CN117224683A - Trim25基因作为靶点在抑制h9n2流感病毒复制中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及TRIM25基因作为靶点在抑制H9N2流感病毒复制中的应用。(1)本发明发现抑制或沉默TRIM25基因，能够抑制H9N2流感病毒的复制，TRIM25可作为靶点用于筛选抑制H9N2流感病毒复制的药物；(2)本发明提供了一种特异性靶向TRIM25基因的sgRNA，结合CRISPR‑Cas9技术实现了TRIM25基因的完全敲除，获得的单克隆细胞系对H9N2流感病毒具有抗性表型，为H9N2流感病毒的防控提供新思路；(3)本发明发现过表达TRIM25细胞系能够促进H9N2流感病毒的复制，TRIM25或其表达促进剂可作为H9N2流感病毒的复制或生产增效剂。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种TRIM25基因作为靶点在抑制H9N2流感病毒复制中的应用。
背景技术
H9N2流感病毒属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)A型流感病毒(Influenza Avirus，IAV)属，是一种分节段的单股负链RNA病毒。流感病毒的自然宿主为野生的水禽和水鸟，H9N2亚型流感病毒宿主范围在不断扩大，可以感染包括人类在内的多种哺乳动物，对公共卫生安全造成巨大威胁。H9N2是最常见的低致病性流感病毒，本身不会直接引起明显的临床症状，但是它的感染会抑制家禽的免疫反应，且病程较长，容易引发其他病原体的继发感染，从而对家禽造成严重损伤甚至死亡，对家禽养殖业造成重大的损失。目前，疫苗接种仍是我国控制H9N2流感的主要策略之一。然而，多种抗原构成不同的H9N2病毒在我国流行，疫苗的开发速度滞后于病毒突变的速度，给有效的疫苗接种带来了挑战，开发一种具有广谱中和活性良好的通用疫苗对H9N2的控制具有重要意义。因此，对H9N2流感病毒进行更多的研究，揭示更多病毒蛋白调控宿主免疫反应的机制尤为关键。
TRIM25是一种E3泛素连接酶，泛素化是指在泛素激活酶E1、泛素偶联酶E2和泛素连接酶E3的协同作用下，将泛素与特定的靶蛋白结合的过程。最初的研究发现泛素化参与了蛋白质的降解，随着研究的深入，发现泛素化也可以介导蛋白质之间的相互作用和细胞信号转导等过程。TRIM25是第一个被鉴定的免疫调节TRIM蛋白，它通过控制K63型多聚泛素链修饰CARDs调节RIG-I的活性，这是一种非降解类型的泛素化，通过诱导RIG-I寡聚化，随后被招募到MAVS中，从而触发下游抗病毒基因的表达。现有研究表明，TRIM25表达能够抑制口蹄疫病毒、甲型流感病毒、传染性法氏囊和狂犬病毒。
本发明意外发现，与口蹄疫病毒、甲型流感病毒、传染性法氏囊和狂犬病毒等相反的是，TRIM25表达反而能促进H9N2流感病毒的复制，TRIM25或其表达促进剂可作为H9N2流感病毒的复制或生产增效剂，用于H9N2流感病毒或疫苗的生产；而抑制TRIM25表达能够抑制H9N2流感病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制H9N2流感病毒复制的药物。基于此，本发明以TRIM25基因为靶点，设计了一种特异性靶向TRIM25基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向TRIM25基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了TRIM25基因敲除，获得的单克隆细胞系对H9N2流感病毒具有抗性表型，能够显著抑制H9N2流感病毒在细胞内的复制，为研究TRIM25基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供了研究工具和材料，也可用于抗H9N2流感病毒的动物育种。
发明内容
针对上述技术问题，本发明首先发现通过抑制或沉默宿主TRIM25基因，能够抑制H9N2流感病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制H9N2流感病毒复制的药物；其次，本发明提供了一种特异性靶向TRIM25基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向TRIM25基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了TRIM25基因的敲除，获得的单克隆细胞系对H9N2流感病毒具有抗性表型，能够显著抑制H9N2流感病毒在细胞内的复制，进一步地，通过TRIM25基因作为靶点能够筛选用于预防或治疗H9N2流感病毒感染药物，为H9N2流感病毒的防控提供新思路为；最后，本发明发现，过表达TRIM25后，能够显著促进H9N2流感病毒的复制，因此，TRIM25或其表达促进剂可作为H9N2流感病毒的复制或生产增效剂，用于H9N2流感病毒或疫苗的生产；且过表达TRIM25的细胞系可作为H9N2流感病毒或疫苗的生产细胞系。
具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种TRIM25基因/蛋白作为靶点在筛选用于预防或治疗H9N2流感病毒感染药物中的应用，所述药物以TRIM25基因/蛋白为靶点，抑制或者沉默TRIM25基因/蛋白的表达。
第二方面，本发明提供了TRIM25基因/蛋白表达抑制剂的在制备预防或治疗H9N2流感病毒感染药物中的应用。
优选地，所述抑制剂为干扰TRIM25基因/蛋白表达的RNA片段，或靶向TRIM25基因/蛋白的SgRNA，或下调TRIM25基因/蛋白表达的小分子化合物。
优选地，所述抑制剂为靶向TRIM25基因/蛋白的SgRNA。
优选地，所述抑制剂还包括Cas9蛋白的mRNA。
优选地，所述抑制剂通过药物递送载体将携带靶向TRIM25基因/蛋白的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA递送至动物体内抑制TRIM25基因表达。
优选地，所述药物递送载体为脂质体纳米颗粒。
优选地，所述靶向TRIM25基因/蛋白的SgRNA的序列为：
TRIM25-sgRNA-F：5’-GGGAGCCACCCGCCGACGTC-3’；
TRIM25-sgRNA-R：5’-GACGTCGGCGGGTGGCTCCC-3’。
第三方面，本发明提供了一种特异性靶向TRIM25基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列为：
TRIM25-sgRNA-F：5’-GGGAGCCACCCGCCGACGTC-3’；
TRIM25-sgRNA-R：5’-GACGTCGGCGGGTGGCTCCC-3’。
第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的sgRNA在制备TRIM25基因敲除细胞系，或在制备预防或治疗H9N2流感病毒感染药物中的应用。
第五方面，本发明提供了一种TRIM25基因敲除细胞系的构建方法，所述方法为通过基因打靶技术使宿主细胞中TRIM25基因编码蛋白功能丧失。
优选地，所述方法为CRISPR-Cas9技术。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)制备上述第三方面所述的特异性靶向TRIM25基因的sgRNA，在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端，作为靶向TRIM25基因的sgRNA寡聚核苷酸；
(2)将步骤(1)制备的双链片段插入到Cas9表达载体的多克隆位点，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；
(3)将步骤(2)制备的重组载体转染宿主细胞，挑取单个细胞，接种培养，获得TRIM25基因敲除细胞系。
第六方面，本发明提供了一种根据上述第六方面所述的方法构建的TRIM25基因敲除细胞系。
第七方面，本发明提供了TRIM25基因敲除细胞系在非诊断治疗目的的检测中的应用，或作为动物抗H9N2流感病毒育种细胞系中的应用。
第八方面，本发明提供了TRIM25基因/蛋白作为靶点在筛选H9N2流感病毒复制增效剂或生产增效剂中的应用，所述增效剂以TRIM25基因/蛋白为靶点，促进TRIM25基因/蛋白的表达。
第九方面，本发明提供了TRIM25蛋白或其表达促进剂在制备H9N2流感病毒的复制增效剂或H9N2流感病毒疫苗的生产增效剂中的应用。
第十方面，本发明提供了TRIM25基因过表达细胞系作为H9N2流感病毒或疫苗的生产细胞系的应用。
本发明的有益效果是：①本发明首先发现通过抑制或沉默宿主TRIM25基因，能够抑制H9N2流感病毒的复制，可作为靶点用于制备抑制H9N2流感病毒病毒复制的药物；②本发明提供了一种靶向TRIM25基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向TRIM25基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中TRIM25基因的敲除；将靶向TRIM25基因的sgRNA和Cas9蛋白的mRNA序列通过药物载体递送至动物体内，可实现TRIM25基因的抑制，进而抑制H9N2流感病毒的感染；③本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建TRIM25基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法，通过使TRIM25基因敲除，获得了具有H9N2流感病毒抗性的细胞系，能够显著抑制H9N2流感病毒的复制，为进一步研究TRIM25基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料，也可用于抗H9N2流感病毒的动物育种；④本发明发现，过表达TRIM25后，能够显著促进H9N2流感病毒的复制，因此，TRIM25或其表达促进剂可作为H9N2流感病毒的复制或生产增效剂，用于H9N2流感病毒或疫苗的生产；且过表达TRIM25的细胞系可作为H9N2流感病毒或疫苗的生产细胞系。
附图说明
图1TRIM25基因敲除HEK293T细胞TRIM25蛋白Western blotting检测结果；
图2TRIM25基因敲除HEK293T细胞TRIM25测序鉴定结果；
图3TRIM25基因敲除HEK293T细胞经H9N2攻毒后细胞内病毒滴度检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
定义
术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变、以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的TRIM25基因敲除，获得的TRIM25基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系并能抑制H9N2感染后的病毒复制；本发明也可以通过对宿主细胞中的TRIM25基因突变，或缺失基因片段，导致TRIM25基因编码蛋白发生移码突变，成功构建TRIM25基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系。
术语“sgRNA”是向导RNA，指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。
本发明通过人工合成了靶向TRIM25基因的sgRNA，进一步在sgRNA片段正向序列的5’端加入CACC粘性末端，在反向序列的5’端加入AAAC粘性末端制备了靶向TRIM25基因的sgRNA寡聚核苷酸，并退火为双链片段。
本发明在直接靶向剪接TRIM25基因的基础上，利用CRISPR-Cas9联合特异性敲除TRIM25基因的方法，以人HEK293T为例，进行了TRIM25基因的敲除，为H9N2的预防或治疗提供了一种策略。本发明虽然仅对HEK293T中TRIM25基因进行敲除，获得了一种具有H9N2抗性的基因敲除细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到其他动物细胞中TRIM25基因敲除，构建具有TRIM25抗性的基因敲除细胞。
CRISPR-Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对TRIM25基因的sgRNA序列，实现TRIM25基因的准确、高效的敲除，获得一种具有抑制H9N2病毒复制的TRIM25基因敲除单克隆细胞系，从而为H9N2感染的预防或治疗提供新的策略。
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，通过靶向TRIM25基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到TRIM25基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。
细胞培养：HEK293T细胞来源于人；用含5％胎牛血清(FBS)、1％双抗的DMEM培养基置于含有5％ CO2，于37℃温箱中进行培养。
病毒来源：(H9N2，influenza A/chicken/Hong Kong/G9/1997)毒株保存于吉林农业大学动物微生态制剂工程研究中心。
实施例1TRIM25基因敲除HEK293T细胞系
1.靶向TRIM25基因sgRNA的设计
利用数据库查询TRIM25基因序列(Gene ID：7706)，定位TRIM25在基因组中不同转录组中不同转录本重叠区的第一个外显子段，用于靶点设计。
根据CRISPR-Cas9设计原则，登录CRISPR在线设计网站http://crispr.mit.edu/进行sgRNA的设计，命名为：TRIM25-sgRNA；在sgRNA片段正向序列5’端加上CACC粘性末端，在反向序列5’端加上AAAC粘性末端，作为靶向TRIM25基因的sgRNA寡聚核苷酸(sgRNA1-oligo)。所述sgRNA-oligo由擎科生物公司合成，详细序列见表1。
表1靶向TRIM25基因的sgRNA寡聚核苷酸
注：下划线部分所标注的序列为加入的酶切位点，不加下划线的序列为sgRNA序列(SEQ ID NO.1-2所示)。
2.sgRNA重组质粒pX459-sgRNA的构建
pX459载体质粒的酶切：利用Bbs I限制性内切酶酶切pX459载体，体系为(20μL)：pX459载体，5μL；Bbs I，1μL；10×Buffer，2μL；ddH2O，12μL。37℃中放置3h进行酶切。之后进行核酸电泳，利用Omega公司的DNA纯化试剂盒纯化回收含有粘性末端的pX459载体线性化片段。
双链sgRNA-oligo的获得，将合成的两条oligo DNA退火形成双链DNA。退火反应体系为(20μL)：TRIM25-sgRNA-F-oligo，0.5μL；TRIM25-sgRNA-R-oligo，0.5μL；ddH2O，18μL；Annealing Buffer(20×)，1μL。
将以上体系瞬时离心后，在PCR仪中孵育3min，孵育后自然冷却20min。取3.5μL杂交后的双链DNA进行T4 DNAligase连接反应，反应体系为(5μL)：pX459酶切纯化片段，0.5μL；双链DNA，3.5μL；T4 DNALigase，0.5μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，0.5μL。
连接产物直接转化DH5a大肠杆菌高效感受态细胞。转化程序如下：将50μL的DH5a大肠杆菌高效感受态细胞与500ng连接产物混合，冰上放置30min。42℃水浴热激45s，取出冰浴2min。加入无抗LB培养液500mL，37℃，220rpm摇菌1h。将复苏好的菌液4000rpm室温离心5min，弃掉400μL上清后，将剩余上清与沉淀的菌体充分悬浮，用涂菌棒将转化的大肠杆菌涂布在具有氨苄西林抗性的LB培养平板上，37℃温箱培养12h，观察生长情况。
挑取单克隆菌落，利用含有氨苄西林抗性的LB培养液摇菌12h，利用Omega质粒提取试剂盒提取并测序验证，利用TRC通用引物检测所构建质粒得到的序列与原载体进行比对，与预期结果相符。表明表达sgRNA的质粒pX459-TRIM25-sgRNA构建成功。
3.细胞转染
HEK293T细胞使用含有5％的FBS、1％双抗的DMEM培养基培养，当细胞传代2-3次性状稳定且状态良好时，将细胞消化后铺于细胞六孔板，当细胞融合度达到80％，进行转染。将所构建的重组质粒2μg与4μL转染试剂Lipofectamine2000，均用等体积DMEM稀释，静置5min，随后将二者等体积混合，静置5min，以上过程均在室温中进行。最后将混合物转染至HEK293T细胞37℃，5％ CO2培养箱内培养24h，随后用嘌呤霉素浓度2μg/mL的培养基处理细胞2-3天，筛选出转染阳性的细胞。随后通过细胞计数，数100个阳性细胞铺在96孔板中获得单个细胞克隆。
(1)TRIM25-KO Western blotting验证
以未发生基因编辑的HEK293T细胞(野生型细胞)作为阴性对照。取野生型细胞(WT)株与敲除型候选细胞株分别培养，待细胞长满后，收取细胞。加RIPA和2×SDS-PAGEBuffer1:1混合物进行裂解，移至1.5mL EP管中，100℃金属浴10min，12000rpm离心1min。取上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。程序结束后用含5％脱脂牛奶的TBST封闭1h；在4℃条件下孵育一抗(TRIM25抗体、GAPDH抗体)过夜，用1×TBST洗膜3次，每次5min；二抗(HRP偶联的羊抗兔二抗，HRP偶联的羊抗鼠二抗)在室温摇床上孵育1h，用1×TBST洗膜3次，每次5min，将发光底物ECL显影液滴加于硝酸纤维素膜上，曝光显影，对TRIM25基因敲除HEK293T细胞系在蛋白表达水平进行验证。结果如图1所示，TRIM25-KO HEK293T细胞系中TRIM25蛋白无表达。
(2)TRIM25敲除细胞系测序鉴定
将无TRIM25蛋白表达的TRIM25基因敲除HEK293T细胞系(TRIM25-KO)提取mRNA，RT-PCR扩增TRIM25靶标序列，送至擎科生物公司测序，如图2所示，其中TRIM25-KO测序结果表明扩增片段中发生了14个有效的碱基缺失，导致移码突变，结合Western blotting结果未检测到TRIM25蛋白表达，说明成功构建TRIM25基因敲除HEK293T细胞系。
实施例2TRIM25基因敲除HEK293T细胞系对H9N2复制的影响
用野生型HEK293T细胞正常传代后，转染空载或过表达TRIM25质粒；以及用TRIM25基因敲除HEK293T细胞和野生型HEK293T细胞正常传代后，均铺于细胞培养皿中，接种H9N2流感病毒。最后利用流感病毒滴定实验检测H9N2流感病毒复制情况。
结果如图3所示，其中，vector为转染空载体的野生型HEK293T细胞，TRIM25为转染过表达TRIM25质粒的HEK293T细胞，TRIM25+/+为野生型HEK293T细胞，TRIM25-/-为本申请所述的TRIM25基因敲除HEK293T细胞。结果表明，野生型HEK293T细胞过表达TRIM25基因后(TRIM25)，接种H9N2流感病毒后病毒复制能力强于正常野生型HEK293T细胞；以及TRIM25基因敲除HEK293T细胞(TRIM25-/-)接种H9N2流感病毒后病毒复制能力弱于野生型HEK293T细胞。
以上结果表明，通过基因编辑技术获得TRIM25基因敲除HEK293T细胞能够显著抑制H9N2流感病毒的复制，具有H9N2流感病毒抗性。因此构建的TRIM25基因编码蛋白的功能丧失细胞可用于动物抗H9N2流感病毒的育种。
综上所述，本发明通过CRISPR-Cas9技术成功构建了TRIM25基因编码蛋白功能丧失的细胞系。但本发明并不局限于CRISPR-Cas9技术，在本发明的基础上，通过其他技术手段使TRIM25基因编码蛋白功能丧失也能够获得TRIM25基因编码蛋白功能丧失的细胞系。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
Claims (10)
1.TRIM25基因/蛋白作为靶点在筛选用于预防或治疗H9N2流感病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述药物以TRIM25基因/蛋白为靶点，抑制或者沉默TRIM25基因/蛋白的表达。
2.TRIM25基因/蛋白表达抑制剂的在制备预防或治疗H9N2流感病毒感染药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为干扰TRIM25基因/蛋白表达的RNA片段，或靶向TRIM25基因/蛋白的SgRNA，或下调TRIM25基因/蛋白表达的小分子化合物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶向TRIM25基因/蛋白的SgRNA的序列为：
TRIM25-sgRNA-F：5’-GGGAGCCACCCGCCGACGTC-3’；
TRIM25-sgRNA-R：5’-GACGTCGGCGGGTGGCTCCC-3’。
5.一种特异性靶向TRIM25基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列为：
TRIM25-sgRNA-F：5’-GGGAGCCACCCGCCGACGTC-3’；
TRIM25-sgRNA-R：5’-GACGTCGGCGGGTGGCTCCC-3’。
6.如权利要求5所述的sgRNA在制备预防或治疗H9N2流感病毒感染药物中的应用。
7.TRIM25基因敲除细胞系作为动物抗H9N2流感病毒育种细胞系中的应用，或非诊断治疗目的的检测细胞系中的应用。
8.TRIM25基因/蛋白作为靶点在筛选H9N2流感病毒复制增效剂或生产增效剂中的应用，其特征在于，所述增效剂以TRIM25基因/蛋白为靶点，促进TRIM25基因/蛋白的表达。
9.TRIM25蛋白或其表达促进剂在制备H9N2流感病毒的复制增效剂或H9N2流感病毒疫苗的生产增效剂中的应用。
10.TRIM25基因过表达细胞系作为H9N2流感病毒或疫苗的生产细胞系的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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