CN111849979B

CN111849979B - 一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法

Info

Publication number: CN111849979B
Application number: CN202010576529.3A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 朱紫祥; 张向乐; 高利利; 杨帆; 曹伟军; 王聪聪; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-06-22
Filing date: 2020-06-22
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2040-06-22
Also published as: CN111849979A

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法。本发明设计了一种特异性靶向RPSA基因的sgRNA；所述的sgRNA能够特异性靶向RPSA基因，应用CRISPR‑Cas9技术实现了对宿主细胞中RPSA基因的完全敲除，敲除效率高；本发明还提供了一种通过CRISPR‑Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建RPSA基因敲除细胞系的方法；敲除宿主细胞中RPSA基因不仅能够促进FMDV病毒的复制，可用于提高FMDV疫苗的生产量和抗原表达量；而且还意外的发现，敲除宿主细胞中RPSA基因能够显著抑制塞内卡谷病毒在细胞内的复制；为进一步研究RPSA基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

Description

一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA、RPSA基因敲除细胞系的构建方法。

背景技术

基因组操作技术是基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。通过人为操作引起基因组特定碱基插入、缺失或替换等，对基因组进行精确修饰和定向编辑的基因组编辑(Genome editing)技术的出现使得生命科学的各大领域有了新的进步，并且被广泛应用于基础研究和临床治疗等方面。最初的基因编辑技术是将外源DNA，利用注射或者电转的方法导入细胞中，通过发生同源重组把导入的DNA片段插入到细胞基因组，但是此类技术对细胞活性和外源DNA损伤较大，致使其插入效率较低，导致其应用以及推广上受到一定程度上的限制。CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9)基因编辑技术是继锌指核酸内切酶(Zinc-finger nucleases, ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,Talens)) 技术之后而衍生的第三代新型基因编辑技术，由Cas9核酸酶和特异性的sgRNA构成，是一种具有广阔前景的基因修饰工具。

CRISPR-Cas9技术是基于广泛存在于细菌及古细菌中的一种获得性免疫防御机制经由人工改造开发而建立，是利用小分子RNA介导的一种靶向基因组编辑新技术。该技术通过导向 RNA序列在靶标基因特定位点进行切割引起DNA双链断裂，进而诱发细胞固有的同源重组和非同源末端自我修复过程，实现对基因组特定靶标位点进行编辑和修饰。相对于之前的技术来说，该技术能够实现基因精准编辑，且使用便捷，重复性好，合成简单，操作灵活，成本低，毒性小，适用范围广，为基因组定向改造、调控与应用等带来突破性革命。CRISPR/Cas9 技术目前已广泛应用于细胞的基因编辑和基因调节、基因敲除动物模型的构建、人类疾病动物模型的治疗研究等领，且已有相关实验证实该技术能够在人类胚胎中发挥基因编辑的作用，未来应用于临床靶向治疗前景广阔。

宿主核糖体蛋白SA(ribosomal protein SA,RPSA)是核糖体亚基的组成部分，也被称为层粘连蛋白受体1，在多种细胞中广泛表达，具有多形性、多位点、多功能的特点，是一种多功能蛋白。RPSA在从基质粘附到核糖体生物发生等过程中发挥作用，其参与RNA合成、细胞迁移、血管生成、蛋白质翻译和脾脏发育等生物学反应过程，并与细胞核结构紧密联系。同时，分布于细胞表面的RPSA能够被登革热病毒、猪瘟病毒和委内瑞拉马脑炎病毒利用作为受体感染靶标细胞，但是关于RPSA在其他病毒中的功能至今仍不清楚。

早期基因打靶技术因插入效率较低、打靶定点编辑能力差等缺点，使其应用以及推广受到了很大程度的限制，至今未构建出RPSA基因敲除细胞系。

塞内卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)作为塞内卡病毒属(Senecavirus)唯一的成员，是无囊膜、单股正链RNA病毒。SVV疫情的爆发会对畜牧养殖业造成巨大的经济损失，如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止该病的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。但由于SVV感染与致病机制仍不清楚，仍未有商品化的疫苗或药物问世，给该病的防控带来难题，急需阐明感染致病机制。

口蹄疫病毒属小RNA病毒科、口蹄疫病毒属，由其引起的口蹄疫是一种急性、热性、高致病性传染病。口蹄疫在世界范围内广泛分布，是世界性流行性偶蹄动物传染病。目前，接种疫苗是预防该病的最有效方法。但口蹄疫病毒有七种不同的血清型，且彼此之间几乎没有交叉保护，选择正确血清型的疫苗接种防控是极其重要的。口蹄疫可感染多种偶蹄动物，被 OIE列为A类头号烈性传染病。动物感染该病后，口、鼻、蹄、乳头部位皆出现大量泡状斑疹，水泡溃烂后形成明显斑痂。口蹄疫致病性高，但致死率较低，动物长期患病会出现跛行和生产性能下降等，对养殖户产生了非常消极的经济影响。因此通过CRISPR-Cas9技术构建促进FMDV病毒复制的细胞系对于口蹄疫疫苗的生产意义重大。

基于上述问题，本发明首先提供了一种靶向RPSA基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向RPSA基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中RPSA基因的完全敲除，成功构建了一种RPSA基因敲除的细胞系，打靶准确、敲除效率高；通过敲除RPSA基因，获得RPSA基因编码蛋白的功能丧失的细胞系不仅能够促进细胞中FMDV病毒的复制，提高了 FMDV疫苗的生产量和抗原表达量，而且能够显著抑制SVV病毒的复制；通过使RPSA基因编码蛋白的功能丧失，可用于FMDV疫苗的生产和抗SVV病毒动物的育种。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种使RPSA基因编码蛋白的功能丧失制备具有抑制塞内卡谷病毒(Seneca valley virus)复制细胞的应用。

本发明的另一目的在于提供一种使RPSA基因编码蛋白的功能丧失构建具有塞内卡谷病毒(Seneca valley virus)抗性细胞系的应用。

优选地，所述使RPSA基因编码蛋白的功能丧失的方法包括基因敲除技术、基因突变技术、基因插入技术。

本发明的目的在于提供一种特异性靶向RPSA基因的sgRNA，所述sgRNA包括 RPSA-sgRNA1、RPSA-sgRNA2、RPSA-sgRNA3、RPSA-sgRNA4中的任一种，所述sgRNA 的核苷酸序列为：

RPSA-sgRNA1-F：5’-GCTCAATAGCAACGATGGCCC-3’；

RPSA-sgRNA1-R：5’-GGGCCATCGTTGCTATTGAGC-3’；

RPSA-sgRNA2-F：5’-GCATCGTTGCTATTGAGAACC-3’；

RPSA-sgRNA2-R：5’-GGTTCTCAATAGCAACGATGC-3’；

RPSA-sgRNA3-F：5’-GTCTCAATAGCAACGATGGCC-3’；

RPSA-sgRNA3-R：5’-TCGTTGCTATTGAGAACCCGC-3’；

RPSA-sgRNA4-F：5’-GTCTCAATAGCAACGATGGCC-3’；

RPSA-sgRNA4-R：5’-GGCCATCGTTGCTATTGAGAC-3’。

优选地，所述sgRNA为RPSA-sgRNA2、所述sgRNA的核苷酸序列为：

RPSA-sgRNA2-F：5’-GCATCGTTGCTATTGAGAACC-3’；

RPSA-sgRNA2-R：5’-GGTTCTCAATAGCAACGATGC-3’。

本发明的另一目的在于提供一种sgRNA在敲除RPSA基因中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种sgRNA在制备RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种用于敲除RPSA基因的试剂盒，所述试剂盒包括上述 sgRNA或靶向敲除RPSA基因的打靶载体，所述靶向敲除RPSA基因的打靶载体包括上述sgRNA和Cas9蛋白基因的编码序列。

本发明的另一目的在于提供一种RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中RPSA基因编码蛋白功能丧失。

优选地，所述方法为CRISPR-Cas9技术。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备含有粘性末端的特异性靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸的双链片段；

(2)将步骤(1)制备的双链片段插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；

(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得RPSA基因功能缺失细胞系。

优选地，所述步骤(1)中含有粘性末端的特异性靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸为RPSA-sgRNA1-oligo、RPSA-sgRNA2-oligo、RPSA-sgRNA3-oligo、RPSA-sgRNA4-oligo中的任一种，所述sgRNA寡聚核苷酸的序列为：

RPSA-sgRNA1-oligo-F：5’-CACCGCTCAATAGCAACGATGGCCC-3’；

RPSA-sgRNA1-oligo-R：5’-AAACGGGCCATCGTTGCTATTGAGC-3’；

RPSA-sgRNA2-oligo-F：5’-CACCGCATCGTTGCTATTGAGAACC-3’；

RPSA-sgRNA2-oligo-R：5’-AAACGGTTCTCAATAGCAACGATGC-3’；

RPSA-sgRNA3-oligo-F：5’-CACCGTCTCAATAGCAACGATGGCC-3’；

RPSA-sgRNA3-oligo-R：5’-AAACTCGTTGCTATTGAGAACCCGC-3’；

RPSA-sgRNA4-oligo-F：5’-CACCGTCTCAATAGCAACGATGGCC-3’；

RPSA-sgRNA4-oligo-R：5’-AAACGGCCATCGTTGCTATTGAGAC-3’。

优选地，所述步骤(1)中含有粘性末端的特异性靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸为RPSA-sgRNA2-oligo，所述sgRNA寡聚核苷酸的序列为：

RPSA-sgRNA2-F-oligo：5’-CACCGCATCGTTGCTATTGAGAACC-3’；

RPSA-sgRNA2-R-oligo：5’-AAACGGTTCTCAATAGCAACGATGC-3’。

本发明的另一目的在于提供一种根据上述方法制备获得的RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系。

本发明的另一目的在于提供一种RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系在口蹄疫病毒疫苗生产中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系在动物抗塞内卡谷病毒(Seneca valley virus)育种中的应用。

本发明的有益效果是：①本发明提供了一种靶向RPSA基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向RPSA基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中RPSA基因的完全敲除，打靶准确、敲除效率高；②本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法；③通过使RPSA基因编码蛋白功能丧失，不仅获得的了具有SVV抗性表型的宿主细胞，能够抑制SVV的复制，而且能够促进FMDV病毒的复制，提高了FMDV疫苗的抗原表达量，降低疫苗生产过程中SVV污染的风险；④构建的RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系可用于FMDV疫苗的生产和动物抗塞内卡谷病毒(Seneca valley virus)的育种。

附图说明

图1PX330-RPSA-sgRNA重组质粒的核酸电泳检测结果；

图2转染PX330-RPSA-sgRNA质粒后，BHK21细胞DNA check引物PCR扩增结果；

图3sgRNA酶切效率的检测结果；

图4转染PX330-RPSA-sgRNA2质粒后，BHK21细胞DNA check引物扩增片段测序图谱；

图5转染PX330-RPSA-sgRNA2质粒后，BHK21细胞RPSA蛋白Western blotting检测结果；

图6转染PX330-RPSA-sgRNA2质粒后，单克隆细胞团观察结果图；

图7RPSA基因敲除BHK21备选细胞RPSA蛋白Western blotting检测结果；

图8SVV在RPSA基因敲除BHK21细胞中复制水平的Western blotting检测结果；

图9SVV在RPSA基因敲除BHK21细胞中复制水平的qPCR检测结果；

图10FMDV在RPSA基因敲除BHK21细胞中复制水平的Western blotting检测结果；

图11FMDV在RPSA基因敲除BHK21细胞中复制水平的qPCR检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

定义

术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明通过对宿主细胞中的RPSA基因靶向敲除，导致RPSA基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了RPSA基因编码蛋白功能丧失的细胞系，并用于FMDV疫苗的生产以及抗SVV动物育种。但是本发明并不局限于RPSA基因敲除，也可通过其他技术手段使RPSA基因编码蛋白的功能丧失，并用于构建RPSA基因编码蛋白功能丧失的细胞系。

术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的RPSA基因敲除，获得的RPSA基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系既能抑制SVV感染后的病毒复制，又促进FMDV抗原的表达；本发明也可以通过对宿主细胞中的RPSA基因突变，或插入基因片段，导致RPSA基因编码蛋白发生移码突变，成功构建出RPSA基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系；也可以通过基因沉，在不损伤原有RPSA基因的情况下使RPSA基因基因低表达或不表达，从而抑制SVV感染后的病毒复制，用于预防或治疗SVV感染。

术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。

本发明通过人工合成了靶向RPSA基因的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向RPSA基因的 sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段；

本发明在直接靶向剪接RPSA基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除RPSA 基因的方法，以幼仓鼠肾细胞BHK21为例，进行了RPSA基因敲除，为FMDV疫苗的生产及SVV的预防或治疗提供了一种策略。本发明虽然仅对幼仓鼠肾细胞BHK21中RPSA基因进行敲除，获得了一种基因敲除宿主细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物细胞中RPSA基因敲除，构建具有SVV抗性，和/或FMDV表达的基因敲除宿主细胞。

CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了 Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对RPSA基因的sgRNA序列，实现RPSA基因的准确、高效地敲除，获得一种既具有SVV抗性，又能促进FMDV表达的RPSA基因敲除单克隆细胞系，打靶率高达 30％，从而为FMDV疫苗的生产以及SVV感染的预防或治疗提供新的策略。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向RPSA基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到RPSA基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。

SVV(CH-GD-2017-1株，基因登录号MF189000.1)与FMDV(O/BY/CHA/2010株，基因登录号JN998085.1)均由本团队分离，并保存于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。

实施例1 靶向RPSA基因sgRNA的设计

利用NCBI数据库查询RPSA基因序列，并找到金仓鼠全基因组(GenBank登录号：NW_004801729)，定位RPSA在基因组中不同转录本的重叠区的第一个外显子段，用于靶点设计。

根据CRISPR/Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispr-era.stanford.edu/ind ex.jsp进行sgRNA的设计，根据评分选取4对20bp的sgRNA片段，分别命名为：RPSA-sg RNAsp1、RPSA-sgRNAsp2、RPSA-sgRNAsp3、RPSA-sgRNAsp4：在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA-oligo)。所述sgRNA-oligo由金唯智生物科技有限公司合成，详细序列见表1。

表1靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸

注：下划线部分所标注的序列为加入的酶切位点，不加下划线的序列为sgRNA序列。

实施例2 sgRNA重组质粒PX330-sgRNA的构建

双链sgRNA-oligo的获得：将实施例1中合成的sgRNA-oligo稀释至100μmol/L，配制共 10μl反应体系：上游引物2.5，μl；下游引物，2.5μl；ddH₂O，4μl；10×TaqBuffer，1μl。反应程序：按照0.3℃/s梯度降温进行退火处理，95℃，3min；95℃，1min；85℃，1min；75℃，1min；65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min；25℃，1min；16℃，1h；使上下游引物退火形成双链sgRNA-oligo。

PX330载体质粒的酶切：利用BBSI限制性内切酶酶切PX330载体，共配制20μl酶切体系如下：PX330载体，5μl；BBSI，1μl；10×Buffer，2μl；ddH₂O，12μl。37℃中放置2h进行酶切。之后进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收含有粘性末端的PX330载体线性化片段。

PX330-sgRNA重组质粒的构建：将纯化回收PX330线性化片段产物与双链sgRNA-oligo 进行连接反应，反应体系：T4 Ligase，1μl；10×T4Ligase Buffer，1μl；PX330酶切纯化片段， 1.5μl；双链sgRNA-oligo，6.5μl，共10μl体系。16℃过夜连接，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。转化程序：将50μl的Trans5α感受态细胞与 500ng连接产物混合，冰上放置30min。42℃水浴热激45s，取出冰浴2min。加入无抗性LB 培养液500ml，37℃，220rpm摇菌60min。将复苏好的菌液4000rpm室温离心5min。吸去400μl 上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37℃温箱培养12h，观察生长状况。

挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，利用

质粒提取试剂盒提取并测序验证，PX330-RPSA-sgRNA各个质粒进行核酸电泳检测，检测结果如图1所示，质粒大小与预期结果相符，表明表达sgRNA的质粒PX330-RPSA-sgRNA1(对应RPSA-sgRNA1)、PX330-RPSA-sgRNA2(对应RPSA-sgRNA2)、PX330-RPSA-sgRNA3(对应RPSA-sgRNA3)、PX330-RPSA-sgRNA4(对应RPSA-sgRNAp4)构建成功。

实施例3 细胞转染

在转染前复苏BHK21细胞于T25细胞瓶中，使用含有10％的FBS、1％双抗的DMEM 培养基培养，当细胞传代2-3次性状稳定且状态较好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板中，待细胞融合度至70％～80％时，将实施例2中成功构建的重组质粒(PX330-RPSA-sgRNA1、PX330-RPSA-sgRNA2、PX330-RPSA-sgRNA3、PX330-RPSA-sgRNA4)2μg分别与Lipofectamine3000，4μl(按照比例1μg：2μL)加至50μl的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将四种脂质体-质粒DNA混合物静置15min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、 5％CO₂培养箱中培养48h。

1.细胞DNA的提取及SURVEYOR实验：

按照微量DNA提取试剂盒的操作说明提取PX330-sgRNA重组质粒转染48h后的BHK21细胞总DNA，使用check引物进行扩增，总25μl反应体系：Premix Taq(Ex Taq Version2.0plus dye)，12.5μl；DNA模板，0.5μg；DNA check引物：BHK-RPSA-Check-F(5’-GTCTGCCTTCCTGTAGTGTCCT-3’(SEQ ID NO.17)；和BHK-RPSA-Check-R(5’-CAACCTAACTCAGCCAGCCTAT-3’(SEQ ID NO.18))各1μl；ddH₂O，10μl。反应程序：98℃，3min； 98℃，10sec，55℃，30sec，30个循环；72℃，30sec；72℃，5min；16℃保存。将PCR 产物进行纯化回收。按照0.3℃/s梯度降温进行退火处理，95℃，3min；95℃，1min；85℃， 1min；75℃，1min；65℃，1min；55℃，1min；45℃，1min；35℃，1min；25℃，1min；16℃， 1h。之后对扩增出的目的片段进行酶切鉴定，共10μl体系：再退火DNA产物，8μl；T7核酸内切酶，1μl；10×Buffer，1μl；37℃温育1小时。使用10×LoadingBuffer终止反应后，然后用1％琼脂糖胶进行电泳鉴定，检测是否具有切割片段，分析切割效率。

转染PX330-RPSA-sgRNA质粒后，BHK21细胞DNA check引物PCR扩增结果如图2 所示，以野生型BHK21细胞为对照，所有转染组均扩增到了约750bp大小片段，与预期设计片段大小相符，可用于下一步酶切效率分析。

将DNA check引物扩增片段进行胶回收纯化后，进行变性再退火，进行T7EI酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，分析酶切效率，酶切效率结果如图3所示，4对sgRNA转染均能够引起RPSA基因的编辑(产生明显切割条带)，通过灰度扫描表明转染 PX330-RPSA-sgRNA2后(0.293)，酶切效率更高，说明扩增片段中发生了更有效的基因编辑。

将PX330-RPSA-sgRNA2质粒转染BHK21细胞后，进一步利用DNAcheck引物扩增含有打靶位点区段的RPSA基因片段，纯化回收后送样进行测序，测序图谱如图4所示，测序峰图中出现了大量的套峰，表明扩增片段中发生了有效的基因编辑，RPSA-sgRNA2发挥了更有效RPSA基因打靶效应。

转染PX330-RPSA-sgRNA2质粒后，BHK21细胞中RPSA蛋白的Western blotting检测结果如图5所示，相较于野生型BHK21细胞，转染PX330-RPSA-sgRNA2质粒后的BHK21细胞(多克隆混合细胞)中RPSA蛋白表达显著降低，说明转染PX330-RPSA-sgRNA2质粒后，构建的多克隆混合宿主细胞中的RPSA基因的表达显著下降，sgRNA2成功的编辑了RPSA 基因，使RPSA基因功能缺失。

2.用有限稀释法进行RPSA基因敲除细胞系的筛选：

SURVEYOR实验中具有切割条带的细胞进行有限稀释、挑选单克隆细胞。利用0.25％胰酶消化细胞，轻拍脱落后，加入培养基吹打均匀；留取100μl细胞悬液用于后续测序使用以确定打靶作用。剩余细胞使用无血清培养基进行有限稀释法，按照10倍依次稀释，然后进行细胞计数。使用100μl排枪将稀释后细胞悬液每孔0.1ml加入96孔板中，每孔计算含有0.5 个细胞。培养4-5天后观察，除去双细胞孔、多细胞孔，对细胞形态正常且单一细胞孔进行标记；继续培养约7-9天，随机选取4个单克隆细胞团进行拍照和图片采集，显微观察结果如图6所示，表明单克隆细胞团生长状况良好，可用于进一步培养和后续检测分析。确认单克隆细胞团生长状况良好后，将96孔板中筛选的单克隆细胞团胰酶消化转入48孔板继续传代培养，待细胞长满后依次传至24孔板、6孔板进行放大培养。

3.RPSA基因敲除BHK21细胞系的Western blotting鉴定：

以未发生基因编辑的BHK21细胞(野生型细胞)作为阴性对照。取野生型细胞(WT)株与10株敲除型候选细胞株(分别编号为#1-#10)分别培养，待细胞长满后，收取细胞放置冰上。加入适量1×SDS loading Buffer充分搅拌裂解，待细胞全部脱落后吸取至EP管中，做好标记；金属浴放置10min变性，离心后，取上清进行SDS-PAGE。电泳后通过湿转法转移至NC膜，转印后使用5％的脱脂奶粉封闭，用购买的67kDaLaminin兔抗为一抗，羊抗兔IgG(IgG-HRP)为二抗，进行抗原抗体复合物检测，对RPSA基因敲除的BHK21单克隆细胞系在蛋白表达水平进行验证。实验结果如图7所示，WT检测到清晰的RPSA蛋白条带，在10 株候选细胞株中，#1、#6和#7候选株未检测到RPSA蛋白条带，说明#1、#6和#7候选株中 RPSA基因打靶成功，说明采用本发明提供的sgRNA，并应用CRISPR-Cas9技术实现了对宿主细胞中RPSA基因的完全敲除，打靶效率达30％。

综上所述，本发明通过CRISPR-Cas9技术成功构建了RPSA基因编码蛋白功能丧失的细胞系。但本发明并不局限于CRISPR-Cas9技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使 RPSA基因编码蛋白功能丧失也能够获得RPSA基因编码蛋白功能丧失的细胞系。

实施例4 RPSA基因敲除BHK21细胞系对SVV复制的影响

用RPSA基因敲除BHK21细胞和野生型BHK21细胞，进行正常传代培养后，将细胞铺至35mm细胞培养皿，接种CH-GD-2017-1株塞内卡谷病毒，分别用Western blotting和qPCR方法检测SVV复制情况。Western blotting检测结果如图8所示，结果表明，RPSA基因敲除BHK21细胞中基本检测不到SVV的VP2蛋白表达；qPCR检测结果如图9所示，RPSA基因敲除BHK21细胞接种SVV后病毒含量不变，而野生型BHK21细胞接种SVV后病毒含量显著升高。以上结果表明，通过基因编辑技术获得RPSA基因敲除BHK21细胞能够显著抑制 SVV的复制，具有SVV抗性。因此，构建的RPSA基因编码蛋白的功能丧失细胞可用于动物抗SVV病毒的育种。

实施例5 RPSA基因敲除BHK21细胞系对FMDV病毒复制的影响

用RPSA基因敲除BHK21细胞和野生型BHK21细胞，进行正常传代培养后，将细胞铺至35mm细胞培养皿，接种O/BY/CHA/2010株口蹄疫病毒，分别用Western blotting和qPCR方法检测FMDV复制情况。Western blotting检测结果如图10所示，相较于野生型BHK21细胞，RPSA基因敲除BHK21细胞中口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP1、VP3的表达量增高；qPCR 检测结果如图11所示，RPSA基因敲除BHK21细胞接种口蹄疫后，病毒含量升高，且与野生型BHK21细胞相比，RPSA基因敲除BHK21细胞接种口蹄疫后病毒含量升高显著。以上结果表明，构建的RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系可用于口蹄疫病毒疫苗生产。

以上所述仅为本发明的个别示范性实施案例的细节，对于本领域的技术人员来说，本发明在实际应用过程中根据具体的制备条件可以有各种更改和变化，并不用于限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种靶向敲除RPSA基因的sgRNA及RPSA基因敲除细胞系的构建方法

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcaatagc aacgatggcc c 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggccatcgt tgctattgag c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcgttgc tattgagaac c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggttctcaat agcaacgatg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtctcaatag caacgatggc c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgttgctat tgagaacccg c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtctcaatag caacgatggc c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggccatcgtt gctattgaga c 21

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccgctcaa tagcaacgat ggccc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacgggcca tcgttgctat tgagc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccgcatcg ttgctattga gaacc 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacggttct caatagcaac gatgc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caccgtctca atagcaacga tggcc 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaactcgttg ctattgagaa cccgc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caccgtctca atagcaacga tggcc 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaacggccat cgttgctatt gagac 25

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gtctgccttc ctgtagtgtc ct 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caacctaact cagccagcct at 22

Claims

1.RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系在动物抗塞内卡谷病毒（Seneca valley virus）育种中的应用。

2.RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系在抑制塞内卡谷病毒（Seneca valley virus）复制中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，使RPSA基因编码蛋白的功能丧失的方法包括基因敲除技术、基因突变技术、基因插入技术。

4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述RPSA基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法包括以下步骤：

（1）制备含有粘性末端的特异性靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸的双链片段；

（2）将步骤（1）制备的双链片段插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；

（3）将步骤（2）制备的重组载体转染宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得RPSA基因功能缺失细胞系；所述步骤（1）中含有粘性末端的特异性靶向RPSA基因的sgRNA寡聚核苷酸为RPSA-sgRNA2-oligo，所述sgRNA寡聚核苷酸的序列为：

RPSA-sgRNA2-oligo-F：5’-CACCGCATCGTTGCTATTGAGAACC-3’；

RPSA-sgRNA2-oligo-R：5’-AAACGGTTCTCAATAGCAACGATGC-3’。