CN111925426A

CN111925426A - 一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用

Info

Publication number: CN111925426A
Application number: CN202010907968.8A
Authority: CN
Inventors: 贺笋; 王钢; 唐慧芬; 刘强德; 何海; 霍新亮; 孙彦军; 任立松
Original assignee: Tecon Biological Co ltd
Current assignee: Tiankang Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2020-11-13
Anticipated expiration: 2040-09-02
Also published as: CN111925426B

Abstract

本发明公开了一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用，提供了一种产气荚膜梭菌α毒素突变体，与野生型产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列相比，所述的产气荚膜梭菌α毒素突变体第56位天冬氨酸突变为丙氨酸，共370个氨基酸残基，所述野生型产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，将该突变后的核酸序列整合到质粒载体上形成表达载体，而后将表达载体转化进革兰氏阳性菌中，得到革兰氏阳性菌表达系统。该突变体D56A保留了野生型产气荚膜梭菌α毒素的免疫原性，同时其与细胞受体的结合能力下降，大大降低了其在细胞水平和动物体内的毒性。

Description

一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物疫苗技术领域，具体而言，涉及一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用。

背景技术

产气荚膜梭菌种类众多，均能够产生α毒素，且α毒素是产气荚膜梭菌主要的毒力因子，是产气荚膜梭菌的主要免疫原，能够引起机体的免疫反应。因此，α毒素是制备产气荚膜梭菌感染疫苗过程中应用的主要抗原。同时，由于在众多产气荚膜梭菌中，A型产气荚膜梭菌分泌α毒素最多，因此，选用A型产气荚膜梭菌对α毒素的研究最多。

目前α毒素疫苗有两种制备方法，分别是传统菌苗和基因工程亚单位菌苗。其中传统菌苗具体的为，将A型产气荚膜梭菌于厌气肉肝汤中培养24h后的培养液，提取并测定α毒素毒力后，加入甲醛灭活，再按照一定比例的配比与氢氧化铝佐剂混合制成。由于厌氧肝汤培养基成分复杂，难以进行质量控制，使得批间差异巨大，杂蛋白众多；在毒素定量过程中，无法进行除小鼠毒力试验以外的测定方法，既不方便也不准确；在毒素灭活过程中，由于α毒素毒力强，所需使用的甲醛含量高，使得灭活时间非常久；更重要的是这种方法中，A型产气荚膜梭菌分泌的α毒素含量过低，通常需要将培养液浓缩10～15倍，才能达到疫苗中所需的抗原含量。

另外一种基因工程亚单位疫苗的制备方法中，由于α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等两种酶的活性，其能同时将细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂水解，最终导致细胞裂解，因而α毒素具有细胞毒性、溶血活性、致死性和致血小板聚集等特性。因此，研究者利用基因工程技术进行α毒素亚单位疫苗研制时，去除α毒素毒性是抗原研制疫苗的热点。

目前，对α毒素毒性去除的方法有将α毒素进行截短表达的报道，截短后的α毒素不含毒性但却保留了免疫原性(具体参见公开号CN93107585和CN106008684B)。但是，截短长度很难控制均一，这既影响了α毒素的免疫原性，也降低了α毒素的产量，导致生产成本较高；同时现有对α毒素采取截短表达的方法中，全部采用的是大肠杆菌表达系统表达。公知的，大肠杆菌表达系统具有清楚的遗传背景清楚，且操作简便、生产周期短、表达水平高、成本低，特别适合大规模培养，是目前最常用、最经济的外源蛋白表达系统。但是大肠杆菌表达系统在表达外源蛋白时，外源蛋白通常在胞内以不可溶性的包涵体或胞内的可溶性蛋白形式存在，其中包涵体不具有生物活性，在进一步使用之前，需首先对其进行变性、复性等处理；而胞内的可溶性蛋白虽然具有生物活性，但其含有较多的杂蛋白，在对其进一步应用之前，需进行复杂的纯化过程；同时由于大肠杆菌是革兰氏阴性菌，内胞内含有大量的LPS(内毒素)，这将造成疫苗带有大量的副反应，因此疫苗生产中需要去除内毒素，但是其内毒素的去除工艺复杂，生产成本高，目前是兽用生物制品生产中的难点。

已有关于产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗的报道，如牛A型产气荚膜梭菌的亚单位疫苗及其制备方法和应用(申请号CN201710819084.5)、抑制产气荚膜梭菌感染的重组α蛋白及其制备方法与应用(申请号CN201610304595.9)、一种产气荚膜梭菌α毒素基因工程疫苗及其应用(申请号CN201410117383.0)。这些报道中，均采用IPTG作为诱导剂，诱导剂的添加量需要根据检测重组菌的生长情况来确定；且α毒素重组蛋白均在胞内表达，需要将宿主细胞破碎后进行复杂的纯化过程。

因此，亟需一种能够将α毒素以“胞外分泌”的形式进行合成的表达系统，将α毒素直接以可溶的形式分泌至细胞外的培养基中，从而避免了因包涵体复性带来的困难；而且细胞外杂蛋白少，α毒素的回收简单。同时表达系统无内毒素的产生，减少疫苗纯化内毒素的成本和副反应。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明公开了一种用革兰氏阳性表达系统制备产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法以及应用，成功实现了产气荚膜梭菌α毒素突变体蛋白分泌表达，且在细胞水平和动物体内减毒，甚至无毒。采用革兰氏阳性菌表达系统，在商品化的培养基中发酵培养，能够将重组蛋白诱导分泌表达到培养基中，目的蛋白表达量和蛋白纯度高、无需要去除内毒素；同时制备方法工艺简单、成本低、过程可控；疫苗具有安全有效的优点，有效地避免现有传统疫苗和大肠杆菌基因工程疫苗生产工艺复杂、内毒素含量高、副反应大、有效抗原含量低和生产成本高的问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种产气荚膜梭菌α毒素突变体，以起始氨基酸甲硫氨酸为第1位氨基酸，与野生型产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列相比，所述的产气荚膜梭菌α毒素突变体第56位天冬氨酸突变为丙氨酸，命名为D56A，共370个氨基酸残基，所述野生型产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其对应的优选核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述产气荚膜梭菌α毒素突变体D56A的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该突变体D56A保留了野生型产气荚膜梭菌α毒素的免疫原性，同时其与细胞受体的结合能力下降，大大降低了其在细胞水平和动物体内的毒性。

本发明还提供了一种核酸，所述核酸含有编码产气荚膜梭菌α毒素突变体D56A的核苷酸序列；优选为序列SEQ ID No.3。

本发明还提供了一种产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达载体，所述表达载体包括质粒载体，所述质粒载体上包括有编码产气荚膜梭菌α毒素突变体D56A的核苷酸序列。

优选地，所述核苷酸序列包括核苷酸序列SEQ ID No.3。

优选地，所述质粒载体包括以pRB373质粒为基础构建的重组质粒pYL。

进一步优选地，所述重组质粒pYL包括Xyl/tet片段、ori区域及Erm抗性基因。

进一步优选地，所述重组质粒pYL还包括复制子pUC18和pE194。

优选地，所述表达载体中核苷酸序列SEQ ID No.3上游还包括信号肽的核苷酸序列SEQ ID No.6，信号肽氨基酸序列为SEQ ID No.5，信号肽的加入使得目的蛋白更容易分泌表达。

优选地，本发明提供了一种质粒载体，所述质粒载体包括以pRB373质粒为基础构建的重组质粒pYL，其中重组质粒的多克隆位点包括Xyl/tet片段和ori区域，抗性区域包括Erm抗性基因，该重组质粒pYL上还包括有两个复制子：pUC18复制子保证此载体能在大肠杆菌中复制；pE194复制子保证质粒在葡萄球菌中复制，其多克隆位点上游还包括可诱导表达的Xyl/tet片段，为四环素抗性基因表达调控元件，外源基因的表达受四环素诱导，使其下游基因限制性表达(严谨型表达)，避免本底性表达造成表型的不可控性。Erm抗性基因则赋予质粒及克隆子方便快捷的抗生素筛选表型。

本发明还提供了一种表达系统，所述表达系统包括含有上述表达载体的革兰氏阳性菌表达系统。

优选地，所述革兰氏阳性菌表达系统包括葡萄球菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统或谷氨酸棒状杆菌表达系统中的一种。

进一步优选地，所述葡萄球菌表达系统包括表皮葡萄球菌表达系统。

表皮葡萄球菌(S.epidermidis)一般不产生外毒素(溶血毒素)、杀白细胞毒素和肠毒素，故侵袭力较弱，属于非致病性葡萄球菌，适合作为受体菌。

采用革兰氏阳性菌表达系统，能够将表达载体表达得到的重组蛋白分泌表达到培养基中，目的蛋白表达量和蛋白纯度高、无需要去除内毒素。而且革兰氏阳性菌表达系统能够使蛋白外分泌，保留蛋白的天然构象，同时革兰氏阳性菌培养液中不含有类似脂多糖的毒性化合物，有利于产气荚膜梭菌α毒素突变体的合成和纯化。

本发明提供的上述表达系统的制备方法包括将包含SEQ ID No.3的核苷酸序列整合到质粒载体上形成表达载体，而后将表达载体转化进革兰氏阳性菌中，得到革兰氏阳性菌表达系统。

上述的表达载体是经过改进获得的，其改进过程包括根据需求选择的核苷酸序列，或根据需求合成所需核苷酸序列，而后将其插入到相应质粒载体上作为表达载体。

优选地，所述重组质粒pYL包括保证表达载体在转化细菌中正常复制的复制子、ori区域、用于表达调控的序列和用于筛选的序列。

优选地，所述复制子包括pUC18和pE194。

优选地，所述用于表达调控的序列包括Xyl/tet片段。

优选地，所述用于筛选的序列包括Erm抗性基因。

优选地，所述表达载体中核苷酸序列SEQ ID No.3上游还包括信号肽的核苷酸序列SEQ ID No.6。

优选地，所述的表达载体经过中间宿主转化进革兰氏阳性菌。

优选地，所述中间宿主包括RN4220。

本发明还提供了采用上述表达系统或采用上述表达系统制备方法得到的表达系统进行产气荚膜梭菌α毒素突变体的制备方法，该方法包括所述表达系统在诱导剂作用下诱导合成产气荚膜梭菌α毒素突变体。

优选地，所述诱导合成选用液体培养基。

优选地，所述液体培养基包括TSB培养基。

优选地，所述液体培养基中还包括Erm。

优选地，所述Erm的浓度为1～20μg/ml。

优选地，所述Erm的浓度为5μg/ml。

优选地，在产气荚膜梭菌α毒素突变合成的过程中流加补碳，实现连续诱导合成。

优选地，所述的诱导剂为aTc。

优选地，所述诱导剂aTc的浓度为300～700ng/mL，可以是但不限于为300、400、500、600、700ng/ml。

优选地，所述诱导合成的温度为36℃～37℃，可以但不限于为36.2℃、36.4℃、36.6℃、36.8℃。

优选地，所述诱导合成的时间为16～42h，可以但不限于20h、24h、28h、32h、36h、40h。

优选地，所述流加补碳的碳源包括葡萄糖和/或甘油。

优选地，所述甘油的流加速度为，按照体积比计算，每6-8h补加甘油1％。

优选地，所述葡萄糖的流加速度为，每6-8h补加葡萄糖1g/L。

优选地，所述诱导合成的过程中所加入种子培养液的体积分数为0.1％～5％，可以但不限于0.2％、1％或2％。

优选地，所述诱导合成的过程中选用TSB液体培养基，所述流加补碳的碳源为甘油，按照体积比计算，所述甘油的流加速度为每6h补加甘油1％，所述TSB液体培养基中还包括5μg/ml Erm，所述诱导剂为300ng/mL的aTc，诱导时间为20h，种子液接种量体积分数为1％。

本发明还要求保护上述表达系统表达所得产气荚膜梭菌α毒素突变体在以下(A)-(C)中的应用：

(A)制备产气荚膜梭菌基因工程疫苗。

(B)制备产气荚膜梭菌病诊断抗原。

(C)制备产气荚膜梭菌α毒素的单克隆抗体。

本发明还提供了应用上述表达系统所得产气荚膜梭菌α毒素突变体制备的基因工程疫苗、抗原或单克隆抗体。

优选地，所述基因工程疫苗中产气荚膜梭菌α毒素突变体浓度为50～100μg/mL；更优选50μg/mL。

优选地，所述基因工程疫苗还包括辅料，所述辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种。

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂。

优选地，所述疫苗佐剂为Montanide ISA系列佐剂。

优选地，所述疫苗佐剂为ISA35A佐剂。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的产气荚膜梭菌α毒素突变体与野生成熟α毒素相比，100μg的重组蛋白对小鼠无毒力，证明了本发明提供的产气荚膜梭菌α毒素突变体减毒成功，毒素安全；在兔子和牛模型中表现出良好的免疫原性和免疫保护性，能够应用于制备预防产气荚膜梭菌亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。

2、本发明还提供了可以编码上述产气荚膜梭α毒素突变体的核酸和上述产气荚膜梭菌α毒素突变体表达系统的制备方法，通过将上述产气荚膜梭α毒素突变体的核苷酸序列构建在革兰氏阳性菌表达系统中，而后对表达系统进行发酵培养，即可诱导表达目的产气荚膜梭α毒素突变体。该表达系统实现了产气荚膜梭α毒素突变体分泌表达在培养基中，易纯化，且无需去除内毒素，工艺简单、成本低、过程可控，避免了大肠杆菌表达系统和传统疫苗生产中的缺点。

3、本发明还在产气荚膜梭α毒素突变体核苷酸序列上游设计了编码信号肽的核苷酸序列，使得在本发明提供的表达系统在合成产气荚膜梭α毒素突变体时，同时合成信号肽，该信号肽能够促使产气荚膜梭α毒素突变体分泌表达。

4、本发明还提供了产气荚膜梭菌α毒素突变体制备方法，本发明所提供的制备方法得到的蛋白含量不低于350μg/ml，蛋白纯度不低于80％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中重组目的基因扩增产物SDS-PAGE检测结果图；

图2为实施例1中表达载体双酶切产物检测结果图；

图3为实施例2中确定重组蛋白分泌部位的实验结果；

图4为实施例2中重组蛋白Western Blot鉴定结果；

图5为实施例4中得到细胞状态拍照图；

图6为实施例6中免疫持续期阻断率的计算结果；

图7为实施例7中培养条件优化后，四次发酵所得重组蛋白进行凝胶电泳结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

具体实施方式中所使用的试验材料、试剂、菌株、细胞与试验动物如下：

质粒载体PYL	本申请人实验室冻存
		菌株RN4220	ATCC
pRB373质粒	ATCC
		RN4220感受态细胞	本申请人实验室冻存
E.coli DH5α感受态细胞	宝生物工程(大连)有限公司
		高保真FastPfu DNA聚合酶	全式金公司
dNTPs	全式金公司
		限制性内切酶(AscⅠ；PmeⅠ)	宝生物工程(大连)有限公司
DL2000DNA Marker	宝生物工程(大连)有限公司
		10×Loading Buffer	宝生物工程(大连)有限公司
4×Protein SDS PAGE Loading Buffer	宝生物工程(大连)有限公司
		PCR产物回收纯化试剂盒	宝生物工程(大连)有限公司
质粒小提试剂盒	天根生化科技(北京)有限公司
		Hela细胞系	本申请人实验室冻存
产气荚膜梭菌α毒素抗体检测试剂盒	BIO-X Diagnostics
		A型产气荚膜梭菌C57-1	中国兽医药品监察所菌种保藏中心
体重15～20g的小鼠	新疆医科大学实验动物中心
		体重1.5～2.0kg的兔	新疆医科大学实验动物中心

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1构建产气荚膜梭菌α毒素突变体表达系统

1.1重组质粒pYL的构建

首先，根据对表达载体的需求，人工化学合成可使用四环素进行表达调控的Xyl/tet片段、ori区域及可使用抗生素进行筛选的Erm抗性基因。

然后，将上述合成的基因片段通过分子生物学的方法插入到PRB373质粒中，测序正确，获得重组质粒pYL。

1.2产气荚膜梭菌α毒素突变体表达系统的构建

1.2.1合成重组目的基因

对产气荚膜梭菌α毒素编码基因进行优化设计，并将第56位天冬氨酸突变为丙氨酸，突变后核苷酸序列，如SEQ ID No.3所示，而后在其上游设计信号肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.6所示，经人工合成获得包括序列SEQ ID No.6和序列SEQ ID No.3的重组目的基因片段。

1.2.2设计引物

上游引物序列为：5’-AAACTATGTCAAAAAAATCTTTTGCT-3’，SEQ ID No.7；

下游引物序列为：5’-TTGGCGCGCCTTATATATTATTAATTAATATC-3’，SEQ ID No.8。

1.2.3重组目的基因扩增

以上述人工合成获得的重组目的基因片段为模板，利用上述1.2.2中设计的相应引物进行PCR扩增，PCR扩增体系为：DNA Temple，1.0μl；Premix Ex Taq，12.5μl；上游引物，0.5μl；下游引物，0.5μl；ddH₂O，10.5μl。反应程序为：95℃预变性5分钟；95℃，1分钟，53℃，1分钟，72℃，1分30秒，扩增35个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增完成后，对产物进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示，其中泳道1中样品为重组目的基因扩增后产物；泳道2为阴性对照；泳道3中样品为A型产气荚膜梭菌a毒素基因片段。从图中可以看出，泳道1中条带位置与A型产气荚膜梭菌a毒素基因片段相当，证明重组目的基因合成成功，泳道1中条带宽大，证明通过扩增获得了大量的重组目的基因产物。

1.2.4重组目的基因片段与重质粒pYL连接形成表达载体及表达载体转化进表皮葡萄球菌细胞

采用10μl连接体系：其中包括吸取DNA Ligase Buffer 1μl，重组目的基因片段回收产物4μl，重组质粒pYL双酶切后回收产物2μl，T4 DNA Ligase1μl，双蒸水2μl加入PCR管中，轻弹PCR管管壁，使反应混合液混合均匀，瞬离，置连接仪中16℃连接过夜。

将含有表达载体的连接产物转化进E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含300μg/mlErm的LB固体培养板上，置36～38℃恒温培养箱中培养16～24小时。挑选单菌落，提取表达载体进行双酶切(AscⅠ/PmeⅠ)，同时对上述得到的重组质粒进行双酶切(AscⅠ/PmeⅠ)，而后将表达载体的双酶切产物、重组质粒的双酶切产物和上述扩增后的重组目的基因产物同时经琼脂凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。其中泳道1的表达载体样品为双酶切产物，泳道2的样品为扩增目的基因片段，泳道3的样品为重组质粒pYL，M为DNA Marks；由图中可以看出表达载体经过双酶切后的两段序列大小分别与重组质粒pYL和扩增目的基因相当，因此，证明本实施例成功构建了表达载体。

将鉴定正确的表达载体再转化至RN4220后，置于36～33℃恒温培养箱培养20～24小时，从平板上挑取5个菌落转接到10ml TSB液体培养基(含5μg/ml红霉素)中，置于36～33℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16～20小时，将菌液按照核酸提取试剂盒说明书进行操作，提取质粒，然后电击转化进入表皮葡萄球菌(SE)中，获得最终用于诱导表达的重组菌株SE/PYL-CPA_D56A。

本实施例采用的RN4220一直以来被广泛地应用于金黄色葡萄球菌的基因研究。该菌株来源NCTC3325-4，是一株限制性内切酶缺陷菌株，能够接受来源于外部的其他物种的DNA质粒。RN4220体内没有其他质粒，对大部份抗生素都敏感。RN4220是用来转化大肠杆菌质粒DNA的葡萄球菌菌株。该菌株在基因Sau1 HsdR上有突变，该突变的产生可以导致RN4220成为限制修饰系统基因缺陷型，可以用来作为大肠杆菌质粒DNA和葡萄球菌质粒转化的中间宿主菌。表皮葡萄球菌(S.epidermidis)一般不产生外毒素(溶血毒素)、杀白细胞毒素和肠毒素，故侵袭力较弱，属于非致病性葡萄球菌，在中国医学细菌保藏管理中心和ATCC官网中均规定生物安全等级1，非常适合作为受体菌。

实施例2产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与鉴定

2.1将制备好的重组菌株SE/PYL-CPA_D56A按种子液体积比1％的比例接种含5μg/mlErm的TSB液体培养基中，按300ng/ml加入诱导剂aTc置于36～37℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养20小时。

2.2重组蛋白分泌表达上清的确定将2.1中获得的培养液高速离心收集上清溶液A，同时得到湿菌体，对湿菌体超声后得到全菌裂解物，取一半全菌裂解物作为待测样品B，将另一半全菌裂解物离心得到全菌裂解物的离心上清C和全菌裂解物离心的沉淀物D。

再取不含有质粒的表皮葡萄球菌和含有空载重组质粒pYL的表皮葡萄球菌，采用与2.1相同的培养方法，将得到的培养液分别离心后，上清液分别记为待测样品E和待测样品F，然后将上述的待测样品A-F进行SDS-PAGE检测，观察记录重组蛋白含量和蛋白纯度。具体见图3和图4，图3中各检测位对应的检测物质如表2.1所示。

表2.1图3中各检测位对应的检测物质

由图3中可以看出重组蛋白主要在表达系统上清液中表达。

2.3重组蛋白Western Blot鉴定

重组蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，以HRP标记的α毒素的特异性单抗(1∶20)为一抗进行孵育，按照底物显色试剂盒说明进行显色，检测重组蛋白反应原性。具体见图4。图4中，M为蛋白分子量Marker，1为诱导后上清，2为诱导前培养基，由图4可以看出表达的产气荚膜梭菌a毒素突变体具有良好的反应原性。

实施例3重组蛋白小鼠毒力试验

本研究根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)三部中的规定，选择尾静脉注射的方法来检测产气荚膜梭菌α毒素突变体对小鼠的毒力。将16～18g的小鼠随机分为6组，每组5只，分别以1μg、10μg以及100μg三个注射剂量注射，同时设置培养基作为阴性对照以及1个MLD的天然毒素为阳性对照。样品用明胶缓冲液进行稀释，注射的液体总体积为200μL，观察1～3日，记录小鼠死亡情况。结果，1MLD的天然毒素小鼠全部死亡，阴性对照组和重组毒素三个不同注射剂量小鼠均存活。

实施例4重组蛋白Hela细胞毒力试验

4.1细胞培养

将Hela细胞(2×10⁵个/ml)加入96孔板，100μl/孔，于37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。

4.2重组蛋白稀释接种和培养

将产气荚膜梭菌α毒素突变蛋白和野生α毒素蛋白用0.2μm的滤器过滤后稀释，进行蛋白定量。将两种蛋白分别进行2倍比稀释，共各自得到10个浓度，每个浓度接种3孔，作为实验组，正常细胞接种空培养基，作为阴性对照组，于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

4.2.1细胞观察

记录细胞病变时间24h细胞状态并拍照，见图5，图中a为78.59μg/ml产气荚膜梭菌a毒素突变蛋白对Hela细胞毒力结果，b为6.72μg/ml野生α毒素蛋白对Hela细胞毒力结果，由图5可以看出a为产气荚膜梭菌a毒素突变蛋白对Hela细胞物无毒力。

4.2.2MTS检测

在上述4.2中得到的三种Hela细胞培养24小时后，弃上清，每孔加入100μL培养基，每孔再加入20μLMTS试剂，于37℃，5％CO₂培养箱中培养1-2小时，在酶标仪上读取A490nm下的OD值来判定细胞死亡情况。

4.2.3细胞死亡率计算

细胞死亡率(％)＝(1-实验组A_490nm/阴性对照组A_490nm)100％。

4.2.4细胞半数病变量CT₅₀值计算

CT₅₀＝㏒^-1[Xm-i(∑P-0.5)]+i/4(1-Pm-Pn)，死亡率对应数据见表4.1。

其中：Xm：最大反应率组剂量的对数

i：组间剂量比的对数

P：各组死亡率

Pm：最大死亡率

Pn：最小死亡率

表4.1稀释后α毒素浓度与Hela细胞死亡率对照表

经计算，α毒素突变体细胞半数病变量CT₅₀＝242.38μg/ml，野生型α毒素细胞半数病变量CT₅₀＝1.38μg/ml。

实施例5产气荚膜梭菌α毒素突变体免疫原性研究

5.1目的蛋白的表达

将制备好的SE/PYL-CPA_D56A株接种在含5μg/ml Erm TSA固体平板上，置于36～37℃恒温培养箱中培养16～18小时，选取单个菌落接种于10ml含5μg/ml Erm TSB液体培养基内，置于36～37℃恒温振荡培养箱中200r/min振荡培养12～14h，然后按1％的比例接种含5μg/ml Erm TSB液体培养基中，按300ng/ml加入诱导剂aTc，置36～37℃恒温振荡培养箱中，以200r/min振荡培养16～24小时。

5.2抗原处理

5.2.1按照体积比0.2％的比例向上述得到的离心上清溶液中加入甲醛溶液，置于36～37℃恒温振荡摇床中，以100r/min振荡24～48h，灭活残留菌体。然后放入2～8℃冷藏箱中备用。

5.2.2灭活检验

5.2.2.1无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。

5.2.2.2灭活检验用体重16～20g的小白鼠2只，各静脉注射离心上清0.4ml，观察24小时，均健活。

5.3乳化

将产气荚膜梭菌α毒素突变体蛋白与ISA35A佐剂乳化，然后将两部分充分混合，制备成抗原含量为100μg/ml的疫苗400ml。

5.4兔子免疫试验

5.4.1中和抗体试验

用体重1.5～2.0kg兔4只，每只肌肉注射疫苗0.5ml，免疫21天后，采血分离血清，4只动物血清等量混合，取混合血清0.4ml分别与0.8ml的A型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠MLD)，置36～37℃作用40分钟，然后静脉注射15～20g的小鼠各2只，0.3ml/只。同时各型用对照小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。小鼠观察3日，判定结果。

5.4.2免疫攻毒试验

免疫21日后，连同条件相同的对照兔2只，分别耳缘静脉注射1个家1个兔MLD的(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素。观察1日，记录家兔死亡情况。

5.5牛免疫试验

5.5.1中和抗体试验用3～6月龄左右健康犊牛3只，每只肌肉注射疫苗2ml，免疫21天后按照相同途径进行第二次免疫，二免后14日，采血分离血清，取每只动物血清0.4ml分别与0.8ml的A型产气荚膜梭菌毒素(含12个小鼠MLD)，置36～37℃作用40分钟，然后静脉注射15～20g的小鼠各2只，0.3ml/只。同时各型用对照小鼠2只，分别注射1MLD与毒素血清混合物相同的毒素作对照。小鼠观察1日，判定结果。

5.5.2免疫攻毒试验二免后14日，连同条件相同的对照牛3只，分别静脉注射1个牛最小致死剂量(MLD)的A型产气荚膜梭菌毒素。观察3日，记录牛死亡情况。

5.6结果

5.6.1家兔免疫试验结果

将SE/PYL-CPA_D56A所表达的重组蛋白与佐剂混合后制成蛋白含量为100μg/ml的疫苗，免疫兔子，0.25ml/只，免疫后21日，进行血清中和试验和攻毒试验，结果各代次免疫组血清中和效价对A型产气荚膜梭菌毒素的效价均达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)；静脉注射1兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素，免疫组均4/4保护，对照全部死亡。见表5.1。

表5.1家兔血清中和效价和攻毒试验结果

分组	试验动物(只)	血清中和效价(MLD/0.1ml)	攻毒结果
				免疫组	4	3	4/4存活
对照组	2	0	0/2存活

5.6.2牛免疫试验结果

将疫苗免疫牛，间隔21日进行二免，二免后14日进行血清中和试验和攻毒试验，结果显示，重组蛋白100μg/头免疫组血清中和效价对A型产气荚膜梭菌毒素的效价均达到3(0.1ml免疫动物血清中和3MLD毒素)。详见表5.2。

表5.2牛血清中和效价和攻毒试验结果

实施例6产气荚膜梭菌α毒素突变体蛋白亚单位疫苗免疫持续期试验

6.1免疫

将产气荚膜梭菌α毒素突变体蛋白亚单位疫苗(100μg/ml)通过肌肉接种4只健康易感兔子，0.25ml/只(25μg/只)。一免后第14日、28日、60日、90日、120日、150日、180日采血，分离血清，-20℃保存备用。

6.2抗体检测

将不同免疫时间血清按照抗体检测试剂盒的检测方法进行检测。

6.3攻毒

免疫后180日，所有实验动物均静脉注射1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。

6.4阻断率计算公式

样品阻断率＝[(阴性血清OD值－样品血清OD值)/阴性对照OD值]×100％。

阳性血清阻断率＝[(阴性血清OD值－阳性血清OD值)/阴性血清OD值]×100％。

6.5试验成立的标准

阴性血清OD值－阳性血清OD值>0.7

阳性血清阻断率>30％

6.6免疫持续期结果

6.6.1抗体结果

根据图6结果所示，兔子免疫疫苗(25μg/只)，180日采血，免疫兔血清阻断率在80％以上。

6.6.2A型产气荚膜梭菌毒素攻毒结果

喂养180日后，用A型产气荚膜梭菌毒素对所有试验动物进行攻击，对照组兔2/2死亡，免疫组4/4存活。

6.6.3产气荚膜梭菌α毒素突变体蛋白亚单位疫苗，免疫兔子，25μg/只，从抗体阻断率和免疫攻毒结果来看，免疫持续期至少保持180日以上。

实施例7蛋白表达优化

7.1培养基的制备

7.1.1TSA固体培养基

按胰蛋白大豆琼脂粉(Tryptic Soy Agar，TSA)每40g加入940ml注射用水充分混匀后加热至完全溶解，121℃高压蒸汽灭菌15分钟，待冷却至50℃左右，根据需要可加入终浓度为5μg/ml的红霉素，倒平皿备用。

7.1.2TSB液体培养基

按胰蛋白大豆肉汤粉(Tryptic Soy Broth，TSB)每30g加入940ml注射用水充分混匀后加热至完全溶解，121C高压蒸汽灭菌15分钟，使用前根据需要可加入终浓度为5μg/ml的红霉素。

7.2菌种复苏

7.2.1一级生产种子制备取SE/PYL-CPA_D56A菌株，进行表面消毒后打开，加入少许TSB培养基，用接种环在含有红霉素的TSB平板上划线，置于36～38℃恒温培养箱培养12～16小时，从平板上挑取单个菌落转接到10ml TSB液体培养基(含5μg/ml红霉素)中，置于36～38℃恒温振荡培养箱，以200r/min振荡培养16～24小时,收集复苏菌液作为一级生产种子。

7.2.2二级生产种子制备将一级生产种子按1％(V/V)接种量接种含200ml TSB培养基(含5μg/ml红霉素)500ml摇瓶中,置于36～38℃恒温振荡箱，以200r/min振荡培养8～12小时,收集复苏菌液作为二级生产种子。

7.2.3发酵罐试验参考摇瓶培养体条件，采用15L发酵罐进行发酵试验,通过无菌过滤方式装入培养基5L，加入终浓度为5μg/ml的红霉素，加入0.01％的消泡剂。设置发酵参数:培养温度36～37℃，pH值7.0，溶氧20％。打开补料、补碱、补酸三路开关,通过自动添加1mol/L盐酸或30％氨水来控制pH值。手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧。分别补料碳源的选择、种子液的接种比例、诱导剂浓度、诱导表达时间等参数，筛选出菌体生长和蛋白表达的最佳条件，并在最佳条件下进行发酵参数的验证。

7.2.3.1补料碳源的选择用15L发酵罐进行发酵试验，初始上作体积为5L，按1％的接种量接种种子液。发酵过程采用葡萄糖(每6小时添加1g/L)和甘油(每6小时添加体积比1％)作为补料碳源，分别于不同时间取样检测蛋白表达量。结果见表7.1，从表中可以看见甘油作为补料碳源时，重组蛋白表达量要高。因此选择甘油作为补料碳源。

表7.1补料碳源对重组蛋白表达的影响

7.2.3.2诱导剂浓度的选择用15L发酵罐进行发酵试验,初始体积为5L,按1％接种量接种种子液。采用甘油作为补料碳源，加入终浓度为300、500、700ng/ml的ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测重组蛋白的表达量。结果见表7.2，从表中可以看出诱导剂终浓度为500ng/ml的ATC，蛋白表达量最高。

表7.2诱导剂浓度对重组蛋白表达的影响

7.2.3.3诱导时间的选择用15L发酵罐进行发酵试验，初始体积为5L，按1％接种量接种种子液。采用甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的ATC进行诱导表达，分别不同时间取样检测重组蛋白的表达量。结果见表7.3，从表中可以看到20-24小时，蛋白表达最高。

表7.3不同诱导时间对重组蛋白表达的影响

7.2.3.4种子液接种量的选择用15L发酵罐进行发酵试验，初始体积为5L，按0.2％、1％、5％的接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的aTc进行诱导表达，分别不同时间取样检测重组蛋白的表达量。结果见表7.4，从表中可以看到1％接种量蛋白表达最高。

表7.4种子接种量对重组蛋白表达的影响

7.2.3.5发酵工艺的验证参考优化的条件，用15L发酵罐进行4次分批补料发酵试验，初始体积为5L，按1％接种量接种种子液。采甘油作为补料碳源，加入终浓度为500ng/ml的ATC进行诱导表达，诱导表达20小时结束发酵，检测重组蛋白表达情况和纯度。

7.2.4发酵优化结果

用15L发酵罐进行了4次SE/PYL-CPA_D56A株的发酵表达，具体参数为：补料碳源为甘油、诱导剂浓度为300ng/ml、诱导时间为20h、种子液接种量为1％。其蛋白含量均不低于350μg/ml，蛋白纯度不低于80％。工艺简单，过程可控。

7.3蛋白定量以及纯度分析

将培养液高速离心收集上清，然后将上清液进行SDS-PAGE检测，观察记录重组蛋白含量和蛋白纯度。

7.3.1SDS-PAGE凝胶电泳

将蛋白Marker、待检样品及BSA标准品依序上样至胶片中，进行SDS-PAGE凝胶电泳，结束后，用考马斯亮蓝R250进行染色30分钟，然后用脱色液脱色至目的条带清晰，拍照保存。

7.3.2蛋白定量

7.3.2.1标准曲线绘制

打开Launch Vision Works LS软件，依次框选待检样品及BSA标准品目的条带，依次输入BSA标准品蛋白浓度，绘制标准曲线，当R²≥0.99时，可进行待检样品的测定。

7.3.2.2待检样品蛋白含量

测定以标准曲线为参照，Launch Vision Works LS软件分析得出待检样品中的目的蛋白浓度。

7.3.2.3蛋白纯度测定

打开AlphaEaseFC软件，点击“Aanlysis Tools”按钮，再打开“1D-Muti”界面，框选待检样品所有条带，点击“AUTOGRID”按钮，得出待检样品所有条带百分比含量，记录目的蛋白百分比含量，即为目的蛋白纯度结果。

检测结果，具体结果见图7，图中a～d分别对应牛血清蛋白的不同浓度，1～4分别对应四次发酵所得重组蛋白，M为蛋白质分子量Marks，由图7可以看出目的蛋白表达量高，浓度不低于350μg/ml，蛋白纯度不低于80％，且含量稳定。

实施例8佐剂筛选试验

8.1疫苗制备

制备四种不同佐剂疫苗，氢氧化铝胶疫苗、油包水佐剂疫苗(ISA 61)、水包油包水佐剂疫苗(ISA 201)、水包油佐剂疫苗(ISA 35A),CPA_D56A蛋白含量均为100μg/ml。

8.2安全试验

用350～450g的豚鼠8只，分成4组，每组2只，肌肉注射注射部位，每只2ml,观察兔是否存活，注射部分是否有坏死。四种不同佐剂疫苗兔均健活，注射部位没有坏死。

8.3效力试验

用350～450g的兔子18只，分成4组，每组4只，通过肌肉注射4种疫苗，0.25ml/只，另外2只作为空白对照。免疫后21日进行A型产气荚膜梭菌强毒素(C57-1)攻毒。攻毒试验结果见表8.1，水包油佐剂疫苗免疫组4/4保护，效果最好。

表8.1不同疫苗对兔攻毒实验结果

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物股份有限公司

<120> 一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 370

<212> PRT

<213> Clostridium perfringens

<400> 1

Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Ala Thr

1 5 10 15

Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu

20 25 30

Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu

35 40 45

Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu

50 55 60

Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys

65 70 75 80

Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser

85 90 95

Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly

100 105 110

Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe

115 120 125

Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp

130 135 140

Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu

145 150 155 160

Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Ala Phe Tyr

165 170 175

Thr Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr

180 185 190

Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala

195 200 205

Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr

210 215 220

Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu

225 230 235 240

His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys

245 250 255

Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr

260 265 270

Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln

275 280 285

Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys

290 295 300

Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp

305 310 315 320

Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Ser Asp

325 330 335

Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val

340 345 350

Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn

355 360 365

Ile Lys

370

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Ala Thr

1 5 10 15

Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu

20 25 30

Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu

35 40 45

Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Ala Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu

50 55 60

Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys

65 70 75 80

Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser

85 90 95

Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly

100 105 110

Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe

115 120 125

Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp

130 135 140

Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu

145 150 155 160

Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Ala Phe Tyr

165 170 175

Thr Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr

180 185 190

Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala

195 200 205

Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr

210 215 220

Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu

225 230 235 240

His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys

245 250 255

Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr

260 265 270

Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln

275 280 285

Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys

290 295 300

Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp

305 310 315 320

Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Ser Asp

325 330 335

Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val

340 345 350

Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn

355 360 365

Ile Lys

370

<210> 3

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgggatggaa agattgatgg aacaggaact catgctatga ttgcaactca aggggtttca 60

atcttagaaa atgatctgtc caaaaatgaa ccagaaagtg taagaaaaaa cttagagatt 120

ttaaaagaga acatgcatga gcttcaatta ggttctactt atccagctta tgataagaat 180

gcatatgatc tatatcaaga tcatttctgg gatcctgata cagataataa tttctcaaag 240

gataatagtt ggtatttagc ttattctata cctgacacag gggaatcaca aataagaaaa 300

ttttcagcat tagctagata tgaatggcaa agaggaaact ataaacaagc tacattctat 360

cttggagagg ctatgcacta ttttggagat atagatactc catatcatcc tgctaatgtt 420

actgccgttg atagcgcagg acatgttaag tttgagactt ttgcagagga aagaaaagaa 480

cagtataaaa taaacacagc aggttgcaaa actaatgagg ctttttatac tgatatctta 540

aaaaacaaag attttaatgc atggtcaaaa gaatatgcaa gaggttttgc taaaacagga 600

aaatcaatat actatagtca tgctagcatg agtcatagtt gggatgattg ggattatgca 660

gcaaaggtaa ctttagctaa ctctcaaaaa ggaacagcgg gatatattta tagattctta 720

cacgatgtat cagagggtaa tgatccatca gttggaaaga atgtaaaaga actagtagct 780

tacatatcaa ctagtggtga gaaagatgct ggaacagatg actacatgta ttttggaatc 840

aaaacaaagg atggaaaaac tcaagaatgg gaaatggaca acccaggaaa tgattttatg 900

actggaagta aagacactta tactttcaaa ttaaaagatg aaaatctaaa aattgatgat 960

atacaaaata tgtggattag aaaaagaaaa tatacagcat tctcagatgc ttataagcca 1020

gaaaacataa agataatagc aaatggaaaa gttgtagtgg acaaagatat aaacgagtgg 1080

atttcaggaa attcaactta taatataaaa taa 1113

<210> 4

<211> 1113

<212> DNA

<213> Clostridium perfringens

<400> 4

tgggatggaa agattgatgg aacaggaact catgctatga ttgcaactca aggggtttca 60

atcttagaaa atgatctgtc caaaaatgaa ccagaaagtg taagaaaaaa cttagagatt 120

ttaaaagaga acatgcatga gcttcaatta ggttctactt atccagatta tgataagaat 180

gcatatgatc tatatcaaga tcatttctgg gatcctgata cagataataa tttctcaaag 240

gataatagtt ggtatttagc ttattctata cctgacacag gggaatcaca aataagaaaa 300

ttttcagcat tagctagata tgaatggcaa agaggaaact ataaacaagc tacattctat 360

cttggagagg ctatgcacta ttttggagat atagatactc catatcatcc tgctaatgtt 420

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cagtataaaa taaacacagc aggttgcaaa actaatgagg ctttttatac tgatatctta 540

aaaaacaaag attttaatgc atggtcaaaa gaatatgcaa gaggttttgc taaaacagga 600

aaatcaatat actatagtca tgctagcatg agtcatagtt gggatgattg ggattatgca 660

gcaaaggtaa ctttagctaa ctctcaaaaa ggaacagcgg gatatattta tagattctta 720

cacgatgtat cagagggtaa tgatccatca gttggaaaga atgtaaaaga actagtagct 780

tacatatcaa ctagtggtga gaaagatgct ggaacagatg actacatgta ttttggaatc 840

aaaacaaagg atggaaaaac tcaagaatgg gaaatggaca acccaggaaa tgattttatg 900

actggaagta aagacactta tactttcaaa ttaaaagatg aaaatctaaa aattgatgat 960

atacaaaata tgtggattag aaaaagaaaa tatacagcat tctcagatgc ttataagcca 1020

gaaaacataa agataatagc aaatggaaaa gttgtagtgg acaaagatat aaacgagtgg 1080

atttcaggaa attcaactta taatataaaa taa 1113

<210> 5

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Met Lys Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Ala Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala

20 25

<210> 6

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaaaagaa agatttgtaa ggcgcttatt tgtgccgcgc tagcaactag cctatgggct 60

ggggcatcaa ctaaagtcta cgct 84

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaactatgtc aaaaaaatct tttgct 26

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttggcgcgcc ttatatatta ttaattaata tc 32

Claims

1.一种产气荚膜梭菌α毒素突变体，其特征在于，与野生型产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列相比，所述的产气荚膜梭菌α毒素突变体第56位的天冬氨酸突变为丙氨酸，共370个氨基酸残基，所述野生型产气荚膜梭菌α毒素氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种核酸，其特征在于，含有编码权利要求1所述产气荚膜梭菌α毒素突变体的核苷酸序列；

所述编码权利要求1所述产气荚膜梭菌α毒素突变体的核苷酸序列优选为序列SEQ IDNo.3。

3.一种产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括质粒载体，所述质粒载体上包括有权利要求2所述的核苷酸序列；

优选地，所述核苷酸序列包括核苷酸序列SEQ ID No.3；

优选地，所述质粒载体包括以pRB373质粒为基础构建的重组质粒pYL；

进一步优选地，所述重组质粒pYL包括Xyl/tet片段、ori区域及Erm抗性基因；

进一步优选地，所述重组质粒pYL还包括复制子pUC18和pE194。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体中核苷酸序列SEQ IDNo.3上游还包括信号肽的核苷酸序列SEQ ID No.6。

5.一种产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达系统，其特征在于，所述表达系统包括含有权利要求3或4所述表达载体的革兰氏阳性菌表达系统。

6.根据权利要求5所述的表达系统，其特征在于，所述的革兰氏阳性菌表达系统包括葡萄球菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统或谷氨酸棒状杆菌表达系统中的一种；

优选地，所述的葡萄球菌表达系统包括表皮葡萄球菌表达系统。

7.一种产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达系统的制备方法，其特征在于，包括步骤：将权利要求2所述产气荚膜梭菌α毒素突变体的核苷酸序列整合到质粒载体上形成表达载体，而后将表达载体转化进革兰氏阳性菌中，得到革兰氏阳性菌表达系统；

优选地，所述重组质粒pYL包括保证表达载体在转化细菌中正常复制的复制子、ori区域、用于表达调控的序列和用于筛选的序列；

优选地，所述复制子包括pUC18和pE194；

优选地，所述用于表达调控的序列包括Xyl/tet片段；

优选地，所述用于筛选的序列包括Erm抗性基因；

优选地，所述产气荚膜梭菌α毒素突变体的核苷酸序列包括核苷酸序列SEQ ID No.3；

优选地，所述表达载体中核苷酸序列SEQ ID No.3上游还包括信号肽的核苷酸序列SEQID No.6；

优选地，所述的表达载体经过中间宿主转化进革兰氏阳性菌；

优选地，所述中间宿主包括RN4220。

8.一种产气荚膜梭菌α毒素突变体的制备方法，其特征在于，采用权利要求5或6所述表达系统或权利要求7所述制备方法得到的表达系统，在诱导剂作用下诱导合成产气荚膜梭菌α毒素突变体；

优选地，所述的诱导合成选用液体培养基；

优选地，所述液体培养基包括TSB培养基；

优选地，所述液体培养基中还包括Erm；

优选地，所述Erm的浓度为1～20μg/ml；

优选地，所述Erm的浓度为5μg/ml；

优选地，在产气荚膜梭菌α毒素突变体合成的过程中流加补碳；

优选地，所述的诱导剂包括aTc；

优选地，所述诱导剂aTc的浓度为300～700ng/mL；

优选地，所述诱导合成的温度为36℃～37℃；

优选地，所述诱导合成的时间为16～24h；

优选地，所述流加补碳的碳源包括葡萄糖或/和甘油；

优选地，所述甘油的流加速度为，按照体积比计算，每6-8h补加甘油1％；

优选地，所述葡萄糖的流加速度为，每6-8h补加葡萄糖1g/L；

优选地，所述诱导合成的过程中所加入种子培养液的接种体积分数为0.1％～5％；

优选地，所述诱导合成的过程中选用TSB液体培养基，所述流加补碳的碳源为甘油，所述甘油的流加速度为，按照体积比计算，每6h补加甘油1％，所述TSB液体培养基中还包括5μg/ml Erm，所述诱导剂为300ng/mL的aTc，所述诱导合成的时间为20h，所述种子培养液的接种体积分数为1％。

9.权利要求8所述的产气荚膜梭菌α毒素突变体在以下(A)-(C)中的应用：

(A)制备产气荚膜梭菌基因工程疫苗；

(B)制备产气荚膜梭菌病诊断抗原；

(C)制备产气荚膜梭菌α毒素的单克隆抗体。

10.应用权利要求8所述产气荚膜梭菌α毒素突变体制备的基因工程疫苗、抗原或单克隆抗体；

优选地，所述基因工程疫苗中产气荚膜梭菌α毒素突变体浓度为50～100μg/mL；更优选为50μg/mL；

优选地，所述基因工程疫苗还包括辅料，所述的辅料包括疫苗佐剂、稳定剂和抗生素中的一种或多种；

优选地，所述疫苗佐剂包括氢氧化铝胶、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、白油佐剂、MF59佐剂或Montanide ISA系列佐剂；

优选地，所述疫苗佐剂为Montanide ISA系列佐剂；

优选地，所述疫苗佐剂为ISA35A佐剂。