CN114058619A

CN114058619A - Riplet敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用

Info

Publication number: CN114058619A
Application number: CN202111392731.1A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 朱紫祥; 张向乐; 曹伟军; 杨帆; 唐闻达; 李攀; 齐晓兰; 顾峰幸; 陈文哲; 张克山; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN114058619B

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因表达能促进小核糖核酸病毒科病毒，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向RIPLET的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR‑Cas9技术实现了RIPLET基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

Description

RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。

背景技术

小核糖核酸(RNA)病毒科是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属，包括塞内卡病毒和口蹄疫病毒。口蹄疫属于口疮病毒属，是一种由口蹄疫病毒引起的重要的感染偶蹄动物的疾病，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，由结构蛋白VP1-VP4组成。塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)与FMDV同科病毒，其感染猪能够引起与口蹄疫极为类似的临床症状，并且可以引发新生仔猪的急性死亡，对养猪业危害巨大，至今没有用于该病防控的商品化疫苗产品，使得该病的防控形势异常严峻。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止塞内卡病毒和口蹄疫病毒的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。开发出有效的疫苗是当前该病防控最有效的举措。而选取病毒高效繁殖的细胞系是制备有效疫苗的前提，急需开展相关工作。

其中，基因编辑技术是通过分子生物学方法对各类细胞中基因进行定向、精准的突变、修饰或编辑的技术。该技术已被广泛用于疾病治疗、抗病育种、遗传工程改造等研究领域。基因编辑技术不断发展成熟，从第一代的依赖锌指核酸酶ZFN的编辑技术，第二代依赖转录激活样效应因子核酸酶TALEN的编辑技术，到第三代依赖成簇的规律性间隔的短回文重复序列CRISPR-Cas9的编辑技术，历经发展近30年，已经取得了突破性的进展。第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9是利用小分子sgRNA进行靶基因编辑的一种定向基因组编辑技术。该技术较前两代编辑技术更加便捷、高效、精准、稳定，而且相关使用成本费用更加低廉。为基因组定向改造、修饰、调控和应用等带来了突破性革命，在医学与生命科学各大领域具有广阔的应用前景。

本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因的表达能促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向RIPLE T基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了RIPLET基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

发明内容

针对上述问题，本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因的表达能促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了RIPLET基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种使RIPLET基因编码蛋白的功能丧失制备促进小核糖核酸病毒科病毒复制的细胞系的应用。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒包括口蹄疫病毒、塞内卡病毒。

第二方面，本发明提供了一种抑制或者沉默细胞中RIPLET基因的表达的试剂在制备小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系中的应用。

优选地，所述试剂包括靶向敲除RIPLET基因的sgRNA和/或Cas9蛋白的mRNA序列。

优选地，所述sgRNA包括RIPLET-sgRNA和RIPLET-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

RIPLET-sgRNA1-F：5’-CACCGTGAGCTGCATTATCTGCCAA-3’；

RIPLET-sgRNA1-R：5’-AAACTTGGCAGATAATGCAGCTCAC-3’；

RIPLET-sgRNA2-F：5’-CACCGCCTACTGTTGCAGGACCTGG-3’；

RIPLET-sgRNA2-R：5’-AAACCCAGGTCCTGCAACAGTAGGC-3’。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为口蹄疫病毒或塞内卡病毒。

第三方面，本发明提供了一种特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，所述sgRNA包括RIPLET-sgRNA和RIPLET-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

RIPLET-sgRNA1-F：5’-CACCGTGAGCTGCATTATCTGCCAA-3’；

RIPLET-sgRNA1-R：5’-AAACTTGGCAGATAATGCAGCTCAC-3’；

RIPLET-sgRNA2-F：5’-CACCGCCTACTGTTGCAGGACCTGG-3’；

RIPLET-sgRNA2-R：5’-AAACCCAGGTCCTGCAACAGTAGGC-3’。

第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的sgRNA在制备RIPLET基因敲除细胞系中的应用。

第五方面，本发明提供了一种RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中RIPLET基因编码蛋白功能丧失。

优选地，所述方法为CRISPR-Cas9技术。

优选地，所述方法包括以下步骤：

(1)制备上述第三方面所述的特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向RIPLET基因的sgRNA寡聚核苷酸；

(2)将步骤(1)制备的双链片段插入到PX459表达质粒载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；

(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单个细胞株，从而获得RIPLET基因功能缺失细胞系。

第六方面，本发明提供了一种根据上述第五方面所述的方法构建的RIPLET基因缺失的细胞系。

第七方面，本发明提供了一种RIPLET基因缺失的细胞系作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。

本发明的有益效果是：①本发明首先发现，抑制宿主细胞中RIPLET基因的表达能促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制；②本发明提供了一种靶向RIPLET基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向RIPLET基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中RIPLET基因的敲除，打靶准确、敲除效率高；③本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法；④依据本发明所述方法获得的单克隆细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，尤其是口蹄疫病毒和塞内卡病毒的复制，提高小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 PX459-RIPLET-sgRNA1与PX459-RIPLET-sgRNA2重组质粒的测序结果；

图2琼脂糖凝胶电泳检测分析嘌呤霉素筛选后BHK-21细胞中RIPLET基因的编辑情况；

图3嘌呤霉素筛选后的BHK21细胞，提取细胞总DNA，利用RIPLET基因DNA check引物扩增片段，测序峰图结果；

图4嘌呤霉素筛选出的不同单克隆BHK21细胞RIPLET基因DNA check引物扩增检测结果；

图5嘌呤霉素筛选出的#29号单克隆BHK21细胞RIPLET基因DNA check引物扩增片段测序图谱及琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图6 FMDV在RIPLET基因敲除BHK21细胞中复制水平的Western blotting和qPCR检测结果；

图7 SVA在RIPLET基因敲除BHK21细胞中复制水平的Western blotting和qPCR检测结果。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

定义

术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明通过对宿主细胞中的RIPLET基因靶向敲除，导致RIPLET基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了RIPLET基因编码蛋白功能丧失的细胞系，并用于FMDV和SVA疫苗的生产。但是本发明并不局限于RIPLET基因敲除，也可通过其他技术手段使RIPLET基因编码蛋白的功能丧失，并用于构建RIPLET基因编码蛋白功能丧失的细胞系。

术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的RIPLET基因敲除，获得的RIPLET基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系既能促进SVA抗原的表达，又能促进FMDV抗原的表达；本发明也可以通过对宿主细胞中的RIPLET基因突变，或插入基因片段，导致RIPLET基因编码蛋白发生移码突变，成功构建出RIPLET基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系。

术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。

本发明通过人工合成了靶向RIPLET基因的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向RIPLET基因的sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段；

本发明在直接靶向剪接RIPLET基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除RIPLET基因的方法，以幼仓鼠肾细胞BHK21为例，进行了RIPLET基因(RIPLET氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)敲除，为FMDV和SVA疫苗的生产提效提供了一种策略。本发明虽然仅对幼仓鼠肾细胞BHK21中RIPLET基因进行敲除，获得了一种基因敲除宿主细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物细胞中RIPLET基因敲除，构建具有提升FMDV和SVA抗原表达的基因敲除细胞系。

CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对RIPLET基因的sgRNA序列，实现RIPLET基因的准确、高效地敲除，获得一种既能促进FMDV抗原表达，又能促进SVA抗原表达的RIPLET基因敲除单克隆细胞系，打靶率高达30％，从而为FMDV和SVA疫苗的生产提供新的策略。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向RIPLET基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到RIPLET基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。

SVA(CH-FJ-2017株，基因登录号KY747510)与FMDV(O/BY/CHA/2010株，基因登录号JN998085)来源于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。

以下实施例所述的RIPLET基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

实施例1靶向RIPLET基因sgRNA的设计

利用NCBI数据库查询RIPLET基因序列，并找到金仓鼠全基因组(GenBank登录号：NW_004801729)，定位RIPLET在基因组中不同转录本的重叠区的第一个外显子段，用于靶点设计。

根据CRISPR/Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispr-era.stanford.edu/index.jsp进行sgRNA的设计，根据评分选取2对20bp的sgRNA片段，分别命名为：RIPLET-sgRNAsp1(RIPLET-sgRNA1-F，SEQ ID NO.3所示；RIPLET-sgRNA1-R，SEQ IDNO.4所示)、RIPLET-sgRNAsp2(RIPLET-sgRNA2-F，SEQ ID NO.5；RIPLET-sgRNA2-R，SEQ IDNO.6)；在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向RIPLET基因的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA1-oligo)。所述sgRNA1-oligo由金唯智生物科技有限公司合成，详细序列见表1。

表1靶向RIPLET基因的sgRNA寡聚核苷酸

注：下划线部分所标注的序列为加入的酶切位点，不加下划线的序列为sgRNA序列。

实施例2 sgRNA重组质粒PX459-sgRNA的构建

双链sgRNA-oligo的获得：将实施例1中合成的sgRNA-oligo稀释至10μmol/L，配制共10μL反应体系：上游引物4.5μL；下游引物，4.5μL；10×TaqBuffer，1μL。反应程序：99℃，10min；16℃，保存；使上下游引物退火形成双链sgRNA-oligo。

PX459载体质粒的酶切：利用BBSI限制性内切酶酶切PX459载体，共配制50μl酶切体系如下：PX459载体，5μL；BBSI，2μL；10×Buffer，5μL；ddH₂O，38μL。37℃中放置3h进行酶切。之后进行核酸电泳，利用promega公司的DNA纯化回收试剂盒纯化回收含有粘性末端的PX459载体线性化片段。

PX459-sgRNA重组质粒的构建：将纯化回收PX459线性化片段产物与双链sgRNA-oligo进行连接反应，反应体系：T4Ligase，0.5μL；10×T4LigaseBuffer，0.5μl；PX459酶切纯化片段，0.5μL；双链sgRNA-oligo，3.5μL，共5μL体系。16℃过夜连接，将连接产物转化Trans5α大肠杆菌感受态细胞，进行重组质粒的克隆扩增。转化程序：将100μL的Trans5α感受态细胞与500ng连接产物混合，冰上放置30分钟。42℃水浴热激45秒，取出冰浴2分钟。加入无抗性LB培养液500ml，37℃，220rpm摇菌60分钟。将200μL的菌体，利用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄抗生素抗性的LB平板上，37℃温箱培养12h，观察生长状况。

挑取单克隆菌落，利用含有氨苄抗生素抗性的LB液体培养基摇菌12h，利用

质粒提取试剂盒提取并测序验证，PX459-RIPLET-sgRNA各个质粒进行测序，检测结果如图1所示，测序结果与预期结果相符；表明表达sgRNA的质粒PX459-RIPLET-sgRNA1和PX459-RIPLET-sgRNA2构建成功。

实施例3细胞转染

在转染前复苏BHK21细胞于T25细胞瓶中，使用含有10％的FBS、1％双抗的DMEM培养基培养，当细胞传代2-3次性状稳定且状态较好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板中，待细胞融合度至70％～80％时，将实施例2中成功构建的重组质粒(PX459-RIPLET-sgRNA1和PX459-RIPLET-sgRNA2)各2μg与Lipofectamine3000，6μL(按照比例1μg：1.5μL)加至50μL的Opti-MEM中，静止5min后将两者混合。将脂质体-质粒DNA混合物静置15min后直接加至细胞培养基中。将细胞重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24小时。用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选72小时。

实施例4 RIPLET基因敲除BHK21细胞系的筛选与鉴定

1.细胞DNA的提取及打靶效率鉴定：

按照微量DNA提取试剂盒的操作说明提取嘌呤霉素筛选后的BHK21细胞总DNA，使用RIPLET基因DNA check引物进行扩增，总50μL反应体系：PremixTaq(ExTaqVersion2.0plusdye)，25μL；DNA模板，100ng；RIPLET基因DNAcheck引物：BHK-RIPLET-Check-F(5’-AGCAACGCCAAGCACTTCTA-3’，SEQ ID NO.11所示)；和BHK-RIPLET-Check-R(5’-TGCCAGAATCGTGTGGGTTT-3’，SEQ ID NO.12所示)各1μL；ddH₂O，22μL。反应程序：98℃，3min；98℃，15sec，58℃，30sec，30个循环；72℃，45sec；72℃，10min；16℃保存。取6μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图2所示，说明扩增片段中发生了打靶。将剩余PCR产物纯化回收后送样进行测序，测序图谱如图3所示，测序峰图中出现了大量的套峰，表明扩增片段中发生了有效的基因编辑。

2.RIPLET基因敲除BHK21细胞系的测序鉴定：

将有打靶的细胞进行有限稀释、挑选单克隆细胞。利用0.25％胰酶消化细胞，轻拍脱落后，加入培养基吹打均匀；留取100μL细胞悬液用于细胞计数。根据计数结果使用无血清培养基进行有限稀释法，按照10倍依次稀释至100个细胞。使用100μL排枪将稀释后细胞悬液每孔0.1mL加入96孔板中，每孔计算含有1个细胞。培养5-7天后观察，除去双细胞孔、多细胞孔，对细胞形态正常且单一细胞孔进行标记；继续培养约7-9天，确认单克隆细胞团生长状况良好后，将96孔板中筛选的单克隆细胞团胰酶消化转入48孔板继续传代培养，待细胞长满后依次传至24孔板、12孔板、6孔板进行放大培养。

取10株敲除型候选细胞株分别培养，待细胞长满后，用0.25％胰酶消化细胞，5000rpm离心5min。去除上清，细胞用试剂盒进行DNA提取。如细胞DNA的提取及打靶效率鉴定方法所述，利用RIPLET基因DNAcheck引物进行扩增后，琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图4所示，表明25#、26#、27#、29#和30#为成功打靶的单克隆细胞系。

将鉴定有打靶效率的样本的PCR产物进去纯化回收。回收后连入PMD-19T载体中，总体系10μL：pMD19-TVector 0.5μL；SolutionI 5μL；PCR回收产物4.5μL；16℃反应2h。将10μL连接产物加入至100ΜlTrans5α感受态细胞中，冰中放置30分钟；42℃加热45秒钟后，再在冰中放置2分钟；加入500μL无抗性LB培养基，37℃振荡培养60分钟。将200μL悬液均匀涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。培养12小时；每个样本挑选8个白色菌落，使用pM19-TVector通用引物进行测序。确定29#为单克隆RIPLET基因敲除细胞系，经与野生型序列比对，结果如图5中A所示，发现RIPLET基因敲除细胞系发生了182个核苷酸的缺失。提取野生型细胞与#29单克隆细胞系基因组，用RIPLET基因DNA check引物进行扩增后，琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5中B所示，表明与野生型扩增片段相比，片段减小了预期大小，进一步确定了基因的缺失。

综上所述，本发明通过CRISPR-Cas9技术成功构建了RIPLET基因编码蛋白功能丧失的细胞系(RIPLET基因敲除BHK21细胞系)。但本发明并不局限于CRISPR-Cas9技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使RIPLET基因编码蛋白功能丧失也能够获得RIPLET基因编码蛋白功能丧失的细胞系。

实施例5 RIPLET基因敲除BHK21细胞系对FMDV病毒复制的影响

用RIPLET基因敲除BHK21细胞和野生型BHK21细胞，进行正常传代培养后，分别将等量细胞铺至12孔板细胞培养皿，1:1000接种O/BY/CHA/2010株口蹄疫病毒，感染8h后，分别用Western blotting和qPCR方法检测FMDV复制情况。

结果如图6所示，Western blotting检测结果显示，相较于野生型BHK21细胞，RIPLET基因敲除BHK21细胞中口蹄疫病毒结构蛋白VP1、VP3的表达量显著增高；qPCR和TCID₅₀方法检测结果显示，RIPLET基因敲除BHK21细胞接种口蹄疫病毒后，病毒RNA含量明显升高，病毒滴度升高，进一步表明FMDV在RIPLET基因敲除BHK21细胞中可以更高水平的复制，可以增加结构蛋白抗原表达量。以上结果表明，构建的RIPLET基因敲除细胞系可用于口蹄疫病毒疫苗的生产，提升疫苗抗原产能。

实施例6 RIPLET基因敲除BHK21细胞系对SVA病毒复制的影响

用RIPLET基因敲除BHK21细胞和野生型BHK21细胞，进行正常传代培养后，分别将细胞铺至12孔细胞培养板，1:200接种CH-FJ-2017-1株塞内卡病毒，感染12h后，分别用Western blotting和qPCR方法检测SVA复制情况。

结果如图7所示，Western blotting检测结果显示，相较于野生型BHK21细胞，RIPLET基因敲除BHK21细胞中塞内卡病毒结构蛋白VP2的表达量显著增高；qPCR和TCID₅₀检测结果显示，RIPLET基因敲除BHK21细胞接种塞内卡病毒后，病毒RNA含量明显升高，病毒滴度升高，进一步表明塞内卡病毒在RIPLET基因敲除BHK21细胞中可以更高水平的复制，可以增加结构蛋白抗原表达量。以上结果表明，构建的RIPLET基因敲除细胞系可用于塞内卡病毒疫苗生产，提升疫苗抗原产能。

综上结果表明，RIPLET基因敲除细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒结构蛋白的表达，促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，可用于小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> RIPLET敲除细胞系的构建及作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 434

<212> PRT

<213> 幼仓鼠(hamster)

<400> 1

Met Ala Thr Pro Val Leu Gly Thr Ser Ile Pro Val Trp Leu Ser Glu

1 5 10 15

Glu Asp Leu Ser Cys Ile Ile Cys Gln Gly Leu Leu Asn Trp Pro Val

20 25 30

Thr Leu Pro Cys Gly His Ser Phe Cys His Arg Cys Leu Asn Gly Leu

35 40 45

Trp Ala Thr Gln Arg Ala Gly Val Asn Gly Arg Pro Trp Ser Cys Pro

50 55 60

Thr Cys Arg Glu Gly Pro Glu Ala Lys Pro Lys Leu Arg Lys Asn Leu

65 70 75 80

Leu Leu Gln Asp Leu Ala Asp Lys Tyr Arg Gln Ala Ala Leu Glu Leu

85 90 95

Glu Ala Gly Pro Glu Thr Ala Pro Ala Pro Arg Ser Pro Gly Arg Pro

100 105 110

Ala Gln Pro Pro Asp Leu Pro Ser Val Asp Gln Gly Gly Leu Glu Pro

115 120 125

Gln Val Ala Val Gln Lys Ser Thr Thr Glu Glu Val Ile Gln Glu Leu

130 135 140

Thr Glu Leu Gly Gln Gln Leu Glu Asp Ile Val Lys Ser Leu Gln Thr

145 150 155 160

Pro Arg Pro Arg Ser Gly Cys Gly Leu Asp Asn Glu Val Gly Ile Leu

165 170 175

Asp Met Ala Ser Ser Ser Glu Arg Glu His Ser Leu Ser Ser Pro Lys

180 185 190

Leu Val Thr Ser Ser Ala Ser Glu Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Gln

195 200 205

Lys Leu Glu Glu Ile Gln Lys Lys Leu Lys Gly Ser Val Thr Trp Lys

210 215 220

Glu Ala Pro Gly Glu Gln Val Gln Glu Met Pro Ser Ser Ser Leu Cys

225 230 235 240

Gln Leu Pro Asp Gln Gly Cys Pro Val Pro Arg Lys Ser Ser Gln Phe

245 250 255

Ala Leu Trp Ala Ile Ser Pro Thr Phe Asp Leu Gly Ser Leu Ser Cys

260 265 270

Asn Leu Glu Val Ser Asn Ser Cys Arg Thr Val Thr Val Ser His Cys

275 280 285

Gln Gln Pro Tyr Arg Trp Ser Pro Glu Arg Phe Leu Ile Ser Gln Val

290 295 300

Leu Cys Ser Gln Ala Leu Ser Ser Gly Arg Arg Tyr Trp Glu Val Asp

305 310 315 320

Thr Arg Asn Cys Asn His Trp Ala Val Gly Val Ala Ser Trp Gly Met

325 330 335

Lys Arg Asn Gln Val Leu Gly Arg Thr Lys Asp Ser Trp Cys Ile Glu

340 345 350

Trp Lys Gly Pro Gly Gln Phe Ser Ala Trp Ala Thr Glu Lys Lys Thr

355 360 365

Asp Leu His Leu Gly Arg Pro Glu Val Val Gly Val Trp Leu Asp Leu

370 375 380

Glu Leu Gly Lys Leu Ala Phe Tyr Ser Val Ser Asp Gln Glu Arg Leu

385 390 395 400

Leu Tyr Glu Cys Glu Val Ser Val Ser Tyr Pro Leu His Pro Ala Phe

405 410 415

Trp Leu Tyr Gly Leu Cys Pro Gly Asn Tyr Leu Glu Ile Lys Gln Val

420 425 430

Asn Ser

<210> 2

<211> 1305

<212> DNA

<213> 幼仓鼠(hamster)

<400> 2

atggcgaccc cggtcctagg cacttccatt cctgtgtggt tgagcgagga ggacctgagc 60

tgcattatct gccaagggtt gctgaactgg ccggtcacgc tgccctgcgg ccacagcttt 120

tgccaccggt gcctcaatgg cttgtgggcc acgcagcgcg cgggcgtgaa tggccgcccc 180

tggtcttgcc ccacctgccg ggagggcccc gaggcgaagc caaaactgcg caagaaccta 240

ctgttgcagg acctggcgga caagtaccgc caagcggcgc ttgagctcga ggctggccca 300

gaaaccgcgc ccgcaccccg atcgccgggt cgccccgcgc agccgccgga tctacctagt 360

gtagaccaag gtggccttga acctcaagtg gcagtacaga agagcaccac agaagaggtc 420

atccaggagc tgacagaact ggggcaacag cttgaagaca ttgtcaagag ccttcaaaca 480

ccaagaccta ggtcgggatg tggactggac aatgaagtag gcatcctgga catggcttct 540

tcctcagaga gggaacattc cttgagttct ccaaagctgg taacatccag tgcatccgag 600

aggaaaattc gagagattct ccaaaagcta gaagaaattc agaaaaaact gaaagggagt 660

gtcacatgga aagaagctcc tggagaacaa gttcaggaaa tgccatcttc ttccttatgc 720

cagctgcctg accaagggtg tcctgtaccc aggaaatctt ctcagtttgc cctatgggcc 780

atcagtccaa catttgactt ggggagcctc tcctgtaacc tggaggtttc taacagttgc 840

cggacagtga ccgtgtctca ttgtcaacag ccctatcgtt ggagtcccga gagattttta 900

attagccaag tcttatgttc ccaggctctc tcctctggcc ggaggtactg ggaagtggac 960

actaggaact gtaaccactg ggctgttggg gtggcttcgt ggggcatgaa gcggaaccag 1020

gtgctgggaa ggactaagga ttcttggtgc atagagtgga aagggcctgg ccagttctct 1080

gcttgggcca cggagaagaa aactgacctt cacttaggcc gcccggaggt cgtgggcgtg 1140

tggctggacc ttgagttggg gaagcttgcc ttctactcgg tctctgacca ggagaggctt 1200

ctgtatgagt gtgaggtctc tgtctcctac cccctgcacc ctgccttctg gctgtatggc 1260

ttatgtcctg gaaactacct agaaataaag caggtaaact catga 1305

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgtgagc tgcattatct gccaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacttggca gataatgcag ctcac 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgcctac tgttgcagga cctgg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacccaggt cctgcaacag taggc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccgtgagc tgcattatct gccaa 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacttggca gataatgcag ctcac 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caccgcctac tgttgcagga cctgg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaacccaggt cctgcaacag taggc 25

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agcaacgcca agcacttcta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tgccagaatc gtgtgggttt 20

Claims

1.抑制或者沉默细胞中RIPLET基因的表达的试剂在制备小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括靶向敲除RIPLET基因的sgRNA，和/或Cas9蛋白的mRNA序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述sgRNA包括RIPLET-sgRNA和RIPLET-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

RIPLET-sgRNA1-F：5’-CACCGTGAGCTGCATTATCTGCCAA-3’；

RIPLET-sgRNA1-R：5’-AAACTTGGCAGATAATGCAGCTCAC-3’；

RIPLET-sgRNA2-F：5’-CACCGCCTACTGTTGCAGGACCTGG-3’；

RIPLET-sgRNA2-R：5’-AAACCCAGGTCCTGCAACAGTAGGC-3’。

4.如权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述小核糖核酸病毒科病毒包括口蹄疫病毒和塞内卡病毒。

5.一种特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括RIPLET-sgRNA和RIPLET-sgRNA2中的至少一种，所述sgRNA的核苷酸序列为：

RIPLET-sgRNA1-F：5’-CACCGTGAGCTGCATTATCTGCCAA-3’；

RIPLET-sgRNA1-R：5’-AAACTTGGCAGATAATGCAGCTCAC-3’；

RIPLET-sgRNA2-F：5’-CACCGCCTACTGTTGCAGGACCTGG-3’；

RIPLET-sgRNA2-R：5’-AAACCCAGGTCCTGCAACAGTAGGC-3’。

6.如权利要求5所述的sgRNA在制备RIPLET基因敲除细胞系中的应用。

7.一种RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法，其特征在于，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中RIPLET基因编码蛋白功能丧失。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)制备权利要求5所述的特异性靶向RIPLET基因的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向RIPLET基因的sgRNA寡聚核苷酸；

9.如权利要求8所述的方法制备获得的RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系。

10.RIPLET基因编码蛋白功能丧失细胞系作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。