CN114107304A - 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法 - Google Patents

一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的靶点位于ETH_00009555基因，可以进行精确的基因定点突变；由sgRNA、Cas9和同源重组片段建立基因编辑系统，可精确地将目的片段同源重组于ETH_00009555基因；构建一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的球虫载体，所述重组球虫载体的DNA中成功重组了目的基因，且在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白。

Description

一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检 测方法
技术领域
本发明属于球虫载体疫苗领域，尤其涉及一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens，CP)属于芽孢杆菌科梭状芽孢杆菌属，是一种严格厌氧的革兰氏阴性菌，其中A型产气荚膜梭菌是引起鸡坏死性肠炎(NecroticEnteritis，NE)的主要病原体。鸡坏死性肠炎常被称为“烂肠病”，是一种发病机制复杂的鸡肠道疾病。鸡坏死性肠炎的易感群体为2～4周龄的仔鸡，主要病理特征为肠道粘膜的严重损伤，极大地降低了动物的生产性能。据统计，每年在全球范围内，由鸡坏死性肠炎造成的经济损失在50亿美元以上。
A型产气荚膜梭菌的α毒素是导致鸡患坏死性肠炎的主要原因。α毒素是一种由370个氨基酸组成的分泌型多功能性锌金属酶，它融合了以下两种酶的活性：卵磷脂酶和鞘磷脂酶，这两种酶的协同作用产生溶血素效果，使得细胞膜中的磷脂被水解，从而将细胞裂解。
饲料中的抗生素添加剂的使用在防治鸡坏死性肠炎方面发挥了较大作用，但是由此带来的耐药性和药物残留等问题已经不容忽视。目前，已经禁止向饲料中加入除抗球虫病之外的抗生素添加剂，这为鸡坏死性肠炎的防治增加了巨大压力。因此，应从免疫预防的方向着手，防控A型产气荚膜梭菌。
如何提供一种防控A型产气荚膜梭菌的方法，降低鸡坏死性肠炎的患病概率，减少经济损失，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法，所述重组球虫载体表达α毒素抗原，可诱发动物机体产生适应性免疫应答，从而预防A型产气荚膜梭菌。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的靶点位于ETH_00009555基因的3’UTR区。
本发明中，ETH_00009555为该基因在NCBI中的基因标记名称。
本发明中，所述sgRNA靶向ETH_00009555基因的3’UTR区，保证了插入的外源基因不对球虫的原有基因进行破坏，不影响球虫的正常生理活动，方便后续的筛选及实际应用。
本发明中，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA包括SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
SEQ ID NO.3：
gttaataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaagtggcaccgagtcggtgc。
第二方面，本发明提供了一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括第一方面所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。
优选地，所述ETH_00009555基因编辑系统还包括Cas9。
优选地，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA与所述Cas9连接在同一个基因编辑质粒中。
优选地，所述ETH_00009555基因编辑系统还包括同源重组片段。
优选地，所述同源重组片段中包括α毒素基因和筛选标记基因。
优选地，所述筛选标记基因包括荧光标签基因。
优选地，所述同源重组片段还包括5’同源臂、启动子和3’同源臂。
本发明中，通过设置5’同源臂和3’同源臂，提高了外源基因的整合效率；通过设置筛选标记基因，方便后续阳性克隆的筛选。
本发明中，通过靶向ETH_00009555基因的sgRNA、Cas9与同源重组质粒的相互配合，实现了α毒素基因和荧光标签基因在ETH_00009555基因3’UTR区的定点插入，提高了插入效率，且避免了外源片段的随机插入。
第三方面，本发明提供了一种重组球虫载体，所述重组球虫载体含有第一方面所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。
本发明中，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、缓艾美耳球虫、布氏艾美耳球虫或早熟艾美耳球虫中的任意一种。
优选地，所述重组球虫载体含有第二方面所述的ETH_00009555基因编辑系统。
优选地，所述重组球虫载体为经过第二方面所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因的3’UTR区中整合了所述α毒素基因和荧光标签基因的球虫载体。
第四方面，本发明提供了一种第三方面所述的重组球虫载体的构建方法，所述构建方法包括：
构建基因编辑质粒；
构建同源重组片段；
将所述基因编辑质粒和所述同源重组片段导入球虫子孢子中，筛选阳性克隆，得到所述重组球虫载体。
本发明中，所述构建方法技术成熟，成功率高，促进了相关技术的推广与使用。
优选地，所述基因编辑质粒的构建方法包括：
PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接，得到含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒。
优选地，所述同源重组片段的构建方法包括：
依次将5’同源臂、启动子、α基因、筛选标记基因和3’同源臂按顺序连接，再连接到克隆载体上，得到含有α基因和筛选标记基因的同源重组质粒；
以所得同源重组质粒为模板，通过PCR扩增得到仅含5’同源臂、启动子、α基因、筛选标记基因和3’同源臂的同源重组片段。
优选地，所述筛选标记基因包括EGFP基因。
优选地，所述同源重组片段的构建方法还包括测序验证的步骤。
优选地，所述导入包括电转染。
优选地，所述筛选阳性克隆的步骤包括：
使用球虫子孢子感染动物，收获卵囊后，根据筛选标记基因进行筛选，得到阳性球虫载体。
优选地，所述动物包括鸡。
优选地，所述根据筛选标记基因进行筛选的步骤包括：
在荧光显微镜下观察并挑选。
作为优选技术方案，本发明所述重组球虫载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒：
PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接，得到含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒；
(2)构建含有α基因和筛选标记基因的同源重组片段：
依次将5’同源臂、启动子、α基因、EGFP基因和3’同源臂按顺序连接，再连接到克隆载体上，测序验证，得到含有α基因和筛选标记基因的同源重组质粒；
以所得同源重组质粒为模板，通过PCR扩增得到仅含5’同源臂、启动子、α基因、EGFP基因和3’同源臂的同源重组片段；
(3)构建重组球虫载体：
将所述含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒和所述含有α基因和筛选标记基因的同源重组片段通过电转染导入球虫子孢子中，使用球虫子孢子感染鸡，收获卵囊后，在荧光显微镜下观察并挑选，筛选阳性克隆，得到阳性球虫载体。
(4)阳性重组球虫载体的分子检测：
提取所得阳性球虫载体的总RNA，反转录为cDNA，进行PCR检测，测序，α毒素蛋白和荧光蛋白基因都成功表达，证明成功构建了表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体。
第五方面，本发明提供一种第三方面所述的重组球虫载体的检测方法，所述检测方法包括PCR扩增检测和/或荧光检测。
优选地，所述PCR扩增检测的靶点基因包括α毒素基因和/或荧光标签基因。
优选地，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA以及ETH_00009555基因编辑系统具有良好的特异性，基因编辑效率高；实现了目标基因的定点插入，避免了外源片段的随机插入；
(2)本发明所述重组球虫载体利用CRISPR/Cas9和同源重组质粒构成的基因编辑系统和球虫自身的同源重组修复作用相结合，在球虫的ETH_00009555基因的3’UTR区中敲入了α基因和EGFP基因，构建的重组球虫载体具有良好的稳定性，可通过细胞分裂将编辑后的基因型传递给子代，实现了相关基因型的可遗传性，减少了工作量，应用价值更高；
(3)本发明构建的重组球虫载体可以同时表达荧光蛋白和α毒素蛋白，具有良好的应用前景，一方面，重组球虫载体表达荧光蛋白，可用于观察球虫不同发育阶段的转化、球虫与所感染组织的细胞的相互作用或者球虫药物评价中；另一方面，重组球虫载体表达α毒素蛋白，可用于α毒素蛋白在球虫中表达量以及诱发动物机体产生适应性免疫应答以预防A型产气荚膜梭菌等相关的研究中。
附图说明
图1为本发明实施例1中的同源重组质粒的构建流程及结构示意图；
图2为本发明实施例2中重组球虫载体的构建原理示意图；
图3为本发明实施例2中重组球虫载体的图片(放大倍数＝200倍)；
图4为本发明实施例3中重组球虫载体的PCR鉴定图，图中，泳道M-1kb Laddermarker；泳道1-CPα基因的扩增产物，泳道2-EGFP标签蛋白基因的扩增产物。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料与方法：
柔嫩艾美耳球虫来自佛山市正典生物技术有限公司；
使用Q5定点突变试剂盒来自NEB(北京)有限公司；
重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；
电转缓冲液购自哈佛生物科学公司；
SPF鸡来自广东新兴县温室总部后山SPF实验动物中心；
RNAeasy动物RNA抽提试剂盒试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；
BeyoRT II cDNA合成试剂盒(with gDNA Eraser)购自上海碧云天生物技术有限公司；
1kb Ladder marker购自北京擎科生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括靶向ETH_00009555基因的sgRNA、Cas9和同源重组片段；
所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的靶点位于ETH_00009555基因的3’UTR区，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA与所述Cas9连接在同一个基因编辑质粒中；
所述同源重组片段中包括依次连接的5’同源臂、SAG13启动子、CPα基因、P2A-EGFP基因和3’同源臂。
所述基因编辑质粒通过如下方法进行制备：
(1)PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列：
以CRISPR-ACT-F(SEQ ID NO.1)和CRISPR-R(SEQ ID NO.2)为引物，以pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒为模板，使用Q5定点突变试剂盒，进行PCR反应，得到PCR产物；
所述PCR扩增的反应体系如下：
Figure BDA0003402431360000041
SEQ ID NO.1：aataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagttaaaa；
SEQ ID NO.2：aacttgacatccccatttaccag。
所述PCR扩增的反应程序如下：
预变性：98℃，30s；
循环扩增：98℃，10s；55℃，30s；72℃，2min，35个循环；
循环外延伸：72℃，2min。
(2)连接：
使用上述PCR产物参照使用Q5定点突变试剂盒上的说明进行KLD反应，将扩增产物成环连接，反应体系如下：
Figure BDA0003402431360000042
反应程序为：在室温下孵育30min。
取5μL KLD反应产物转化到DH5α感受态细胞中，涂布Amp抗性的固体培养基平板，37℃倒置培养过夜；
挑取单菌落置于Amp抗性的液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养10h至菌液浑浊，提取质粒，使用CRISPR-ACT-F(SEQ ID NO.1)和CRISPR-R(SEQ ID NO.2)进行扩增验证，扩增产物大小与预期相符，证明所述基因编辑质粒pSAG1::Cas9-U6::sgACT构建成功，sgRNA序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3：
gttaataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaagtggcaccgagtcggtgc。
所述同源重组片段的构建流程及结构示意图如图1所示，包括以下步骤：
(1)扩增线性化PUC19质粒序列：
以L-PUC19-F(SEQ ID NO.4)和L-PUC19-R(SEQ ID NO.5)为引物，以PUC19质粒作为模板进行PCR反应扩增，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。
SEQ ID NO.4：aagcttggcgtaatcatggtc；
SEQ ID NO.5：gaattcactggccgtcgtttt。
(2)扩增5’同源臂序列：
以h5’PUC19-5’同源臂-F(SEQ ID NO.6)和5’同源臂-R(SEQ ID NO.7)为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。扩增产物序列如SEQ ID NO.8所示。
SEQ ID NO.6：aaaacgacggccagtgaattctttgcagcagagtagttcatgac；
SEQ ID NO.7：tcatgtgggcattaactaataggccg；
SEQ ID NO.8：
tttgcagcagagtagttcatgacttgcgaaacggcctctcgattaataatacgctttgccgcaacgtgaagtaggcgttattgtgtgctgcctgtcgctgagctcctgcatcgagcggcaaggggttcaaccgagcgcaaattctgtggaaatagctggacaaaagcatctgcgacgggtgggggcaggcgcagctagctgttgctcccgacatcagtcatggaaatgcgtttcaggctaagcaagtagctgcccgcctggtgggaagatgaggctaggaactgctatgtttgcccctcacttggcggtattgcagtgtagtacgtgcattgtgaacccagagaaatgtgctccgcgtgacgcagcgaggcacaggggaacagcaagaggggccgttattgctcagcgtgctggacccccttgttccttcaaaccttacttatgagggcttacgcatcgcacctgatgggtcggtgtagcgtgatcatttcactgttcagtagtaggtatgggaggagtgtagttggcaggatgtaggagctttgcaagcggtggaacggttgagatgagtagtgaacagaggctttgcccaatgtcggatagtgagtgtttctcgagcacgaaacgtgcaaggcaacaggttactgtaggtttatgtagttggcaagagtgggccttgcccagtattcggtagtaagtgtcaagcacgacaccagattgcgaagcaacaggtaattgtaggtttacgtatcgtacgtttttcatgggagtgtgacggaaagttgtgggtagcagggtccgggggagtctgcggcaagcagttcaacagattgatggaacagaaagattaagaggcggagtgtccgctgttgctgtgggcagaaagagggcggcgtagagaggcatttagtggatgcttttgaggagttctgggaggtcatcagtagtggggaaggtctaccgcaccgtctggtcggcctattagttaatgcccacatga。
(3)扩增SAG13启动子序列：
以h5’同源臂-SAG13启动子-F(SEQ ID NO.9)和SAG13启动子-R(SEQ ID NO.10)为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。扩增产物序列如SEQ ID NO.11所示。
SEQ ID NO.9：cctattagttaatgcccacatgacgggaaaggcacctatgctg；
SEQ ID NO.10：tgcggaaaaacacagaaagcaaa；
SEQ ID NO.11：
cgggaaaggcacctatgctgcaagtcgcagctcactgaaaaaatagagccgtgcagggtctgttttgacgcttgcgcatgtaccagtagcggaaaggttgttaagtgcaaaaaatttcagtttatatagcgagtttatcgcagcccctcactaaccgtgaatctgtcagcgaatgcgtgagtacttcaatgttttggtccaccacttacacgcatcataggccgaaggttgctcacattttgacgatgaaaaaacgtgtgtatctaagaaaactgtctaatgagcataaaatgcatcgtcgtaatatagagggagatgcggtcagagacctgtaaaacgatcagatgctgtcacaggagccacctcacctagcgcacgtttcaccatagaaagttgccgacgcactcatacagaatccagaaaataacacaaaaatggagttgtaatgatgcattgtgagcgcctgcagcatctgctaaggttagtccttcaacgggcactccccccaaagtccgactgcacatggggatctaacctattcttaacagacctgactgatcccattaactcaacaggctcacatatgtatcatattaattccggccagtgtctctaaataaactcttttgtaggatctgccaactcactgcgggggggcacacagaagcaccacattgcacgacactgcttttgcgcaggctgcggggcaattaaacgttaacagtgcttgatccggccgaaatgacgcgaaatatttaaaacattatctgtttgtcagcctaacggagatgacatggtcgcacaagagactacagtgtgtgtgtgatgtctttcgtgcatcccaccgagcctctggaattcggcaccgcattagcccacacgtaaaacattgcgtacctaaccaagaagacttctcgggcagagaaaatgtaaaattatacattagcagagccacacattacactaaattgtttaattaggcttggttcacgttccgcagctcgtaatgcgggcgcgcgacagatcaacacacacacacaagcatctcggcagcacgtagtcactagtggaataaccgcgcacttcaacagaccattaaaaacctagacatttatatcctaaagcatgttctgttgaagcttcacaaagcagaattctaagacagcttagctcgtcgcaactcaggtggtgaaacagcaccatgctctagctggcagctgggactgtcacgtcgatgagccctgagtttctcatcgtacacacgcatttttcccagcatttcaattttttttgttgacccgggtgtgctcgcccactttgttcctgttgtccctttgctttctgtgtttttccgca。
(4)扩增CPα基因序列：
以hSAG13启动子-CPα毒素基因-F(SEQ ID NO.12)和CPα毒素基因-R(SEQ IDNO.13)为引物，以A型产气荚膜梭菌基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。扩增产物序列如SEQ ID NO.14所示。
SEQ ID NO.12：gctttctgtgtttttccgcaatgaagcgcaaaatttgcaaggc；
SEQ ID NO.13：cttaatgttgtatgtgctgttgcc；
SEQ ID NO.14：
atgaagcgcaaaatttgcaaggcactgatttgcgctgctctggcaacaagcctgtgggctggcgcaagcacaaaagtgtacgcttgggacggcaaaattgacggcacaggcactcacgcaatgattgtgactcagggcattagcattctggagaacgacctgagcaagaacgaacccgagagcgtgcgcaaaaacctggaaattctgaaagaaaacatgcacgaactgcagctgggcagcacataccctgactacgacaagaacgcatacgacctgtaccaggaccacttctgggaccctgacacagacaacaactttagcaaagacaacagctggtacctggcttacagcattcctgacacaggcgagagccagattcgcaagttcagcgcactggctcgctacgaatggcagcgcggcaactacaaacaggctactttttacctgggcgaggcaatgcactactttggcgacattgacactccctaccaccctgctaacgtgactgcagtggacagcgctggccacgtgaagttcgagacattcgctgaggagcgcaaagagcagtacaagattaacacagcaggctgcaaaacaaacgagaacttctacgcagacattctgaagaacaaagactttaacgcatggagcaaggaatacgcacgcggcttcgcaaagactggcaaaagcatctattacagccacgctagcatgagccacagctgggacgactgggactacgctgctaaggtgactctggctaacagccagaagggcacagcaggctacatctatcgctttctgcacgacgtgagcgagggcaacgaccctagcgtgggcaagaacgtgaaagaactggtggcatacattagcactagcggcgagaaggacgcaggcacagacgactacatgtacttcggcattaagactaaggacggcaagacacaggaatgggagatggacaaccctggcaacgacttcatgacaggcagcaaggacacatacacattcaagctgaaggacgagaacctgaaaattgacgacattcagaacatgtggattcgcaaacgcaagtacacagcatttcccgacgcatacaaacctgaaaacattaaggttattgcaaacggcaaggtggtggtggacaaagacattaacgaatggattagcggcaacagcacatacaacattaag。
(5)扩增EGFP序列：
以P2A-EGFP-F(SEQ ID NO.15)和EGFP-R1(SEQ ID NO.16)为引物，以pEGFP-C1质粒为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。
SEQ ID NO.15：
ggcagcggcgctacaaacttcagcctgctgaaacaggcaggcgacgtggaggaaaaccctggccccatggtgagcaagggcgag；
SEQ ID NO.16：ttacttgtacagctcgtccatgcc。
(6)扩增P2A-EGFP序列：
以hCPα-P2A-EGFP-F(SEQ ID NO.17)和EGFP-R2(SEQ ID NO.18)为引物，以步骤(5)中的扩增产物为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。P2A-EGFP序列如SEQ ID NO.19所示。
SEQ ID NO.17：ggcaacagcacatacaacattaagggcagcggcgctacaaac；
SEQ ID NO.18：ttacttgtacagctcgtccatg；
SEQ ID NO.19：
ggcagcggcgctacaaacttcagcctgctgaaacaggcaggcgacgtggaggaaaaccctggccccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa。
(7)扩增3’同源臂序列：
以hEGFP-3’同源臂-F(SEQ ID NO.20)和h3’PUC19-3’同源臂-R(SEQ ID NO.21)为引物，以柔嫩艾美耳球虫基因组为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。扩增产物序列如SEQ ID NO.22所示。
SEQ ID NO.20：gctgtacaagtaacgatcttttggtggtgcgtga；
SEQ ID NO.21：gttttggcttcacgtgggtg；
SEQ ID NO.22：
cgatcttttggtggtgcgtgacggggtcagtcattggatttggtatctgccgctccatttgtagctaggagagcctctgatgccgtgacatcttgctaggttcgcactgtttccacaacgactactttgtttggtcattttcaccgtgaaagtatgttcaccttggagagagaaaatttgagagagctctgagttgttggaacagcccaagtagctgactctcataggatactactaaagccaaacggcgcgttgtagcgctcatctgcagggattgatctttaaaaaaatgatcttttaaggttcatgccatacttattgagttcgctaggtgtcaacttgtcgaacacattcttgaggtgttgcgtatctgggcgctcccaggggttccatgtgaagcaattgtccagcgttgcgcggacgctcggatgaaaccaggcaggaacggtaggtttgcgacgattgtacaagagcgcgtgtattactcctacgcatccacagaaatcagcattggtaatcgtcgtggctgttgcaaggtctggtagcaaagctgcatatatttgcttgactgaatttcacttaccctcgttagagtgtatgtcttcgtagggtatcggaccccccagtatttcaattaggcagcatgcaagcccccaaatatcaagcttctcatccacgtagttgccttccacgaagcattcaggagccatgtagcggggagaccctccgttgtcctccaatttaagctttccgtgctgctctaatgaccgtgtcttgccaaagtcgcagagccgaatgttgtactgcacacataagttgaacatcacagagaaaccaagggagaaattcactcacagggctgtgcccaccctcattcatcctggtagaatagccaaccaattgcacccacgtgaagccaaaac。
(8)重组反应：
将线性化载体和各基因片段按比例混合，在重组酶体系催化下，完成重组反应。反应体系如下：
Figure BDA0003402431360000071
式中，Vn＝[0.02×片段碱基对数]ng(0.03pmol)。
反应条件为：37℃，反应30min。
取10μL重组产物加入100μL感受态细胞中，混匀，冰上静置30min后，在42℃水浴中热激45s，再冰浴2min；
再加入900μL无抗性SOC培养基，37℃下200rpm振荡培养1h后，在5000rpm下离心5min，弃掉900μL上清；
用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有Amp抗性的平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养12h；
挑取单菌落，使用含Amp抗性的液体培养基培养，再使用PUC19载体的通用引物进行扩增鉴定，扩增产物大小正确的即为阳性菌株。取1mL菌液保菌，剩余菌液抽提质粒，即为阳性质粒。
(9)扩增同源重组片段：
以5’同源臂-F(SEQ ID NO.23)和3’同源臂-R(SEQ ID NO.24)为引物，以阳性质粒为模板进行PCR反应，扩增体系及程序与构建基因编辑质粒中的相同。扩增产物序列如SEQID NO.25所示。
SEQ ID NO.23：tttgcagcagagtagttcatgact；
SEQ ID NO.24：gttttggcttcacgtgggtg；
SEQ ID NO.25：
tttgcagcagagtagttcatgacttgcgaaacggcctctcgattaataatacgctttgccgcaacgtgaagtaggcgttattgtgtgctgcctgtcgctgagctcctgcatcgagcggcaaggggttcaaccgagcgcaaattctgtggaaatagctggacaaaagcatctgcgacgggtgggggcaggcgcagctagctgttgctcccgacatcagtcatggaaatgcgtttcaggctaagcaagtagctgcccgcctggtgggaagatgaggctaggaactgctatgtttgcccctcacttggcggtattgcagtgtagtacgtgcattgtgaacccagagaaatgtgctccgcgtgacgcagcgaggcacaggggaacagcaagaggggccgttattgctcagcgtgctggacccccttgttccttcaaaccttacttatgagggcttacgcatcgcacctgatgggtcggtgtagcgtgatcatttcactgttcagtagtaggtatgggaggagtgtagttggcaggatgtaggagctttgcaagcggtggaacggttgagatgagtagtgaacagaggctttgcccaatgtcggatagtgagtgtttctcgagcacgaaacgtgcaaggcaacaggttactgtaggtttatgtagttggcaagagtgggccttgcccagtattcggtagtaagtgtcaagcacgacaccagattgcgaagcaacaggtaattgtaggtttacgtatcgtacgtttttcatgggagtgtgacggaaagttgtgggtagcagggtccgggggagtctgcggcaagcagttcaacagattgatggaacagaaagattaagaggcggagtgtccgctgttgctgtgggcagaaagagggcggcgtagagaggcatttagtggatgcttttgaggagttctgggaggtcatcagtagtggggaaggtctaccgcaccgtctggtcggcctattagttaatgcccacatgacgggaaaggcacctatgctgcaagtcgcagctcactgaaaaaatagagccgtgcagggtctgttttgacgcttgcgcatgtaccagtagcggaaaggttgttaagtgcaaaaaatttcagtttatatagcgagtttatcgcagcccctcactaaccgtgaatctgtcagcgaatgcgtgagtacttcaatgttttggtccaccacttacacgcatcataggccgaaggttgctcacattttgacgatgaaaaaacgtgtgtatctaagaaaactgtctaatgagcataaaatgcatcgtcgtaatatagagggagatgcggtcagagacctgtaaaacgatcagatgctgtcacaggagccacctcacctagcgcacgtttcaccatagaaagttgccgacgcactcatacagaatccagaaaataacacaaaaatggagttgtaatgatgcattgtgagcgcctgcagcatctgctaaggttagtccttcaacgggcactccccccaaagtccgactgcacatggggatctaacctattcttaacagacctgactgatcccattaactcaacaggctcacatatgtatcatattaattccggccagtgtctctaaataaactcttttgtaggatctgccaactcactgcgggggggcacacagaagcaccacattgcacgacactgcttttgcgcaggctgcggggcaattaaacgttaacagtgcttgatccggccgaaatgacgcgaaatatttaaaacattatctgtttgtcagcctaacggagatgacatggtcgcacaagagactacagtgtgtgtgtgatgtctttcgtgcatcccaccgagcctctggaattcggcaccgcattagcccacacgtaaaacattgcgtacctaaccaagaagacttctcgggcagagaaaatgtaaaattatacattagcagagccacacattacactaaattgtttaattaggcttggttcacgttccgcagctcgtaatgcgggcgcgcgacagatcaacacacacacacaagcatctcggcagcacgtagtcactagtggaataaccgcgcacttcaacagaccattaaaaacctagacatttatatcctaaagcatgttctgttgaagcttcacaaagcagaattctaagacagcttagctcgtcgcaactcaggtggtgaaacagcaccatgctctagctggcagctgggactgtcacgtcgatgagccctgagtttctcatcgtacacacgcatttttcccagcatttcaattttttttgttgacccgggtgtgctcgcccactttgttcctgttgtccctttgctttctgtgtttttccgcaatgaagcgcaaaatttgcaaggcactgatttgcgctgctctggcaacaagcctgtgggctggcgcaagcacaaaagtgtacgcttgggacggcaaaattgacggcacaggcactcacgcaatgattgtgactcagggcattagcattctggagaacgacctgagcaagaacgaacccgagagcgtgcgcaaaaacctggaaattctgaaagaaaacatgcacgaactgcagctgggcagcacataccctgactacgacaagaacgcatacgacctgtaccaggaccacttctgggaccctgacacagacaacaactttagcaaagacaacagctggtacctggcttacagcattcctgacacaggcgagagccagattcgcaagttcagcgcactggctcgctacgaatggcagcgcggcaactacaaacaggctactttttacctgggcgaggcaatgcactactttggcgacattgacactccctaccaccctgctaacgtgactgcagtggacagcgctggccacgtgaagttcgagacattcgctgaggagcgcaaagagcagtacaagattaacacagcaggctgcaaaacaaacgagaacttctacgcagacattctgaagaacaaagactttaacgcatggagcaaggaatacgcacgcggcttcgcaaagactggcaaaagcatctattacagccacgctagcatgagccacagctgggacgactgggactacgctgctaaggtgactctggctaacagccagaagggcacagcaggctacatctatcgctttctgcacgacgtgagcgagggcaacgaccctagcgtgggcaagaacgtgaaagaactggtggcatacattagcactagcggcgagaaggacgcaggcacagacgactacatgtacttcggcattaagactaaggacggcaagacacaggaatgggagatggacaaccctggcaacgacttcatgacaggcagcaaggacacatacacattcaagctgaaggacgagaacctgaaaattgacgacattcagaacatgtggattcgcaaacgcaagtacacagcatttcccgacgcatacaaacctgaaaacattaaggttattgcaaacggcaaggtggtggtggacaaagacattaacgaatggattagcggcaacagcacatacaacattaagggcagcggcgctacaaacttcagcctgctgaaacaggcaggcgacgtggaggaaaaccctggccccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacgatcttttggtggtgcgtgacggggtcagtcattggatttggtatctgccgctccatttgtagctaggagagcctctgatgccgtgacatcttgctaggttcgcactgtttccacaacgactactttgtttggtcattttcaccgtgaaagtatgttcaccttggagagagaaaatttgagagagctctgagttgttggaacagcccaagtagctgactctcataggatactactaaagccaaacggcgcgttgtagcgctcatctgcagggattgatctttaaaaaaatgatcttttaaggttcatgccatacttattgagttcgctaggtgtcaacttgtcgaacacattcttgaggtgttgcgtatctgggcgctcccaggggttccatgtgaagcaattgtccagcgttgcgcggacgctcggatgaaaccaggcaggaacggtaggtttgcgacgattgtacaagagcgcgtgtattactcctacgcatccacagaaatcagcattggtaatcgtcgtggctgttgcaaggtctggtagcaaagctgcatatatttgcttgactgaatttcacttaccctcgttagagtgtatgtcttcgtagggtatcggaccccccagtatttcaattaggcagcatgcaagcccccaaatatcaagcttctcatccacgtagttgccttccacgaagcattcaggagccatgtagcggggagaccctccgttgtcctccaatttaagctttccgtgctgctctaatgaccgtgtcttgccaaagtcgcagagccgaatgttgtactgcacacataagttgaacatcacagagaaaccaagggagaaattcactcacagggctgtgcccaccctcattcatcctggtagaatagccaaccaattgcacccacgtgaagccaaaac。
至此，含有所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA与Cas9的基因编辑质粒以及5’同源臂、SAG13启动子、CPα基因、P2A-EGFP基因和3’同源臂顺次连接的同源重组片段构建成功，得到了所述ETH_00009555基因编辑系统。
实施例2
本实施例提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体为经过实施例1所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因的3’UTR区中整合了所述CPα基因和EGFP基因的球虫载体。
所述重组球虫载体的构建原理示意图如图2所示，构建方法如下：
(1)取100万新鲜的球虫子孢子悬浮液，加入gap＝4mm的电击杯中，使用电转缓冲液将子孢子在电击杯中重悬；
(2)在电击液中加入实施例1中的pSAG1::Cas9-U6::sgACT质粒和同源重组片段，使用电击液定容至800μL，轻轻吹打将其混匀；
(3)将电击杯置于BTX电穿孔仪中，在电压2000V、电容25μF、电阻50Ω的条件下电击2次；
(4)电转后，将步骤(3)中电转处理后的子孢子通过泄殖腔接种至3日龄SPF鸡中，收集感染后7-10天的粪便，收获卵囊，进行孢子化；
(5)对孢子化卵囊在488nm光源下进行荧光显微镜观察，观察到发绿色荧光的球虫，即为重组CPα基因和EGFP基因的球虫载体，如图3所示。通过流式分选仪对阳性克隆进行筛选，得到阳性球虫载体，即所述的重组球虫载体。
实施例3
本实施例对实施例2制备得到的重组球虫载体进行检测，步骤如下：
(1)取100万新鲜的重组球虫载体子孢子悬浮液，使用RNAeasy动物RNA抽提试剂盒，按照其说明书步骤进行虫株的RNA提取，再使用BeyoRT II cDNA合成试剂盒(with gDNAEraser)进行cDNA合成；
(2)以所得cDNA为模板进行PCR扩增检测：
使用CPα毒素基因-F(SEQ ID NO.26)、CPα毒素基因-R(SEQ ID NO.13)扩增α毒素基因，使用EGFP-F(SEQ ID NO.27)、EGFP-R1(SEQ ID NO.16)，扩增EGFP标签蛋白基因，扩增结果如图4所示。
由图可以看出，扩增产物的大小与预期相符，表明α毒素蛋白和EGFP标签蛋白在重组球虫载体已经成功转录。
SEQ ID NO.26：atgaagcgcaaaatttgcaaggc；
SEQ ID NO.13：cttaatgttgtatgtgctgttgcc；
SEQ ID NO.27：atggtgagcaagggcgag；
SEQ ID NO.16：ttacttgtacagctcgtccatgcc。
综上所述，本发明提供了一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA以及ETH_00009555基因编辑系统，所述sgRNA以及基因编辑系统均具有良好的特异性及较低的脱靶率，实现了在球虫的ETH_00009555基因的3’UTR区域中定点插入CPα基因和EGFP基因，基因编辑效率高；通过在CPα基因和EGFP基因之间插入P2A多肽，避免了形成融合蛋白而影响蛋白的生理活性；构建的重组球虫载体可以同时表达CPα毒素蛋白和EGFP标签蛋白，可用于相关的研究中。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 佛山市正典生物技术有限公司
<120> 一种表达α毒素蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体及其检测方法
<130> 2021
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列 CRISPR-ACT-F
<400> 1
aataggccga ccagacggtg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaa 49
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 CRISPR-R
<400> 2
aacttgacat ccccatttac cag 23
<210> 3
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttaataggc cgaccagacg gtggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta 60
gtccgttatc aacttgaaaa gtggcaccga gtcggtgc 98
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 L-PUC19-F
<400> 4
aagcttggcg taatcatggt c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列 L-PUC19-R
<400> 5
gaattcactg gccgtcgttt t 21
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列 h5'PUC19-5'同源臂-F
<400> 6
aaaacgacgg ccagtgaatt ctttgcagca gagtagttca tgac 44
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列 5'同源臂-R
<400> 7
tcatgtgggc attaactaat aggccg 26
<210> 8
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tttgcagcag agtagttcat gacttgcgaa acggcctctc gattaataat acgctttgcc 60
gcaacgtgaa gtaggcgtta ttgtgtgctg cctgtcgctg agctcctgca tcgagcggca 120
aggggttcaa ccgagcgcaa attctgtgga aatagctgga caaaagcatc tgcgacgggt 180
gggggcaggc gcagctagct gttgctcccg acatcagtca tggaaatgcg tttcaggcta 240
agcaagtagc tgcccgcctg gtgggaagat gaggctagga actgctatgt ttgcccctca 300
cttggcggta ttgcagtgta gtacgtgcat tgtgaaccca gagaaatgtg ctccgcgtga 360
cgcagcgagg cacaggggaa cagcaagagg ggccgttatt gctcagcgtg ctggaccccc 420
ttgttccttc aaaccttact tatgagggct tacgcatcgc acctgatggg tcggtgtagc 480
gtgatcattt cactgttcag tagtaggtat gggaggagtg tagttggcag gatgtaggag 540
ctttgcaagc ggtggaacgg ttgagatgag tagtgaacag aggctttgcc caatgtcgga 600
tagtgagtgt ttctcgagca cgaaacgtgc aaggcaacag gttactgtag gtttatgtag 660
ttggcaagag tgggccttgc ccagtattcg gtagtaagtg tcaagcacga caccagattg 720
cgaagcaaca ggtaattgta ggtttacgta tcgtacgttt ttcatgggag tgtgacggaa 780
agttgtgggt agcagggtcc gggggagtct gcggcaagca gttcaacaga ttgatggaac 840
agaaagatta agaggcggag tgtccgctgt tgctgtgggc agaaagaggg cggcgtagag 900
aggcatttag tggatgcttt tgaggagttc tgggaggtca tcagtagtgg ggaaggtcta 960
ccgcaccgtc tggtcggcct attagttaat gcccacatga 1000
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列 h5'同源臂-SAG13启动子-F
<400> 9
cctattagtt aatgcccaca tgacgggaaa ggcacctatg ctg 43
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 SAG13启动子-R
<400> 10
tgcggaaaaa cacagaaagc aaa 23
<210> 11
<211> 1356
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgggaaaggc acctatgctg caagtcgcag ctcactgaaa aaatagagcc gtgcagggtc 60
tgttttgacg cttgcgcatg taccagtagc ggaaaggttg ttaagtgcaa aaaatttcag 120
tttatatagc gagtttatcg cagcccctca ctaaccgtga atctgtcagc gaatgcgtga 180
gtacttcaat gttttggtcc accacttaca cgcatcatag gccgaaggtt gctcacattt 240
tgacgatgaa aaaacgtgtg tatctaagaa aactgtctaa tgagcataaa atgcatcgtc 300
gtaatataga gggagatgcg gtcagagacc tgtaaaacga tcagatgctg tcacaggagc 360
cacctcacct agcgcacgtt tcaccataga aagttgccga cgcactcata cagaatccag 420
aaaataacac aaaaatggag ttgtaatgat gcattgtgag cgcctgcagc atctgctaag 480
gttagtcctt caacgggcac tccccccaaa gtccgactgc acatggggat ctaacctatt 540
cttaacagac ctgactgatc ccattaactc aacaggctca catatgtatc atattaattc 600
cggccagtgt ctctaaataa actcttttgt aggatctgcc aactcactgc gggggggcac 660
acagaagcac cacattgcac gacactgctt ttgcgcaggc tgcggggcaa ttaaacgtta 720
acagtgcttg atccggccga aatgacgcga aatatttaaa acattatctg tttgtcagcc 780
taacggagat gacatggtcg cacaagagac tacagtgtgt gtgtgatgtc tttcgtgcat 840
cccaccgagc ctctggaatt cggcaccgca ttagcccaca cgtaaaacat tgcgtaccta 900
accaagaaga cttctcgggc agagaaaatg taaaattata cattagcaga gccacacatt 960
acactaaatt gtttaattag gcttggttca cgttccgcag ctcgtaatgc gggcgcgcga 1020
cagatcaaca cacacacaca agcatctcgg cagcacgtag tcactagtgg aataaccgcg 1080
cacttcaaca gaccattaaa aacctagaca tttatatcct aaagcatgtt ctgttgaagc 1140
ttcacaaagc agaattctaa gacagcttag ctcgtcgcaa ctcaggtggt gaaacagcac 1200
catgctctag ctggcagctg ggactgtcac gtcgatgagc cctgagtttc tcatcgtaca 1260
cacgcatttt tcccagcatt tcaatttttt ttgttgaccc gggtgtgctc gcccactttg 1320
ttcctgttgt ccctttgctt tctgtgtttt tccgca 1356
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列 hSAG13启动子-CPα毒素基因-F
<400> 12
gctttctgtg tttttccgca atgaagcgca aaatttgcaa ggc 43
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 CPα毒素基因-R
<400> 13
cttaatgttg tatgtgctgt tgcc 24
<210> 14
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atgaagcgca aaatttgcaa ggcactgatt tgcgctgctc tggcaacaag cctgtgggct 60
ggcgcaagca caaaagtgta cgcttgggac ggcaaaattg acggcacagg cactcacgca 120
atgattgtga ctcagggcat tagcattctg gagaacgacc tgagcaagaa cgaacccgag 180
agcgtgcgca aaaacctgga aattctgaaa gaaaacatgc acgaactgca gctgggcagc 240
acataccctg actacgacaa gaacgcatac gacctgtacc aggaccactt ctgggaccct 300
gacacagaca acaactttag caaagacaac agctggtacc tggcttacag cattcctgac 360
acaggcgaga gccagattcg caagttcagc gcactggctc gctacgaatg gcagcgcggc 420
aactacaaac aggctacttt ttacctgggc gaggcaatgc actactttgg cgacattgac 480
actccctacc accctgctaa cgtgactgca gtggacagcg ctggccacgt gaagttcgag 540
acattcgctg aggagcgcaa agagcagtac aagattaaca cagcaggctg caaaacaaac 600
gagaacttct acgcagacat tctgaagaac aaagacttta acgcatggag caaggaatac 660
gcacgcggct tcgcaaagac tggcaaaagc atctattaca gccacgctag catgagccac 720
agctgggacg actgggacta cgctgctaag gtgactctgg ctaacagcca gaagggcaca 780
gcaggctaca tctatcgctt tctgcacgac gtgagcgagg gcaacgaccc tagcgtgggc 840
aagaacgtga aagaactggt ggcatacatt agcactagcg gcgagaagga cgcaggcaca 900
gacgactaca tgtacttcgg cattaagact aaggacggca agacacagga atgggagatg 960
gacaaccctg gcaacgactt catgacaggc agcaaggaca catacacatt caagctgaag 1020
gacgagaacc tgaaaattga cgacattcag aacatgtgga ttcgcaaacg caagtacaca 1080
gcatttcccg acgcatacaa acctgaaaac attaaggtta ttgcaaacgg caaggtggtg 1140
gtggacaaag acattaacga atggattagc ggcaacagca catacaacat taag 1194
<210> 15
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列 P2A-EGFP-F
<400> 15
ggcagcggcg ctacaaactt cagcctgctg aaacaggcag gcgacgtgga ggaaaaccct 60
ggccccatgg tgagcaaggg cgag 84
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 EGFP-R1
<400> 16
ttacttgtac agctcgtcca tgcc 24
<210> 17
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列 hCPα-P2A-EGFP-F
<400> 17
ggcaacagca catacaacat taagggcagc ggcgctacaa ac 42
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列 EGFP-R2
<400> 18
ttacttgtac agctcgtcca tg 22
<210> 19
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggcagcggcg ctacaaactt cagcctgctg aaacaggcag gcgacgtgga ggaaaaccct 60
ggccccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 120
ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 180
acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 240
cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 300
atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 360
atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 420
accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 480
gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 540
aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 600
ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 660
aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 720
atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 780
aagtaa 786
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列 hEGFP-3'同源臂-F
<400> 20
gctgtacaag taacgatctt ttggtggtgc gtga 34
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 h3'PUC19-3'同源臂-R
<400> 21
gttttggctt cacgtgggtg 20
<210> 22
<211> 923
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cgatcttttg gtggtgcgtg acggggtcag tcattggatt tggtatctgc cgctccattt 60
gtagctagga gagcctctga tgccgtgaca tcttgctagg ttcgcactgt ttccacaacg 120
actactttgt ttggtcattt tcaccgtgaa agtatgttca ccttggagag agaaaatttg 180
agagagctct gagttgttgg aacagcccaa gtagctgact ctcataggat actactaaag 240
ccaaacggcg cgttgtagcg ctcatctgca gggattgatc tttaaaaaaa tgatctttta 300
aggttcatgc catacttatt gagttcgcta ggtgtcaact tgtcgaacac attcttgagg 360
tgttgcgtat ctgggcgctc ccaggggttc catgtgaagc aattgtccag cgttgcgcgg 420
acgctcggat gaaaccaggc aggaacggta ggtttgcgac gattgtacaa gagcgcgtgt 480
attactccta cgcatccaca gaaatcagca ttggtaatcg tcgtggctgt tgcaaggtct 540
ggtagcaaag ctgcatatat ttgcttgact gaatttcact taccctcgtt agagtgtatg 600
tcttcgtagg gtatcggacc ccccagtatt tcaattaggc agcatgcaag cccccaaata 660
tcaagcttct catccacgta gttgccttcc acgaagcatt caggagccat gtagcgggga 720
gaccctccgt tgtcctccaa tttaagcttt ccgtgctgct ctaatgaccg tgtcttgcca 780
aagtcgcaga gccgaatgtt gtactgcaca cataagttga acatcacaga gaaaccaagg 840
gagaaattca ctcacagggc tgtgcccacc ctcattcatc ctggtagaat agccaaccaa 900
ttgcacccac gtgaagccaa aac 923
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列 5'同源臂-F
<400> 23
tttgcagcag agtagttcat gact 24
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列 3'同源臂-R
<400> 24
gttttggctt cacgtgggtg 20
<210> 25
<211> 5259
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tttgcagcag agtagttcat gacttgcgaa acggcctctc gattaataat acgctttgcc 60
gcaacgtgaa gtaggcgtta ttgtgtgctg cctgtcgctg agctcctgca tcgagcggca 120
aggggttcaa ccgagcgcaa attctgtgga aatagctgga caaaagcatc tgcgacgggt 180
gggggcaggc gcagctagct gttgctcccg acatcagtca tggaaatgcg tttcaggcta 240
agcaagtagc tgcccgcctg gtgggaagat gaggctagga actgctatgt ttgcccctca 300
cttggcggta ttgcagtgta gtacgtgcat tgtgaaccca gagaaatgtg ctccgcgtga 360
cgcagcgagg cacaggggaa cagcaagagg ggccgttatt gctcagcgtg ctggaccccc 420
ttgttccttc aaaccttact tatgagggct tacgcatcgc acctgatggg tcggtgtagc 480
gtgatcattt cactgttcag tagtaggtat gggaggagtg tagttggcag gatgtaggag 540
ctttgcaagc ggtggaacgg ttgagatgag tagtgaacag aggctttgcc caatgtcgga 600
tagtgagtgt ttctcgagca cgaaacgtgc aaggcaacag gttactgtag gtttatgtag 660
ttggcaagag tgggccttgc ccagtattcg gtagtaagtg tcaagcacga caccagattg 720
cgaagcaaca ggtaattgta ggtttacgta tcgtacgttt ttcatgggag tgtgacggaa 780
agttgtgggt agcagggtcc gggggagtct gcggcaagca gttcaacaga ttgatggaac 840
agaaagatta agaggcggag tgtccgctgt tgctgtgggc agaaagaggg cggcgtagag 900
aggcatttag tggatgcttt tgaggagttc tgggaggtca tcagtagtgg ggaaggtcta 960
ccgcaccgtc tggtcggcct attagttaat gcccacatga cgggaaaggc acctatgctg 1020
caagtcgcag ctcactgaaa aaatagagcc gtgcagggtc tgttttgacg cttgcgcatg 1080
taccagtagc ggaaaggttg ttaagtgcaa aaaatttcag tttatatagc gagtttatcg 1140
cagcccctca ctaaccgtga atctgtcagc gaatgcgtga gtacttcaat gttttggtcc 1200
accacttaca cgcatcatag gccgaaggtt gctcacattt tgacgatgaa aaaacgtgtg 1260
tatctaagaa aactgtctaa tgagcataaa atgcatcgtc gtaatataga gggagatgcg 1320
gtcagagacc tgtaaaacga tcagatgctg tcacaggagc cacctcacct agcgcacgtt 1380
tcaccataga aagttgccga cgcactcata cagaatccag aaaataacac aaaaatggag 1440
ttgtaatgat gcattgtgag cgcctgcagc atctgctaag gttagtcctt caacgggcac 1500
tccccccaaa gtccgactgc acatggggat ctaacctatt cttaacagac ctgactgatc 1560
ccattaactc aacaggctca catatgtatc atattaattc cggccagtgt ctctaaataa 1620
actcttttgt aggatctgcc aactcactgc gggggggcac acagaagcac cacattgcac 1680
gacactgctt ttgcgcaggc tgcggggcaa ttaaacgtta acagtgcttg atccggccga 1740
aatgacgcga aatatttaaa acattatctg tttgtcagcc taacggagat gacatggtcg 1800
cacaagagac tacagtgtgt gtgtgatgtc tttcgtgcat cccaccgagc ctctggaatt 1860
cggcaccgca ttagcccaca cgtaaaacat tgcgtaccta accaagaaga cttctcgggc 1920
agagaaaatg taaaattata cattagcaga gccacacatt acactaaatt gtttaattag 1980
gcttggttca cgttccgcag ctcgtaatgc gggcgcgcga cagatcaaca cacacacaca 2040
agcatctcgg cagcacgtag tcactagtgg aataaccgcg cacttcaaca gaccattaaa 2100
aacctagaca tttatatcct aaagcatgtt ctgttgaagc ttcacaaagc agaattctaa 2160
gacagcttag ctcgtcgcaa ctcaggtggt gaaacagcac catgctctag ctggcagctg 2220
ggactgtcac gtcgatgagc cctgagtttc tcatcgtaca cacgcatttt tcccagcatt 2280
tcaatttttt ttgttgaccc gggtgtgctc gcccactttg ttcctgttgt ccctttgctt 2340
tctgtgtttt tccgcaatga agcgcaaaat ttgcaaggca ctgatttgcg ctgctctggc 2400
aacaagcctg tgggctggcg caagcacaaa agtgtacgct tgggacggca aaattgacgg 2460
cacaggcact cacgcaatga ttgtgactca gggcattagc attctggaga acgacctgag 2520
caagaacgaa cccgagagcg tgcgcaaaaa cctggaaatt ctgaaagaaa acatgcacga 2580
actgcagctg ggcagcacat accctgacta cgacaagaac gcatacgacc tgtaccagga 2640
ccacttctgg gaccctgaca cagacaacaa ctttagcaaa gacaacagct ggtacctggc 2700
ttacagcatt cctgacacag gcgagagcca gattcgcaag ttcagcgcac tggctcgcta 2760
cgaatggcag cgcggcaact acaaacaggc tactttttac ctgggcgagg caatgcacta 2820
ctttggcgac attgacactc cctaccaccc tgctaacgtg actgcagtgg acagcgctgg 2880
ccacgtgaag ttcgagacat tcgctgagga gcgcaaagag cagtacaaga ttaacacagc 2940
aggctgcaaa acaaacgaga acttctacgc agacattctg aagaacaaag actttaacgc 3000
atggagcaag gaatacgcac gcggcttcgc aaagactggc aaaagcatct attacagcca 3060
cgctagcatg agccacagct gggacgactg ggactacgct gctaaggtga ctctggctaa 3120
cagccagaag ggcacagcag gctacatcta tcgctttctg cacgacgtga gcgagggcaa 3180
cgaccctagc gtgggcaaga acgtgaaaga actggtggca tacattagca ctagcggcga 3240
gaaggacgca ggcacagacg actacatgta cttcggcatt aagactaagg acggcaagac 3300
acaggaatgg gagatggaca accctggcaa cgacttcatg acaggcagca aggacacata 3360
cacattcaag ctgaaggacg agaacctgaa aattgacgac attcagaaca tgtggattcg 3420
caaacgcaag tacacagcat ttcccgacgc atacaaacct gaaaacatta aggttattgc 3480
aaacggcaag gtggtggtgg acaaagacat taacgaatgg attagcggca acagcacata 3540
caacattaag ggcagcggcg ctacaaactt cagcctgctg aaacaggcag gcgacgtgga 3600
ggaaaaccct ggccccatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat 3660
cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga 3720
gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc 3780
cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta 3840
ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca 3900
ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt 3960
cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg 4020
caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc 4080
cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg 4140
cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct 4200
gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa 4260
gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga 4320
cgagctgtac aagtaacgat cttttggtgg tgcgtgacgg ggtcagtcat tggatttggt 4380
atctgccgct ccatttgtag ctaggagagc ctctgatgcc gtgacatctt gctaggttcg 4440
cactgtttcc acaacgacta ctttgtttgg tcattttcac cgtgaaagta tgttcacctt 4500
ggagagagaa aatttgagag agctctgagt tgttggaaca gcccaagtag ctgactctca 4560
taggatacta ctaaagccaa acggcgcgtt gtagcgctca tctgcaggga ttgatcttta 4620
aaaaaatgat cttttaaggt tcatgccata cttattgagt tcgctaggtg tcaacttgtc 4680
gaacacattc ttgaggtgtt gcgtatctgg gcgctcccag gggttccatg tgaagcaatt 4740
gtccagcgtt gcgcggacgc tcggatgaaa ccaggcagga acggtaggtt tgcgacgatt 4800
gtacaagagc gcgtgtatta ctcctacgca tccacagaaa tcagcattgg taatcgtcgt 4860
ggctgttgca aggtctggta gcaaagctgc atatatttgc ttgactgaat ttcacttacc 4920
ctcgttagag tgtatgtctt cgtagggtat cggacccccc agtatttcaa ttaggcagca 4980
tgcaagcccc caaatatcaa gcttctcatc cacgtagttg ccttccacga agcattcagg 5040
agccatgtag cggggagacc ctccgttgtc ctccaattta agctttccgt gctgctctaa 5100
tgaccgtgtc ttgccaaagt cgcagagccg aatgttgtac tgcacacata agttgaacat 5160
cacagagaaa ccaagggaga aattcactca cagggctgtg cccaccctca ttcatcctgg 5220
tagaatagcc aaccaattgc acccacgtga agccaaaac 5259
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列 CPα毒素基因-F
<400> 26
atgaagcgca aaatttgcaa ggc 23
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列 EGFP-F
<400> 27
atggtgagca agggcgag 18

Claims (10)

1.一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，其特征在于，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的靶点位于ETH_00009555基因的3’UTR区。
2.一种ETH_00009555基因编辑系统，其特征在于，所述ETH_00009555基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。
3.根据权利要求2所述的ETH_00009555基因编辑系统，其特征在于，所述ETH_00009555基因编辑系统还包括Cas9。
4.根据权利要求2所述的ETH_00009555基因编辑系统，其特征在于，所述ETH_00009555基因编辑系统还包括同源重组片段。
5.根据权利要求4所述的ETH_00009555基因编辑系统，其特征在于，所述同源重组片段中包括α毒素基因和筛选标记基因；
优选地，所述筛选标记基因包括荧光标签基因。
6.一种重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体含有权利要求1所述的靶向ETH_00009555基因的sgRNA。
7.根据权利要求6所述的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体含有权利要求2～5任一项所述的ETH_00009555基因编辑系统。
8.根据权利要求7所述的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体为经过权利要求2～5任一项所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因中整合了所述α毒素基因和荧光标签基因的球虫载体。
9.一种权利要求6～8任一项所述的重组球虫载体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括PCR扩增检测和/或荧光检测。
10.根据权利要求9所述的重组球虫载体的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增检测的靶点基因包括α毒素基因和/或荧光标签基因；
优选地，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。
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CN113528347A (zh) * 2021-06-28 2021-10-22 佛山市正典生物技术有限公司 一种提高荧光艾美耳球虫卵囊分选成功率的方法和应用

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