при иммунизации с AF (фиг. 2).
Пример 3
ЦТЛ эффекторами являются CD8+ Т-клетки
То, что растворимые белковые антигены в AF индуцируют CD8+ эффекторные Т-клетки, было показано следующим образом. Спленоциты от иммунизированных мышей культивировали в течение пяти дней с облученными трансфектантами in vitro. Затем клетки собирали и истощали от CD4+ или CD8+ Т-клеток путем использования моноклональных анти-CD4 или анти-CD8 антител плюс комплемент. Истощенные популяции затем испытывали против 51Cr-EL7-ova в ova системе или 51Cr-P13.1 в β-gal системе. Данные, представленные на фиг. 4, показывают, что в ova системе истощения CD8+ Т-клеточной популяции устраняло цитолитическую активность, приданную целой популяции эффекторных клеток. Однако истощение CD4+ Т-клеточной популяции не имело какого-либо эффекта на лизис EG-7-ova.
ЦТЛ эффекторами являются CD8+ Т-клетки
То, что растворимые белковые антигены в AF индуцируют CD8+ эффекторные Т-клетки, было показано следующим образом. Спленоциты от иммунизированных мышей культивировали в течение пяти дней с облученными трансфектантами in vitro. Затем клетки собирали и истощали от CD4+ или CD8+ Т-клеток путем использования моноклональных анти-CD4 или анти-CD8 антител плюс комплемент. Истощенные популяции затем испытывали против 51Cr-EL7-ova в ova системе или 51Cr-P13.1 в β-gal системе. Данные, представленные на фиг. 4, показывают, что в ova системе истощения CD8+ Т-клеточной популяции устраняло цитолитическую активность, приданную целой популяции эффекторных клеток. Однако истощение CD4+ Т-клеточной популяции не имело какого-либо эффекта на лизис EG-7-ova.
Подобным же образом в β-gal системе истощение CD8+ Т клеток устраняло цитолитическую активность клеток селезенки, иммунизированных β-gal-антигенной рецептурой (данные не представлены).
Пример 4
Растворимый ova в AF примирует CD8+ Т-клеток
Чтобы продемонстрировать, что ova-AF примирует CD8+ Т клеточные популяции in vivo и является определяющим для вторичного ответа in vitro, популяции CD4+ или CD8+ истощались в селезенках от мышей, иммунизированных ova-AF или от простых мышей. Эти обработанные популяции затем стимулировали in vitro AG7-ova один или в комбинации CD4+ и CD8+ Т-клеток от мышей, иммунизированных ova-AF, или в разных сочетаниях CD4+ или CD8+ Т-клеток от мышей, иммунизированных ova-AF, с CD4+ или CD8+ клетками от простых мышей. Фиг. 5 показывает, что примированные CD8+ клетки являются существенными для проявления вторичного ответа ЦТЛ in vitro. Эти данные также показывают, что для эффективного вторичного ответа ЦТЛ in vitro необходимы CD4+ Т-клетки. CD4+ клетки не нужны для примирования.
Растворимый ova в AF примирует CD8+ Т-клеток
Чтобы продемонстрировать, что ova-AF примирует CD8+ Т клеточные популяции in vivo и является определяющим для вторичного ответа in vitro, популяции CD4+ или CD8+ истощались в селезенках от мышей, иммунизированных ova-AF или от простых мышей. Эти обработанные популяции затем стимулировали in vitro AG7-ova один или в комбинации CD4+ и CD8+ Т-клеток от мышей, иммунизированных ova-AF, или в разных сочетаниях CD4+ или CD8+ Т-клеток от мышей, иммунизированных ova-AF, с CD4+ или CD8+ клетками от простых мышей. Фиг. 5 показывает, что примированные CD8+ клетки являются существенными для проявления вторичного ответа ЦТЛ in vitro. Эти данные также показывают, что для эффективного вторичного ответа ЦТЛ in vitro необходимы CD4+ Т-клетки. CD4+ клетки не нужны для примирования.
Вышеприведенные примеры показывают действие антигенной рецептуры на индукцию ответов, ограниченных классом 1 ЦТЛ против растворимых белковых антигенов. Опосредованное антигенной рецептурой примирование ЦТЛ, индуцированное растворимым антигеном, и по активности было сходно с таковым, индуцированным трансфектантами и спленоцитами цитоплазматически нагруженными расторимыми ova или β-gal. В овальбуминовой системе EG7-ova, цитоплазматически нагруженные ova спленоциты и ova-AF индуцировали:
(a) ограниченные классом 1 CD8+ ЦТЛ;
(b) ЦТЛ, которые распознают мишени, сенсибилизированные ova 253 - 276 синтетическим пептидом; и
(c) должно живущие ЦТЛ после только одной иммунизации.
(a) ограниченные классом 1 CD8+ ЦТЛ;
(b) ЦТЛ, которые распознают мишени, сенсибилизированные ova 253 - 276 синтетическим пептидом; и
(c) должно живущие ЦТЛ после только одной иммунизации.
В β-галактозидазной системе β-gal-AF индуцировал ЦТЛ, которые распознают трансфектант C3-4, экспрессирующий β-gal, а также нетрансфицированные клетки P815, сенсибилизированные, расщепленной щелочью β-gal. Это аналогично тому, что наблюдалось с ЦТЛ, индуцированными иммунизацией клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными β-галактозидазой. Индукция ova-специфических ЦТЛ антигенной рецептурой является уникальной, потому что ни ova, инкапсулированный в чувствительных к pH липосомах, ни в алюм (данные не показаны), не могли индуцировать примирование ЦТЛ in vivo.
Эти примеры показывают, что антигенная рецептура, использованная выше, и ее эквиваленты применимы для лечения людей и в разработке вакцин для индукции ЦТЛ при различных видах рака и вирусных заболеваний.
Пример 5
Этот пример является специфическим примером для демонстрации использования вышеописанной AF при получении примирования ограниченных классом 1 ЦТЛ при помощи растворимого gp120 из HIV.
Этот пример является специфическим примером для демонстрации использования вышеописанной AF при получении примирования ограниченных классом 1 ЦТЛ при помощи растворимого gp120 из HIV.
Экспрессирующая gp1600 IIIB линия клеток (15 - 12) была получена в происходящей из фибробласта Balb/c клеточной линии 3T3. Она получена от докторов Ron Germain и Jay Berzofsky, National Institute of Health, Bethesda, M.D. Экспрессирующая gp160 линия клеток использовалась для стимуляции in vitro примированных in vivo лимфоцитов селезенки, а также использовалась в качестве мишени для индукции gp160 специфичных ЦТЛ. Во многих экспериментах пептид 188IIIb, который содержит доминантный эпитоп ЦТЛ использовался для стимуляции in vitro. Для повторной стимуляции пептидом в культуре в среду добавлялся IL-2. Мышей Balb/c иммунизировали один раз 1 мкг gp120 на мышь с AF или без нее. Инъекции мышам производили подкожно и в основание хвоста. Клетки селезенки брали от иммунизированных мышей через три недели после иммунизации и стимулировали in vitro облученными трансфектантами gp160 или пептидом 18IIIb. После пяти дней культивирования in vitro примирование оценивалось по наличию специфичных эффекторов, способных лизировать трансфектанты gp160 и нетрансфицированные линии клеток. В некоторых экспериментах в качестве мишеней использовались инфицированные vac: gp160 P815 клетки. Результаты показаны в таблице 4A, когда ответ ЦТЛ потенцирован AF и gp120. Необходимо отметить, что в системе gp120 оптимальной антигенной рецептурой для gp120 специфичной индукции ЦТЛ (после одной иммунизации 1 мкг gp120 в AF) является та, которая не содержит или содержит минимальные количества плюрониевого. Однако, когда мышей иммунизировали многократно 5 мкг gp120 в AF, содержащей более высокие концентрации плюрониевого (3.75%), наблюдалась существенная индукция ЦТЛ (данные не представлены).
Следующий пример демонстрирует применение антигенных рецептур этого изобретения с использованием только одного или двух компонентов. Эти примеры показывают, что ответы ЦТЛ могут индуцироваться только с двумя из трех вышеназванных компонентов.
Пример 6
Определение решающих компонентов, необходимых для индукции ЦТЛ.
Определение решающих компонентов, необходимых для индукции ЦТЛ.
Чтобы определить необходимы ли все отмеченные выше компоненты для антиген-специфичной индукции ЦТЛ, мышей иммунизировали овальбумином в микропсевдоожиженной рецептуре с различными комбинациями двух из трех компонентов, представленных в вышеназванных AF, замещая третий компонент PBS. Два компонента, использованных комбинаций, были следующими:
сквалан / ТВИН в PBS,
сквалан / плюрониевый в PBS или
плюрониевый / ТВИН в PBS.
сквалан / ТВИН в PBS,
сквалан / плюрониевый в PBS или
плюрониевый / ТВИН в PBS.
Другой набор групп включался, когда мышей иммунизировали ova оформленным в однокомпонентной системе, т.е. сквалана в PBS плюрониевого в PBS или ТВИН в PBS и только.
Вышеприведенные трехкомпонентные антигенные рецептуры состоят из:
0.300 г ТВИН 80 (Aldrich, WI),
1.875 г плюрониевого L121 (BASF, NJ), и 7.5 г сквалана (Aldrich, WI), доводимых до 50 мл PBS.
0.300 г ТВИН 80 (Aldrich, WI),
1.875 г плюрониевого L121 (BASF, NJ), и 7.5 г сквалана (Aldrich, WI), доводимых до 50 мл PBS.
Двухкомпонентные рецептуры составляли:
сквалан / ТВИН : 0.300 г ТВИН 80 и 7.5 г сквалана, доводимых до 50 мл PBS;
Плюрониевый / ТВИН :
1.875 г плюрониевого 121 и 0.300 г ТВИН 80, доводимых до 50 мл PBS.
сквалан / ТВИН : 0.300 г ТВИН 80 и 7.5 г сквалана, доводимых до 50 мл PBS;
Плюрониевый / ТВИН :
1.875 г плюрониевого 121 и 0.300 г ТВИН 80, доводимых до 50 мл PBS.
Плюрониевого / сквалана :
1.875 г плюрониевого 121 и 7.5 г сквалана, доводимых до 50 мл PBS.
1.875 г плюрониевого 121 и 7.5 г сквалана, доводимых до 50 мл PBS.
Трехкомпонентными рецептурами с изменяемой концентрацией плюрониевого были:
Концентрации сквалана и ТВИН сохранялись как в предыдущих, но концентрации плюрониевого изменялись (см. талб.1А).
Концентрации сквалана и ТВИН сохранялись как в предыдущих, но концентрации плюрониевого изменялись (см. талб.1А).
Образцы затем обрабатывались в приборе для микропседоожижения, модель 110Т, Microfludics Corp., помещали во флаконы и хранили при 4oC до использования.
Овальбумин (ova, Sigma, MO) взвешивали и доводили до концентрации раствора 0.3 мг/мл в HBSS (Whittaker, выше).
Стандартный раствор 0.3 мг/мл соединяли с двухкомпонентными рецептурами в следующих количествах:
5 частей раствора овальбумиа 0.3 мг/мл,
3.3 части 2-компонентной рецептуры и
1.7 части HBSS.
5 частей раствора овальбумиа 0.3 мг/мл,
3.3 части 2-компонентной рецептуры и
1.7 части HBSS.
Подобным же образом β-gal и HIV gp120 смешивали с AF.
Рецептура энергично перемешивалась и сохранялась на льду до инъецирования. Все растворы соединяли непосредственно перед инъекцией.
Каждая мышь получала 200 мкл одной рецептуры, содержащей 30 мкл ova путем подкожной инъекции и введения в основание хвоста. Мышам давали отдохнуть в течение по крайней мере от двух до четырех недель до изъятия селезенки.
Через две недели после иммунизаций подготавливали клетки селезенок и стимулировали in vitro облученными EG7-ova. После пяти дней культивирования оценивалось наличие ova-специфических ЦТЛ путем испытания в отношении 51Cr-EG7-ova или 51Cr-EL4 в 4-часовом исследовании выделения 51Cr. Данные, показанные на фигурах 6 - 8, демонстрируют, что овальбуминовая сформированная в приборе для микропсевдоожижения двухкомпонентная система может примировать ova специфические ЦТЛ in vivo.
Далее мы оценили относительное значение отдельных компонентов по их способности индуцировать ЦТЛ в комбинации с белковыми антигенами. Для целей иммунизации растворимый антиген смешивался с составляющими, прошедшими микропсевдоожижение, чтобы получить стабильную гомогенную эмульсию с размерами частиц в пределах от 250 до 300 нм. Чтобы к тому же определить компоненты рецептуры сквален - ТВИН 80 - плюрониевый (СТП), ответственные за индукции ЦТЛ, мы иммунизировали мышей ova в смеси сквалана - ТВИН 80 (СТ), плюрониевого - ТВИН 80 (ПТ) или смеси сквалана - плюрониевого (СП) и в качестве контроля, в сквалане (С), ТВИН 80 (Т) или плюрониевом (П). Мышей также иммунизировали ova-SAFm (содержащим 70 мкг MDP) или ova-алюм в качестве контролей адъюванта. Для положительного контроля мыши были иммунизированы клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными растворимым ova. Были также использованы других комбинации и заместители, и результаты представлены в таблице 1. Результаты показывают, что 30 мгк ova в комбинации с СТП или СТ примируют ответ ЦТЛ, ограниченных классом 1, у мышей. Примирование ova специфически ЦТЛ ova в СТП или ova в СТ по-видимому происходит лучше, чем примирование, индуцированное клетками селезенки, цитоплазматически нагруженными растворами ova. Ova в ПТ или в СП мог индуцировать ova специфические ответы ЦТЛ у мышей, но неустойчиво или плохо. В отличие от SAFm, добавлением MDP к СТ рецептуре не нарушало ova специфической индукции ЦТЛ у мышей (таблица 2). Не происходило ova-специфической индукции ЦТЛ, ни когда мышей иммунизировали ova, смешанным с отдельными компонентами, С, П или Т, ни когда мышей иммунизировали ova-SAFm или ova-алюм. У мышей, иммунизированных таким количеством ova, как 1 мг в (a) HBSS, в (b) SAFm или (c) адсорбированным на алюм, не примировались ova специфические ЦТЛ.
Пример 7
Компоненты, необходимые для продукции ova специфических антител
Мышей иммунизировали три раза через 2-недлеьные интервалы 30 мкг ova в HBSS, СТП, СТ, ПТ или СП. В качестве положительного контроля мышей также имунизировали ova-AF, так как известно, что SAFm индуцируют сильный антительный ответ. Через семь дней после второй и третьей иммунизации мышей обескровливали и сыворотки испытывали на ova специфический антительный ответ. Результаты показаны в таблице 3. Они указывают на то, что мыши, иммунизированные ova в СТП, СТ или в SAFm проявляют сходные анти-ova ответы после трех иммунизаций.
Компоненты, необходимые для продукции ova специфических антител
Мышей иммунизировали три раза через 2-недлеьные интервалы 30 мкг ova в HBSS, СТП, СТ, ПТ или СП. В качестве положительного контроля мышей также имунизировали ova-AF, так как известно, что SAFm индуцируют сильный антительный ответ. Через семь дней после второй и третьей иммунизации мышей обескровливали и сыворотки испытывали на ova специфический антительный ответ. Результаты показаны в таблице 3. Они указывают на то, что мыши, иммунизированные ova в СТП, СТ или в SAFm проявляют сходные анти-ova ответы после трех иммунизаций.
Пример 8
HIV gp120 специфическая индукция ЦТЛ
HIV gp120 IIIB использовался в качестве третьей антигенной системы для определения индукции ЦТЛ с СТП или 2- и 3-компонентными вариантов рецептуры. Мышей иммунизировали 1 мкг gp120 IIIb в HBSS, СПТ, ПТ или в СТ. Для контроля мышей иммунизировали 1 мкг gp120 IIIb в SAFm или CFA (полный адъювант Фрейнда) (таблица 4B). Через три недели после иммунизации клетки селезенки подготавливали и стимулировали in vitro клетками трансфектанта 15 - 12, обработанными митомицином, или пептидом 18IIIb. После пяти дней культивирования полученные в результате эффекторные клетки испытывали против вируса коровьей оспы: gp160 IIIB или исходных инцифированных вирусом коровьей оспы клеток P815 в качестве мишеней. Результаты показывают, что gp120-сквалан-ТВИН 80 постоянно индуцирует gp120 специфический ответ ЦТЛ у мышей (таблица 4A и 4B). CFA или SAFm были, однако неспособны индуцировать gp120 специфические ЦТЛ (таблица 4B). В отдельном исследовании gp120 в СТ с изменяемыми дозами плюрониевого от 0.0015% до 1.5% испытывались на индукцию ЦТЛ.
HIV gp120 специфическая индукция ЦТЛ
HIV gp120 IIIB использовался в качестве третьей антигенной системы для определения индукции ЦТЛ с СТП или 2- и 3-компонентными вариантов рецептуры. Мышей иммунизировали 1 мкг gp120 IIIb в HBSS, СПТ, ПТ или в СТ. Для контроля мышей иммунизировали 1 мкг gp120 IIIb в SAFm или CFA (полный адъювант Фрейнда) (таблица 4B). Через три недели после иммунизации клетки селезенки подготавливали и стимулировали in vitro клетками трансфектанта 15 - 12, обработанными митомицином, или пептидом 18IIIb. После пяти дней культивирования полученные в результате эффекторные клетки испытывали против вируса коровьей оспы: gp160 IIIB или исходных инцифированных вирусом коровьей оспы клеток P815 в качестве мишеней. Результаты показывают, что gp120-сквалан-ТВИН 80 постоянно индуцирует gp120 специфический ответ ЦТЛ у мышей (таблица 4A и 4B). CFA или SAFm были, однако неспособны индуцировать gp120 специфические ЦТЛ (таблица 4B). В отдельном исследовании gp120 в СТ с изменяемыми дозами плюрониевого от 0.0015% до 1.5% испытывались на индукцию ЦТЛ.
Пример 9
Индукция gp120 специфического гуморального ответа у мышей
Для индукции gp120 специфических гуморальных ответов мышей иммунизировали 1 мкг gp120IIIb три раза через двухнедельные интервалы. Животных обескровливали и сыворотку крови испытывали на наличие IgG антител, определяя gp120IIIb в твердофазном исследовании по ELISA. Результаты эксперимента 1 показывают, что gp120-в СТ или ПТ являются лучшими иммуногенами, чем gp120-HBSS, gp120 SAFm (таблица 5) или gp120-СТП. Однако результаты эксперимента 2 показывают, что gp120 в СТ иил СТП (содержащих концентрации плюрониевого 1.5% или 3.75%) могут вызывать ответы с высоким титром антител.
Индукция gp120 специфического гуморального ответа у мышей
Для индукции gp120 специфических гуморальных ответов мышей иммунизировали 1 мкг gp120IIIb три раза через двухнедельные интервалы. Животных обескровливали и сыворотку крови испытывали на наличие IgG антител, определяя gp120IIIb в твердофазном исследовании по ELISA. Результаты эксперимента 1 показывают, что gp120-в СТ или ПТ являются лучшими иммуногенами, чем gp120-HBSS, gp120 SAFm (таблица 5) или gp120-СТП. Однако результаты эксперимента 2 показывают, что gp120 в СТ иил СТП (содержащих концентрации плюрониевого 1.5% или 3.75%) могут вызывать ответы с высоким титром антител.
Пример 10
gp120 специфические антительные ответы у обезьян
Обезьяны (две на группу) были иммунизированы gp120-SAFm, gp120-СТП, gp120-СТ или gp120-HBSS. Для контроля группу обезьян иммунизировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы, содержащим gp160 IIIb. Обезьян иммунизировали через двухнедельные интервалы и кровь брали через две и три недели после второй иммунизации. Неименные и иммунные сыворотки от каждой обезьяны разводили серийно и оценивали на анти-gp120 активность путем ELISA, как описано в материалах и методах. Данные (фигура 9) показывают, что у обезьян, иммунизированных gp120-СТП или gp120 SAFm, индуцировались сходные ответы. У одной обезьяны, иммунизированной gp120-СТ, индуцировался анти-gp120 ответ, сходный с ответом в группе, иммунизированной gp120-SAFm или gp120-СТП. У одной обезьяны, иммунизированной gp120-СТ, не индуцировался сильный анти-gp120 ответ после двух иммунизаций.
gp120 специфические антительные ответы у обезьян
Обезьяны (две на группу) были иммунизированы gp120-SAFm, gp120-СТП, gp120-СТ или gp120-HBSS. Для контроля группу обезьян иммунизировали рекомбинантным вирусом коровьей оспы, содержащим gp160 IIIb. Обезьян иммунизировали через двухнедельные интервалы и кровь брали через две и три недели после второй иммунизации. Неименные и иммунные сыворотки от каждой обезьяны разводили серийно и оценивали на анти-gp120 активность путем ELISA, как описано в материалах и методах. Данные (фигура 9) показывают, что у обезьян, иммунизированных gp120-СТП или gp120 SAFm, индуцировались сходные ответы. У одной обезьяны, иммунизированной gp120-СТ, индуцировался анти-gp120 ответ, сходный с ответом в группе, иммунизированной gp120-SAFm или gp120-СТП. У одной обезьяны, иммунизированной gp120-СТ, не индуцировался сильный анти-gp120 ответ после двух иммунизаций.
Пример 11
gp120 специфические ответы ЦТЛ у обезьян
Обезьян иммунизировали 30 мкг - 50 мкг HIV gp120 в AF или в HBSS многократно. Для контроля обезьян также иммунизировали рекомбинантным gp160 в вирусе коровьей оспы. Наши предварительные результаты показывают, что у 1/2 обезьян, иммунизированных gp120-AF, и у 1/2 обезьян, иммунизированных gp160: вирус коровьей оспы, показано преимущественное умерщвление инфицированных vac: gp160 аутологических мишеневых клеток (фиг-ы 10A и 10B).
gp120 специфические ответы ЦТЛ у обезьян
Обезьян иммунизировали 30 мкг - 50 мкг HIV gp120 в AF или в HBSS многократно. Для контроля обезьян также иммунизировали рекомбинантным gp160 в вирусе коровьей оспы. Наши предварительные результаты показывают, что у 1/2 обезьян, иммунизированных gp120-AF, и у 1/2 обезьян, иммунизированных gp160: вирус коровьей оспы, показано преимущественное умерщвление инфицированных vac: gp160 аутологических мишеневых клеток (фиг-ы 10A и 10B).
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID N: 1
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: - 24
(B) ТИП: - аминокислотная
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: - единственная
(D) ТОПОЛОГИЯ: - линейная
(II) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 1:
Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr - 16
20 Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg - 24
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID N: 2:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: - 19
(B) ТИП: - аминокислотная
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: - единственная
(D) ТОПОЛОГИЯ: - линейная
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Ang Ile Val Thr Pro Arg - 16
Thr Pro Pro - 19н
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: - 24
(B) ТИП: - аминокислотная
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: - единственная
(D) ТОПОЛОГИЯ: - линейная
(II) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: SEQ ID NO: 1:
Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr - 16
20 Ser Ser Asn Val Met Glu Glu Arg - 24
(2) ИНФОРМАЦИЯ ПО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ID N: 2:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ:
(A) ДЛИНА: - 19
(B) ТИП: - аминокислотная
(C) ЧИСЛО НИТЕЙ: - единственная
(D) ТОПОЛОГИЯ: - линейная
Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Ang Ile Val Thr Pro Arg - 16
Thr Pro Pro - 19н
Claims (38)
1. Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических Т-лимфоцитов в организме, содержащая иммуногенный агент и дополнительные вещества, отличающаяся тем, что в качестве иммуногенного агента она содержит антиген, за исключением альбумина или антигена лимфомы В-клеток, и дополнительно содержит стабилизирующий детергент, вещество, формирующее мицеллы, и биосовместимое масло, при этом композиция представляет собой стабильную микросжиженную эмульсию, свободную от иммуностимулирующих пептидов и при использовании ее для живого организма способную индуцировать специфический цитотоксический ответ Т-лимфоцитов при эффективном количестве антигена в композиции.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержит в качестве антигена HIV фрагменты следующих антигенов: gp 120, gp 160, gag, pcl, Nef, Tat и Rev; малярийных антигенов: белка CS и спорозоитного поверхностного белка 2; поверхностных антигенов гепатита B; Pre - S1, Pre - S2, HBcAg и HBe Ag; антигена вируса гриппа; HA, NF и NA поверхностных антигенов гепатита A; антигенов вируса герпеса; EBV gp 340, EBV gp 85, HSVgB, HSVgD, HSVgH, раннего белкового продукта HSV, цитомегаловирусного gB, цитомегаловирусного gH и JE белкового gp 72, антигенов респираторно-синцитиального вируса: белка F, белка G и белка N; антигенов E4, E6 и E7 вируса герпеса, вызывающего папилломы, и опухолевых антигенов: CEA карциномы, карциномного муцина, P21 карциномы, P53 карциномы, MPG меланомы, p97 меланомы, MAGE антигена, онкогенного продукта Neu карциномы, продукта гена p53 карциномы, специфического антигена простаты (PSA) и простатного антигена, и мутированный белок p21ras.
3. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что стабилизирующий детергент выбирается из группы, включающей полисорбат 80, Твин 20, Твин 40, Твин 60, Zurttegent 3-12, Teepol HB7 и Span 85.
4. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный агент, образующий мицеллы, представляет гидрофильно-липофильный баланс от 0 до 2.
5. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что агент, образующий мицеллы, выбирается из группы, включающей полиоксамер 401, Pluronic L62LF, Pluronic L101, Pluronic L64, PEG 1000, Tetronic 1501, Tetronic 150R1, Tetronic 701, Tetronic 901, Tetronic 1301, Tetronic 130R1.
6. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что количество агента, образующего мицеллы, составляет от 0,5 до 10%.
7. Композиция по п.6, отличающаяся тем, что количество агента, образующего мицеллы, составляет от 1,25 до 5%.
8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что масло имеет температуру плавления менее 60oC.
9. Композиция по п.8, отличающаяся тем, что масло выбирают из группы, включающей сквелен, скволен, эйкозен, тетратетраконтан, пристан, глицерин и растительные масла.
10. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что количество масла составляет от 1 до 10%.
11. Композиция по п.9, отличающаяся тем, что количество масла составляет от 2,5 до 5%.
12. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что содержит менее 20 мкг муремилдипептида.
13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что не содержит муремилдипептида.
14. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что детергент является полисорбетом 80, а агент, образующий мицеллы, - полоксамером 401.
15. Композиция по п.14, отличающаяся тем, что маслом является скволан.
16. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что детергент выбирается из группы, включающей Твин 20, Твин 40 и Твин 80, масло выбирается из группы, включающей скволан, эйкозан и пристан, а агент, образующий мицеллы, выбирается из группы, включающей Pluronic Z62LF и полиоксамер 401.
17. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что размеры частиц композиции составляют от 250 до 300 нм.
18. Композиция, отличающаяся тем, что содержит микрофлюидизированный антигенный состав, исключая альбумин или антиген лимфы В-клеток и включающая: а) полисорбатный детергент; b) плюрониевый агент, образующий мицеллы; c) масло, выбираемое из группы, включающей скволан, эйкозан и пристан, причем указанная композиция по существу свободна от иммуностимулирующих пептидов.
19. Композиция по п.18, отличающаяся тем, что полисорбатный детергент выбирается из группы, включающей Твин 20, Твин 40 и Твин 80; плюрониевый агент, образующий мицеллы, является Pluronic Z62LF или полоксамер 401, и масло выбирается из группы, включающей скволан, эйкозан и пристан.
20. Способ индуцирования ответа цитотоксических Т-лимфоцитов путем введения в организм иммуногенного агента, отличающийся тем, что вводят в качестве агента антигенную композицию по п.1.
21. Способ по п.20, отличающийся тем, что смесь вводится однократно.
22. Способ по п.20, отличающийся тем, что введение агента проводят в организм, пораженный вирусом.
23. Способ по п.20, отличающийся тем, что вводимый агент является нетоксичным.
24. Способ по п.20, отличающийся тем, что композицию по п.18 или 19 вводят в организм в количестве, достаточном для индукции ответа цитотоксических Т-лимфоцитов.
25. Способ лечения болезни или состояния, при котором индукция ответа цитотоксических Т-лимфоцитов терапевтически выгодна путем введения иммуногенного агента, отличающийся тем, что антигенную композицию по пп.1 - 9 используют в качестве такого агента в дозе, достаточной для индукции ответа цитотоксических Т-лимфоцитов.
26. Способ по п.25, отличающийся тем, что болезнь связана с инфицированием вирусом HJV.
27. Способ по п.25, отличающийся тем, что болезнь является малярией.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что малярийный антиген выбирается из белка CS и спорозонтного поверхностного белка 2.
29. Способ по п.25, отличающийся тем, что болезнь является гриппом.
30. Способ по п.29, отличающийся тем, что антиген гриппа выбирается из HA, NP и NA.
31. Способ по п.25, отличающийся тем, что болезнь является гепатитом.
32. Способ по п.31, отличающийся тем, что гепатитный антиген выбирается из поверхностных антигенов гепатита A, Prc - S1, Prc - S2, HBcAg и HBeAg.
33. Способ по п.25, отличающийся тем, что болезнь является раком.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что раковый антиген выбирается из CEA карцином, карциномного муцина P21, p53 карцином, MPG меланомы, p97 меланомы и онкогенного продукта Neu карциномы, генного продукта p53 карциномы и мутантного белка p21 ras.
35. Способ по п.25, отличающийся тем, что болезнь связана с вирусом герпеса.
36. Способ по п.35, отличающийся тем, что антиген вируса герпеса выбирается из EBV gp 340, EBV gp 85, HSV gB, HSV gD, HSV gH, раннего белкового продукта HSV, gB цитомегаловируса, gH цитомегаловируса и JE белка gP72.
37. Способ по п. 25, отличающийся тем, что болезнь связана с респираторно-синцитиальным вирусом.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что антиген респираторно-синцитиального вируса выбирается из белка F, белка C и белка N.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US73506991A | 1991-07-25 | 1991-07-25 | |
US07/735,069 | 1991-07-25 | ||
PCT/US1992/006193 WO1993001831A1 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-24 | Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU94038046A RU94038046A (ru) | 1997-11-10 |
RU2129439C1 true RU2129439C1 (ru) | 1999-04-27 |
Family
ID=24954233
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU94038046/14A RU2129439C1 (ru) | 1991-07-25 | 1992-07-24 | Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических т-лимфоцитов, способ индуцирования и способ лечения болезни |
Country Status (27)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5585103A (ru) |
EP (1) | EP0596032B2 (ru) |
JP (1) | JP3939746B2 (ru) |
KR (1) | KR100198868B1 (ru) |
AT (1) | ATE166578T1 (ru) |
AU (1) | AU666127B2 (ru) |
BG (1) | BG62240B1 (ru) |
BR (1) | BR9206310A (ru) |
CA (1) | CA2113720A1 (ru) |
CZ (1) | CZ288048B6 (ru) |
DE (1) | DE69225710T3 (ru) |
DK (1) | DK0596032T4 (ru) |
ES (1) | ES2117052T5 (ru) |
FI (2) | FI108114B (ru) |
HU (2) | HU220295B (ru) |
IE (1) | IE922436A1 (ru) |
IL (1) | IL102639A (ru) |
MX (1) | MX9204376A (ru) |
NO (1) | NO317203B1 (ru) |
OA (1) | OA09880A (ru) |
PH (1) | PH30906A (ru) |
RO (1) | RO116459B1 (ru) |
RU (1) | RU2129439C1 (ru) |
SK (1) | SK282920B6 (ru) |
TW (1) | TW349867B (ru) |
WO (1) | WO1993001831A1 (ru) |
ZA (1) | ZA925614B (ru) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473557C2 (ru) * | 2007-01-03 | 2013-01-27 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Вакцины на основе пептида foxp3 |
RU2775424C2 (ru) * | 2017-09-13 | 2022-06-30 | Санофи Пастер | Иммуногенная композиция цитомегаловируса человека |
Families Citing this family (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5709860A (en) * | 1991-07-25 | 1998-01-20 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
US6197311B1 (en) * | 1991-07-25 | 2001-03-06 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses |
AU6363094A (en) * | 1993-03-15 | 1994-10-11 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Peptide coated dendritic cells as immunogens |
GB9314623D0 (en) * | 1993-07-14 | 1993-08-25 | Nordion Int Inc | Localization and therapy with agents directed against prostate specific antigen in breast cancer |
GB9326253D0 (en) | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccines |
AUPM446594A0 (en) * | 1994-03-16 | 1994-04-14 | Csl Limited | Cytotoxic t-cell epitopes identified within epstein-barr virus |
GB9620795D0 (en) * | 1996-10-05 | 1996-11-20 | Smithkline Beecham Plc | Vaccines |
US5820880A (en) * | 1995-06-07 | 1998-10-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Liposomal formulation |
US6884435B1 (en) * | 1997-01-30 | 2005-04-26 | Chiron Corporation | Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof |
DE69812941T2 (de) * | 1997-01-30 | 2004-02-05 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Verwendung von mikropartikeln mit adsorbiertem antigen zur stimulierung der immunabwehr |
ATE371463T1 (de) * | 1997-02-05 | 2007-09-15 | Jean-Claude Bystryn | Ph-sensitive liposomen und andere typen immunomodulatoren enthaltender gekapselter impfstoffe sowie herstellungs- und anwendungsverfahren dafür |
AT405939B (de) * | 1997-02-24 | 1999-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren |
US6632619B1 (en) | 1997-05-16 | 2003-10-14 | The Governors Of The University Of Alberta | Microfluidic system and methods of use |
ATE264717T1 (de) * | 1997-05-16 | 2004-05-15 | Alberta Res Council | Mikrofluidisches system und verfahren zu dessen betrieb |
GB9718901D0 (en) | 1997-09-05 | 1997-11-12 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
EP1279401B1 (en) * | 1997-09-05 | 2008-01-09 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Oil in water emulsions containing saponins |
ZA988461B (en) * | 1997-09-18 | 1999-03-30 | Idec Pharma Corp | Synergistic composition and methods for treating neoplastic or cancerous growths and for restoring or boosting hematopoiesis |
US6858386B1 (en) | 1998-05-21 | 2005-02-22 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer |
US6949339B1 (en) * | 1998-05-21 | 2005-09-27 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, and staging colon cancer |
AU774419C (en) * | 1998-10-30 | 2005-03-03 | Genetics Institute, Llc | Inhibition of differentiation of cytotoxic T-cells by P-selectin ligand (PSGL) antagonists |
EP1131430B1 (en) * | 1998-11-10 | 2007-01-17 | Emory University | Mitogenic regulators |
US7198920B1 (en) * | 1999-01-29 | 2007-04-03 | Corika Corporation | HER-2/neu fusion proteins |
US20050226890A1 (en) * | 1999-08-12 | 2005-10-13 | Cohen David I | Tat-based vaccine compositions and methods of making and using same |
EP1250149A4 (en) * | 1999-11-22 | 2003-06-04 | Diadexus Inc | NEW METHOD FOR DIAGNOSIS, MONITORING, STADIFYING, IMAGING AND TREATING CANCER |
US7238471B1 (en) | 1999-11-23 | 2007-07-03 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating breast cancer |
US20020048777A1 (en) * | 1999-12-06 | 2002-04-25 | Shujath Ali | Method of diagnosing monitoring, staging, imaging and treating prostate cancer |
AU2001265239B2 (en) * | 2000-05-26 | 2006-05-25 | Diadexus, Inc. | Method of diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating colon cancer |
US7229623B1 (en) * | 2000-08-03 | 2007-06-12 | Corixa Corporation | Her-2/neu fusion proteins |
WO2005090392A1 (en) * | 2004-03-16 | 2005-09-29 | Inist Inc. | Tat-based tolerogen compositions and methods of making and using same |
US6663861B2 (en) | 2000-11-09 | 2003-12-16 | Antibodyshop A/S | Method of producing antibodies by immunization with conjugates of molecules coupled to charge-modified proteins |
WO2003104429A2 (en) * | 2002-06-10 | 2003-12-18 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Genes overexpressed by ovarian cancer and their use in developing novel therapeutics |
MXPA05003049A (es) | 2002-09-19 | 2005-11-17 | Us Gov Health & Human Serv | Polipeptidos de phlebotomus ariasi, polipeptidos de phlebotomus perniciosus y metodos de uso. |
EP1572968B1 (en) | 2002-10-29 | 2009-04-22 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Lutzomyia longipalpis polypeptides and methods of use |
DK1613346T3 (da) * | 2003-04-04 | 2013-01-07 | Pah Usa 15 Llc | Mikrofluidiske olie-i-vand-emulsioner og vaccinesammensætninger |
RU2354399C2 (ru) * | 2003-07-24 | 2009-05-10 | Мериал Лимитед | Вакцинная композиция и способ индуцирования иммунологического ответа у животного |
US7927580B2 (en) * | 2004-03-16 | 2011-04-19 | Nanirx, Inc. | Tat-based immunomodulatory compositions and methods of their discovery and use |
US8124397B2 (en) * | 2005-08-08 | 2012-02-28 | Oregon Health & Science University | Inactivating pathogens with oxidizing agents for vaccine production |
US20100130425A1 (en) | 2005-09-09 | 2010-05-27 | Oregon Health & Science University | Use of toll-like receptor ligands in treating excitotoxic injury, ischemia and/or hypoxia |
EP2397854B1 (en) | 2006-03-14 | 2014-06-04 | Oregon Health and Science University | Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection |
AU2007240614B2 (en) | 2006-04-20 | 2013-09-12 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Incorporated | Methods and compositions based on Shiga toxin type 1 protein |
US20090181078A1 (en) | 2006-09-26 | 2009-07-16 | Infectious Disease Research Institute | Vaccine composition containing synthetic adjuvant |
PT2486938T (pt) | 2006-09-26 | 2018-06-12 | Infectious Disease Res Inst | Composição para vacina contendo adjuvante sintético |
DK2918598T3 (en) | 2007-02-28 | 2019-04-29 | The Govt Of U S A As Represented By The Secretary Of The Dept Of Health And Human Services | Brachyury polypeptides and methods of use |
KR20160065985A (ko) * | 2007-10-18 | 2016-06-09 | 버베리안 노딕 에이/에스 | 전립선 암 치료를 위한 mva의 용도 |
EP2324049B1 (en) | 2008-08-04 | 2016-05-25 | The Government of the U.S.A. as represented by The Secretary of the dept. of Health & Human Services | Membrane proximal region of hiv gp41 anchored to the lipid layer of a virus-like particle vaccine |
US8664183B2 (en) | 2009-02-27 | 2014-03-04 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | SPANX-B polypeptides and their use |
NZ595060A (en) | 2009-03-23 | 2013-05-31 | Pin Pharma Inc | Treatment of cancer with immunostimulatory hiv tat derivative polypeptides |
TWI494125B (zh) | 2009-06-05 | 2015-08-01 | Infectious Disease Res Inst | 合成的葡萄吡喃糖基脂質佐劑 |
CN102782138A (zh) | 2009-10-07 | 2012-11-14 | Uvic工业合伙公司 | 包含热敏性转基因的疫苗 |
WO2011047340A1 (en) | 2009-10-16 | 2011-04-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Insertion of foreign genes in rubella virus and their stable expression in a live, attenuated viral vaccine |
EP3263124A1 (en) | 2009-11-20 | 2018-01-03 | Oregon Health&Science University | Methods for producing an immune response to tuberculosis |
WO2011112599A2 (en) | 2010-03-12 | 2011-09-15 | The United States Of America, As Represented By The Secretary. Department Of Health & Human Services | Immunogenic pote peptides and methods of use |
AU2011230619C1 (en) | 2010-03-25 | 2016-06-23 | Oregon Health & Science University | CMV glycoproteins and recombinant vectors |
AU2012243039B2 (en) | 2011-04-08 | 2017-07-13 | Immune Design Corp. | Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses |
LT2691530T (lt) | 2011-06-10 | 2018-08-10 | Oregon Health & Science University | Cmv glikoproteinai ir rekombinantiniai vektoriai |
PL2734544T3 (pl) | 2011-07-18 | 2021-05-31 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Sposoby i kompozycje do hamowania patologii związanej z poliomawirusem |
US20130189754A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-07-25 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
US9566329B2 (en) | 2012-04-06 | 2017-02-14 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Live, attenuated rubella vector to express vaccine antigens |
EA034351B1 (ru) | 2012-05-16 | 2020-01-30 | Иммьюн Дизайн Корп. | Трехкомпонентная вакцина против впг-2 и способы ее применения |
US10501499B2 (en) | 2012-06-06 | 2019-12-10 | Bionor Immuno As | Peptides derived from viral proteins for use as immunogens and dosage reactants |
EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
WO2014043518A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Brachyury protein, non-poxvirus non-yeast vectors encoding brachyury protein, and their use |
AU2013331328B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-05-31 | Bavarian Nordic A/S | Methods and compositions for the treatment of cancer |
BR112015025709A2 (pt) | 2013-04-18 | 2017-07-18 | Immune Design Corp | monoterapia com gla para uso em tratamento de câncer |
US9463198B2 (en) | 2013-06-04 | 2016-10-11 | Infectious Disease Research Institute | Compositions and methods for reducing or preventing metastasis |
US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
EP3052127A1 (en) | 2013-10-04 | 2016-08-10 | PIN Pharma, Inc. | Immunostimulatory hiv tat derivative polypeptides for use in cancer treatment |
US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
JP6758185B2 (ja) | 2013-12-13 | 2020-09-23 | ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ, アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー, デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ | マルチエピトープtarpペプチドワクチンおよびその使用 |
US9931393B2 (en) | 2013-12-20 | 2018-04-03 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Immunogenic JC polyomavirus compositions and methods of use |
US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3331554B1 (en) | 2015-08-03 | 2022-05-11 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Brachyury deletion mutants, non-yeast vectors encoding brachyury deletion mutants, and their use |
ES2929274T3 (es) | 2016-05-10 | 2022-11-28 | Najit Tech Inc | Inactivación de patógenos y producción de vacunas inactivadas altamente inmunógenas utilizando un proceso de oxidación dual |
EP3703745B1 (en) | 2017-11-04 | 2024-04-10 | Nevada Research & Innovation Corporation | Immunogenic conjugates and methods of use thereof |
KR20210124205A (ko) | 2018-12-04 | 2021-10-14 | 더 락커펠러 유니버시티 | Hiv 백신 면역원 |
WO2021160887A1 (en) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | Immunor As | Corona virus vaccine |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3083142A (en) * | 1958-02-27 | 1963-03-26 | Glaxo Group Ltd | Improved swine erysipelas vaccine |
US3790665A (en) * | 1968-02-23 | 1974-02-05 | Haver Lockhart Labor Inc | Injectable adjuvant,method of preparing same and compositions including such adjuvant |
US3919411A (en) * | 1972-01-31 | 1975-11-11 | Bayvet Corp | Injectable adjuvant and compositions including such adjuvant |
US4117113A (en) * | 1974-06-25 | 1978-09-26 | National Research Development Corporation | Immunological preparations |
GB1502774A (en) * | 1974-06-25 | 1978-03-01 | Nat Res Dev | Immunological preparations |
US4772466A (en) * | 1983-08-22 | 1988-09-20 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Vaccines comprising polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants |
US4770874A (en) * | 1983-08-22 | 1988-09-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants |
JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
CA1337395C (en) * | 1986-10-20 | 1995-10-24 | Rae Lyn Burke | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
US4778784A (en) * | 1987-01-07 | 1988-10-18 | Baylor College Of Medicine | Cyclic peptide and method of use for inducing an immunological response to hepatitis B virus |
US4963354A (en) * | 1987-01-21 | 1990-10-16 | Genentech, Inc. | Use of tumor necrosis factor (TNF) as an adjuvant |
IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
JPH0832638B2 (ja) * | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 |
AU1025692A (en) * | 1991-02-06 | 1992-08-13 | Ciba-Geigy Ag | Novel chimeric antiidiotypic monoclonal antibodies |
-
1992
- 1992-07-24 EP EP92917479A patent/EP0596032B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-24 PH PH44711A patent/PH30906A/en unknown
- 1992-07-24 JP JP50307193A patent/JP3939746B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-24 BR BR9206310A patent/BR9206310A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-07-24 CZ CZ1994150A patent/CZ288048B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 IE IE243692A patent/IE922436A1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 MX MX9204376A patent/MX9204376A/es not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 ES ES92917479T patent/ES2117052T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-24 HU HU9400202A patent/HU220295B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 AT AT92917479T patent/ATE166578T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 AU AU24338/92A patent/AU666127B2/en not_active Ceased
- 1992-07-24 WO PCT/US1992/006193 patent/WO1993001831A1/en active IP Right Grant
- 1992-07-24 CA CA002113720A patent/CA2113720A1/en not_active Abandoned
- 1992-07-24 US US07/919,787 patent/US5585103A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-24 RO RO94-00094A patent/RO116459B1/ro unknown
- 1992-07-24 DK DK92917479T patent/DK0596032T4/da active
- 1992-07-24 IL IL102639A patent/IL102639A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 SK SK89-94A patent/SK282920B6/sk unknown
- 1992-07-24 KR KR1019940700218A patent/KR100198868B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-07-24 DE DE69225710T patent/DE69225710T3/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-24 RU RU94038046/14A patent/RU2129439C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-07-27 ZA ZA925614A patent/ZA925614B/xx unknown
- 1992-08-27 TW TW081105966A patent/TW349867B/zh not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-01-21 NO NO19940218A patent/NO317203B1/no unknown
- 1994-01-24 OA OA60461A patent/OA09880A/en unknown
- 1994-01-24 BG BG98410A patent/BG62240B1/bg unknown
- 1994-01-24 FI FI940335A patent/FI108114B/fi active
-
1995
- 1995-05-24 US US08/449,728 patent/US6270769B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-06-22 HU HU95P/P00339P patent/HU211299A9/hu unknown
-
2001
- 2001-06-05 FI FI20011187A patent/FI109335B/fi active
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473557C2 (ru) * | 2007-01-03 | 2013-01-27 | Онкотерапи Сайенс, Инк. | Вакцины на основе пептида foxp3 |
US8563516B2 (en) | 2007-01-03 | 2013-10-22 | Oncotherapy Science, Inc. | Foxp3 peptide vaccine |
RU2775424C2 (ru) * | 2017-09-13 | 2022-06-30 | Санофи Пастер | Иммуногенная композиция цитомегаловируса человека |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2129439C1 (ru) | Антигенная композиция для индуцирования ответа цитотоксических т-лимфоцитов, способ индуцирования и способ лечения болезни | |
RU2201253C2 (ru) | Микрофлюидизированная композиция для индукции специфичного цитотоксического т-лимфоцитного иммунного ответа и ее использование для лечения заболеваний | |
US20060057162A1 (en) | Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses | |
KR100478617B1 (ko) | 세포독성t-림프구반응을유도하는방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080725 |