CN114181938B - 一种表达r7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法 - Google Patents

一种表达r7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法，属于基因工程技术领域。本发明提供一种靶向ETH_00009555基因的sgRNA，可以进行精确地基因定点突变；由sgRNA和同源重组片段建立基因编辑系统，可精确地将卡氏住白细胞虫的R7蛋白和荧光标签蛋白等目的片段同源重组于ETH_00009555基因，构建一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体。所述重组球虫载体DNA经过PCR检测和测序，表明R7基因和荧光标签基因已成功重组于ETH_00009555基因；且重组球虫载体在荧光显微镜下具有明显的荧光信号，表明其已成功表达R7蛋白和荧光标签蛋白。

Description

一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法。
背景技术
CRISPR-Cas9基因编辑系统是由规律成簇间隔短回文重复序列(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein9，Cas9)组成，是继锌指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectornucleases，TALENs)技术之后迅速发展起来的基因组编辑技术，在细胞基因敲除中已被广泛应用。CRISPR-Cas9通过小向导RNA(small guide RNA，sgRNA)识别靶序列并引导Cas9蛋白对靶位点进行切割，使DNA发生双链断裂(DNA double-strand break，DSB)。断裂的DNA为防止被降解会自动启动内源性修复机制，而内源修复机制通常有两种，在非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复机制下修复时，在断裂缺口处往往随机的插入或删除碱基，若突变位点位于蛋白编码区(coding sequence，CDS)，将转录错误mRNA，导致翻译失败或蛋白失活从而实现基因敲除，而在同源重组(Homologous recombination，HR)修复机制以及修复模板存在的条件下，可以实现定点单个碱基或长片段的插入、删除或者突变，形成基因的重组与敲除。
鸡卡氏住白细胞虫病是由卡氏住白细胞虫侵害鸡的血液和内脏器官的组织细胞而引起的一种原虫病，这种原虫病对雏鸡(0～50天为雏鸡)的危害极大。鸡卡氏住白细胞虫寄生于鸡的红细胞、白细胞和内脏组织细胞内，引起鸡患血孢子虫病，主要临床表现为鸡冠发白、消瘦或绿色稀粪，成年鸡感染率高，鸡感染卡氏住白细胞虫后其生长发育受阻。
鸡球虫病是常见且危害十分严重的寄生虫病，对养鸡行业造成了严重的影响。柔嫩艾美耳球虫是众多球虫中的一种，其致病力最强，寄生于鸡的盲肠，主要危害3月龄内的雏鸡，鸡在食用球虫卵囊后，球虫在肠道内着床，繁殖并损害组织。病鸡感染球虫病后发病突然，容易造成大规模感染，对养殖厂造成巨大的损失。
卡氏住白细胞虫病和鸡球虫病是规模化养鸡工厂所面临的重要挑战，传统的药物治疗方法长期使用会产生耐药性和药物残留等问题，目前大量的实验表明虫体对多数抗虫药物已经产生了抗药性，因此开发针对球虫病和卡氏住白细胞虫病的疫苗是防治的关键。
目前利用基因工程技术研制的卡氏住白细胞虫病疫苗主要有重组亚单位疫苗和转基因植物疫苗两种。单一的疫苗只能对应一种球虫病，要想实现多种球虫病的免疫，需要较长的时间建立免疫屏障。在大型养殖孵化场中，快速免疫保护、降低鸡群的发病风险具有至关重要的作用，但是目前还没有能够同时免疫卡氏住白细胞虫和柔嫩艾美耳球虫的疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法，利用所述CRISPR-Cas9基因编辑系统可以在ETH_00009555基因上插入R7基因和EGFP基因，构建的重组球虫能稳定高效表达荧光信号和R7蛋白。本发明成功构建了表达R7蛋白和荧光蛋白标签的球虫载体，所述球虫载体便于筛选，其在荧光显微镜下能观察到自发荧光，且在靶向R7基因和荧光蛋白基因的PCR检测下为阳性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括基因编辑质粒和同源重组片段；
所述基因编辑质粒包括靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9；
所述同源重组片段包括R7基因和筛选标记基因。
本发明中，所述ETH_00009555基因的核苷酸序列来自于NCBI。
优选地，所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA包括SEQ ID No.2所示的序列。
优选地，所述R7基因的核苷酸序列包括SEQ ID No.1所示的序列。
本发明中R7基因编码卡氏住白细胞虫的第二代裂殖体(second-generationschizont，2GS)的外膜蛋白R7。R7蛋白可诱导机体产生抗2GS抗体，具有良好的免疫原性。接种R7蛋白可诱导免疫反应，提高鸡体对卡氏住白细胞虫的抵抗力。
优选地，所述筛选标记基因包括荧光标签基因。
优选地，所述荧光标签基因为EGFP基因。
本发明中的荧光筛选标记基因是EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)增强绿色荧光蛋白基因，EGFP发射出的荧光强度大，有利于筛选。
第二方面，本发明提供一种重组球虫载体，所述重组球虫载体含有第一方面所述的ETH_00009555基因编辑系统。
优选地，所述重组球虫载体为经过第一方面所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因上整合了所述R7基因和所述荧光标签基因的球虫。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的重组球虫载体的构建方法，所述构建方法包括：
构建基因编辑质粒；
构建同源重组片段；
将所述基因编辑质粒和所述同源重组片段导入球虫子孢子中，感染动物；
筛选阳性克隆，得到所述球虫载体。
本发明中，所述构建方法简单，可操作性强，编辑效率高，容易获得稳定性状遗传的虫株。
优选地，所述基因编辑质粒的构建方法包括：
PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接所述编码序列，得到含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒。
优选地，所述同源重组片段的构建方法包括：
依次将R7基因和筛选标记基因按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到克隆载体上，得到所述同源重组质粒；
以所得同源重组质粒为模板，通过PCR扩增得到同源重组片段。
优选地，所述导入包括电转染。
优选地，所述球虫包括柔嫩艾美耳球虫。
优选地，所述动物包括鸡。
优选地，所述筛选阳性克隆的步骤包括：根据同源重组片段上的荧光标签基因进行筛选，得到阳性球虫。
优选地，所述筛选阳性克隆的步骤还包括将所得阳性球虫口服接种，重复4～5代后得到稳定表达R7蛋白的重组球虫载体。
本发明中以所述EGFP基因作为荧光标签基因，在筛选的过程中通过在荧光显微镜下观察荧光即可筛选出阳性球虫，并且通过口服接种所述阳性球虫，重复4～5代后得到稳定表达R7蛋白的重组球虫载体。
作为优选技术方案，本发明所述重组球虫载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建基因编辑质粒：
PCR扩增所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的编码序列，连接所述编码序列，得到所述含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒；
(2)构建同源重组片段：
依次将R7基因和荧光标签基因按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到克隆载体上，得到所述同源重组质粒；
以所得同源重组质粒为模板，通过PCR扩增得到同源重组片段；
(3)将所述含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒和所述同源重组片段通过电转染导入柔嫩艾美耳球虫子孢子中，使用球虫子孢子感染鸡；
(4)筛选阳性克隆：
根据同源重组片段上的荧光标记基因进行荧光信号筛选，得到阳性荧光球虫；将所得阳性荧光球虫口服接种，重复4～5代后得到稳定表达R7蛋白的重组球虫载体。
步骤(1)和步骤(2)的顺序不受编号限制。
第四方面，本发明提供一种第二方面所述的重组球虫载体的检测方法，所述检测方法包括PCR扩增检测和/或荧光检测。
优选地，所述PCR扩增检测的靶点基因包括R7基因和/或荧光标签基因序列。
优选地，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。
本发明中对重组球虫载体的进行检测方法包括：提取重组球虫载体的基因组DNA，进行PCR检测，测序，R7基因和荧光蛋白基因都成功重组，证明成功构建一种表达R7蛋白和荧光标签蛋白的重组球虫载体。
需要说明的是，本发明中所使用的科学和技术术语及其缩略语具有本领域技术人员通常理解的含义。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明通过在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因中定点插入R7基因，避免了非特异性基因编辑，编辑效率高，脱靶率低。构建的重组球虫可以通过细胞分裂的方式将突变的基因传递给子代球虫，实现了基因突变的稳定性及可遗传性，降低了筛选的工作量，这种方法技术成熟，操作简单，成功率高，具有良好的重复性；R7基因和筛选标记基因之间插入了间隔序列，避免了R7蛋白和筛选标记蛋白之间形成融合蛋白，有利于R7蛋白发挥免疫学活性；EGFP发射出的荧光强度有利于阳性个体的筛选。
附图说明
图1为实施例2中同源重组质粒图谱。
图2为实施例2中球虫载体的荧光显微图片(放大倍数＝400倍)。
图3为实施例3中球虫载体的PCR检测图片(泳道M：DL10000 DNA Marker，泳道1：球虫载体DNA；泳道2：同源重组片段；泳道3：母株球虫DNA)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
PCR扩增试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
质粒提取试剂盒购自赛默飞世尔科技公司。
KLD反应试剂盒购自NEB(北京)有限公司。
电击缓冲液购自哈佛生物科学生物公司。
柔嫩艾美尔球虫来自佛山市正典生物技术有限公司。
雏鸡来自广东新兴县温氏总部后山SPF实验动物中心。
实施例1
本实施例提供一种ETH_00009555基因编辑系统，所述ETH_00009555基因编辑系统包括基因编辑质粒和同源重组片段；所述基因编辑质粒包括靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9；所述同源重组片段包括5’同源臂、3’同源臂、SAG13启动子、卡氏住白细胞虫R7基因和EGFP基因。
所述卡氏住白细胞虫R7基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
SEQ ID No.1：
ggagcaagtggtctggttacctttattagcccgaacaacgtccaggcggaaatcatcaacacccacggcgttcgttgtaaccagaacgaagaagttacccatcagacccatcagacccatcaaacccatcaaacccatcagacccatcaaacccaccagatccatcagatccaccagattcacggctacatgaccaaccagaagcacgaagaacacggcaagatcatcaaccaggtcaaagaaaacgtcaagaacaccgtcaacgagaacgtcaagaacaacgtcgacgagaacaccacctctgaacacgaaatcaccatcccgaacgagaacgacatcaagaccaacgacgagaacgaaaccacccactacgaacgcgagatcatctacatcgtggacgatctgccggaagttaacgttgaagaaagcgacgaaaccgaacacatcacctacgagatcgacaacgacatccaggaagaacacgagaaagtcacccacgaagaagaaaaagaagaagtgacccacgaagagatcgagaaagaagaacatgaagaagtgatccacgaagaagagaaagaagaagtgacccacgaagaaattgagaaagaagaacatgaagaagtgatccacgaagaagaaaaagaagaagtgacccacgaagagaaagaaaaagaagaacatgaagaagtg。
所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.2：aataggccgaccagacggtg。
本发明中，根据柔嫩艾美耳球虫ETH_00009555基因序列，针对ETH_00009555基因序列一号外显子序列设计sgRNA序列。
实施例2
本实施例提供一种重组球虫，所述重组球虫载体为经过实施例1中ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因上定点插入卡氏住白细胞虫R7基因的柔嫩艾美耳球虫。
所述重组球虫载体通过如下方法进行构建：
(1)构建含有靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9的基因编辑质粒：
PCR扩增：正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，模板为pSAG1-CAS9-U6质粒，得到PCR产物。
SEQ ID No.3：aataggccgaccagacggtggttttagagctagaaatagcaagttaa。
SEQ ID No.4：aacttgacatccccatttacc。
反应体系如表1所示。
表1
试剂 用量(μL)
酶、dNTPs和缓冲液的混合物 12.5
正向引物 1.25
反向引物 1.25
模板为pSAG1-CAS9-U6质粒 1
水 补足至25
PCR反应条件如表2所示：
表2
Figure BDA0003402435440000061
扩增片段大小为9600bp，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
PCR产物进行KLD反应，室温静置5min。KLD反应的反应体系如表3所示。
表3
试剂 用量(μL)
反应缓冲液 5
酶混合物 1
PCR产物 1
水 补足至10
将获得的KLD反应产物，转化入DH5α(100μL)感受态细胞中，涂LB/Amp平板，37℃倒置培养12h。
挑取单菌落置于5mL LB/Amp液体培养基中，37℃/180rpm振荡培养10h至菌液浑浊。
取500μL菌液和500μL 40％甘油混合，将混合后的菌液保藏于-20℃；剩余菌液用于质粒提取，并对提取的质粒进行酶切鉴定，反应体系如下：缓冲液2.0μL、SalⅠ酶1.0μL、质粒1.0μL和灭菌水16.0μL；37℃反应3h后进行琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产物为两条带(大小分别为6kb和3.7kb)即为阳性克隆。
将鉴定为阳性的克隆进行测序分析，使用通用引物M13进行单向测序，测序引物为M13反向引物，所述测序引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，测序结果显示靶点序列已完全被替换，基因编辑质粒构建成功。
SEQ ID No.5：aacttgacatccccatttacc。
(2)构建同源重组片段：
依次将ETH_00009555基因5’同源臂、SAG13启动子、卡氏住白细胞虫R7基因、EGFP荧光蛋白基因、SAG13终止子和ETH 00009555基因3’同源臂按顺序连接得到整体片段，将所述整体片段构建到载体上，得到所述同源重组质粒，所述同源重组质粒图谱如图1所示，所述同源重组质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。基因序列发送至深圳华大基因股份有限公司合成质粒。
SEQ ID No.6：
tttgcagcagagtagttcatgacttgcgaaacggcctctcgattaataatacgctttgccgcaacgtgaagtaggcgttattgtgtgctgcctgtcgctgagctcctgcatcgagcggcaaggggttcaaccgagcgcaaattctgtggaaatagctggacaaaagcatctgcgacgggtgggggcaggcgcagctagctgttgctcccgacatcagtcatggaaatgcgtttcaggctaagcaagtagctgcccgcctggtgggaagatgaggctaggaactgctatgtttgcccctcacttggcggtattgcagtgtagtacgtgcattgtgaacccagagaaatgtgctccgcgtgacgcagcgaggcacaggggaacagcaagaggggccgttattgctcagcgtgctggacccccttgttccttcaaaccttacttatgagggcttacgcatcgcacctgatgggtcggtgtagcgtgatcatttcactgttcagtagtaggtatgggaggagtgtagttggcaggatgtaggagctttgcaagcggtggaacggttgagatgagtagtgaacagaggctttgcccaatgtcggatagtgagtgtttctcgagcacgaaacgtgcaaggcaacaggttactgtaggtttatgtagttggcaagagtgggccttgcccagtattcggtagtaagtgtcaagcacgacaccagattgcgaagcaacaggtaattgtaggtttacgtatcgtacgtttttcatgggagtgtgacggaaagttgtgggtagcagggtccgggggagtctgcggcaagcagttcaacagattgatggaacagaaagattaagaggcggagtgtccgctgttgctgtgggcagaaagagggcggcgtagagaggcatttagtggatgcttttgaggagttctgggaggtcatcagtagtggggaaggtctaccgcaccgtctggtcggcctattagttaatgcccacatgacgggaaaggcacctatgctgcaagtcgcagctcactgaaaaaatagagccgtgcagggtctgttttgacgcttgcgcatgtaccagtagcggaaaggttgttaagtgcaaaaaatttcagtttatatagcgagtttatcgcagcccctcactaaccgtgaatctgtcagcgaatgcgtgagtacttcaatgttttggtccaccacttacacgcatcataggccgaaggttgctcacattttgacgatgaaaaaacgtgtgtatctaagaaaactgtctaatgagcataaaatgcatcgtcgtaatatagagggagatgcggtcagagacctgtaaaacgatcagatgctgtcacaggagccacctcacctagcgcacgtttcaccatagaaagttgccgacgcactcatacagaatccagaaaataacacaaaaatggagttgtaatgatgcattgtgagcgcctgcagcatctgctaaggttagtccttcaacgggcactccccccaaagtccgactgcacatggggatctaacctattcttaacagacctgactgatcccattaactcaacaggctcacatatgtatcatattaattccggccagtgtctctaaataaactcttttgtaggatctgccaactcactgcgggggggcacacagaagcaccacattgcacgacactgcttttgcgcaggctgcggggcaattaaacgttaacagtgcttgatccggccgaaatgacgcgaaatatttaaaacattatctgtttgtcagcctaacggagatgacatggtcgcacaagagactacagtgtgtgtgtgatgtctttcgtgcatcccaccgagcctctggaattcggcaccgcattagcccacacgtaaaacattgcgtacctaaccaagaagacttctcgggcagagaaaatgtaaaattatacattagcagagccacacattacactaaattgtttaattaggcttggttcacgttccgcagctcgtaatgcgggcgcgcgacagatcaacacacacacacaagcatctcggcagcacgtagtcactagtggaataaccgcgcacttcaacagaccattaaaaacctagacatttatatcctaaagcatgttctgttgaagcttcacaaagcagaattctaagacagcttagctcgtcgcaactcaggtggtgaaacagcaccatgctctagctggcagctgggactgtcacgtcgatgagccctgagtttctcatcgtacacacgcatttttcccagcatttcaattttttttgttgacccgggtgtgctcgcccactttgttcctgttgtccctttgctttctgtgtttttccgcaatggcgccccttcctcggcgaaggctagcgccctgcagggcattatcattgctggttggtctgcttgccgcaagttttgctttttctggagcaagtggtctggttacctttattagcccgaacaacgtccaggcggaaatcatcaacacccacggcgttcgttgtaaccagaacgaagaagttacccatcagacccatcagacccatcaaacccatcaaacccatcagacccatcaaacccaccagatccatcagatccaccagattcacggctacatgaccaaccagaagcacgaagaacacggcaagatcatcaaccaggtcaaagaaaacgtcaagaacaccgtcaacgagaacgtcaagaacaacgtcgacgagaacaccacctctgaacacgaaatcaccatcccgaacgagaacgacatcaagaccaacgacgagaacgaaaccacccactacgaacgcgagatcatctacatcgtggacgatctgccggaagttaacgttgaagaaagcgacgaaaccgaacacatcacctacgagatcgacaacgacatccaggaagaacacgagaaagtcacccacgaagaagaaaaagaagaagtgacccacgaagagatcgagaaagaagaacatgaagaagtgatccacgaagaagagaaagaagaagtgacccacgaagaaattgagaaagaagaacatgaagaagtgatccacgaagaagaaaaagaagaagtgacccacgaagagaaagaaaaagaagaacatgaagaagtggactacaaggacgacgacgacaaaggcagcggcgctacaaacttcagcctgctgaaacaggcaggcgacgtggaggaaaaccctggccccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacgatcttttggtggtgcgtgacggggtcagtcattggatttggtatctgccgctccatttgtagctaggagagcctctgatgccgtgacatcttgctaggttcgcactgtttccacaacgactactttgtttggtcattttcaccgtgaaagtatgttcaccttggagagagaaaatttgagagagctctgagttgttggaacagcccaagtagctgactctcataggatactactaaagccaaacggcgcgttgtagcgctcatctgcagggattgatctttaaaaaaatgatcttttaaggttcatgccatacttattgagttcgctaggtgtcaacttgtcgaacacattcttgaggtgttgcgtatctgggcgctcccaggggttccatgtgaagcaattgtccagcgttgcgcggacgctcggatgaaaccaggcaggaacggtaggtttgcgacgattgtacaagagcgcgtgtattactcctacgcatccacagaaatcagcattggtaatcgtcgtggctgttgcaaggtctggtagcaaagctgcatatatttgcttgactgaatttcacttaccctcgttagagtgtatgtcttcgtagggtatcggaccccccagtatttcaattaggcagcatgcaagcccccaaatatcaagcttctcatccacgtagttgccttccacgaagcattcaggagccatgtagcggggagaccctccgttgtcctccaatttaagctttccgtgctgctctaatgaccgtgtcttgccaaagtcgcagagccgaatgttgtactgcacacataagttgaacatcacagagaaaccaagggagaaattcactcacagggctgtgcccaccctcattcatcctggtagaatagccaaccaattgcacccacgtgaagccaaaac。
用所述同源重组质粒转化感受态细胞DH5α，提取质粒。用线性化引物PCR扩增所述同源重组质粒，所述线性化引物的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述线性化引物的反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，获得同源重组片段。
SEQ ID No.7：gctcagcgtgctggacc。
SEQ ID No.8：tacactctaacgagggtaagt。
(3)柔嫩艾美耳球虫子孢子转染及阳性克隆筛选：
取100万个刚提取的新鲜并且有活力的柔嫩艾美耳球虫子孢子悬液加入到电转杯中，用电击缓冲液Cytomix重悬虫体。
Cytomix的组成：120mmol/L KCl、0.15mmol/L CaCl2、10mmol/L K2HPO4(pH7.6)、25mmol/L HEPES(pH7.6)、2mmol/L EGTA和5mmol/L MgC12。
向重悬虫体中加入基因编辑质粒与同源重组片段，所述基因编辑质粒与所述同源重组片段拷贝数的比为1:1，质粒浓度在200～250ng/μL之间，用电击缓冲液定容至800μL，充分混合。
将电转杯置于Bio-Rad电穿孔仪中，设置电压2000v、电容25μF、电容∞，进行电击3次，电转后将电转杯中液体吸出，用适量PBS冲洗电转杯，将电转杯内液体和PBS冲洗液全部吸入1mL注射器。
拔掉注射器针头，蘸取甘油，经泄殖腔感染8日龄SPF鸡(是指生长在屏障系统或隔离器中、不存在国际或国内流行的主要鸡传染病病原的鸡)。
收集接种后6天的鸡粪便，纯化获得卵囊。卵囊孢子化后，使用倒置荧光显微镜观察有发荧光的卵囊，证明荧光蛋白表达，筛选荧光单卵囊，继续接种雏鸡进行传代，重复4代后得到阳性率达到80％的卵囊，获得稳定遗传荧光的卵囊，即可得到稳定遗传的球虫载体。
在荧光显微镜绿光下观测到发荧光的球虫即为球虫载体，如图2所示。
实施例3
本实施例提供一种重组球虫载体检测方法，所述检测方法用于实施例2中定点插入卡氏住白细胞虫R7基因的柔嫩艾美耳球虫。
所述重组球虫载体通过如下方法进行检测：
正向引物序列的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，反向引物的核苷酸序列如SEQID No.8所示，模板为球虫载体DNA、同源重组质粒、亲本株DNA，得到条带大小为4866bp和1923bp的PCR产物，反应体系如表4所示。图3为PCR结果。
表4
试剂 用量(μL)
酶、dNTPs和缓冲液的混合物 12.5
正向引物 1.25
反向引物 1.25
模板为DNA 1
水 补足至25
PCR反应条件如表5所示：
表5
Figure BDA0003402435440000101
扩增片段大小为4866bp，用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
如图3所示，结果表明，在柔嫩艾美耳球虫中成功重组R7基因，获得了重组球虫载体。
通过上述构建方法，本实施例成功在柔嫩艾美耳球虫的ETH_00009555基因上定点插入卡氏住白细胞虫R7基因，并获得了可稳定遗传的虫株。本发明所述的构建方法成功构建和筛选表达卡氏住白细胞虫R7蛋白的柔嫩艾美耳球虫，并且可通过构建的重组球虫载体用于疫苗研究，为预防卡氏住白细胞虫和柔嫩艾美耳球虫提供了新方法。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 佛山市正典生物技术有限公司
<120> 一种表达R7蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法
<130> 2021
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 1
ggagcaagtg gtctggttac ctttattagc ccgaacaacg tccaggcgga aatcatcaac 60
acccacggcg ttcgttgtaa ccagaacgaa gaagttaccc atcagaccca tcagacccat 120
caaacccatc aaacccatca gacccatcaa acccaccaga tccatcagat ccaccagatt 180
cacggctaca tgaccaacca gaagcacgaa gaacacggca agatcatcaa ccaggtcaaa 240
gaaaacgtca agaacaccgt caacgagaac gtcaagaaca acgtcgacga gaacaccacc 300
tctgaacacg aaatcaccat cccgaacgag aacgacatca agaccaacga cgagaacgaa 360
accacccact acgaacgcga gatcatctac atcgtggacg atctgccgga agttaacgtt 420
gaagaaagcg acgaaaccga acacatcacc tacgagatcg acaacgacat ccaggaagaa 480
cacgagaaag tcacccacga agaagaaaaa gaagaagtga cccacgaaga gatcgagaaa 540
gaagaacatg aagaagtgat ccacgaagaa gagaaagaag aagtgaccca cgaagaaatt 600
gagaaagaag aacatgaaga agtgatccac gaagaagaaa aagaagaagt gacccacgaa 660
gagaaagaaa aagaagaaca tgaagaagtg 690
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
aataggccga ccagacggtg 20
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
aataggccga ccagacggtg gttttagagc tagaaatagc aagttaa 47
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
aacttgacat ccccatttac c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 5
aacttgacat ccccatttac c 21
<210> 6
<211> 4866
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 6
tttgcagcag agtagttcat gacttgcgaa acggcctctc gattaataat acgctttgcc 60
gcaacgtgaa gtaggcgtta ttgtgtgctg cctgtcgctg agctcctgca tcgagcggca 120
aggggttcaa ccgagcgcaa attctgtgga aatagctgga caaaagcatc tgcgacgggt 180
gggggcaggc gcagctagct gttgctcccg acatcagtca tggaaatgcg tttcaggcta 240
agcaagtagc tgcccgcctg gtgggaagat gaggctagga actgctatgt ttgcccctca 300
cttggcggta ttgcagtgta gtacgtgcat tgtgaaccca gagaaatgtg ctccgcgtga 360
cgcagcgagg cacaggggaa cagcaagagg ggccgttatt gctcagcgtg ctggaccccc 420
ttgttccttc aaaccttact tatgagggct tacgcatcgc acctgatggg tcggtgtagc 480
gtgatcattt cactgttcag tagtaggtat gggaggagtg tagttggcag gatgtaggag 540
ctttgcaagc ggtggaacgg ttgagatgag tagtgaacag aggctttgcc caatgtcgga 600
tagtgagtgt ttctcgagca cgaaacgtgc aaggcaacag gttactgtag gtttatgtag 660
ttggcaagag tgggccttgc ccagtattcg gtagtaagtg tcaagcacga caccagattg 720
cgaagcaaca ggtaattgta ggtttacgta tcgtacgttt ttcatgggag tgtgacggaa 780
agttgtgggt agcagggtcc gggggagtct gcggcaagca gttcaacaga ttgatggaac 840
agaaagatta agaggcggag tgtccgctgt tgctgtgggc agaaagaggg cggcgtagag 900
aggcatttag tggatgcttt tgaggagttc tgggaggtca tcagtagtgg ggaaggtcta 960
ccgcaccgtc tggtcggcct attagttaat gcccacatga cgggaaaggc acctatgctg 1020
caagtcgcag ctcactgaaa aaatagagcc gtgcagggtc tgttttgacg cttgcgcatg 1080
taccagtagc ggaaaggttg ttaagtgcaa aaaatttcag tttatatagc gagtttatcg 1140
cagcccctca ctaaccgtga atctgtcagc gaatgcgtga gtacttcaat gttttggtcc 1200
accacttaca cgcatcatag gccgaaggtt gctcacattt tgacgatgaa aaaacgtgtg 1260
tatctaagaa aactgtctaa tgagcataaa atgcatcgtc gtaatataga gggagatgcg 1320
gtcagagacc tgtaaaacga tcagatgctg tcacaggagc cacctcacct agcgcacgtt 1380
tcaccataga aagttgccga cgcactcata cagaatccag aaaataacac aaaaatggag 1440
ttgtaatgat gcattgtgag cgcctgcagc atctgctaag gttagtcctt caacgggcac 1500
tccccccaaa gtccgactgc acatggggat ctaacctatt cttaacagac ctgactgatc 1560
ccattaactc aacaggctca catatgtatc atattaattc cggccagtgt ctctaaataa 1620
actcttttgt aggatctgcc aactcactgc gggggggcac acagaagcac cacattgcac 1680
gacactgctt ttgcgcaggc tgcggggcaa ttaaacgtta acagtgcttg atccggccga 1740
aatgacgcga aatatttaaa acattatctg tttgtcagcc taacggagat gacatggtcg 1800
cacaagagac tacagtgtgt gtgtgatgtc tttcgtgcat cccaccgagc ctctggaatt 1860
cggcaccgca ttagcccaca cgtaaaacat tgcgtaccta accaagaaga cttctcgggc 1920
agagaaaatg taaaattata cattagcaga gccacacatt acactaaatt gtttaattag 1980
gcttggttca cgttccgcag ctcgtaatgc gggcgcgcga cagatcaaca cacacacaca 2040
agcatctcgg cagcacgtag tcactagtgg aataaccgcg cacttcaaca gaccattaaa 2100
aacctagaca tttatatcct aaagcatgtt ctgttgaagc ttcacaaagc agaattctaa 2160
gacagcttag ctcgtcgcaa ctcaggtggt gaaacagcac catgctctag ctggcagctg 2220
ggactgtcac gtcgatgagc cctgagtttc tcatcgtaca cacgcatttt tcccagcatt 2280
tcaatttttt ttgttgaccc gggtgtgctc gcccactttg ttcctgttgt ccctttgctt 2340
tctgtgtttt tccgcaatgg cgccccttcc tcggcgaagg ctagcgccct gcagggcatt 2400
atcattgctg gttggtctgc ttgccgcaag ttttgctttt tctggagcaa gtggtctggt 2460
tacctttatt agcccgaaca acgtccaggc ggaaatcatc aacacccacg gcgttcgttg 2520
taaccagaac gaagaagtta cccatcagac ccatcagacc catcaaaccc atcaaaccca 2580
tcagacccat caaacccacc agatccatca gatccaccag attcacggct acatgaccaa 2640
ccagaagcac gaagaacacg gcaagatcat caaccaggtc aaagaaaacg tcaagaacac 2700
cgtcaacgag aacgtcaaga acaacgtcga cgagaacacc acctctgaac acgaaatcac 2760
catcccgaac gagaacgaca tcaagaccaa cgacgagaac gaaaccaccc actacgaacg 2820
cgagatcatc tacatcgtgg acgatctgcc ggaagttaac gttgaagaaa gcgacgaaac 2880
cgaacacatc acctacgaga tcgacaacga catccaggaa gaacacgaga aagtcaccca 2940
cgaagaagaa aaagaagaag tgacccacga agagatcgag aaagaagaac atgaagaagt 3000
gatccacgaa gaagagaaag aagaagtgac ccacgaagaa attgagaaag aagaacatga 3060
agaagtgatc cacgaagaag aaaaagaaga agtgacccac gaagagaaag aaaaagaaga 3120
acatgaagaa gtggactaca aggacgacga cgacaaaggc agcggcgcta caaacttcag 3180
cctgctgaaa caggcaggcg acgtggagga aaaccctggc cccatggtga gcaagggcga 3240
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca 3300
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa 3360
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac 3420
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa 3480
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa 3540
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct 3600
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta 3660
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt 3720
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa 3780
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc 3840
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac 3900
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taacgatctt ttggtggtgc 3960
gtgacggggt cagtcattgg atttggtatc tgccgctcca tttgtagcta ggagagcctc 4020
tgatgccgtg acatcttgct aggttcgcac tgtttccaca acgactactt tgtttggtca 4080
ttttcaccgt gaaagtatgt tcaccttgga gagagaaaat ttgagagagc tctgagttgt 4140
tggaacagcc caagtagctg actctcatag gatactacta aagccaaacg gcgcgttgta 4200
gcgctcatct gcagggattg atctttaaaa aaatgatctt ttaaggttca tgccatactt 4260
attgagttcg ctaggtgtca acttgtcgaa cacattcttg aggtgttgcg tatctgggcg 4320
ctcccagggg ttccatgtga agcaattgtc cagcgttgcg cggacgctcg gatgaaacca 4380
ggcaggaacg gtaggtttgc gacgattgta caagagcgcg tgtattactc ctacgcatcc 4440
acagaaatca gcattggtaa tcgtcgtggc tgttgcaagg tctggtagca aagctgcata 4500
tatttgcttg actgaatttc acttaccctc gttagagtgt atgtcttcgt agggtatcgg 4560
accccccagt atttcaatta ggcagcatgc aagcccccaa atatcaagct tctcatccac 4620
gtagttgcct tccacgaagc attcaggagc catgtagcgg ggagaccctc cgttgtcctc 4680
caatttaagc tttccgtgct gctctaatga ccgtgtcttg ccaaagtcgc agagccgaat 4740
gttgtactgc acacataagt tgaacatcac agagaaacca agggagaaat tcactcacag 4800
ggctgtgccc accctcattc atcctggtag aatagccaac caattgcacc cacgtgaagc 4860
caaaac 4866
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 7
gctcagcgtg ctggacc 17
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 8
tacactctaa cgagggtaag t 21

Claims (5)

1.一种ETH_00009555基因编辑系统，其特征在于，所述ETH_00009555基因编辑系统包括基因编辑质粒和同源重组片段；
所述基因编辑质粒包括靶向ETH_00009555基因的sgRNA和Cas9；
所述同源重组片段包括R7基因和筛选标记基因；所述筛选标记基因包括荧光标签基因；所述R7基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的序列；
所述同源重组片段由同源重组质粒线性化得到，所述线性化采用的引物为SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8；所述同源重组质粒的核苷酸序列为SEQ ID No.6；
所述靶向ETH_00009555基因的sgRNA为SEQ ID No.2所示的序列。
2.一种重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体含有权利要求1所述的ETH_00009555基因编辑系统。
3.根据权利要求2所述的重组球虫载体，其特征在于，所述重组球虫载体为经过权利要求1所述的ETH_00009555基因编辑系统编辑后，在ETH_00009555基因中整合了所述R7基因和荧光标签基因的球虫载体。
4.一种权利要求2或3所述的重组球虫载体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括PCR扩增检测和/或荧光检测；
所述PCR扩增检测的靶点基因包括R7基因和/或荧光标签基因序列，所述PCR扩增检测的正向引物为SEQ ID No.7，所述PCR扩增检测的反向引物为SEQ ID No.8。
5.根据权利要求4所述的重组球虫载体的检测方法，其特征在于，所述荧光检测包括根据所述重组球虫载体的荧光进行检测。
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