CN116948975A - Ifnar1基因敲除的mdck细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。所述IFNAR1基因敲除的细胞株命名为MDCK‑IFNAR1‑KO，已于2023年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202390。该细胞株对多种流感病毒的亚型敏感，可用于分离流感病毒或生产流感疫苗。且该细胞株的胰酶消化时间相对于MDCK原始细胞大幅度缩短，不仅能提高流感疫苗生产效率，同时还能降低生产成本。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
接种流感疫苗是预防流感最有效的手段。传统鸡胚培养的流感疫苗在流感的防控中发挥了重要作用，尽管该生产方式具有工艺成熟，设备设施价格相对低廉等优点，但是也存在其局限性，如鸡胚基质流感疫苗的生产工艺繁琐，不易扩大规模，受可用鸡蛋的限制，当流感大流行时，以鸡胚为基质的流感疫苗可能无法满足短时间内快速生产的需要。同时，鸡胚培养的过程中会出现流感病毒免疫原性的改变，并且也存在致病因子污染，过敏原以及残体无害化处理等问题，对其质量提升造成障碍。基于以上问题，WHO在1995年就建议流感疫苗生产企业用哺乳动物细胞替代鸡胚来进行流感疫苗的生产。相对于鸡胚培养，以细胞为基质培养的流感疫苗有以下优势：摆脱了鸡胚供应速度慢的限制；生产工艺易于自动化、规模化，能在短时间内实现大规模培养；流感病毒毒株在细胞中传代突变的几率较低；生产过程中利用生物反应器系统，能有效降低致病微生物的污染；不含有卵清蛋白，大大降低接种后的过敏反应。近些年来，基于不同类型的细胞基质流感疫苗已在不同国家和地区获批上市。其中，MDCK(Madin Darby canine kidney)细胞株被认为是最适用于流感疫苗生产的细胞株之一。
通过对MDCK细胞进行改造，是提高流感病毒产量的重要途径之一。众所周知，干扰素具有广谱的抗病毒作用，在细胞对病毒的免疫抵抗中具有重要作用，其中以Ⅰ型干扰素最为重要。Ⅰ型干扰素与其受体结合后，其受体胞质内的尾部构象发生改变，随后使JAK1(Janus激酶家族成员之一)与TYK2(Janus激酶家族成员之一)发生磷酸化，从而进一步使STAT(信号转导子和转录激活子，共有7个家族成员，分别命名为STAT1～STAT7)磷酸化形成STAT1-STAT2二聚体，然后与IRF9(干扰素调节因子9)一起构成干扰素刺激基因因子3(IFN-stimulated gene factor 3，ISGF3)三元复合物。该复合物进入细胞核后，可以通过ISGF3与干扰素刺激应答元件(IFN-stimulated response element，ISRE)结合，最终激活干扰素刺激基因(Interferon-stimulated genes,ISGs)的转录表达，例如，激活黏液瘤抗性蛋白1(MX1)、2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OAS)、干扰素刺激基因15(ISG15)及双链RNA依赖的蛋白质激酶(PKR)的转录表达，从而发挥其抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等生物学作用。但是，MDCK细胞由于存在干扰素相关抗病毒系统，对流感病毒在其中的复制存在较大影响，这将限制MDCK细胞基质流感疫苗的产量。
发明内容
为了解决上述问题，本发明中通过对MDCK细胞中的IFNAR1基因进行敲除，破坏Ⅰ型干扰素受体，阻断JAK-STAT信号通路，阻断干扰素发挥强大的抗病毒作用，从而提高流感病毒疫苗在细胞基质中的产量。
本发明第一个目的是提供一种IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株，该细胞株是通过基因敲除技术使MDCK细胞的IFNAR1基因第5号外显子(28169633-28169829段碱基)缺失，从而使I型干扰素受体功能失效，进一步使得该细胞株比现有技术中的细胞株具有更高的病毒滴度和细胞传代效率。
所述IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株命名为犬肾细胞MDCK-IFNAR1-KO(MadinDarby Canine Kidney Cells,MDCK-IFNAR1-KO)，已于2023年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，湖北省武汉市，武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:C202390。
本发明中的MDCK-IFNAR1-KO细胞株由于将IFNAR1基因进行了敲除，可以阻断I型干扰素发挥抗病毒作用，破坏MDCK原始细胞的病毒免疫力，从而提高病毒滴度。该细胞株对多种流感病毒的亚型敏感，可用于流感病毒的分离和流感疫苗的生产。同时，由于I型干扰素受体位于细胞膜上，IFNAR1基因敲除后，细胞的表型发生明显变化，由梭形变为针尖型，其胰酶消化的时间大大缩短，因而大幅度提高了细胞的传代效率，同时节约了胰酶使用量，降低了细胞基质疫苗的生产成本。
本发明第二个目的是提供一种sgRNA，所述sgRNA用于制备所述IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明第三个目的是提供一种表达载体，所述表达载体包含所述sgRNA。
所述表达载体的构建包括以下步骤：将pX330质粒以限制性内切酶BbsI酶切后，通过T7 DNA连接酶与所述sgRNA进行连接。
本发明第四个目的是提供所述IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株的构建方法，该方法包括采用含有所述sgRNA或含有所述表达载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统对MDCK细胞中的IFNAR1基因进行敲除的方法。
在优选的实施方案中，该方法还包括制备供体载体的步骤，所述供体载体中含有针对所述sgRNA的序列识别位点的5'端同源臂和3'端同源臂，所述5'端同源臂的序列如SEQID No.2所示，所述3'端同源臂的序列如SEQ ID No.3所示。
在优选的实施方案中，该方法采用嘌呤霉素筛选IFNAR1基因敲除的单克隆细胞。嘌呤霉素的优选浓度为10μg/mL。
本发明第五个目的是提供所述IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株或所述sgRNA或所述表达载体或根据所述IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株的构建方法制备得到的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株在提高流感病毒疫苗产量或/和分离流感病毒中的应用。
在优选的实施方案中，所述流感病毒包括甲型流感病毒或/和乙型流感病毒。
在进一步优选的实施方案中，所述流感病毒包括H1N1、H3N2、H5N1、BV、BY亚型流感病毒或它们的组合。
本发明的有益效果是：(1)本发明中提供的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株与MDCK原始细胞株相比，对流感病毒有更高的敏感性，可获得更高流感病毒滴度，可在流感疫苗生产中提升流感疫苗的产量。(2)IFNAR1基因敲除后的MDCK细胞由于抑制了I型干扰素的广谱抗病毒作用，能提高多种亚型流感病毒的滴度，因此可用于分离流感病毒。(3)IFNAR1基因敲除后的MDCK细胞在95％细胞汇合度下进行胰酶消化时，仅需45s即可完全消化；大幅度提升了细胞传代的效率，缩短了细胞扩大培养的周期，降低了细胞基质流感疫苗的生产成本。
附图说明
图1为实施例1中构建的pX330-sgRNA质粒的测序结果图；
图2为pY75质粒的质粒图谱；
图3为实施例1中同源臂菌落PCR鉴定结果图；
图4为实施例1中进行嘌呤霉素筛选后得到的具有嘌呤霉素抗性的细胞在光学显微镜下观察结果图；
图5为实施例1中阳性单克隆细胞PCR鉴定结果图；
图6为MDCK原始细胞与实施例1中IFNAR1基因敲除的MDCK细胞在光学显微镜(40×)下观察的结果对比图；
图7为MDCK原始细胞与实施例1中IFNAR1基因敲除的MDCK细胞的胰酶消化时间对比图；
图8为MDCK原始细胞与实施例1中IFNAR1基因敲除的MDCK细胞的血凝滴度和病毒滴度对比图；
图9为MDCK原始细胞与实施例1中IFNAR1基因敲除的MDCK细胞对不同亚型的流感病毒的血凝滴度对比图。
具体实施方式
以下内容结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域技术人员能够充分地理解本发明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分优选的实施例，而不是全部的实施例。本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下，对以下实施方式所作的任何等效变换或替代，均属于本发明的保护范围之内。
以下实施例中所使用的试剂、试剂盒或其他材料的来源或成分如下：
MDCK细胞购自美国模式培养物集存库(ATCC)，保藏编号为CCL-34。pX330质粒(货号：#42230)购自Addgene质粒保存中心，包含gRNA骨架、Cas9表达序列、核定位序列(NLS)和抗氨苄基因。Top10感受态细胞购自生工生物工程(上海)有限公司(货号：B528412)。pY75质粒包含LoxP位点和嘌呤霉素抗性基因。H1N1(IVR-215)流感病毒来自于H1N1(IVR-215)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：202103W01H1。H1N1(CNIC-1909)流感病毒来自于H1N1(CNIC-1909)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：202012W02H1。H1N1(NIB-74)流感病毒来自于H1N1(NIB-74)主库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司。H1N1(IVR-180)流感病毒来自于H1N1(IVR-180)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：201810W07H1。H1N1(X-179A)流感病毒来自于H1N1(X-179A)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：G20150703。H3N2(IVR-224)流感病毒来自于H3N2(IVR-224)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：202106W02H3。H5N1(NIBVRG-14)流感病毒来自于H5N1(NIBVRG-14)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：202101W01H5。BY(BVR-1B)流感病毒来自于BY(BVR-1B)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：202012W01BY。BV(BVR-11)流感病毒来自于BV(BVR-11)工作种子库，保存于中国的武汉生物制品研究所有限责任公司，批号：202012W01BV。
细胞完全培养基的主要成分：VP-SFM培养基(Gibco公司)、5％胎牛血清(Gibco公司)、1％谷氨酰胺(Gibco公司)。
以下实施例中未详细说明的方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法。
实施例1
本实施例提供一种IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株的构建方法，并研究了该细胞株的细胞形态学、胰酶消化时间、血凝滴度、病毒滴度、对多亚型病毒的敏感程度。具体的实验方法包括以下步骤：
1、设计MDCK细胞的IFNAR1基因的sgRNA
针对MDCK细胞的IFNAR1基因(NCBI网站基因ID：609830)第5号外显子(28169633-28169829段碱基)设计出sgRNA的序列SEQ ID No.1：5'-GGGGTCTTTATACAGTACAC-3'。根据该靶点序列设计sgRNA的上下游引物IFNAR1-sgRNA-F和IFNAR1-sgRNA-R：
IFNAR1-sgRNA-F：5'-CACCGGGGGTCTTTATACAGTACAC-3'；
IFNAR1-sgRNA-R：5'-AAACGTGTACTGTATAAAGACCCCC-3'。
将上述上下游引物经PCR磷酸化和退火，形成具有粘性末端的双链sgRNA。其中，PCR反应体系(总体积为10μL)如下：1μL上游引物TRAF3-sgRNA-F，1μL下游引物TRAF3-sgRNA-R，1μLT4 Ligation Buffer，6.5μL ddH2O，0.5μLT4 PNK。PCR反应程序如下：37℃，30min；95℃，5min；随后每分钟降5℃，直至25℃。退火产物(双链sgRNA)稀释250倍以用于下一步。
2、构建pX330-sgRNA质粒
将pX330质粒以限制性内切酶BbsI酶切后，与合成的双链sgRNA进行酶连，得到pX330-sgRNA质粒。酶切和酶连反应同时进行，反应体系如下：100ng pX330质粒，2μL双链sgRNA稀释液，2μLTango buffer，1μL 1mmol/L DTT，1μL 1mmol/LATP，1μL BbsI酶，0.5μLT7 DNA连接酶，用ddH2O补至反应体系总体积为20μL。反应体系先在37℃下保温30min，然后在23℃下保温30min。质粒构建完成后交由生工生物工程(上海)有限公司公司进行测序，结果如图1所示。
3、获得同源臂
在sgRNA的序列的上下游分别选取长度约为1000bp的序列作为5'端同源臂(28168456-28169632段碱基，序列号为SEQ ID No.2)和3'端同源臂(28169830-28170932段碱基，序列号为SEQ ID No.3)。以野生型MDCK细胞基因组DNA作为模板，通过PCR扩增获得同源臂。PCR反应体系如下：2μL正向引物(10μM)，2μL反向引物(10μM)，模板DNA(100ng)，25μL2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)(诺唯赞，P525)，用ddH2O补至反应体系总体积为50μL。PCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，Tm温度下退火15s，72℃下延伸60s，扩增35个循环；最后在72℃下延伸5min。
5'端同源臂的序列SEQ ID No.2：cctgtcactatacagaagccactcctgttggggcacctgggtggctcagcggttgagcgtctgcctttggcccaggtcgtgatcccagggtcctgggatcaagtcccttattggtctccccgcatggagcctgcttctccctctgcctgtgtctctgcctctctctgtctctctcatgaataaataaatattttttaaaatctta agaaaaaaaatgaaaaaaggaaaagaaaccactcctgtcaaggactctggtgccctcctcaatgccgagagacttcccagccctcctctggctcagaacctgtgtagggccacagtgatcactggaagcccatccgtttctgggtctccagggccctgatccctgtcagctcctttcctgctcatccttccctcctttgcccctttctccaggccttgcaggcctttcggtgccagattaccgcagggctggattgtcctacttcttctttttctaccctcggtccttccaatctgtgtgcccttgagaaaagctcaaacttacatctccagccccactcctttcccttaaccgtgacacttgtatcaccagctctctagtcaccatctctgcttgggcgtctgagtcatcaggtcaaacaaagctcttgatttcccactccaaacctgctcctcttgcagctaattttccatccccactacagatggcacctgtttcattgatagcgccaagagctttggagtcacttttagcatcccttttccttaaaatcctgcatccgttctgtcaacacattgaatgatcaactttgagagtgcgtaccctggagcggatccctgaatgtttccaccctctattaatgaagtgatcaaataaatgtgttcatttctttacagctcagattggtcccccaaaagtacatttagaagccgaagataagacaatcataataaacatctccctgcctggagcgagagacagcgtcatgtgggctctggatagctccagctttacctacagcttagatatctggaaaaactcttcaagtggagaagtaagcattctttgtacctctgtttaatgggagagaaaaaagacaagaatttgttctccattttgacctttttcttttttttgaagagcagtattctatttgttttattctagagaaggactgaaactgtttactcc；
3'端同源臂的序列SEQ ID No.3：tgctgacgtttataggatggttttaatagatattgaaacaaa aacattacaatagcacttagataagcaaaaaaaaaaaaaatcaccgtatttgggatttttgtctcaagtgaacagtaatgaaagttctgcctaggggcgcctgggtggctcagtcagttaagcatttctgctcaggtcatgatctcagagtcctgggatcgagtcccacatcgggctcccctcagggagcctgcttctgcctctgcctgtgtctctgcctctctctaagtgtctctcataaataaatctttaaaaataaaaaaatgggatcttgctagatatatcttacaacttgcttatttaacttattacattgaggatctcttcatatgtcagcacatacgatctatcatgttcttttttttttaattttaagattttatttatttagttaagagagaaagagcacaagccagagatggggacaggaagcagcagagggagagggagaagcagactccccactaaggagggagcccaacgcggggcttgaccccgttaccctgggatcatgacctgacctgaaggcagacacttaaccgacagagccacccaggcacccctatcccattctttttaagtgggtgatactatcccatagtgtaaacccacaccgtaactcatgtgtaagccttttattttcttgcccatgctgttaagaattcttcccatgtatctctctcgtgctcaaataaataaatttttaagaaaaaaaaagaacccttaccatgtattctcactcaagtaaaaatgtatgcttttctctgtattctctgtcttctagttgcaaataaactgcctccaccagaaaacatccggcttgattctaaaaacaacatctttgttcttagatgggattacccctatggaagtgtgaaatggggtcacgcacgtccaaatgttactttccaagctcagtggctctagtaagttctcatccatgagtgtccctttgcccaatttcttagggttccttgcactgggcttcggcccgctacagctctctgcacaggtgactgcttcaggagattgtaccatattggaaacggggtgttttctct。
5'端同源臂PCR扩增引物如下：
正向引物5TYB-F：5'-CGGAATTCCCTGTCACTATACAGAAGCC-3'；
反向引物5TYB-R：5'-CCGCTCGAGGGAGTAAACAGTTTCAGTCC-3'。
3'端同源臂PCR扩增引物如下：
正向引物3TYB-F：5'-ACGCGTCGACTGCTGACGTTTATAGGATGG-3'；
反向引物3TYB-R：5'-CCCAAGCTTAGAGAAAACACCCCGTTTCC-3'。
4、构建同源重组载体pY75-5'arm-3'arm
使用EcoRI和XhoI酶(购自New England Biolabs公司，即NEB公司)对5'端同源臂及其对应的Donor载体pY75质粒(质粒图谱见图2)骨架一侧进行酶切，于37℃下孵育过夜。酶切产物用TaKaRaMiniBEST DNAFragment Purification KitVer.4.0(Takara公司)进行纯化。纯化产物使用NEB公司的T4 DNA Ligase体系进行连接反应，于16℃下孵育过夜。孵育结束后，将连接产物通过42℃水浴热激45秒，然后将连接产物转化至50μLTop10感受态细胞，置于冰上2min后加入不含抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时(160～225rpm)。随后取100μL菌液均匀涂布到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基平板中，37℃正置至液体被吸收，然后倒置过夜培养。挑取单菌落溶于5μL LB液体培养基中，取2μL菌液进行菌落PCR鉴定。选取鉴定结果为阳性的菌落送至生工生物工程(上海)有限公司测序。若测序结果显示同源臂已正确连接，则按照前述同样的方法进行3'端同源臂的连接，得到同源重组载体pY75-5'arm-3'arm。需要说明的是，也可以先连接3'端同源臂至pY75质粒，再连接5'端同源臂。对3'端同源臂和pY75质粒酶切所使用的酶为SalI酶和HindⅢ酶(购自NEB公司)。
5'端同源臂PCR鉴定的引物如下：
5TYBJD-F(正向引物)：5'-CTCTTCGCTATTACGCCAGC-3'；
5TYBJD-R(反向引物)：5'-CCAGAGGCCACTTGTGTAGC-3'。
3'端同源臂PCR鉴定的引物如下：
3TYBJD-F(正向引物)：5'-TCACCGCATTCTAGTTGTGG-3'；
3TYBJD-R(反向引物)：5'-TAGCTCACTCATTAGGCACC-3'。
菌落PCR鉴定反应体系：2μL菌液，1μL正向引物(10μM)，1μL反向引物(10μM)，12.5μL 2×Phanta Max MasterMix(Dye Plus)(诺唯赞，P525)，用ddH2O补至反应体系总体积为25μL。
菌落PCR鉴定反应程序：95℃预变性3min，95℃变性15s，Tm温度下退火15s，72℃下延伸60s，扩增35个循环；最后在72℃下延伸5min。
同源臂菌落PCR鉴定结果见图3。图3中A图为5'同源臂菌落PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳结果，B图为3'同源臂菌落PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳结果；图中M表示DNAmarker，A图中的1～16分别表示连接5'同源臂后的菌落PCR产物的1～16号待检菌，B图中的1～16分别表示连接3'同源臂后的菌落PCR产物的1～16号待检菌。图中大小约为1300bp的条带对应的菌落为阳性菌落，说明同源臂已插入目的区域(阴性条带为271bp)。
5、细胞转化
将pX330-sgRNA质粒和同源重组载体pY75-5'arm-3'arm共同转化至MDCK细胞，方法如下：
电转体系：每个电转杯体系中细胞量为106个，加入pX330-sgRNA质粒和同源重组载体pY75-5'arm-3'arm各8μg/体系，用不含血清的VP培养基将整个体系体积补至200μL，充分吹打混匀，备用。
在电转仪(型号：Gene PulserXcell，Bio-Rad公司)上设置电转条件：脉冲电压为110V、脉冲个数为1个脉冲、脉冲宽度为25ms。
将电转杯放入电转仪样品凹槽中，盖上盖子，开始电转。电转后，将每个电转杯中的细胞均分到1个6孔细胞培养板中，加入细胞完全培养基，置于37℃细胞培养箱中培养24h。
6、获得单克隆细胞
细胞转化完成后，待细胞达到70％的汇合度时，更换含有10μg/mL嘌呤霉素的细胞完全培养基进行加压筛选，每2-3天更换筛选培养基(10μg/mL嘌呤霉素+细胞完全培养基)。镜下可观察到绝大部分细胞会逐渐死亡，在嘌呤霉素筛选5-7天时，镜下可观察到个别六孔板内局部存在具有嘌呤霉素抗性的小细胞团(见图4)。
通过极限稀释方法获得单克隆细胞：
(1)对六孔板内长出的具有嘌呤霉素抗性的细胞团使用胰蛋白酶(Gibco公司)进行消化，并计数。
(2)根据细胞数量对细胞进行稀释，用细胞完全培养基将细胞稀释至细胞浓度为30-50个/10mL，将细胞悬浮液充分混匀后，加入96孔板内，每孔100μL，37℃孵育培养。
(3)密切观察细胞生长状态，4-5天后在光学显微镜下观察，标记出仅含有单克隆细胞团的孔。
(4)待标记的孔内细胞长满，可扩大培养，一部分用于冻存，一部分细胞用于PCR鉴定。
7、单克隆细胞PCR鉴定
用基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取细胞DNA作为模板，进行PCR扩增，PCR反应体系如下：2μL正向引物(10μM)，2μL反向引物(10μM)，模板DNA(100ng)，25μL 2×PhantaMax MasterMix(Dye Plus)(诺唯赞，P525)，用ddH2O补至反应体系总体积为50μL。PCR反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，Tm温度下退火15s，72℃下延伸60s，扩增35个循环；最后在72℃下延伸5min。
单克隆细胞PCR鉴定引物设计：分别设计三对引物用于鉴定阳性克隆，第一对为全长PCR引物(全长IFNAR1-F和全长IFNAR1-R)，分别在5'同源臂和3'同源臂设计上下游引物，且其结合位置距离sgRNA结合位点大于100bp，此对引物可同时鉴别野生型、单敲除和双敲除的克隆。第二对为5'同源臂定位PCR引物(定位5TYB-F和定位5TYB-R)，分别在5'同源臂序列和嘌呤霉素序列上设计上下游引物。第三对引物为3'同源臂定位PCR引物(定位3TYB-F和定位3TYB-R)，分别在嘌呤霉素序列上和3'同源臂序列下游设计上下游引物。第二对和第三对引物用以进一步确认双敲除克隆，以排除细胞中质粒残留的干扰。
全长IFNAR1-F(正向引物)：5'-CACATGCGCTTAGAGCAAGG-3'；
全长IFNAR1-R(反向引物)：5'-GCAGAGACTGGAGATGCTGC-3'；
定位5TYB-F(正向引物)：5'-CCAAAGACAGAACCAGTTAGGAGG-3'；
定位5TYB-R(反向引物)：5'-CCAGAGGCCACTTGTGTAGC-3'；
定位3TYB-F(正向引物)：5'-TCACCGCATTCTAGTTGTGG-3'；
定位3TYB-R(反向引物)：5'-GCCTGAGGTTACATAACTGGTTGC-3'。
经过PCR鉴定(以MDCK原始株为对照组)，获得阳性细胞后，PCR产物交由生工生物工程(上海)有限公司公司进行测序，阳性细胞用液氮冻存。
单克隆细胞PCR鉴定电泳图如图5所示。图5中A图为阳性单克隆细胞DNA全长序列经1％琼脂糖凝胶电泳后的结果图，B图为5'同源臂和3'同源臂的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后的结果图；图中M表示DNAMaker，2和4表示阳性细胞，1和3表示MDCK原始株，KO表示IFNAR1基因缺失。从图5中可知，全长PCR的条带比对照组大1300bp左右，且条带单一，无其他条带，而定位PCR显示仅实验组有条带，对照组没有条带。这些结果表明所获得的细胞株为IFNAR1基因敲除的纯合子细胞株。经测序阳性细胞株IFNAR1基因的5号外显子及部分内含子共缺失197bp(28169633-28169829段碱基)，同时插入嘌呤霉素序列及酶切位点共1383bp。
8、IFNAR1基因敲除的细胞形态学变化
在光学显微镜下(40×)观察细胞形态，MDCK原始细胞(MDCK-WT)镜下呈不规则扁平状，类似梭形，多角(图6中A图)；而IFNAR1基因敲除的MDCK细胞(MDCK-IFNAR1-KO)形态发生了较大的变化，呈针尖形态(图6中B图)。
9、IFNAR1基因敲除的细胞胰酶消化时间变化
MDCK细胞为贴壁细胞，在细胞传代扩大的过程中，需要进行胰酶消化。分别对汇合度为95％的MDCK-WT和MDCK-IFNAR1-KO细胞进行消化，镜下观察细胞消化情况，统计细胞完全脱落时间，统计结果如图7所示。图7中WT表示MDCK原始细胞，KO表示IFNAR1基因敲除的MDCK细胞。从图7中可知，MDCK原始细胞胰酶消化所需的平均时间为22.67min，而IFNAR1基因敲除的MDCK细胞胰酶消化所需的平均时间仅为45s。可见，IFNAR1基因敲除的MDCK细胞的胰酶消化时间与MDCK原始细胞相比大幅度缩短。
10、IFNAR1基因敲除的细胞血凝滴度和CCID50滴度变化
分别对MDCK-WT和MDCK-IFNAR1-KO细胞以MOI＝0.01接种H1N1(IVR-215)流感病毒，在接种后72h收集病毒上清进行血凝滴度和CCID50滴度检测，检测结果如图8所示。图8中WT表示MDCK原始细胞，KO表示IFNAR1基因敲除的MDCK细胞。从图8中可知，IFNAR1基因敲除的MDCK细胞的平均血凝滴度为6.167log2(HAU/25μL)，病毒平均滴度为5.217(CCID50/mL)；MDCK原始细胞的平均血凝滴度为7.75log2(HAU/25μL)，病毒平均滴度为6.383(CCID50/mL)。与MDCK原始细胞相比，IFNAR1基因敲除的MDCK细胞的血凝滴度提升2.99倍，病毒滴度(CCID50/mL)提升14.65倍。
11、IFNAR1基因敲除的细胞对多亚型病毒的血凝滴度的变化
分别对MDCK-WT细胞和MDCK-IFNAR1-KO细胞以MOI＝0.01接种H1N1、H3N2、H5N1、BV、BY各亚型流感病毒，在接毒后72h收集病毒上清进行血凝滴度检测，检测结果如图9所示。从图9中可以看出，MDCK-IFNAR1-KO细胞对各亚型流感病毒的敏感性均有不同程度提升。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。对于任何熟悉本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。任何依据本发明申请保护范围及说明书内容所作的简单的等效变化和修饰，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株，其特征在于，所述细胞株于2023年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C202390。
2.一种sgRNA，其特征在于，所述sgRNA用于制备权利要求1所述的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
3.一种包含权利要求2所述的sgRNA的表达载体。
4.权利要求1所述的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，包括采用含有权利要求2所述的sgRNA或含有权利要求3所述的表达载体的CRISPR/Cas9基因编辑系统对MDCK细胞中的IFNAR1基因进行敲除的方法。
5.根据权利要求4所述的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，还包括制备供体载体的步骤，所述供体载体中含有针对所述sgRNA的序列识别位点的5'端同源臂和3'端同源臂，所述5'端同源臂的序列如SEQ ID No.2所示，所述3'端同源臂的序列如SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求4所述的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，采用嘌呤霉素筛选IFNAR1基因敲除的单克隆细胞。
7.权利要求1所述的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株或权利要求2所述的sgRNA或权利要求3所述的表达载体或权利要求4所述的构建方法制备得到的IFNAR1基因敲除的MDCK细胞株在提高流感病毒疫苗产量或/和分离流感病毒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒或/和乙型流感病毒。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括H1N1、H3N2、H5N1、BV、BY亚型流感病毒中至少一种。
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|---|---|---|---|---|
| CN117802097A (zh) * | 2023-12-05 | 2024-04-02 | 北京蒙微生物科技有限公司 | 一种敲除ISG15基因的sgRNA、ISG15基因缺失的牛肾细胞及其应用 |
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2023
- 2023-06-11 CN CN202310692117.XA patent/CN116948975A/zh active Pending
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