CN102782138A

CN102782138A - 包含热敏性转基因的疫苗

Info

Publication number: CN102782138A
Application number: CN2010800555715A
Authority: CN
Inventors: F·E·纳诺
Original assignee: Victoria University of Innovation and Development Corp
Current assignee: Victoria University of Innovation and Development Corp
Priority date: 2009-10-07
Filing date: 2010-10-07
Publication date: 2012-11-14
Also published as: ES2594485T3; CA2776922A1; AU2010305273B2; EP2486133B1; US20120189661A1; US9580478B2; EP2486133A1; EP2486133A4; WO2011041886A1; AU2010305273A1; US20130177589A1; HUE029386T2; HRP20161234T1; BR112012009401A2; US20170136111A1; WO2011041886A8; US8778683B2

Abstract

本公开内容提供了来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子、由所述核酸分子编码的蛋白以及其中已引入这类核酸分子的重组细胞。所公开的含有来自嗜冷细菌的一个或多个必需核酸分子的重组细胞从而变为温度敏感性的，并且可被给予哺乳动物以在所述哺乳动物中诱导免疫反应。

Description

包含热敏性转基因的疫苗

相关申请的交叉引用

本申请要求于2009年10月7日提交的美国临时申请No.61/249,385和于2010年4月9日提交的美国临时申请No.61/322,634的优先权，所述两篇临时申请以援引的方式纳入本文。

技术领域

该技术涉及来源于嗜冷细菌的基因，用于热敏性疫苗的开发。在一个实例中，所述技术涉及含有冷红科尔韦尔氏菌(Colwelliapsychrerythraea)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)和冷海希瓦氏菌(Shewanella frigidimarina)的热敏性基因ligA以及冷红科尔韦尔氏菌的基因ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、murG、fmt和dnaK的重组病原体。

背景技术

抗细菌和病毒疾病的疫苗在减少人的传染病中已经起到了重要作用；然而，仍然存在对用于减少目前全世界的传染病负担的新型疫苗的需要。适冷病毒已被用作抗人病毒疾病的疫苗达数十年。这类疫苗的最广为人知的实例是Sabin脊髓灰质炎病毒疫苗。另一实例是名为

(Medimmune LLC,Gaithersburg,MD,USA)的适冷流感疫苗，其在2003年引入美国。

已被证明在某些人口统计组中比实施使用灭活病毒来刺激免疫反应的更常见免疫接种策略的流感疫苗有效得多。通常，已经通过在低温下将病毒在卵中或细胞培养物中反复传代然后测试其后代能否在高于约37℃（通常被认为“正常”人体温度）下生长而开发出适冷的或“温度敏感性”(TS)病毒株。

“正常”人体温度的概念考虑解剖学位点、个体差异、性别、生理条件和环境温度。尽管存在若干变量，然而人体仅可在一个非常窄的温度范围内发挥功能，其通常为约36°C-39°C。如果人体内部温度下降到约35℃，那么必须使身体暖和，否则会造成死亡。不管环境温度和穿着衣物如何，皮肤温度总是低于身体体核（body core）的温度。在适宜温度下（例如21℃），皮肤的温度为约32°C-35°C。

本领域技术人员认为，细菌通常具有一组约100到150个对维持细菌生活力绝对必需的基因，称为“必需基因”。由于必需基因的性质，鉴定必需基因是困难的，因为敲除这些基因会导致生物体的死亡。必需基因编码蛋白，所述蛋白由在几乎全部细菌种属之间高度保守的氨基酸序列构成。这种保守性很可能反映了在不同种间这些蛋白的共同功能和结构。选定数量的必需基因已被证明能够置换另一细菌种中的同源物，在某些情况下这些置换来自关系较远的细菌种。氨基酸序列的保守性在细菌中广泛存在，嗜冷生物和嗜热生物的必需基因的推定氨基酸序列显示出与其嗜温对应物的高度同一性。微生物学家通常使用条件致死突变（例如TS突变）来鉴定必需基因。

许多细菌种在传染病的全世界负担中起到重要作用。然而，结核病的致病因素可能是由细菌传染病引起的人发病率和致死率的最显著因素。尽管几十年来一直使用卡介苗(BCG)来预防结核病，然而其低的效能已不能将结核病的发生率降低至可接受的水平。

发明内容

本公开提供了用于改造、生产和使用热敏性宿主微生物细胞的方法。在一个实例中，重组病原体含有例如使用同源重组插入的热敏性必需基因。“嗜冷生物”是适用于这样的生物的术语，即所述生物在低温例如<20℃下机能最佳。在冰冷海水特别是北极和南极海域中生活的细菌是嗜冷细菌的实例。嗜冷细菌中的酶和其他蛋白在冰冷环境中的机能好于其在嗜温细菌中的同源对应物。许多来自嗜冷细菌的酶易于变性的温度比影响所述酶的嗜温对应物的温度低得多。据推测，嗜冷酶的温度敏感模式可扩展至必需基因的产物。

本发明提供了鉴定和操作具有所需TS特性的嗜冷必需基因的方法。可使用体外和体内重组技术。土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)是动物传染病土拉菌病的病原体。其可通过多种途径感染多种动物，并通常感染网状内皮组织系统器官中的来源于单核细胞的细胞并在其中生长。一种密切相关的细菌——新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)——具有土拉弗朗西斯菌的许多特性，并且，除此之外，还非常适于许多遗传操作包括基因置换。新凶手弗朗西斯菌的病理生理学和遗传特性使其适合研究基因置换对病原菌的作用。新凶手弗朗西斯菌是最大生长温度为约45℃的嗜温生物。

本公开内容还提供了用于确定两种细菌株的最大生长温度及其在限制温度下的生长特性的方法。所测试的重组细菌株会在低于所述限制温度的温度下生长，但不会在高于所述限制温度的温度下生长。当将编码必需基因的嗜冷必需等位基因插入到温度低于人体体核温度的哺乳动物身体区域（例如皮肤）中后，所述重组病原细菌将具有快速生长从而诱发免疫反应的能力。当所述病原性重组细菌迁移到温度更高的人体体核的器官中时，它们会死亡并且不能伤害宿主。

本公开内容提供了从嗜冷细菌分离的温度敏感性必需核酸分子，所述核酸分子与示于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、22、23或24中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。在某些实例中，所述嗜冷细菌在约-10℃到约30℃的温度下是能行使功能（operable）的，但是在高于约30℃的温度下是不能行使功能（operable）的。本公开内容还提供了包含这类来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子的载体和重组宿主细胞（例如重组细菌宿主细胞）。还公开了包含这类重组宿主细菌（例如活细胞或被杀死的细胞）的免疫原性组合物。本公开内容还提供了由所公开的分离的温度敏感性必需核酸分子编码的分离蛋白，例如与示于SEQID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、27或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的蛋白。

本公开内容提供了制备温度敏感性微生物宿主细胞（例如重组宿主细胞）的方法。在一个实例中，所述方法包括将核酸构建体引入嗜温细菌株的基因组中（例如通过插入、置换或替换），其中所述核酸构建体包含来自嗜冷细菌株的温度敏感性必需核酸分子以及与所述温度敏感性必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列，其中由所引入的温度敏感性必需核酸分子编码的温度敏感性必需肽在低于约30℃的温度下是能行使功能的（例如有功能的），在高于约30℃的温度下是不能行使功能的（例如无功能的）。在某些实例中，所述方法还包括：在其中所述温度敏感性必需肽能行使功能的温度下培养所述温度敏感性微生物宿主细胞，藉此所述微生物宿主细胞产生多种肽；将培养温度升高至所述温度敏感性肽不能行使功能的温度；维持所述培养一段足够长的时间以杀死所述温度敏感性微生物宿主细胞；以及收获所述被杀死的温度敏感性微生物宿主细胞。

本公开内容提供了用于使用所公开的核酸分子、蛋白和重组宿主细胞在受试者中产生对细菌的免疫反应的方法。在一个实例中，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌表达来自嗜冷细菌株的温度敏感性必需核酸分子，藉此诱发对所述细菌的免疫反应。所述方法可用于预防或治疗细菌感染（例如结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、沙门氏菌（Salmonella）或弗朗西斯菌（Francisella）感染）。

根据以下参照附图进行的对几个实施方案的详细描述，本公开内容的上述和其他特征会变得更加明了。

附图说明

图1a是流程图，示出了使用聚合酶链式反应(PCR)的示例性方法；图1b是示意图，示出了显示导致基因置换的DNA整合-切除事件的示例性方法。

图2a是示意图，示出了野生型(wt)新凶手弗朗西斯菌ligA基因的正常存在于染色体中的序列；图2b是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的ligA_Cp基因置换；图2c是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的ligA_Sf基因置换；图2d是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的ligA_Ph基因置换；图2e是示意图，示出了依照本公开内容的示例性方法进行的到所述新凶手弗朗西斯菌染色体中的ligA_Ph2基因置换。

图3a的曲线图示出了在30°C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用冷红科尔韦尔氏菌ligA_Cp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3b的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到33°C时，用冷红科尔韦尔氏菌ligA_Cp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3c的曲线图示出了3.5小时后温度从30℃转换到34°C时，用冷红科尔韦尔氏菌ligA_Cp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3d的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到35°C时，用冷红科尔韦尔氏菌ligA_Cp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图3e的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到37°C时，用冷红科尔韦尔氏菌ligA_Cp基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。

图4a的曲线图示出了在30°C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用冷海希瓦氏菌ligA_Sf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图4b的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到33°C时，用冷海希瓦氏菌ligA_Sf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图4c的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到35°C时，用冷海希瓦氏菌ligA_Sf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图4d的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到37°C时，用冷海希瓦氏菌ligA_Sf基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。

图5a的曲线图示出了在30°C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图5b的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到33°C时，用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图5c的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到35°C时，用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图5d的曲线图示出了2小时后温度从30℃转换到37°C时，用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。

图6a的曲线图示出了在21°C下wt新凶手弗朗西斯菌以及用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图6b的曲线图示出了2小时后温度从21℃转换到26°C时，用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图6c的曲线图示出了2小时后温度从21℃转换到28°C时，用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线；图6d的曲线图示出了2小时后温度从21℃转换到30°C时，用河豚毒素假交替单胞菌ligA_Ph2基因置换新凶手弗朗西斯菌中同源物的新凶手弗朗西斯菌和wt新凶手弗朗西斯菌的生长曲线。

图7的曲线图示出了在33℃下生长至对数生长后期后，在37℃下野生型新凶手弗朗西斯菌和新凶手弗朗西斯菌–ligA_CP培养物的生活力下降。

图8是数字图像，示出了鼠伤寒沙门氏菌（S.ser.Typhimurium）-ligA_CP在30℃下生长以及在37℃下不能生长。

图9a的曲线图示出了在30℃下wt耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)和耻垢分枝杆菌-ligA_CP的生长曲线，图9b的曲线图示出了在4小时后温度从30℃转换到35°C时，耻垢分枝杆菌-ligA_CP和wt耻垢分枝杆菌的生长曲线，图9c的曲线图示出了在4小时后温度从30℃转换到37°C时，耻垢分枝杆菌-ligA_CP和wt耻垢分枝杆菌的生长曲线。

图10a-10d是一系列曲线图，显示了由TS新凶手弗朗西斯菌株诱发的保护性免疫。

图11A-11L显示了本文公开的序列，其中加下划线的部分是新凶手弗朗西斯菌序列。

序列表

所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列是使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码表示的。每个核酸序列只显示一条链，但是应理解对所示链的任何提及包括其互补链。

SEQ ID NO:1是ligA_Cp杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:2是推定的ligA_Cp杂合蛋白的689氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是ligA_Ph杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:4是推定的ligA_Ph杂合蛋白的673氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是ligA_Ph2杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:6是推定的ligA_Ph2杂合蛋白的673氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是ligA_Sf杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:8是推定的ligA_Sf杂合蛋白的670氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是pyrG_Cp杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:10是推定的PyrG_Cp杂合蛋白的545氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是hemC_Cp杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:12是推定的HemC_Cp杂合蛋白的317氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是fmt_Cp杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:14是推定的Fmt_Cp杂合蛋白的327氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是murG_Cp杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:16是推定的MurG_Cp杂合蛋白的387氨基酸序列。

SEQ ID NO:17是对结核分枝杆菌优化的密码子优化的ligA_Cp的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:18是推定的密码子优化的LigA_Cp杂合蛋白的689氨基酸编码序列，其中前4个密码子变为结核分枝杆菌形式。

SEQ ID NO:19是dnaK_Cp杂合基因的全长核酸编码序列。

SEQ ID NO:20是推定的DnaK_Cp杂合蛋白的638氨基酸序列。

SEQ ID NO:21和22分别是来自冷红科尔韦尔氏菌的必需基因tyrS的全长核酸编码序列（正常字体，大写）以及相应的氨基酸序列。

SEQ ID NO:23和24分别是来自冷红科尔韦尔氏菌的必需基因cmk的全长核酸编码序列（正常字体，大写）以及相应的氨基酸序列。如图11J所示，新凶手弗朗西斯菌序列加下划线示出。在核酸和氨基酸序列中加下划线的部分均对应新凶手弗朗西斯菌序列。“未加下划线的”是冷红科尔韦尔氏菌序列。在氨基酸序列中，在末端没有加下划线的氨基酸，因为新凶手弗朗西斯菌序列起始自终止密码子。

SEQ ID NO:25和26分别是来自冷海希瓦氏菌的必需基因dnaKsf的全长核酸编码序列（正常字体，大写）以及相应的氨基酸序列。如图11K所示，新凶手弗朗西斯菌序列加下划线示出。在核苷酸和氨基酸序列中加下划线的部分均对应新凶手弗朗西斯菌序列。“未加下划线的”显示了冷海希瓦氏菌序列。希瓦氏菌和弗朗西斯菌的起始处的氨基酸序列(MGK)是相同的，因此加双下划线示出。氨基酸序列末端处的单下划线对应新凶手弗朗西斯菌序列。

SEQ ID NO:27和28分别是来自冷红科尔韦尔氏菌的必需基因ftsZ的全长核酸编码序列（正常字体，大写）以及相应的氨基酸序列。如图11L所示，新凶手弗朗西斯菌序列加下划线示出。在核苷酸和氨基酸序列中加下划线的部分均对应新凶手弗朗西斯菌序列。“未加下划线的”部分是冷红科尔韦尔氏菌序列。5’-末端（N-末端）处有延伸的新凶手弗朗西斯菌区。

具体实施方式

提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开内容。除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”均指一个或多于一个。例如，术语“包含核酸分子”包括单个或多个核酸分子并被认为等同于短语“包含至少一个核酸分子”。除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”是指所称可替代要素的单个要素或者两个或多个要素的组合。本文所用的“包括”是指“包含”。因此，“包括A或B”是指“包含A、B或者A和B”，而不排除额外的要素。

下面描述用于实施和/或测试本公开内容的实施方案的合适的方法和材料。所述方法和材料仅为示例而非意图进行限制。可使用与本文所述的那些类似或等同的其他方法和材料。例如，所公开的发明所属领域中公知的常规方法记载于多篇一般性和更具体的参考文献中，包括例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2ded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3d ed.,Cold Spring HarborPress,2001；Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates,1992(and Supplements to 2000)；Ausubel et al.,Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley &Sons,1999；Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1990；以及Harlow and Lane,UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1999。

本文引用的参考文献以引用的方式纳入本文。

为方便对本公开内容的各个实施方案的阅读，提供了以下对具体术语的解释。除非另外指出，否则技术术语依照本领域技术人员的常规用法使用。

佐剂：用于增强抗原性——例如含有本文公开的TS必需嗜冷细菌序列的重组宿主细菌的抗原性——的溶剂（vehicle）。佐剂包括上面吸附有抗原的矿物质（例如茂、氢氧化铝或磷酸盐）的悬浮液；或抗原溶液在矿物油中被乳化的油包水乳液（弗氏不完全佐剂）；有些时候还包含被杀死的分枝杆菌（弗氏完全佐剂）以进一步增强抗原性（抑制抗原的降解和/或引起巨噬细胞的流入）。免疫刺激寡核苷酸（例如包含CpG基序的那些）也可用作佐剂（例如参见美国专利No.6,194,388；No.6,207,646；No.6,214,806；No.6,218,371；No.6,239,116；No.6,339,068；No.6,406,705和No.6,429,199）。佐剂包括生物分子（“生物佐剂”），例如共刺激分子。示例性佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41BBL。

给药：通过所选途径将组合物（例如免疫原性组合物）引入受试者（例如哺乳动物，例如人）。给药的示例性途径包括但不限于：局部、注射（如皮下、肌肉、真皮内、腹膜内、肿瘤内和静脉注射）、口服、舌下、直肠、透皮、鼻内、阴道和吸入途径。

缓解：疾病和病理状态（例如细菌感染）由于所述治疗的作用的改善。有益效果可由例如以下表现证明：在疑似受试者中的疾病临床症状的延迟发作，所述疾病的某些或全部临床症状的严重程度的减轻，所述疾病发展的减慢，受试者的整体健康或康乐的改善，或者对具体疾病特异性的本领域技术人员公知的其他参数。

动物：一类包括哺乳动物和鸟类的活的多细胞脊椎动物生物。术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人和畜受试者（例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、马和牛）。

抗体：包含至少一个轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体，所述可变区特异性地识别并结合抗原表位。抗体由重链和轻链构成，各自均具有可变区，称为重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)。所述V_H区和V_L区一起负责结合被抗体识别的抗原。

抗体包括完整的免疫球蛋白，以及本领域中公知的抗体的变体和部分，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab)'₂片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫化物稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合的融合蛋白，而在dsFv中，所述链已被变异以引入二硫键来稳定所述链的缔合。

通常，天然存在的免疫球蛋白具有通过二硫键相互连接的重(H)链和轻(L)链。存在两种类型的轻链，lambda(λ)和kappa(κ)。决定抗体分子功能活性的重链主要有5类（或同种型）：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

“特异性结合”是指个体的抗体——相对于与无关蛋白（例如非细菌蛋白）的结合——与抗原（例如细菌抗原）发生特异性免疫反应的能力。所述结合是抗体分子与T细胞表面分子的抗原决定簇之间的非随机结合反应。所需的结合特异性通常是由所述抗体差别结合T细胞表面分子和无关抗原并因此区分两种不同的抗原（特别是当所述两种抗原具有独特的表位时）的能力的参考点决定。特异性结合具体表位的抗体称为“特异性抗体”。

在某些实例中，抗体与标靶（例如细菌蛋白）以较对样本或受试者中其他分子的结合常数大至少10³M^-1、10⁴M^-1或10⁵M^-1的结合常数特异性结合。在某些实例中，抗体或其片段具有1nM或更小的平衡常数(Kd)。例如，抗体与靶标（例如细菌蛋白）以至少约0.1x 10^-8M、至少约0.3x 10^-8M、至少约0.5x 10^-8M、至少约0.75x 10^-8M、至少约1.0x 10^-8M、至少约1.3x 10^-8M、至少约1.5x 10^-8M或至少约2.0x 10^-8M的结合亲和力结合。Kd值可例如通过竞争性ELISA（酶联免疫吸附测定）或使用表面等离子共振装置例如Biacore T100（其可从Biacore,Inc.,Piscataway,NJ获得）确定。

抗原：可刺激动物中的抗体产生或T细胞反应的化合物、组合物或物质，包括注射到或吸附到动物中的组合物。抗原可与特异性体液或细胞免疫的产物（包括由异种免疫原诱发的那些）反应。术语“抗原”包括全部有关的抗原表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其产生响应的位点。在一个实施方案中，当表位以与MHC分子连接的形式存在时，T细胞对所述表位产生响应。表位由连续氨基酸或通过蛋白的三级折叠并置的非连续氨基酸构成。通常，T细胞识别连续氨基酸的表位。由连续氨基酸构成的表位通常在暴露于变性溶剂后得以保留，而由三级折叠构成的表位通常会在用变性溶剂处理后丧失。表位通常包括以独特的空间构象存在的至少3个，更通常至少5个，约9个或约8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线结晶学和2维核磁共振。

抗原的实例包括但不限于肽、脂质、多糖和含有抗原决定簇的核酸，例如为免疫细胞识别的那些。抗原可为组织特异性抗原，或者疾病特异性抗原。这些术语不是排他性的，因为组织特异性抗原也可为疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限数量的组织例如单一组织中表达。组织特异性抗原可由一种以上相关类型的组织（例如肺泡和支气管组织）表达。疾病特异性抗原伴随疾病过程同时表达。疾病特异性抗原的特异性非限制实例是其表达与细菌感染相关或预示细菌感染（例如结核病）的抗原。疾病特异性抗原可被T细胞或B细胞识别。

CD4：分化因子4的簇，一种T细胞表面蛋白，其介导与MHC II类分子的相互作用。CD4还作为HIV感染过程中T细胞上的HIV主要受体位点。表达CD4的细胞通常是辅助T细胞。

CD8：分化因子8的簇，一种T细胞表面蛋白，介导与MHC I类分子的相互作用。表达CD8的细胞通常是细胞毒性T细胞。“CD8+T细胞介导的免疫性”是通过将抗原呈递至CD8+T细胞而实现的免疫反应。

接触：在另一种试剂存在的情况下孵育一种试剂的过程。因此，当细胞与试剂（例如免疫原性组合物）接触时，用所述试剂将细胞孵育一段足以使所述试剂与细胞相互作用的时间。

身体的温度较低部位：人和其他哺乳动物身体的部位，所述部位的温度通常比身体其他部位低。正常人（或其他哺乳动）体温的概念因解剖学位点、性别、生理和环境温度而变动。尽管有很多变量，但人（或其他哺乳动）身体仅可在一个非常窄的温度范围内发挥功能，因此，例如人体体核维持在约36℃-39℃。身体的温度较低部位包括皮肤、嘴和直肠。例如，皮肤温度为约32°C-35℃。因此，在某些实例中，身体的温度较低部位比身体其他部位（例如体核）低至少1℃、低至少2℃、低至少3℃、低至少4℃、低至少4℃或低至少6℃，例如低1℃-8℃、低1℃-6℃、低2℃-6℃或低2℃-4℃。

细胞因子：由细胞产生的影响其他细胞（如淋巴细胞）行为的蛋白。在一个实施方案中，细胞因子是趋化因子，一种影响细胞运输的分子。细胞因子的具体的非限制性实例包括白细胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21等)和IFN-γ。

简并变体：编码TS必需嗜冷细菌蛋白的TS必需嗜冷细菌核酸序列，包括因遗传密码造成的简并核酸序列。存在20种天然氨基酸，其大部分由多于一种密码子指定。因此，本公开内容中包括所有简并核苷酸序列，只要由所述核苷酸编码的TS必需嗜冷细菌肽的氨基酸序列不变。

Em^R：红霉素抗性。

必需基因：在所有培养条件下对生物（例如嗜温细菌）的生长均必需的基因。

表达控制序列:调控与之可操作地连接的异源核酸序列表达的核酸序列。当表达控制序列控制并调控核酸序列的转录以及（在适当的情况下）核酸序列的翻译时，所述表达控制序列就与所述核酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子（即ATG）、内含子剪接信号、维持该基因的正确阅读框以使mRNA可正确翻译以及终止密码子。术语“控制序列”在最小意义上意图包括其存在可影响表达的组件，并还可包括其存在有利的额外组件，例如前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。

启动子：是足以指导转录的最小序列。还包括那些足以使启动子依赖的基因表达可受细胞类型特异性、组织特异性的外部信号或试剂控制或者可由外部信号或试剂诱导的启动子元件；这些元件可位于所述基因的5'或3'区。包括组成型和诱导型的启动子（参见例如Bitter etal.,Methods in Enzymology 153:516-544,1987）。例如，当克隆到细菌系统中时，可使用诱导型启动子，例如噬菌体lambda的pL、plac、ptrp、ptac（ptrp-lac杂合启动子）等。在一个实施方案中，当克隆到哺乳动物细胞系统中时，可使用来源于哺乳动物细胞的基因组的启动子（例如金属硫蛋白启动子）或来源于哺乳动物病毒的启动子（例如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒后期启动子；牛痘病毒7.5K启动子）。由重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供所述核酸序列的转录。在一个实施方案中，所述启动子是巨细胞病毒启动子。

热敏感性：在高于约28℃的温度下不能行使必需的生物功能。类似地，术语“热敏感性蛋白或多肽”是指由热诱导的灭活导致的无功能成熟蛋白。这种蛋白的一个实例是在高于约28℃的温度下不足以有效催化其已知反应以支持所述生物的生长、发育或生命的酶。

热敏感等位基因：包含编码热敏感性蛋白的基因的等位基因。类似地，术语“热敏感性基因”是指由编码热敏感性蛋白的基因。

宿主细胞：已引入异源核酸分子的细胞。例如，这些细胞可包括可增殖并且其DNA可被表达的核酸载体。所述细胞可为原核细胞或真核细胞。所述细胞可为原核细胞，例如细菌细胞。该术语还包括目的宿主细胞的任何后代。应理解所有细胞均可不同于亲代细胞，因为在复制过程中可能存在突变。然而，当使用“宿主细胞”时，包括这些后代。

免疫反应：免疫系统的细胞（例如B细胞、T细胞或单核细胞）对刺激物的反应。在一个实施方案中，所述反应对特定抗原或特定TS重组微生物细胞（例如含有本文提供的嗜冷必需核酸分子的嗜温细菌）是特异性的。在一个实施方案中，免疫反应是T细胞反应，例如CD4+反应或CD8+反应。在另一个实施方案中，所述反应是B细胞反应，并导致特异性抗体的产生。给予含有嗜冷TS必需核酸分子的嗜温细菌后，免疫反应的形成可使用本领域中已知的常规方法测量，例如通过测量作为保护性免疫反应指征的细胞因子产生。

免疫原性组合物：包含含有嗜冷TS必需核酸分子的重组嗜温细菌的组合物，所述嗜冷TS必需核酸分子诱发可测量的对重组嗜温细菌蛋白的CTL反应，或者诱发可测量的对重组嗜温细菌蛋白的B细胞反应（例如产生特异性结合重组嗜温细菌-特异性蛋白的抗体）。例如，所述免疫原性多肽或编码所述免疫原性多肽的核酸可存在于使用本文提供的方法产生的热敏性嗜温细菌中，其中所述细菌是免疫组合物的一部分，所述免疫组合物还可包含可药用的载体和/或其他治疗剂。免疫原性组合物可任选地包括佐剂、PD-1拮抗剂、共刺激分子或编码共刺激分子的核酸。通过本领域中公认的测定法可容易地测试免疫原性组合物诱发CTL的能力。

免疫原性肽：包含等位基因-特异性基序或其他序列的肽，所述基序或序列使得所述肽结合MHC分子并诱发对来源自所述免疫原性肽的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应或者B细胞反应（例如抗体产生）。免疫原性肽还可在存在MHC蛋白的情况下通过测量其与特异性MHC蛋白的结合以及由其刺激CD4和/或CD8的能力来鉴定。

通常，免疫原性多肽可用于诱发受试者中的免疫反应，例如B细胞反应或T细胞反应。在一个实施例中，免疫原性多肽在结合于MHCI类分子时活化抗所述多肽的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。使用合成肽诱发CTL以及CTL细胞毒性测定是本领域中已知的，参见美国专利5,662,907。在一个实例中，免疫原性肽包含等位基因-特异性基序或其他序列，从而使得所述肽结合MHC分子并诱发抗从其中产生所述免疫原性肽的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应。

免疫原性反应条件：允许对特定表位特异的抗体结合于所述表位的条件，所述结合的程度比与基本上所有其他表位的结合更大，并且/或者基本排除与基本上所有其他表位的结合。这些条件依赖于所述抗体结合反应的形式，通常是那些用于免疫测定方案的条件或者那些体内存在的条件。用于所公开方法的免疫原性反应条件是这样的“生理条件”，即所述条件包括活的哺乳动物或哺乳动物细胞内部常见的条件（例如温度、克分子渗透压浓度、pH）。尽管知晓某些器官处于极端条件下，然而器官内和细胞内环境通常为约pH7（例如pH 6.0到pH8.0或pH 6.5到pH 7.5，例如pH 7.2），含有水作为主要溶剂，并处于高于0℃且低于50℃的温度下。克分子渗透压浓度处于可支持细胞生活力和繁殖的范围内。这些条件为这些领域的技术人员所公知。

干扰素γ(IFN-γ)：IFN-γ是具有146个氨基酸的亚基的二聚体蛋白。所述蛋白在两个位点上被糖基化，并且pI为8.3-8.5。IFN-γ以包含23个氨基酸的分泌信号序列的166个氨基酸的前体蛋白的形式合成。已公开了20和25kDa的两种分子形式的生物活性蛋白。所述两种形式在第25位上均被糖基化。25kDa形式还在第97位上被糖基化。天然IFN-γ在分子量和电荷方面中观测到的不同是由于不同的糖基化模式。在非变性条件下观察到的40-60kDa形式是IFN-γ的二聚体和四聚体。人的该基因具有约6kb的长度。其含有4个外显子，并作谱于染色体12q24.1。

IFN-γ可通过灵敏的免疫测定法检测，例如可检测产生IFN-γ的个体细胞的ELISPOT测试。微量的IFN-γ可通过测量IFN诱导的蛋白（例如Mx蛋白）而间接检测。对IP-10的合成的诱导也已用于测量IFN-γ浓度。此外，可使用生物测定法来检测IFN-γ，例如利用诱导2D9细胞中吲哚胺2,3-二氧化酶活性的测定法。IFN-γ的产生可用于评估T细胞活化，例如细菌抗原对T细胞的活化。

分离的：生物组分（例如核酸分子、蛋白或细胞器），其已被从其天然所在的生物体细胞中的其他生物组分（例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白和细胞器）中基本分离或纯化。已“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。在另一实施方案中，“分离的”是指通过宿主细胞中的重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学方法合成的核酸。

ligA：在嗜温细菌（例如新凶手弗朗西斯菌、耻垢分枝杆菌或大肠杆菌）中发现的编码NAD-依赖的DNA连接酶的基因的wt等位基因。此外，带有下标的ligA（例如ligA_Cp、ligA_Sf或ligA_Ph）是指在嗜冷细菌中发现的编码NAD-依赖的DNA连接酶的基因的wt等位基因。例如，ligA_Cp是指在最大生长温度低于18℃的北极细菌冷红科尔韦尔氏菌株34H中发现的ligA的wt等位基因。可将嗜冷细菌的ligA序列引入嗜温细菌中，以赋予所述嗜温细菌温度敏感性。

嗜温生物：在约20°C到50℃的温度下的环境中天然存在的生物。嗜温细菌是指通常与哺乳动物有关并因此通常在约32℃到45℃的温度下发挥功能的细菌。

嗜冷细菌：在永久低于20℃，经常永久低于10℃并有时低于0℃的环境中天然存在的生物。所述永久低温的环境包括大多数海洋环境、永冻土、北级和南极环境。这些领域的技术人员会理解“嗜冷生物”和“嗜冷性”通常用于描述在低温环境中生长的细菌。

嗜冷的：嗜冷生物的特征。例如，“嗜冷酶”是从嗜冷生物中分离的酶。

肽修饰：可用于本文提供的方法和组合物的蛋白的类似物（非肽有机分子）、衍生物（用所公开的肽序列起始获得的化学上有功能的肽分子）和变体（同源物）。肽由氨基酸构成，所述氨基酸可为天然以及非天然的L-和/或D-氨基酸。所述肽可通过多种化学技术进行修饰以产生具有与未修饰的蛋白基本相同的活性并任选地具有其他所需特性的衍生物。修饰为这些领域的技术人员所公知。

可药用载体：可用于本公开内容的可药用载体（溶剂）是常规的。E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,PA,19th Edition(1995)的Remington’s Pharmaceutical Sciences描述了适于一种或多种治疗组合物（例如免疫原性组合物）的药物递送的组合物和制剂。

所公开的纯化的活性组合物可单独给药或者与可用载体结合给药。制剂可含有一种类型的治疗分子，或可由数种类型的治疗分子的组合构成。所述载体的性质取决于所用的具体给药模式。

通常，载体的性质取决于所用的具体给药模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体作为载体，所述可注射流体包括药学和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡的盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物（例如粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式），常规的无毒固体载体可包括例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上中性的载体以外，待给予的药物组合物还可含有少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨醇单月桂酸酯。

预防或治疗疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的完全形成，例如在已知具有被结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌（M.leprae）感染的风险的人中。已知易患病的人的实例是与被诊断患有结核病的人一起生活的人、职业医护人员或者其他已知已暴露于结核分枝杆菌的人。“治疗”是指在疾病或病理状态（例如结核病）已经开始形成后改善其体征或症状的治疗介入。

纯化的：术语纯化的不要求绝对纯净；而是作为一个相对术语。因此，例如，纯化的蛋白制剂是这样的蛋白：即所述蛋白较细胞内其来源环境的蛋白更纯。蛋白制剂通常进行纯化，从而使得所述蛋白占所述制剂的总蛋白含量的至少50%。然而，某些应用可能需要更高度纯化的制剂。例如，对于这些应用，可使用其中所述蛋白占总蛋白含量的至少75%或至少90%的制剂。

重组：具有非天然存在的序列或通过人工组合序列的两个天然分离的片段形成的序列的核酸分子。这种人工组合通常通过化学合成，通过对分离的核酸片段的人工操作或者通过遗传工程技术来实现。也指已引入非天然核酸分子的细胞。

抗感染的：与无抗性动物相比，感染症状出现减轻的动物（例如哺乳动物）。对感染的抗性的表现可为例如致死率下降，暴露于感染原后测得的寿命延长，强烈生理症状减少或减轻（例如损伤减少），或者所述感染原的细胞或组织浓度降低。在一个实施方案中，对感染的抗性被免疫反应的增强所证实。

限制温度：生物不能生长的最低温度。例如，表1中的“限制温度”具体是指整合有嗜冷基因的新凶手弗朗西斯菌株不能在琼脂糖培养基上形成分离的菌落的最低温度。由于培养箱温度的差异，这些温度解释为约±1℃。

sacB盒：编码枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)的果聚糖蔗糖酶的模块DNA序列。此基因的表达在蔗糖存在的情况下对许多细菌来说是致死性的，并可因此用作帮助选择基因序列丢失的反向选择剂。

选择性杂交：在排除无关核苷酸序列的中度或高度严格的条件下的杂交，所述杂交的技术为这些领域的技术人员已知。

序列同一性：两个或多个核酸序列之间的同一性/相似性，或两个或多个氨基酸序列之间的同一性/类似性，表示为所述序列之间的同一性或类似性。序列同一性可以以同一性百分比的形式度量；百分比越高，所述序列同一性越高。序列相似性可以以相似性百分比（其考虑了保守性氨基酸置换）的形式度量；百分比越高，所述序列相似性越高。

用于比较的序列比对方法是本领域中公知的。多种程序和比对算法记载于：Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins & Sharp,Gene,73:237-44,1988；Higgins & Sharp,CABIOS 5:151-3,1989；Corpet etal.,Nuc.Acids Res.16:10881-90,1988;Huang et al.Computer Appls.inthe Biosciences 8,155-65,1992；以及Pearson et al.,Meth.Mol.Bio.24:307-31,1994。Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990给出了对序列比对方法和同源性计算的详细注意点。

NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul etal.,J.Mol.Biol.215:403-10,1990)可从数个来源获得，包括NationalCenter for Biological Information(NCBI,National Library ofMedicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,MD 20894)和互联网，连同序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。其他信息可见NCBI网站。

BLASTN可用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。如果所述两个比较序列享有同源性，那么指定的输出文件会将那些同源性区域显示为对齐的序列。如果所述两个比较序列不享有同源性，那么指定的输出文件不会显示对齐的序列。

一旦比对上，就通过对这样的位置的数目计数来确定匹配的数目，即在所述位置上两个序列中存在相同的核苷酸或氨基酸残基。序列同一性百分比通过以下方法确定：用匹配的数目除以识别序列中给出的序列的长度或除以联结的长度（articulated length）（例如识别序列中给出的序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基），然后将所得结果乘以100。例如，当与具有1154个核苷酸的测试序列比对时具有1166个匹配的核酸序列与所述测试序列具有75.0%的同一性(1166÷1554*100=75.0)。所述序列同一性百分比值四舍五入到最接近的十分位。例如，75.11、75.12、75.13和75.14向下近似为75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19向上近似为75.2。所述长度值总是为整数。在另一个实例中，与下文中识别序列的20个连续核苷酸比对的含有15个核苷酸区域的靶序列含有与该识别序列享有75%序列同一性（即15÷20*100=75）的区域。

为比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用设定为缺省参数（空位存在分值为11，每个残基空位分值为1）的缺省BLOSUM62矩阵应用Blast 2 sequence的功能。同源物通常特征在于，使用NCBI BasicBlast 2.0,gapped blastp（使用例如nr或swisspro数据库的数据库），对于与氨基酸序列的全长比对计算出具有至少30%或更高的序列同一性。以blastn程序搜索的查询用DUST过滤(Hancock and Armstrong,1994,Comput.Appl.Biosci.10:67-70)。其他程序使用SEG。此外，也可进行人工比对。当通过此方法测定时，具有甚至更大相似性的蛋白会显示更高的同一性百分比，例如与本文公开的蛋白的至少约75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。因此，在一个实例中，可用于所公开的方法和组合物中的蛋白与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性，并且保留赋予嗜温细菌TS（例如热敏感性）的能力。

两个核酸分子密切相关的一个指征是两个核酸分子在严格条件下相互杂交，如上所述。然而，由于遗传密码的简并性，未显示高度同一性的核酸序列也可编码相同或相似的（保守性的）氨基酸序列。可使用这种简并性改变核酸序列以产生均编码基本相同蛋白的多个核酸分子。用此方法测定时，所述同源性核酸序列可例如与所公开的核酸序列具有至少约60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的序列同一性。因此，在一个实例中，可用于所公开的方法和组合物的核酸序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27具有至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性，并且保留编码能够赋予嗜温细菌TS（例如热敏感性）的蛋白的能力。两个核酸序列基本相同的另一个（且不必须是累加的）指征是第一个核酸编码的肽可与第二个核酸编码的肽发生免疫交叉反应

“温度敏感性（TS）”或“热敏感性（HS）”：在最高约30℃时有活性且在通常见于人体的温度（例如高于约30℃）下失活的细菌组分（例如蛋白）或细菌。

测试菌株：容易进行基因替换以使嗜冷必需置换测试菌株中天然存在的同源物的嗜温细菌。

治疗有效量：单独给予或者与其他治疗剂一起给予的组合物的量，所述量足以在被所述药剂治疗的受试者或细胞中实现所需效果。所述药剂（例如本文提供的免疫原性组合物）的有效量可取决于数个因素，包括但不限于要治疗的受试者或细胞、特定治疗剂以及所述治疗组合物的给药方式。在一个实例中，治疗有效量或浓度是足以预防疾病发展、推迟疾病进展或导致疾病消退的量，或者能够减轻由所述疾病（例如细菌感染（例如结核病））引起的症状的量。

在一个实例中，所需的反应是减轻或抑制与细菌感染有关的一种或多种症状。所述组合物起作用并不表示必须完全消除一种或多种症状。被给予人或脊椎动物受试者的包括所公开的免疫组合物之一的药剂的有效量会根据与所述受试者有关的若干因素（例如所述受试者的总体健康）而变化。药剂的有效量可通过改变所述产品的剂量并测量引起的治疗反应（例如预防细菌感染）来确定。有效量还可通过多种体外、体内或原位免疫测定法来确定。所公开的药剂可根据获得所需反应的需要以单剂量或以多剂量给药。

在具体实例中，免疫原性组合物的治疗有效剂量包括至少10²菌落形成单位(CFU)，例如至少10³、至少10⁴、至少10⁵、至少10⁶、至少10⁷或至少10⁸CFU，例如10²-10⁸CFU。在一个实例中，以真皮内或鼻内途径给予10²-10⁸CFU的活细菌。然而，本领域技术人员会认识到，也可例如根据具体免疫原性组合物使用更高或更低的剂量。在具体实例中，这些每日剂量以一个或多个分开的剂量（例如2、3或4剂）或以单个制剂给药。所公开的免疫原性组合物可单独给药，在可药用载体存在的情况下给药或者在其他治疗药剂存在的情况下给药。

治疗：在疾病或病理状态形成后改善其体征或症状的治疗介入。在一个实例中，本文公开的免疫原性组合物在给予哺乳动物后减轻细菌感染的一种或多种体征。

载体：被引入宿主细胞从而产生转导或转化的宿主细胞——在本文中称为重组细胞——的核酸分子。载体可包含使得其可在宿主细胞中复制的核酸分子序列，例如复制起点。载体还可包含一个或多个可选择的标志基因以及本领域中已知的其他遗传元件。载体包括质粒载体，包括用于在格兰氏阴性和格兰氏阳性细菌细胞中表达的质粒。示例性载体包括在大肠杆菌和沙门氏菌中表达的载体。载体还包括病毒载体例如但不限于逆转录病毒、正痘病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒（fowlpox）、羊痘病毒、猪痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、α病毒、杆状病毒、辛德毕斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒载体。

来自嗜冷细菌的温度敏感性必需基因

本文公开了，数种核酸分子及其对应的肽可被引入细菌以赋予所述宿主细菌温度敏感性（TS），例如热敏感性。所得到的细菌可用于诱导对温度敏感性细菌的免疫反应例如T细胞反应。本文提供了具有所需温度敏感性的示例性嗜冷必需基因及其对应的肽。例如，可用一个或多个嗜冷TS必需核酸分子转化宿主嗜温细菌，从而赋予所述嗜温细菌TS。所得到的重组嗜温细菌可制剂为免疫原性组合物，以治疗或预防由嗜温细菌引起的感染。例如，含有一个或多个嗜冷TS必需核酸分子的重组嗜温结核分枝杆菌可用于治疗或预防结核病。相同的方法可用于制备引起炭疽、布氏菌病(brucellosis)、类鼻疽、脑膜炎、牛结核病、伤寒、痢疾、多种类型的医院内感染、肺炎和鼠疫的TS形式的炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia pseudomallei)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。这样，可使用这些TS细菌来治疗或预防这些病症。

本文提供了来自嗜冷细菌的温度敏感性必需蛋白，例如来自科尔韦尔氏菌属种(Colwellia sp.)、假交替单胞菌属种(Psuedoalteromonassp.)或希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)的所述蛋白。示例性蛋白包括ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、murG、fmt和dnaK。示例性序列以示于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28中的氨基酸序列的形式提供。然而，本领域技术人员会理解也可使用变体序列。例如，序列与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28之一所示的氨基酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的肽为本公开内容所涵盖，并可用于本文提供的方法。变体序列保留了嗜冷细菌的天然温度敏感性必需蛋白的生物活性，例如赋予形成细菌TS（例如热敏感性）的能力——例如在-10℃至约30℃（例如0℃-30℃）的温度下能行使功能，但在高于约30℃（例如4℃-30℃）例如高于35℃的温度下不能行使功能。示例性序列可使用互联网上容易获得的计算机程序和本文示出的氨基酸序列获得。在一个实例中，所述变体肽保留天然蛋白的功能，例如赋予细菌温度敏感性的能力。

变体蛋白的具体的非限制性实例为天然蛋白（例如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28）的保守性变体。示于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28中的氨基酸序列的置换可基于此表进行，只要所述病原嗜温细菌被赋予TS并能够引发对其病原性抗原的免疫反应。例如，蛋白序列可被改变而不改变其生物学性质，例如通过引入一个或多个保守性氨基酸置换。因此，SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的任一个均可通过进行1-20个、1-15个、1-12个、1-10个或1-5个保守性氨基酸置换（例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或50个保守性氨基酸置换）而被修饰，同时保留赋予嗜温细菌温度敏感性(TS)的能力。保守性置换的实例如下：

对所公开蛋白序列的微小修饰可形成与本文所述的未修饰的对应物蛋白相比具有基本相同活性的肽。这类修饰可为有目标的（例如通过定点突变），也可为自发的。通过这些修饰产生的所有蛋白均包括在本文中。

本文公开了可用于在所需细菌宿主中诱导温度敏感性的来自嗜冷细菌的温度敏感性必需蛋白（及核酸分子），其中所产生的重组细菌可用于诱发免疫反应（例如在哺乳动物中）。这些肽可包括全长天然蛋白的片段，只要保留有赋予所述宿主细胞温度敏感性的能力。在这些实例中，所述肽不包括如SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26和28所示中的全长氨基酸序列。例如，可缺失不超过10%、不超过5%或不超过1%的所述氨基酸，例如1%到5%的所述氨基酸。

分离的温度敏感性必需蛋白可为融合蛋白的一部分。因此，所述融合蛋白可包括所述温度敏感性必需蛋白（见上文）和第二个异源部分，例如共价结合于所述温度敏感性必需蛋白的myc蛋白、酶或载体（例如肝炎载体蛋白或牛血清白蛋白）。在其他实例中，所述温度敏感性必需蛋白例如在所述温度敏感性必需蛋白的C-端或N-端处包括6个连续的组氨酸残基、β-半乳糖苷酶氨基酸序列或免疫球蛋白氨基酸序列。所述温度敏感性必需蛋白也可共价连接于载体。合适的载体包括但不限于乙型肝炎小包膜蛋白HBsAg。

本文公开的温度敏感性必需蛋白可通过标准方法化学合成，或可通过重组方式产生。多肽产生的示例性方法记载于Lu et al.,Federationof European Biochemical Societies Letters.429:31-35,1998。蛋白还可使用分子遗传技术产生，例如通过将编码温度敏感性必需蛋白的核酸插入到表达载体中，将所述表达载体导入宿主细胞中。其还可通过包括制备色谱法和免疫分离法的方法分离。

本文提供了来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子。示例性序列以示于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27中的核酸序列的形式提供。然而，本领域技术人员会理解也可使用变体序列。例如，序列与SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25和27之一所示的核酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性（例如与SEQ ID NO:1的核苷酸10-2067、SEQ ID NO:3的核苷酸10-2019、SEQ ID NO:5的核苷酸10-2019、SEQID NO:7的核苷酸10-2010所示的核酸序列具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性）的核酸分子被本公开内容所涵盖，并可用于本文提供的方法。在某些实例中，核酸分子的密码子是针对引入了所述分子的细菌进行了优化。在某些实例中，这类优化不改变藉此编码的氨基酸序列。例如，所述嗜冷细菌TS必需核酸可被修饰以对于其中导入了所述嗜冷细菌TS必需核酸的嗜温细菌（例如结核分枝杆菌或新凶手弗朗西斯菌）优化密码子使用，示例性序列可使用互联网上容易获得的计算机程序和本文示出的核酸序列获得。在一个实例中，所述变体核酸序列保留编码具有天然蛋白功能——例如赋予嗜温细菌温度敏感性的能力——的蛋白的能力。

所公开的来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子包括编码温度敏感性必需肽的DNA、cDNA和RNA序列。所述编码序列中的沉默突变是因为遗传密码的简并性（即冗余性）而形成的，其中多于一个密码子可编码相同的氨基酸残基。因此，例如，亮氨酸可由CTT、CTC、CTA、CTG、TTA或TTG编码；丝氨酸可由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC编码；天冬酰胺可由AAT或AAC编码；天冬氨酸可由GAT或GAC编码；半胱氨酸可由TGT或TGC编码；丙氨酸可由GCT、GCC、GCA或GCG编码；谷氨酰胺可由CAA或CAG编码；酪氨酸可由TAT或TAC编码；异亮氨酸可由ATT、ATC或ATA编码。显示标准遗传密码的表可见于多个来源(例如L.Stryer,1988,Biochemistry,3.sup.rd Edition,W.H.5 Freeman and Co.,NY)。

编码来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽的核酸分子可由体外方法克隆或扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应（LCR）、基于转录的扩增系统(TAS)、自持序列复制系统(3SR)和Q β复制酶扩增系统(QB)。例如，编码所述蛋白的多核苷酸可通过使用基于所述分子的DNA序列的引物而对cDNA进行的聚合酶链式反应而分离。多种克隆和体外扩增方法为本领域技术人员所熟知。PCR方法记载于例如美国专利4,683,195;Mullis et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263,1987；和Erlich,ed.,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。多核苷酸可通过用选自所需多核苷酸序列的探针在严格杂交条件下筛选基因组或cDNA文库而分离。

编码来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽的核酸分子包括纳入载体中，纳入自主复制质粒或病毒中或纳入原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者独立于其他序列以单独分子（例如cDNA）的形式存在的重组DNA。本文公开的核酸分子可为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两者的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。

编码来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽的核酸分子可为载体（例如质粒或病毒载体）的一部分。合适的载体包括逆转录病毒载体、正痘病毒载体、禽痘病毒载体、鸡痘病毒载体、羊痘病毒载体、猪痘病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、α病毒载体、杆状病毒载体、辛德毕斯病毒载体、牛痘病毒载体和脊髓灰质炎病毒载体。具体的示例性载体是痘病毒载体，例如牛痘病毒、鸡痘病毒和高度减毒的牛痘病毒(MVA)、腺病毒、杆状病毒等。可使用的其他病毒载体包括其他DNA病毒例如疱疹病毒和腺病毒，以及RNA病毒例如逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。

编码来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽的核酸分子可与至少一个表达控制元件可操作地连接。所述表达控制元件被插入到所述载体或质粒中以控制和调节所述核酸序列的表达。例如，与温度敏感性必需肽编码序列可操作地连接的表达控制序列被连接，使得在与所述表达控制序列相容的条件下实现所述编码序列的表达。表达控制序列可包括但不限于合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子（即ATG）、内含子剪接信号、维持该基因的正确阅读框以使mRNA可正确翻译以及终止密码子。表达控制元件的具体实例包括但不限于lac系统；λ噬菌体的操作子和启动子区；酵母启动子；以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其他操作元件包括但不限于前导序列、终止密码子、多腺苷酸化信号以及对核酸序列的合适转录及随后的翻译所必需的任何其他序列（所述核酸序列在宿主系统中编码来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽）。表达载体可包含额外元件，所述元件是将含有所述核酸序列的表达载体转移所述宿主系统中及后续复制所必需的。这类元件的实例包括但不限于复制起点和选择性标记物。本领域技术人员还应理解，这类载体容易使用常规方法(Ausubel et al.,(1987)in"Current Protocols in MolecularBiology,"John Wiley and Sons,New York,N.Y.)构建并且有市售。

在一个实例中，引入宿主细菌中的载体包含一个或多个以下元件：(i)原核生物复制起点，从而使得所述载体可在原核宿主中扩增；(ii)编码可选择含有所述载体的原核宿主细胞的标记物的基因（例如编码抗生素抗性的基因）；(iii)至少一个编码一个或多个来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽的DNA序列，其位置邻近能够指导所述序列表达的转录启动子；以及(iv)与将插入外来基因的亲本病毒基因组区域同源的DNA序列，位于元件(iii)的构建体的侧翼。

所述载体可含有编码标记物的额外基因，所述标记物将允许鉴定含有插入的外来DNA的重组细胞。这些包括编码抗生素或化学抗性的基因（例如参见Spyropoulos et al.,1988,J.Virol.62:1046;Falkner andMoss,1988,J.Virol.62:1849;Franke et al.,1985,Mol.Cell.Biol.5:1918），以及例如大肠杆菌lacZ基因的基因，lacZ基因可通过比色测定法鉴定重组菌斑。

引入核酸分子（例如编码来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽的那些核酸分子）的方法为本领域技术人员所熟知。当所述宿主是原核生物（例如细菌）时，可由在指数生长期后采集并随后使用本领域中公知的步骤以CaCl₂方法处理的细胞制备能够摄取DNA的感受态细胞。或者，也可使用MgCl₂或RbCl。转化也可视需要在形成所述宿主细胞的原生质体后进行，或者通过电穿孔进行。宿主细胞可包括细菌细胞，例如引起疾病的细菌。这类可用作来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸/肽的宿主细胞的细菌的实例包括但不限于鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、放线杆菌属种(Actinobacillus sp.)、放线菌属(Actinomycetes)、放线菌属种(Actinomyces sp.)(例如以色列放线菌(Actinomyces israelii)和内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))、气单胞菌属种(Aeromonas sp.)（例如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维罗纳气单菌温和生物变种(Aeromonas veronii biovar sobria)（温和气单胞菌，Aeromonas sobria）和豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)）、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、伴放线菌放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、杆菌属种(Bacillus sp.)（例如炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样杆菌(Bacilluscereus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)和嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)）、拟杆菌属种(Bacteroides sp.)（例如脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)）、巴尔通体属种(Bartonella sp.)（例如杆菌状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)和汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)）、双岐杆菌属种(Bifidobacterium sp.)、博德特氏菌属种(Bordetella sp.)（例如百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)、副百日咳博德特氏菌(Bordetella parapertussis)和支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)）、包柔氏螺旋体属种(Borreliasp.)（例如回归热螺旋体(Borrelia recurrentis)和伯氏包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)）、布鲁氏杆菌属种(Brucella sp.)（例如流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、犬布鲁氏菌(Brucella canis)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melintensis)和猪流产布鲁氏杆菌(Brucella suis)）、伯克氏菌属种(Burkholderia sp.)（例如类鼻疽伯克氏菌(Burkholderiapseudomallei)和洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)）、弯曲杆菌属种(Campylobacter sp.)（例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)和胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)）、噬碳酸菌属种(Capnocytophagasp.)、人心杆菌(Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肺炎披衣菌(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉披衣菌(Chlamydophila psittaci)、柠檬酸细菌属种(Citrobacter sp.)、伯纳特氏立克次氏体(Coxiella burnetii)、棒状杆菌属种(Corynebacterium sp.)（例如白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒杆菌(Corynebacterium jeikeum)和棒状杆菌(Corynebacterium)）、梭状芽胞杆菌属种(Clostridium sp.)（例如产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfringens)、艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭状芽胞杆菌(Clostridiumtetani)）、啮蚀艾肯氏菌(Eikenella corrodens)、肠杆菌属种(Enterobactersp.)（例如产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、聚团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和大肠杆菌，包括条件性大肠杆菌(opportunistic Escherichia coli)例如趋肠粘膜毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli)、肠侵染性大肠杆菌(enteroinvasive E.coli)、致肠病大肠杆菌(enteropathogenic E.coli)、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli)、肠聚集性大肠杆菌(enteroaggregative E.coli)和尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic E.coli）)、肠道球菌属种(Enterococcus sp.)（例如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌(Enterococcus faecium)）、埃里希体属种(Ehrlichiasp.)（例如恰菲埃里希氏体(Ehrlichia chafeensia)和犬埃里希体(Ehrlichia canis)）、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真细菌属种(Eubacterium sp.)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德菌(Gardnerellavaginalis)、麻疹孪生球菌(Gemella morbillorum)、嗜血杆菌属种(Haemophilus sp.)（例如流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血杆菌(Haemophilusaegyptius)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血性嗜血杆菌(Haemophilus haemolyticus)和副溶血性嗜血杆菌(Haemophilusparahaemolyticus)）、缠绕杆菌属种(Helicobacter sp.)（例如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)和芬纳尔螺杆菌(Helicobacter fennelliae)）、金氏金氏菌（Kingella kingii）、克雷白氏杆菌属种(Klebsiella sp.)（例如肺炎克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、肉芽肿克雷白氏杆菌(Klebsiella granulomatis)和奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)）、乳酸杆菌属种(Lactobacillus sp.)、单核细胞增多性李司忒氏菌(Listeria monocytogenes)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、嗜肺性军团病杆菌(Legionella pneumophila)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、消化链球菌属种(Peptostreptococcus sp.)、粘膜炎莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌属种(Morganella sp.)、动弯杆菌属种(Mobiluncus sp.)、细球菌属种(Micrococcus sp.)、分枝杆菌属种(Mycobacterium sp.)（例如麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)）、支原菌属种(Mycoplasm sp.)（例如肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人支原体(Mycoplasma hominis)和生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)）、诺卡氏菌属种(Nocardia sp.)（例如星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)、盖尔森基兴诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)和巴西诺卡氏菌(Nocardia brasiliensis)）、奈瑟氏菌属种(Neisseria sp.)（例如淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎萘瑟氏菌(Neisseria meningitidis)）、出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella mulocida)、类志贺氏毗邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普雷沃氏菌属种(Prevotella sp.)、卟啉单胞菌属种(Porphyromonas sp.)、产黑素普雷沃氏菌(Prevotella melaninogenica)、变形菌属种(Proteus sp.)（例如普通变形菌(Proteus vulgaris)和奇异变形菌(Proteus mirabilis)）、普罗威登斯菌属种(Providencia sp.)（例如产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)和斯氏普罗威登斯菌(Providencia stuartii)）、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、短小棒状杆菌(Propionibacterium acnes)、马红球菌(Rhodococcus equi)、立克次体种(Rickettsia sp.)（例如立克氏立克次体(Rickettsia rickettsii)、螨立克次体(Rickettsia akari)和普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)、恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)（学名：恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi)）和地方性斑疹伤寒立克次氏体(Rickettsia typhi)）、红球菌属种(Rhodococcus sp.)、粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、沙门氏菌属种(Salmonella sp.)（例如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪霍乱沙门菌(Salmonella cholerasuis)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)）、沙雷氏菌属种(Serratia sp.)（例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens)）、志贺氏菌属种(Shigella sp.)（例如志贺氏痢疾菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、波伊德志贺氏菌(Shigella boydii)和宋内志贺菌(Shigella sonnei)）、葡萄球菌属种(Staphylococcus sp.)（例如金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hemolyticus)、腐生性葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)）、链球菌属种(Streptococcus sp.)（例如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)（例如氯霉素-抗性血清型4肺炎链球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcuspneumoniae)、壮观霉素-抗性血清型6B炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、链霉素-抗性血清型9V肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9VStreptococcus pneumoniae)、红霉素-抗性血清型14肺炎链球菌(erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣-抗性血清型14肺炎链球菌(optochin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、四环素-抗性血清型19F肺炎链球菌(tetracycline-resistant serotype 19FStreptococcus pneumoniae)、青霉素-抗性血清型19F肺炎链球菌(penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)和甲氧苄啶-抗性血清型23F肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23FStreptococcus pneumoniae)、氯霉素-抗性血清型4肺炎链球菌(chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、壮观霉素-抗性血清型6B肺炎链球菌(spectinomycin-resistant serotype 6BStreptococcus pneumoniae)、链霉素-抗性血清型9V肺炎链球菌(streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、奥普托欣-抗性血清型14肺炎链球菌(optochin-resistant serotype 14Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎链球菌(rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、青霉素-抗性血清型19F肺炎链球菌(penicillin-resistant serotype 19FStreptococcus pneumoniae)或甲氧苄啶-抗性血清型23F肺炎链球菌(trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)）、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、A组链球菌属(Group Astreptococci)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、B组链球菌属(Group B streptococci)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、C组链球菌属(Group C streptococci)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、类马链球菌(Streptococcus equismilis)、D组链球菌属(Group Dstreptococci)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、F组链球菌属(Group Fstreptococci)和咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、G组链球菌属(Group G streptococci)）、鼠咬热螺旋体(Spirillum minus)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformi)、密螺旋体属种(Treponema sp.)（例如品他病密螺旋体(Treponema carateum)、细弱密螺旋体(Treponemapetenue)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)和地方性密螺旋体(Treponema endemicum)、惠普尔吸收障碍菌(Tropheryma whippelii)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)、韦荣球菌属种(Veillonella sp.)、弧菌属种(Vibrio sp.)（例如霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、拟态弧菌(Vibrio mimicus)、霍氏弧菌(Vibriohollisae)、河流弧菌(Vibrio fluvialis)、梅氏弧菌(Vibrio metchnikovii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)和弗氏弧菌(Vibrio furnisii)）、耶尔森氏菌属种(Yersinia sp.)（例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)）、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)等中的一种或多种（或其任意组合）。

转化细菌细胞后，可通过若干技术之一鉴定重组宿主细胞。例如，如上所述，伴随所述温度敏感性基因表达的编码标记物的基因或标识基因可用于鉴定重组后代。标识基因的一个具体的非限制性实例是大肠杆菌lacZ基因。表达β-半乳糖苷酶的重组细菌细胞可使用该酶的发色底物来选择。一旦鉴定出重组细菌，可将其选出并扩增以用于本文提供的免疫原性组合物。

制备温度敏感性细菌株的方法

示例性实施方案涉及产生用于刺激对TS细菌的免疫反应的重组TS细菌的方法。在一个方面，示例性TS免疫原性组合物适用于预防传染病的免疫预防或者适用于治疗传染病的免疫疗法。这类TS细菌通过将来自嗜冷细菌的一个或多个TS必需基因导入靶标细菌（例如引起要治疗或预防的疾病的嗜温细菌）而产生。因此，本公开内容提供了基于遗传改变的活细菌微生物的安全免疫原性组合物。这是利用来自嗜冷细菌的必需基因，通过融合所述嗜冷结构基因与“宿主”基因组的转录和翻译控制元件或者通过融合宿主基因与所述嗜冷基因而完成。所述示例性实施方案提供了活的疫苗和免疫原性组合物，所述疫苗和免疫原性组合物可模拟若干适冷病毒疫苗并且不能在正常体温下生长。

根据另一示例性实施方案，其适用于特别是抗原的大规模生产目的，由于TS菌株的非病毒性质，所产生的气雾胶是无害的，因此，本文公开的此方法和组合物可显著降低或消除人的感染危险。

另一方面，本文提供的方法和组合物具有作为研究诊断工具的价值，或者作为研究/教育工具的价值，因为其允许对处于其存活状态的通常高度致病性的微生物进行实验而不对研究人员产生威胁。

本文提供的方法和组合物可用于以TS生物刺激免疫系统，目的是预防或治疗疾病。

大量嗜冷细菌含有TS基因，其可用于产生本公开内容的TS嗜温细菌。例如，可将一个或多个来自嗜冷细菌的TS必需基因导入嗜温细菌（例如至嗜温细菌的染色体中），从而产生TS菌株，所述可用于TS菌株在被给予所述TS菌株的受试者中诱发免疫反应。将核酸导入细菌的重组方法是本领域中常规的。合适的来自嗜冷细菌的TS必需基因可使用本文提供的方法鉴定。如表1和2所示，将21个来自冷红科尔韦尔氏菌（C.psychrerhraea）的嗜冷必需基因中的9个导入新凶手弗朗西斯菌并置换必需宿主基因以产生新凶手弗朗西斯菌的TS株（“组I”）。组I基因产生限制温度为约33-44℃的一系列TS表型。因此，组I的基因可用于产生本公开内容的TS株。表1中的组II由在示例性菌株新凶手弗朗西斯菌中功能很差或完全无功能的冷红科尔韦尔氏菌基因构成。携带与嗜冷必需基因的整合体（integrate）的新凶手弗朗西斯菌株在因sacB和蔗糖的存在所产生的反向选择压力下溶解所述整合体。然而，所述溶解的菌株同时保留有所述嗜冷基因和新凶手弗朗西斯菌同源物的拷贝，并且所述菌株是非TS的（表1中的“组III”）；表明这些嗜冷必需基因不在所述嗜温宿主中起作用。可选择不同嗜冷细菌的相同基因的等位基因以鉴定当被置换到嗜温细菌的染色体中时产生具有相同TS性质的杂合菌株的那些基因。3种不同嗜冷细菌的ligA等位基因在被置换到嗜温新凶手弗朗西斯菌中时产生了3种不同的TS表型。冷红科尔韦尔氏菌的pyrG_Cp等位基因在被置换到嗜温新凶手弗朗西斯菌中时形成TS菌株，但冷海希瓦氏菌（SF）的pyrG_Sf等位基因在被置换到嗜温新凶手弗朗西斯菌中时不形成TS菌株。PH指河豚毒素假交替单胞菌。

表1

表2

为制备TS细菌病原体，将来自北极嗜冷细菌的必需基因置换到嗜温病原细菌的基因组中。北极细菌必需基因ligA_Sf使新凶手弗朗西斯菌不能在33℃或更高的温度下生长。表2显示了在将嗜温必需基因替换为其嗜冷对应物之后加于新凶手弗朗西斯菌的限制温度性质。表2中的任何基因均可被导入病原细菌株以形成活的热敏感性疫苗。示例性病原细菌包括但不限于：分枝杆菌属种、嗜血杆菌属种、弧菌属种、埃希杆菌属种、沙门氏菌属种、链球菌属种、伯克氏菌属种、弯曲杆菌属种、奈瑟氏菌属种和弗朗西斯菌属种。

本公开内容涉及用于开发热敏性免疫原性组合物的来源于嗜冷细菌的基因，以及使用这些组合物刺激受试者中免疫反应的方法。在具体实例中，所述公开内容提供了含有一个或多个热敏性基因（例如ligA、pyrG、hemC、ftsZ、cmk、dnaK和fmt）的重组病原体（例如分枝杆菌属种、嗜血杆菌属种、弧菌属种、埃希杆菌属种、沙门氏菌属种、链球菌属种、伯克氏菌属种、弯曲杆菌属种、奈瑟氏菌属种和弗朗西斯菌属种），所述病原体可被给予受试者以提供对由这些细菌引起的疾病的预防性免疫反应。

本发明提供了制备重组温度敏感性(TS)细菌细胞的方法。在一个实例中，所述方法包括将核酸构建体导入嗜温细菌株的基因组中，所述核酸构建体包括来自嗜冷细菌（例如科尔韦尔氏菌属种、假交替单胞菌属种或希瓦氏菌属种）的TS必需核酸分子（例如编码在约-10℃到约30℃的温度下能行使功能，并且/或者在高于约30℃的温度下不能行使功能的肽的核酸分子）以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列。所述温度敏感性必需多肽使得所述嗜温细菌在低于约30℃的温度下能行使功能并在高于约30℃的温度下不能行使功能。在某些实例中，所述温度敏感性必需核酸分子包括与示于SEQID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的核苷酸序列。在某些实例中，所述方法还包括从所述嗜冷细菌株的基因组中分离所述TS必需核酸分子。所述方法还可包括构建或产生核酸构建体，所述核酸构建体包含所述TS必需核酸分子以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列。

在某些实例中，所述方法还包括：在其中所述温度敏感性必需肽能行使功能的温度下培养所述重组TS细菌宿主细胞，藉此所述重组TS细菌宿主细胞产生多个肽；将培养温度升高至所述温度敏感性肽不能行使功能的温度；维持所述培养一段足够长的时间以杀死所述重组TS细菌宿主细胞；以及收集被杀死的重组TS细菌宿主细胞。

制备重组TS细菌宿主细胞的方法还可以包括下述内容。筛选嗜冷微生物基因组以检测编码在约高于30℃下失活的肽的TS必需多核苷酸；分离所述TS必需多核苷酸；构建包含所述TS必需多核苷酸以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列的核酸构建体；将所述核酸构建体插入所选的嗜温细菌宿主细胞（例如新凶手弗朗西斯菌）的基因组中，从而在功能上替换所述宿主细胞中TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS肽（并且因此所述表达所述肽的细菌）在低于约30℃的温度下能行使功能而在高于约30℃的温度下不能行使功能，并且可模拟原指定宿主细菌的温度敏感性。将所得到的包含所述TS多核苷酸的重组嗜温细菌宿主细胞在低于约30℃的温度下培养或生长以证实所述重组嗜温细菌宿主细胞的生存力；进一步在大于约30℃的温度下培养所述包含所述TS多核苷酸的重组嗜温细菌宿主细胞以确定所述嗜温细菌宿主细胞是否被杀死。如果所述嗜温细菌宿主细胞被杀死，那么将所述核酸构建体导入所选的目的嗜温细菌宿主细胞（例如沙门氏菌属种或分枝杆菌属种）的基因组中，从而在功能上替换所述宿主细胞中温度敏感性必需多核苷酸的同源物，藉此所述温度敏感肽（并且因此所述表达所述肽的细菌）在低于约30℃的温度下能行使功能而在高于约30℃的温度下不能行使功能，并且可模拟原测试宿主细菌的温度敏感性。

在某些实例中，在导入所述来自嗜冷细菌的TS必需核酸分子前，所述嗜温细菌是在选自约10℃到约50℃的温度下能行使功能的细菌。这类嗜温细菌的实例包括发酵细菌或生物治疗（bioremediation）细菌的菌株。其他示例性细菌在上文提供。

在某些实例中，所述TS必需核酸分子在培养所述重组TS细菌的过程中表达肽，例如与示于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的肽。

本文还提供通过这些方法产生的重组TS细菌，以及包括这些细菌的组合物。

温度敏感性细菌株组合物

本发明提供包含本发明提供的重组TS细菌的组合物。在某些实例中，所述组合物包括多于一种重组TS细菌，例如2、3、4或5种不同的重组TS细菌。在某些实例中，所述重组TS细菌含有两个或多个不同的TS必需嗜冷编码序列（例如列于表I的两个或多个组I基因，例如ligA和另一个组I基因）。在具体实例中，所述重组TS细菌是弗朗西斯菌属种、沙门氏菌属种或分枝杆菌属种（其他具体实例在上文提供）。

在某些实例中，这类组合物是免疫原性的，因为其可刺激哺乳动物中的免疫反应。所述组合物可包括其他组分，例如可药用载体（例如盐水）、佐剂、防腐剂及其结合物等。

使用温度敏感性细菌株刺激免疫反应的方法

本文公开的TS重组细菌可用于在受试者中产生免疫反应。在某些实例中，所述受试者被细菌感染，或有被细菌感染的风险（例如医护工作者），所述细菌例如结核分枝杆菌。因此，在若干实施方案中，所述方法包括给予受试者治疗有效量的本文公开的一种或多种TS重组细菌以产生免疫反应，例如但不限于保护性免疫反应。例如，可使用两种或多种不同的TS重组细菌（例如表达不同的来自嗜冷细菌的TS必需肽的那些重组细菌）来在受试者中产生免疫反应。在某些实例中，用于在受试者中产生免疫反应的重组细菌表达两个或多个不同的来自嗜冷细菌的温度敏感性必需肽，或者来自两种或多种不同嗜冷细菌的相同的温度敏感性必需肽。

被给予的TS重组细菌是基于要预防或治疗的细菌感染选择的。例如，如果受试者中要预防或治疗的细菌感染是结核病，那么所述TS重组细菌是表达至少一个来自嗜冷细菌的TS必需肽的结核分枝杆菌。在另一实例中，如果受试者中要预防或治疗的细菌感染是土拉热病(tularemia)，那么所述TS重组细菌是表达至少一个来自嗜冷细菌的TS必需肽的土拉弗朗西斯菌。

在示例性应用中，给予受试者其量足以产生针对TS重组细菌的免疫反应的组合物。这些TS重组细菌可用于预防细菌（例如结核分枝杆菌）感染，用于预防具有潜伏性细菌感染的受试者中疾病的发展，或者用于治疗由细菌感染导致的疾病（例如结核病）。在若干实例中，给予治疗有效量的包含本文公开的TS重组细菌的组合物可诱发足够的免疫反应以减轻因细菌感染引起的疾病症状，以预防与所述感染有关的疾病的一种或多种症状的发展，或者预防所述细菌的感染。

在某些实例中，所述组合物可用于预防将来的细菌感染。因此，将治疗有效量的所述组合物给予具有被细菌（例如结核分枝杆菌）感染的风险的受试者。例如，所公开的组合物可用于预防结核病的发展，例如在随后接触结核分枝杆菌时受试者体内潜伏性或活动性结核病。在一个实例中，将所述组合物给予具有潜伏性结核分枝杆菌感染的受试者，预防结核病症状的发展。因此，所述组合物可用于治疗具有潜伏性结核病的受试者，从而使所述受试者不形成活动性结核病。

对这些用途有效的量取决于所述疾病的严重度、患者健康的总体情况以及患者免疫系统的强壮程度。在一个实例中，所述化合物的治疗有效量是产生主观的症状减轻或者客观的可识别的改善（由临床医师或其他有资质的观察者观察）的量。在其他实例中，治疗有效量是足以在受试者随后接触所述细菌时预防所述受试者被所述细菌感染的量。在其他实例中，治疗有效量是足以预防被细菌感染的受试者中症状发展的量。

所述含有TS重组细菌的组合物可局部地或系统地通过本领域技术人员已知的任何手段给予，例如通过肌内注射、皮下注射、腹膜内注射、静脉注射、口服、经鼻给予、经皮给予或甚至经肛门给予。在一个实施方案中，通过口服、皮下注射或肌内注射给予。为延长TS重组细菌可用于刺激反应的时间，可以以植入物、油注射剂形式或颗粒系统的形式提供所述TS重组细菌。所述颗粒系统可为微粒、微胶囊、微球、纳米胶囊或类似的颗粒。基于合成聚合物的具体载体已被证明，除了提供受控释放以外，还可作为增强免疫反应的佐剂起作用。铝盐也可用作产生免疫反应的佐剂。

在一个具体的非限制性实例中，所述TS重组细菌以以下方式给予：使所述免疫反应指向细胞反应（即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应）而不是体液（抗体）反应。

任选地，可使用一种或多种细胞因子，例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ；一种或多种生子因子，例如GM-CSF或G-CSF；一种或多种共刺激分子，例如ICAM-1、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2或其他B7相关分子；一种或多种诸如OX-40L或41BBL的分子;或这些分子的结合物作为生物佐剂（参见例如Salgalleret al.,1998,J.Surg.Oncol.68(2):122-38;Lotze et al.,2000,Cancer JSci.Am.6(Suppl 1):S61-6；Cao et al.,1998,Stem Cells 16(Suppl1):251-60;Kuiper et al.,2000,Adv.Exp.Med.Biol.465:381-90）。这些分子可系统地（或局部地）给予所述受试者。在某些实例中，给予IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、B7-1B7-2、OX-40L、41BBL和ICAM-1。在多个实施方案中，可将编码所述生物佐剂的核酸克隆到与嗜冷TS必需肽编码序列相同的载体中，或者可将所述核酸克隆到一个或多个单独的载体中以共给予至所述细菌中。

因此，本文提供了包含TS重组细菌的药物组合物。这些组合物可用于促进对具体细菌的免疫反应。在一个实施方案中，将TS重组细菌与含有稳定洗涤剂、成胶束剂和油中两种或多种的佐剂混合。合适的稳定洗涤剂、成胶束剂和油详细记载于美国专利5,585,103；美国专利5,709,860；美国专利5,270,202以及美国专利5,695,770中，这些专利以引用的方式纳入本文。稳定洗涤剂是使得乳液的组分仍然为稳定的乳液的任何洗涤剂。所述洗涤剂包括聚山梨醇酯，80(TWEEN)（脱水山梨糖醇-单-9-十八碳烯酸-聚（氧-1,2-乙二醇）；由ICI Americas,Wilmington,DE生产）、TWEEN 40^TM、TWEEN 20^TM、TWEEN 60^TM、ZWITTERGENT^TM3-12、TEEPOL HB7^TM和SPAN 85^TM。这些洗涤剂通常以约0.05-0.5%（例如约0.2%）的量提供。胶束形成剂是能够稳定与其他组分形成的乳液从而形成胶束样结构的试剂。这类试剂通常在注射位置引起一定刺激以募集巨噬细胞以增强所述细胞反应。这类试剂的实例包括BASF Wyandotte出版物（例如Schmolka,J.Am.Oil.Chem.Soc.54:110,1977和Hunter et al.,J.Immunol 129:1244,1981）中所描述的聚合物表面活性剂PLURONIC^TM L62LF、L101和L64，PEG1000，以及TETRONIC^TM1501、150R1、701、901、1301和130R1。这类试剂的化学结构为本领域中公知的。在一个实施方案中，选择所述试剂以使亲水亲油平衡值(HLB)在0-2之间，如Hunter and Bennett,J.Immun.133:3167,1984所定义的。可以以有效量提供所述试剂，例如以0.5-10%或以1.25-5%的量。

在一个实例中，所述组合物包含油。这类油的实例包括角鲨烯、角鲨烷、EICOSANE^TM、四十四烷、甘油以及花生油或其他植物油。在一个具体非限制性实例中，所述油以1-10%或2.5-5%的量提供。所述油应既是生物可降解的又是生物相容的，从而使得身体可随时间分解所述油，并且使得使用所述油时没有明显的不利作用，例如肉芽肿。

在一个实施方案中，所述组合物中的佐剂是稳定洗涤剂、胶束形成剂和以商标名PROVAX的市售的油(IDEC Pharmaceuticals,SanDiego,CA)的混合物。佐剂也可为免疫刺激的核酸（例如包含CpG基序的核酸）或者为生物佐剂（见上文）。

受控释放的肠胃外制剂可制成植入体、油注射剂或者制成颗粒系统。对于蛋白递送系统的综述，参见Banga,Therapeutic Peptides andProteins:Formulation,Processing，and Delivery Systems,TechnomicPublishing Company,Inc.,Lancaster,PA,1995。颗粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有治疗蛋白作为核心。在微球中，所述治疗剂分布于整个颗粒。小于约1μm的颗粒、微球和微胶囊通常分别称作纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管的直径为约5μm从而使得只有纳米颗粒可以静脉途径给予。微粒的直径通常为约100μm并以皮下途径或肌内途径给予（参见Kreuter,Colloidal Drug Delivery Systems,J.Kreuter,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.219-342,1994;Tice & Tabibi,Treatise onControlled Drug Delivery,A.Kydonieus,ed.,Marcel Dekker,Inc.NewYork,NY,pp.315-339,1992）。

在具体实例中，每剂至少给予10²CFU的本文公开的TS细菌，例如至少10³CFU、至少10⁴CFU、至少10⁵CFU、至少10⁶CFU、至少10⁷CFU、至少10⁸CFU，例如10²-10⁸CFU或10⁴-10⁸CFU。在具体实例中，所述剂量以真皮内途径或鼻内途径给予。

所述组合物的单或多次给药取决于所述受试者所需要和耐受的剂量和频率。在一个实施方案中，所述剂量以推注的形式一次给药，但在另一实施方案中，可定期施用直至达到治疗结果。在一个实施方案中，所述剂量足以治疗或改善细菌感染的症状或体征而不对受试者产生不可接受的毒性。在另一实施方案中，所述剂量足以在随后接触细菌（例如结核分枝杆菌）时预防所述细菌的感染。在又一实施方案中，所述剂量足以预防具有潜伏性细菌感染的受试者中的细菌感染的症状（例如结核病）。可使用系统或局部给药。

因此，本公开内容提供了用于在受试者中产生对细菌的免疫反应的方法。所述方法可包括给予所述受试者治疗有效量的TS细菌，其中所述温度敏感性细菌表达本文提供的嗜冷TS必需蛋白或核酸分子（例如载体中的核酸编码序列），从而引起对所述细菌的免疫反应。所述方法还可包括给予其他试剂，例如佐剂或抗微生物剂（例如抗生素）。在某些实例中，所述免疫反应是保护性免疫反应。所述受试者可患有细菌感染，处于受到细菌感染的风险中，或者具有潜伏性细菌感染。示例性细菌感染包括结核分枝杆菌、沙门氏菌或弗朗西斯菌的感染。

以细菌抗原刺激后测量免疫反应（例如细胞因子反应）的方法是本领域中已知的。在某些实例中，所述方法还包括在给予本文提供的治疗组合物后测量免疫反应。在一个实例中，细胞因子反应在给予本文提供的组合物后增加，例如相对不给予所述组合物时增加。在一个实例中，在给予所述组合物后，相对不给予所述组合物的细胞因子反应，细胞因子产生增加至少20%，例如至少40%、至少50%、至少75%、至少90%或至少95%。

本公开内容通过以下非限制性实施例来举例说明。

实施例1

此实施例涉及制备连接于嗜温宿主的侧翼DNA的重组嗜冷基因的示例性方法。

图1a图示了用于将冷红科尔韦尔氏菌必需基因(C2)整合到wt新凶手弗朗西斯菌基因组中的融合PCR（也称为“延伸重叠PCR叠、“重叠PCR叠或“剪接重叠PCR叠）方案。所述冷红科尔韦尔氏菌基因借助重叠PCR被改造为含有周围的新凶手弗朗西斯菌基因（F1和F3）的核糖体结合位点(RBS)以及起始3个密码子和终止密码子，以促进新凶手弗朗西斯菌以正常水平翻译C2基因。将所述融合PCR产物连接于红霉素抗性sacB盒(Em^R-sacB)，然后将其转化到新凶手弗朗西斯菌中。使含有所述融合PCR产物的Em^R菌落在蔗糖存在的情况下生长，并针对Em^R的丢失、新凶手弗朗西斯菌必需基因(F2)的丢失以及C2的存在进行筛选。

图1b图示了通过单交换事件将所述嗜冷基因融合构建体导入到靶标生物的染色体中。此外，其还图示了可使用可反向选择的sacB标记物来增加切除。对于不是多顺反子操纵子的一部分的基因，使上游病原基因组区域与所述嗜冷结构基因从第4密码子至终止密码子融合。当将嗜冷等位基因置换到操纵子的中部时使用了类似的方法。然而，如本领域技术人员可理解的，根据所述操纵子的性质，如果在所述宿主同源物C末端的某些密码子对下游顺反子的翻译很重要，那么就保留这些密码子。

实施例2

此实施例涉及将所述嗜冷等位基因插入所述嗜温细菌中的示例性方法。

图2a图示了嗜冷ligA基因的置换区域，对应于SEQ ID NO:1。此外，其还图示了其向wt新凶手弗朗西斯菌染色体中的整合。图2b-e分别图示了冷红科尔韦尔氏菌、冷海希瓦氏菌、河豚毒素假交替单胞菌1和河豚毒素假交替单胞菌2的嗜冷ligA基因的整合位点。新凶手弗朗西斯菌的前3个密码子被保留以使ligA表达水平的潜力最大化。图2a-e图示了在大多数情况下，所述整合和切除事件导致所述嗜冷基因对所述嗜温宿主同源物的简单置换。然而，所述整合和切除事件也可导致如图1b所示的杂合基因的形成。

实施例3

此实施例涉及确定所述细菌株各自的最大生长温度及显示其在限制温度下的生长特性的示例性方法。

在置于高度稳定（+1℃）的培养箱中的琼脂平板上测试每个细菌株；所述限制温度定义为不允许在琼脂划线平板上形成分离菌落的最低温度。含有嗜冷ligA置换的新凶手弗朗西斯菌的4个不同转基因菌株在不同温度下的生长特性以及wt新凶手弗朗西斯菌的生长特性示于图3-6。嗜冷ligA基因为ligA_Cp、ligA_Sf、ligA_Ph和ligA_Ph2，分为由SEQID NO:1、7、3和5示出。在图3-6的第一个图中，显示了在容许温度即低于所述限制温度的温度下的生长。在后续的图中，示出了转基因菌株和wt菌株两者在转换至限制温度或更高温度之前和之后的生长。

新凶手弗朗西斯菌转基因菌株和wt菌株两者的延伸生长曲线在图3-6的选定图中以插图的形式显示。这些曲线是通过以下方式获得：进行完全生长培养、将其稀释并监测其在新鲜培养基中的生长。更具体地，使wt和TS转基因新凶手弗朗西斯菌培养物在限制温度下生长直至其到达静止期，然后将其稀释并再培养以再次在限制温度下生长。附加的生长曲线表明转基因菌株表现的生长停止是真实现象，不同于对温度转变的暂时调整。

实施例4

这涉及用于确定突变的频率的示例性方法，所述突变允许细菌在高于TS新凶手弗朗西斯菌转基因菌株的限制温度的温度下生长。

使培养物在容许生长温度下生长至对数后期，而后将其以10⁹0将其以⁵细胞/平板的系列稀释到琼脂上并在高于所述限制温度约3℃的温度下培养，以及在低于所述限制温度约3℃的温度下培养。由此稀释系列计算出允许在更高温度下生长的突变率，表2举例说明了新凶手弗朗西斯菌中突变成温度抗性的频率。明显地，某些嗜冷基因不能突变成在高于其限制温度的温度下发挥功能的形式。本领域技术人员可推测，适应冷气候所需的几百万年使得某些嗜冷必需基因产物不能通过简单的改变即可允许其在对其嗜温对应物常见的温度下发挥功能。这些包括ligACp、ligA_Ph、hemC_Cp、dnaK_Cp、fmt_Cp和dnaK_Sf。

实施例5

此实施例涉及确定所述重组TS细菌株在所述限制温度下的生存力持续时间的示例性方法。

使最大生长温度为约33℃的TS转基因菌株的示例性培养物在约30℃下生长，并且将所述培养物的一个样本在约37℃下培养以模拟人体体核组织的一般温度。在0-24小时之间的不同时间点采样，并将各个样品重新稀释，铺板于生长培养基上，然后在约30℃下培养以确定高于所述限制温度时的死亡率。作为对照，以wt细菌进行相同的实验。

确定了含有所述嗜冷必需基因的土拉弗朗西斯菌株在其巨噬细胞中的存活率（persistence）。将转基因菌株在约30转基下培养，并且用于使用本领域技术人员已知的标准方法在约37℃下在24孔组织培养板中感染巨噬细胞。在监测所感染的巨噬细胞几天后，将一部分细胞裂解，并将所述细菌铺板到琼脂培养基上并在约30所述下培养。在这些实验中得到的数据表明了在限制温度下巨噬细胞感染过程中转基因菌株的寿命，并帮助预测感染过程中TS菌株的存活率。

此实施例可被外推以提供对在哺乳动物中可能发生的情况的体外关联。TS转基因菌株会在身体的温度较低部分（例如皮肤）中生长。所述菌株在此温度较低位点处及附近的复制会不断地使所述TS转基因菌株后代移动到引流淋巴结中。根据所述淋巴结的位置和所述TS转基因菌株的限制温度，TS后代会在几个小时内死亡。TS转基因菌株以其活的和死的状态存在均会刺激免疫反应。

实施例6

此实施例涉及确定来自嗜冷细菌的TS必需基因对嗜温细菌赋予其TS表型能力的示例性方法。具体地，其提供将编码TS产物的嗜冷必需基因转移至多种细菌中，以及所述嗜冷必需基因在嗜温生物之间转移的方法。

将几种嗜冷必需基因置换到嗜温细菌新凶手弗朗西斯菌的基因组中。可使用多种方法将嗜冷必需基因插入到给定细菌中代替其嗜温同源物。此外，可理解人们可将给定的嗜冷必需基因置换到许多不同的细菌中。以下三种方法举例说明了将ligA_Cp置换到三种不同细菌中的多种方式。基因置换的常规方法示于图1b，包括通过PCR将外来基因整合到细菌中与其宿主同源基因接近的位置。整合后，可使用反向选择标记（例如sacB）来帮助鉴定所述整合与切除事件的结果。具体地，此方法用于将新凶手弗朗西斯菌ligA基因置换为嗜冷ligA_Cp基因。

一种可选方法用于替换肠道沙门氏菌ligA。所用的肠道沙门氏菌菌株在ligA的染色体拷贝中具有噬菌体Mu插入(Park et al.,1989.J.Bacteriol.171:2173-80)。氨苄青霉素抗性质粒pBR313上含有噬菌体T4DNA连接酶的wt拷贝。将所述ligA_Cp基因导入相容的氯霉素抗性质粒pSUP2716上，并将所述重组的肠道沙门氏菌菌株在不存在氨苄青霉素和存在氯霉素的条件下培养。这些生长条件使得pBR313:T4DNA连接酶重组质粒丢失。已经丢失了编码T4DNA连接酶的质粒——这使其对氨苄青霉素敏感——的肠道沙门氏菌菌株倚赖ligA_Cp才能存活并且是TS的。

当将嗜冷必需基因导入革兰氏阳性细菌中时可采用另一可选方法。本文描述的将ligA_Cp插入耻垢分枝杆菌的方法举例说明了此方法。将以优化密码子设计的ligA_Cp类型(SEQ ID NO:17和18)克隆到分枝杆菌质粒pSM1中；这是一个预防步骤，因为与耻垢分枝杆菌和结核分枝杆菌ligA基因的G+C含量相比，ligA_Cp基因的G+C含量较低。将重组pSMT3:ligA_Cp电穿孔到耻垢分枝杆菌中。随后缺失一大段耻垢分枝杆菌ligA基因，形成依赖ligA_Cp才能存活的菌株。此菌株在约34℃下是TS的。此温度反映了编码ligA_Cp的新凶手弗朗西斯菌转基因菌株的TS性质。

此实例说明了当使用所述嗜冷必需基因构建另一嗜温细菌的转基因菌株时，含有所述嗜冷必需基因的嗜温测试菌株用于预测TS表型的用途。在此实施例中，测试菌株是新凶手弗朗西斯菌。ligA_Cp对新凶手弗朗西斯菌ligA同源物的置换表明ligA_Cp在嗜温细菌中具有功能并赋予限制温度为约34℃的TS表型。含有ligA_Cp的新凶手弗朗西斯菌转基因菌株的表型预测了ligA_Cp基因向其他嗜温细菌（目的宿主）中的置换会获得限制温度为约34℃的可生存细菌。含有ligA_Cp的沙门氏菌和分枝杆菌转基因菌株的表型显示出TS嗜冷必需基因的属间转移可获得在测试菌株中所见的表型。

实施例7

此实施例描述了组合嗜冷基因或其片段（如SEQ ID NO:1或其片段所示）或突变必需嗜冷基因以制备具有所需TS特性的基因产物的示例性方法。

将新凶手弗朗西斯菌pyrG基因5’端的约30%与冷红科尔韦尔氏菌pyrG基因(pyrG_Cp)3’端的约2/3在密码子157-159区域组合，形成了在37℃下是TS的重组基因。新凶手弗朗西斯菌和冷红科尔韦尔氏菌pyrG基因在密码子157-159处是相同的。此外，ligA_Ph中氨基酸残基149处从天冬酰胺(从天冬酰残基到赖氨酸(基到赖氨残基的单点突变将限制温度从37点突改变为28为突。

可通过使用体外或体内重组技术来组合相同基因的两个或多个同源物，此方法可适用于不同嗜冷基因。

实施例8

此实施例涉及确定转基因菌株从哺乳动物中感染位置的分布的示例性方法。

使用了含有嗜冷转基因的新凶手弗朗西斯菌（又名土拉弗朗西斯菌新杀手亚种）。本领域技术人员会理解类似的方法可用于产生和检测土拉弗朗西斯菌的TS菌株。新凶手弗朗西斯菌在小鼠内具有高毒性。土拉弗朗西斯菌对小鼠的感染被用作土拉弗朗西斯菌对更大哺乳动物的感染的模型。土拉弗朗西斯菌的大多数菌株在大多数哺乳动物中具有高毒性。

新凶手弗朗西斯菌转基因菌株从感染位置的分布是通过以下方式进行评估：经皮肤注射或者经鼻引入所述重组菌株，然后在接种后约3-10天测量内部器官（例如肺、肝和脾）中存活的新凶手弗朗西斯菌细胞的量。已发现TS新凶手弗朗西斯菌转基因菌株未从接种位置明显扩散。观察到了所述嗜冷必需基因的失活温度与在整个系统中的分布水平之间的直接关联；Lewis大鼠中TS新凶手弗朗西斯菌株的散播列于表3。

表3

作为另一实例，将所述嗜冷必需基因之一(ligA_Cp)置换到结核分枝杆菌的基因组中以制备转基因菌株。某些嗜冷必需基因来源于具有低G+C含量的DNA的细菌。因此，对结核分枝杆菌的密码子优化所述基因，然后再将所述嗜冷基因插入所述病原细菌中（SEQ ID NO:17和18提供了优化的序列）。密码子优化是本领域技术人员公知的，并可使用免费可得的生物信息学工具完成。通过实施例1和2详细描述的方法将所述密码子优化的嗜冷必需基因插入到结核分枝杆菌中。如同耻垢分枝杆菌一样，结核分枝杆菌是革兰氏阳性细菌。

另一示例性方法涉及评估在革兰氏阴性病原菌株中的分布的方法。将嗜冷必需基因导入到肠道沙门氏菌中。当将ligA_Cp嗜冷必需基因导入肠道沙门氏菌中后，得到不能在37℃下生长的转基因菌株，如图8所示。此外，此菌株不能从感染小鼠的接种位点处扩散，这可通过所述菌株不能迁移到肺、肝或脾来证明。

实施例9

此实施例涉及确定通过以TS转基因细菌株接种哺乳动物产生的保护性免疫反应水平的示例性方法。接种方法为本领域中所知，可包括静脉、肌内、皮下或腹膜内注射，以及吸入、口服和经皮途径递送。本领域技术人员会理解，与此实施例描述的那些方法类似的方法可用于测试包含一个或多个嗜冷必需核酸序列的任何转基因TS细菌株。

以TS新凶手弗朗西斯菌株(Fn-ligA_Ph、Fn-ligA_Cp或Fn-dnaK_Cp)接种小鼠导致了小鼠免疫系统的细胞被刺激（这通过细菌器官负荷降低而测量），获得免于受wt新凶手弗朗西斯菌株感染的保护作用（图10a-d）。先以所述TS转基因菌株接种小鼠，并在3周后以wt新凶手弗朗西斯菌株的接种物激发。这导致与未以重组新凶手弗朗西斯菌株接种的小鼠相比，在被wt菌株感染的小鼠的肝和脾中的生长降低。此外，在接种的小鼠组中还观察到了发病率和致死率的下降，说明实现了免疫保护。

类似地，与未免疫接种的小鼠相比，以结核分枝杆菌和肠道沙门氏菌转基因菌株(ligAPh)免疫接种的小鼠被表明具有更强的对wt病原体感染的抗性。

实施例10

此实施例涉及发现新嗜冷必需基因的示例性方法。

嗜冷细菌可从冷环境（例如靠近地球极地的海水）中分离。鉴定必需基因可通过以下方法进行：使用简并PCR或其他常规技术来找出高度保守的基因例如细菌必需基因。一旦鉴定出这些基因，即可使用本文提供的或本领域已知的方法将其置换到嗜温细菌的基因组中，替换所述基因的宿主同源物。然后，可如本文所述测试所获得的菌株的温度敏感性。

实施例11

此实施例涉及在药物发现研究中使用TS转基因菌株的示例性方法。尽管以TS土拉弗朗西斯菌株为例说明，然而本领域技术人员会理解，类似的方法也可用于使用本文提供的方法产生的其他TS菌株。

使用在高于约37℃的温度下不能行使功能的土拉弗朗西斯菌的转基因菌株(ligA_Ph)来感染在34℃下在微量滴定板中生长的巨噬细胞细胞系。将抗微生物药物候选物的文库引入含有所述被感染的巨噬细胞的各孔中，并且通过以下方法测量所述药物候选物杀死土拉弗朗西斯菌的效果：在不同时间点裂解所述巨噬细胞，并通过铺板于琼脂平板上确定存活的TS转基因土拉弗朗西斯菌的数量。wt土拉弗朗西斯菌传染性极强并引起致死的疾病。使用所述TS转基因土拉弗朗西斯菌使得人们可使用较不严格的生物防护条件，因为所述菌株不能在人体内导致疾病。

实施例12

此实施例涉及制备和使用含有来自嗜冷细菌的温度敏感性必需核酸分子的分枝杆菌的TS菌株来开发免疫原性组合物的示例性方法，所述组合物例如可用于刺激哺乳动物的免疫反应，以保护或治疗所述哺乳动物中的结核分枝杆菌感染。

使用整合/切除方法将ligA_Ph和pryG_Cp基因分别导入结核分枝杆菌H37Rv中。使用可反向选择的标记物sacB以增强可检测的切除事件的产生。通过在尾根部皮下引入10000个细菌来接种C57BL/6小鼠。同时处理以PBS注射的阴性对照小鼠和以BCG菌株注射的阳性对照小鼠。使所述小鼠休息30天。此时期后，将所有上述小鼠接触会将150个细菌沉积在肺中的结核分枝杆菌H37Rv气雾剂。在接触结核分枝杆菌H37Rv后第0、4、8、16和32周时，无痛杀死小鼠并确定肺和脾中结核分枝杆菌H37Rv的数量。如果所述转基因TS结核分枝杆菌成功诱发保护性免疫反应，那么所述小鼠器官中的细菌数量会少于阴性对照中的细菌数量。后续实验将在荷兰猪结核病模型中进行。

鉴于存在可适用本发明原理的多种可能实施方案，应理解，举例说明的实施方案只是本发明的实例，而不应理解为是对本发明范围的限制。相反，本发明的范围由下面的权利要求书所界定。因此，本发明人要求保护所有落入这些权利要求的范围和精神内的本发明。

Claims

1.一种来自嗜冷细菌的分离的温度敏感性必需核酸分子，所述核酸分子包含与示于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。

2.权利要求1的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷细菌在约-10℃到约30℃的温度下能行使功能。

3.权利要求1的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷细菌在高于约30℃的温度下不能行使功能。

4.权利要求1的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述核酸分子包含示于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中的核苷酸序列。

5.权利要求1的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述嗜冷细菌为科尔韦尔氏菌属种(Colwellia sp.)、假交替单胞菌属种(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)。

6.权利要求1的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中由所述必需核酸分子编码的蛋白在高于约30℃的温度下不能行使功能。

7.权利要求6的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中由所述必需核酸分子编码的蛋白在选自约4℃到约30℃的温度下能行使功能。

8.一种核酸构建体，包含权利要求1-7中任一项的分离的温度敏感性必需核酸分子，其中所述必需核酸分子与一个或多个控制序列可操作地连接。

9.一种载体，包含权利要求1-8中任一项的分离的核酸分子。

10.权利要求9的载体，其中所述载体包含至少两种选自SEQ IDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中的核酸序列。

11.一种重组宿主细胞，包含权利要求1-8中任一项的核酸构建体或权利要求9或10的载体。

12.权利要求11的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为嗜温细菌。

13.权利要求12的重组宿主细胞，其中所述嗜温细菌在约10℃到约50℃的温度下能行使功能。

14.权利要求11-13中任一项的重组宿主细胞，其中所述嗜温细菌在高于约30℃的温度下失活。

15.一种分离的蛋白，由权利要求1-8中任一项的分离的温度敏感性必需核酸分子编码。

16.权利要求15的分离的蛋白，其中所述蛋白包含与示于SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的氨基酸序列。

17.权利要求15的分离的蛋白，其中所述蛋白包含示于SEQ IDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列。

18.一种免疫原性组合物，包含权利要求11-14中任一项的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞大约在由所述温度敏感性核酸分子编码的蛋白不能行使功能的温度下被杀死。

19.权利要求18的免疫原性组合物，其中由所述温度敏感性必需核酸分子编码的蛋白在高于约30℃的温度下失活。

20.权利要求18或19的免疫原性组合物，其中所述重组宿主细胞是弗朗西斯菌属种(Francisella sp.)、沙门氏菌属种(Salmonella sp.)或分枝杆菌属种(Mycobacterium sp.)。

21.一种制备重组的温度敏感性(TS)细菌的方法，包括：

将核酸构建体导入嗜温细菌的基因组中以制备重组TS细菌，所述核酸构建体包含来自嗜冷细菌的TS必需核酸分子以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列，其中由所述TS必需多核苷酸编码的蛋白在低于约30℃的温度下能行使功能，并且在高于约30℃的温度下不能行使功能。

22.权利要求21的方法，还包括从所述嗜冷细菌的基因组中分离所述TS必需核酸分子。

23.权利要求21或22的方法，还包括构建包含所述TS必需核酸分子以及与所述TS必需核酸分子可操作地连接的一个或多个控制序列的核酸构建体。

24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述嗜冷细菌在约-10℃到约30℃的温度下能行使功能。

25.权利要求21-24中任一项的方法，其中所述嗜冷细菌在高于约30℃的温度下不能行使功能。

26.权利要求21-25中任一项的方法，其中所述嗜冷细菌为科尔韦尔氏菌属种(Colwellia sp.)、假交替单胞菌属种(Psuedoalteromonas sp.)或希瓦氏菌属种(Shewanella sp.)。

27.权利要求21-26中任一项的方法，其中所述嗜温细菌在选自约10℃到约50℃的温度下能行使功能。

28.权利要求21-27中任一项的方法，其中所述嗜温细菌是发酵微生物菌株或生物治疗菌株。

29.权利要求21-28中任一项的方法，其中所述TS必需核酸分子包含与示于SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25或27中的核苷酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的核苷酸序列。

30.权利要求21-29中任一项的方法，其中在培养所述TS微生物宿主细胞的过程中所述TS必需核酸分子表达肽。

31.权利要求30的方法，其中所述肽包含与示于SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28中的氨基酸序列具有至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性的氨基酸序列。

32.权利要求21-31中任一项的方法，还包括：

在由所述TS多核苷酸编码的蛋白能行使功能的温度下培养所述重组TS细菌，藉此所述重组TS细菌产生多种肽；

将所述培养温度增加至由所述TS核酸分子编码的蛋白不能行使功能的温度；

将所述培养维持一段足以杀死所述重组TS细菌的时间；并且

收集被杀死的重组TS细菌。

33.一种制备包含必需肽的重组TS细菌的方法，包括：

筛选嗜冷微生物基因组以检测其中的编码在高于约30℃的温度下失活的蛋白的TS必需多核苷酸；

分离所述TS必需多核苷酸；

构建核酸构建体，所述核酸构建体包含所述TS必需多核苷酸以及与所述TS多核苷酸可操作地连接的一个或多个控制序列；

将所述核酸构建体插入到所选择的嗜温细菌宿主细胞的基因组中，从而在功能上置换在所述宿主细胞中所述TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS多核苷酸编码蛋白，所述蛋白在低于约30℃的温度下能行使功能并在高于约30℃的温度下不能行使功能并且可模拟原指定宿主细菌的温度敏感性；

在低于约30℃的温度下培养包含所述TS多核苷酸的嗜温细菌宿主细胞，以确认所述嗜温细菌宿主细胞的生存力；

在高于约30℃的温度下再培养包含所述TS多核苷酸的嗜温细菌宿主细胞，以确定所述嗜温细菌宿主细胞是否被杀死；以及

如果所述嗜温细菌宿主细胞被杀死，那么将所述核酸构建体插入到所选择的目的嗜温细菌宿主细胞的基因组中，从而在功能上置换所述宿主细胞中所述TS必需多核苷酸的同源物，藉此所述TS多核苷酸编码在低于约30℃的温度下能行使功能并且在高于约30℃的温度下不能行使功能并且可模拟原测试宿主细菌的温度敏感性的蛋白，从而产生重组TS细菌。

34.权利要求33的方法，其中所述嗜温细菌宿主细胞为新凶手弗朗西斯菌（Francisella novicida）细胞。

35.权利要求33或34的方法，其中所述目的嗜温细菌宿主细胞为沙门氏菌属种或结核杆菌属种（Mycobacterium sp.）。

36.一种组合物，包含由权利要求21-35中任一项的方法制备的温度敏感性细菌宿主细胞。

37.权利要求36的组合物，其中所述组合物是免疫原性组合物或治疗性组合物。

38.权利要求36或37的组合物用于在哺乳动物中激发免疫反应的用途。

39.一种用于在受试者体内产生对细菌的免疫反应的方法，包括：

给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌表达权利要求14-17中任一项的分离的蛋白，藉此诱发对所述细菌的免疫反应。

40.一种用于在受试者体内产生对细菌的免疫反应的方法，包括：

给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌包含权利要求1-8中任一项的分离的核酸或者权利要求9-10任一项的载体，从而诱发对所述细菌的免疫反应。

41.一种用于在受试者体内产生对细菌的免疫反应的方法，包括：

给予所述受试者治疗有效量的温度敏感性细菌，其中所述温度敏感性细菌包含权利要求11-14中任一项的重组宿主细胞，从而诱发对所述细菌的免疫反应。

42.权利要求39-41中任一项的方法，还包括给予治疗有效量的佐剂。

43.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述免疫反应是保护性免疫反应。

44.权利要求39-41中任一项的方法，其中所述受试者患有细菌感染。

45.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述受试者处于受到细菌感染的风险中。

46.权利要求39-42中任一项的方法，其中所述受试者患有潜伏性细菌感染。

47.权利要求44-46中任一项的方法，其中所述细菌感染为结核分枝杆菌、沙门氏菌或弗朗西斯菌感染。