CN115948466B - Tollip敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，具体涉及Tollip敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。本发明首先发现，抑制宿主细胞中Tollip基因表达能促进小RNA病毒科病毒FMDV的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向Tollip的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向Tollip基因，结合CRISPR‑Cas9技术实现了Tollip基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小RNA病毒科病毒FMDV的复制，提高FMDV疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒疫苗尤其是FMDV疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种Tollip敲除细胞系的构建及作为小RNA病毒科病毒疫苗生产细胞系的应用。
背景技术
小核糖核酸(RNA)病毒科是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属，包括塞内卡病毒和口蹄疫病毒。口蹄疫属于口疮病毒属，是一种由口蹄疫病毒引起的重要的感染偶蹄动物的疾病，口蹄疫病毒(Foot-and-mouth Disease Virus，FMDV)是单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，由结构蛋白VP1-VP4组成。如何制定有效的诊断和防控策略以及措施来防止口蹄疫病毒的不断流行和扩散是当前亟待解决的问题。开发出有效的疫苗是当前该病防控最有效的举措。而选取病毒高效繁殖的细胞系是制备有效疫苗的前提，急需开展相关工作。
其中，基因编辑技术是通过分子生物学方法对各类细胞中基因进行定向、精准的突变、修饰或编辑的技术。该技术已被广泛用于疾病治疗、抗病育种、遗传工程改造等研究领域。基因编辑技术不断发展成熟，从第一代的依赖锌指核酸酶ZFN的编辑技术，第二代依赖转录激活样效应因子核酸酶TALEN的编辑技术，到第三代依赖成簇的规律性间隔的短回文重复序列CRISPR-Cas9的编辑技术，历经发展近30年，已经取得了突破性的进展。第三代基因编辑技术CRISPR-Cas9是利用小分子sgRNA进行靶基因编辑的一种定向基因组编辑技术。该技术较前两代编辑技术更加便捷、高效、精准、稳定，而且相关使用成本费用更加低廉。为基因组定向改造、修饰、调控和应用等带来了突破性革命，在医学与生命科学各大领域具有广阔的应用前景。
已有文献报道Tollip基因敲除能够抑制疱疹病毒中UL21蛋白诱导的CGAS降解，进而抑制疱疹病毒的复制。本发明意外发现，抑制宿主细胞中Tollip基因的表达能促进小RNA病毒科病毒的复制，尤其是FMDV的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向Tollip基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向Tollip基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了Tollip基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进小RNA病毒的复制，尤其是FMDV的复制，提高小RNA病毒疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小RNA病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。
发明内容
针对上述问题，本发明首先发现，抑制宿主细胞中Tollip基因的表达能促FMDV的复制；其次，本发明提供了一种特异性靶向Tollip基因的sgRNA，所述的sgRNA能够特异性靶向Tollip基因，结合CRISPR-Cas9技术实现了Tollip基因的敲除，获得的单克隆细胞系能够显著促进FMDV的复制，提高FMDV疫苗的生产量和抗原表达量，可作为FMDV疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种Tollip基因编码蛋白功能丧失细胞系作为小RNA病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系的应用。。
优选地，所述RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。
第二方面，本发明提供了一种抑制或者沉默Tollip基因表达的试剂在制备小RNA病毒科病毒或病毒疫苗生产细胞系中的应用。
优选地，所述小RNA病毒科病毒为口蹄疫病毒。
优选地，所述试剂包括靶向敲除Tollip基因的sgRNA，或靶向敲除Tollip基因的sgRNA与Cas9蛋白的mRNA序列组合。
优选地，所述sgRNA包括Tollip-sgRNA1和/或RTollip-sgRNA2；
所述Tollip-sgRNA1的靶向序列为：GAACTACGGCGTGACCCGCA；
所述Tollip-sgRNA2的靶向序列为：CAAGAACCCGCGCTGGAATA。
优选地，所述Tollip-sgRNA1由Tollip-sgRNA1-F和Tollip-sgRNA1-R退火形成的双链片段；所述Tollip-sgRNA2由Tollip-sgRNA2-F和Tollip-sgRNA2-R退火形成的双链片段；
Tollip-sgRNA1-F：5’-GAACTACGGCGTGACCCGCA-3’：
Tollip-sgRNA1-R：5’-TGCGGGTCACGCCGTAGTTC-3’：
Tollip-sgRNA2-F：5’-CAAGAACCCGCGCTGGAATA-3’：
Tollip-sgRNA2-R：5’-TATTCCAGCGCGGGTTCTTG-3’。
优选地，所述小RNA病毒科病毒包括口蹄疫病毒。
第三方面，本发明提供了一种特异性靶向Tollip基因的sgRNA，所述sgRNA包括Tollip-sgRNA1和/或RTollip-sgRNA2；
所述Tollip-sgRNA1的靶向序列为：GAACTACGGCGTGACCCGCA；
所述Tollip-sgRNA2的靶向序列为：CAAGAACCCGCGCTGGAATA。
优选地，所述Tollip-sgRNA1由Tollip-sgRNA1-F和Tollip-sgRNA1-R退火形成的双链片段；所述Tollip-sgRNA2由Tollip-sgRNA2-F和Tollip-sgRNA2-R退火形成的双链片段；
Tollip-sgRNA1-F：5’-GAACTACGGCGTGACCCGCA-3’：
Tollip-sgRNA1-R：5’-TGCGGGTCACGCCGTAGTTC-3’：
Tollip-sgRNA2-F：5’-CAAGAACCCGCGCTGGAATA-3’：
Tollip-sgRNA2-R：5’-TATTCCAGCGCGGGTTCTTG-3’。
第四方面，本发明提供了一种上述第三方面所述的sgRNA在Tollip基因敲除或在制备Tollip基因敲除细胞系中的应用。
第五方面，本发明提供了一种用于敲除Tollip基因的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述第三方面所述的sgRNA，或靶向敲除Tollip基因的打靶载体；所述靶向敲除Tollip基因的打靶载体包括上述第三方面所述的sgRNA和Cas9蛋白基因的编码序列。
第六方面，本发明提供了一种Tollip基因编码蛋白功能丧失细胞系的构建方法，所述方法为：通过基因打靶技术使宿主细胞中Tollip基因编码蛋白功能丧失。
优选地，所述方法为CRISPR-Cas9技术。
优选地，所述CRISPR/Cas9系统使用上述第三方面所述的sgRNA。
第七方面，本发明提供了一种Tollip基因编码蛋白功能丧失PK-15细胞系，所述PK-15细胞系的构建方法包括以下步骤：
(1)制备上述第三方面所述的特异性靶向Tollip基因的sgRNA；
(2)将步骤(1)制备的sgRNA退火并连接至PX459质粒，得到同时表达Cas9蛋白基因和打靶sgRNA序列的重组载体；
(3)将步骤(2)制备的重组载体转染PK-15细胞，用嘌呤霉素(puromycin)抗生素筛选获得Tollip基因功能缺失细胞系。
本发明的有益效果是：①本发明首先发现，抑制宿主细胞中Tollip基因的表达能促进小RNA病毒科病毒FMDV的复制；②本发明提供了一种靶向Tollip基因的sgRNA，所述sgRNA能够特异性靶向Tollip基因，结合CRISPR-Cas9技术可实现宿主细胞中Tollip基因的敲除，打靶准确、敲除效率高；③本发明提供了一种通过CRISPR-Cas9技术将所述sgRNA转染于宿主细胞，构建Tollip基因编码蛋白功能丧失细胞系的方法；④依据本发明所述方法获得的单克隆细胞系能够显著促进小RNA病毒科病毒FMDV的复制，提高小RNA病毒科病毒FMDV疫苗的生产量和抗原表达量，可作为小核糖核酸病毒科病毒或病毒疫苗的生产细胞系，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1靶向Tollip基因组区域的sgRNA色谱示意图；
图2Tollip-KO-1细胞系基因缺失突变型分析图；
图3Tollip-KO-2细胞系基因缺失突变型分析图；
图4Western Blotting检测敲除细胞系中Tollip基因的蛋白水平结果；
图5Tollip基因功能缺失细胞系Tollip-KOs细胞活力检测结果；
图6相对定量检测FMDV在Tollip-WT和Tollip-KOs细胞中的复制情况；
图7Western blot检测FMDV在Tollip-WT和Tollip-KOs细胞中的蛋白水平差异；
图8Tollip-KO细胞中口蹄疫病毒的病毒滴度检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施例进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施例的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
定义
术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明通过对宿主细胞中的Tollip基因靶向敲除，导致Tollip基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了Tollip基因编码蛋白功能丧失的细胞系，并用于FMDV疫苗的生产。但是本发明并不局限于Tollip基因敲除，也可通过其他技术手段使Tollip基因编码蛋白的功能丧失，并用于构建Tollip基因编码蛋白功能丧失的细胞系。
术语“基因打靶”是指利用DNA定点同源重组进行细胞或生物个体遗传信息定向改变的定向转基因技术，主要包括基因敲除、基因灭活、基因敲入、点突变、缺失突变以及染色体组大片段删除等。其中“基因敲除”是指通过同源重组使特定靶基因失活。本发明通过基因敲除技术，使宿主细胞中的Tollip基因敲除，获得的Tollip基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系能促进FMDV抗原的表达；本发明也可以通过对宿主细胞中的Tollip基因突变，或插入基因片段，导致Tollip基因编码蛋白发生移码突变，成功构建出Tollip基因编码蛋白功能丧失的单克隆细胞系。
术语“sgRNA”为向导RNA，是指在RNA编辑的过程中引导尿苷残基插入或缺失到动质体(kinetoplastid)中，属于一种小型非编码RNA。
本发明通过人工合成了靶向Tollip基因的sgRNA；本发明在直接靶向剪接Tollip基因的基础上，利用CRISPR/Cas9联合特异性敲除Tollip基因的方法，以PK-15细胞为例，进行了Tollip基因(Tollip氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)敲除，为FMDV疫苗的生产提效提供了一种策略。本发明虽然仅对PK-15细胞中Tollip基因进行敲除，获得了一种基因敲除宿主细胞，但是本发明所述的方法可以推论并扩展到对其他动物细胞中Tollip基因敲除，构建具有提升FMDV抗原表达的基因敲除细胞系。
CRISPR/Cas9系统对基因的定向识别和剪切是由sgRNA和Cas9实现的，sgRNA决定了Cas9的靶向性，也决定了Cas9的切割活性。本发明旨在应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过体内外筛选针对Tollip基因的sgRNA序列，实现Tollip基因的准确、高效地敲除，获得一种能够促进FMDV抗原表达的Tollip基因敲除单克隆细胞系，从而为FMDV疫苗的生产提供新的策略。
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过靶向Tollip基因的sgRNA引导Cas9蛋白结合到Tollip基因特定序列位置对DNA双链进行切割，造成基因双链断裂，在细胞自身修复机制作用下，产生随机突变，核苷酸的缺失或插入等突变会造成基因的读码框发生改变，最终达到基因编码蛋白功能丧失的目的，获得基因编码蛋白功能丧失细胞系。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。
以下实施例中所涉及的质粒来源：购买于淼灵质粒平台。
FMDV(FMDV/O/ZK/93株)来源于中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学团队与国家口蹄疫参考实验室。
以下实施例所述的Tollip基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
实施例1Tollip基因敲除PK-15细胞系的构建
利用NCBI数据库查询Tollip基因序列，根据CRISPR/Cas9设计原则，利用CRISPR软件在Tollip基因的第3个外显子区域的9528位置和9616位置分别设计两条sgRNA序列(结果如图1所示)：Tollip-sgRNA1和Tollip-sgRNA2：
所述Tollip-sgRNA1的靶向序列为：GAACTACGGCGTGACCCGCA(SEQ ID NO.3所示)；所述Tollip-sgRNA1是由Tollip-sgRNA1-F(5’-GAACTACGGCGTGACCCGCA-3’，SEQ ID NO.5所示)和Tollip-sgRNA1-R(5’-TGCGGGTCACGCCGTAGTTC-3’，SEQ ID NO.6所示)合成的双链片段；优选地，所述Tollip-sgRNA1由Tollip-sgRNA1-F和Tollip-sgRNA1-R退火形成的双链片段；所述Tollip-sgRNA2由Tollip-sgRNA2-F和Tollip-sgRNA2-R退火形成的双链片段；
所述Tollip-sgRNA1的靶向序列为：CAAGAACCCGCGCTGGAATA(SEQ ID NO.4所示)；所述Tollip-sgRNA2是由Tollip-sgRNA2-F(5’-CAAGAACCCGCGCTGGAATA-3’，SEQ ID NO.7所示)和Tollip-sgRNA2-R(5’-TATTCCAGCGCGGGTTCTTG-3’，SEQ ID NO.8所示)合成的双链片段；
sgRNA的退火：将sgRNA上下游序列合成产物稀释至100μmol/L后，取上下游引物各22.5μL，并加入10×PCR buffer，共50μL体系按照99℃退火处理5min，使上下游引物形成双链；
PX459载体的酶切：利用BBSI内切酶酶切PX459载体，按照PX459载体5μL，BBSI1μL、10×buffer 2μL、ddH2O 12μL，共20μL反应体系37℃酶切7h，胶回收酶切片段；
酶切载体与sgRNA的连接：T4连接酶0.5μL、10×T4连接酶buffer 0.5μL、PX459酶切片段1μL、退火后的sgRNA 2μL，ddH2O 1μL，共5μL体系，16℃连接2h；
PX459-sgRNA连接产物转化：将连接产物转化Trans5α感受态细胞，提取质粒，送南京擎科生物科技有限公司测序。使用BLAST软件对测序结果与目的基因序列进行对比，成功构建具有靶向Tollip基因不同外显子的sgRNA重组质粒，位置和序列信息如图1；重组质粒分别命名为：PX459-Tollip-sgRNA1、PX459-Tollip-sgRNA2。
细胞转染：根据Lipofectamine 2000(Invitrogen)的标准转染程序，将CRISPR重组质粒转染PK-15细胞系，转染24h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选3天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆(Tolli p-KO-1和Tollip-KO-2)，转移至48孔板，于37℃，5％CO2培养箱中，添加DMEM培养基中(10％胎牛血清和1％抗生素(penicilin-streptomycin))扩大培养。收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定；扩增产物进行Sanger测序，结果如图2和图3所示，Tollip-KO-1在Cas9外显子3的9528预定切割位置处(距离PAM基序(TGG)第3和4个碱基之间切割)有1个碱基的缺失，Tollip-KO-2在外显子3的9616预定切割位置处(距离PAM基序(AGG)第1和2个碱基之间切割)有1个碱基的插入。
蛋白水平鉴定时用Tollip的抗体(Cat No.11315-1-AP)，利用Western blot检测Tollip的蛋白水平表达。结果如图4所示，Tollip-KO-1和Tollip-KO-2细胞系中均检测不到Tollip的蛋白表达。上述结果表明，Tollip基因敲除PK-15细胞系构建成功。
实施例2Tollip基因敲除PK-15细胞系的活力检测
细胞活力检测，分别将待测细胞消化，细胞消化后计数，调整细胞悬液浓度，每孔100μL接种至96孔板，置细胞培养箱正常培养；每孔加入10μL CCK-8溶液，放细胞培养箱继续培养3h，用酶标仪测定每孔的OD450 nm，分析数据。结果如图5所示，Tollip基因敲除PK-15细胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2与正常型PK-15细胞的细胞活力相同，表明Tolli p基因的敲除并不影响宿主细胞的正常生长。
实施例3FMDV在Tollip-KO细胞系中的复制
分别将Tollip基因敲除PK-15细胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2和正常型PK-15细胞(WT)铺于6孔板中，待细胞长满后感染FMDV，于0，4，12h分别收取细胞，用Trizol裂解法提取细胞总RNA，测定浓度后，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TAKARA#RR047A)反转录试剂盒进行反转录，qPCR用SYBR Green qPCR SuperMix(TA KARA)试剂完成。GAPDH作为内参基因，对FMDV的相对表达水平进行定量。结果如图6中A所示，敲除Tollip之后在不同时间点显著促进FMDV复制。
为了研究接毒剂量对敲除Tollip细胞系的影响，分别将Tollip基因敲除PK-15细胞系Tol lip-KO-1和Tollip-KO-2和正常型PK-15细胞(WT)铺于6孔板中，待细胞长满后，感染不同剂量(MOI＝0.5，5，10)的FMDV，8h后收取细胞样品，按照上述步骤提取RNA，反转录进行定量实验。结果如图6中B所示，Tollip敲除细胞系均能促进不同感染浓度的FMDV。
为了研究敲除Tollip之后对FMDV蛋白水平的影响，将Tollip基因敲除PK-15细胞系To llip-KO-1和Tollip-KO-2和正常型PK-15细胞(WT)分别铺6孔板，待细胞长满后感染FM DV，分别于0，4，12h收取细胞样品，收集的细胞样品中加入200μL细胞裂解液(Pierce)，待细胞充分裂解之后离心除去细胞碎片收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)定量总蛋白。剩余部分加入四分之一体积的4×上样缓冲液混匀，煮沸5min，室温静置冷却。利用定量结果确定上样体积，上样量一般为20-40μg。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转NC膜，冰浴中100V恒压转膜1.5h。5％脱脂奶粉封闭1h。β-actin抗体(Santa Cruz)1:1000倍稀释，VP1单抗(由兰州兽医研究所流行病学团队保存)1:1000倍稀释，一抗4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗1:5000倍稀释，二抗室温孵育1h。蛋白检测用Thermo公司的显色试剂盒(PierceTM ECL Western Blotting Substrate)，图片经Image Lab 4.1(BIO-RAD)扫描成像。结果如图7所示，在FMDV/O/ZK/93接毒后收取的样品中，Tollip基因敲除PK-15细胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2中口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达远高于野生型细胞，说明Tollip基因功能缺失单克隆细胞系能够显著促进FMDV的复制。
此外，在Tollip基因敲除PK-15细胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2和WT细胞中分别比较了病毒滴度的差异，将FMDV分别感染Tollip基因敲除PK-15细胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2和WT细胞，不同时间点收取细胞样品。反复冻融三次后，用无血清的DMEM将获得细胞样品进行10-2～10-8倍梯度稀释，用各稀释度毒液分别接种96孔细胞培养板中长满单层的BHK细胞，每个稀释度接种8个孔，每个孔100μL。置于37℃、5％CO2恒温培养箱中培养并观察4天，每隔12h观察并记录细胞病变(CPE)情况，根据Reed-Muench法计算扩增病毒的TCID50。结果如图8所示，在FMDV/O/ZK/93接毒后收取的样品中，Tollip基因敲除PK-15细胞系Tollip-KO-1和Tollip-KO-2中口蹄疫病毒的病毒滴度远高于野生型细胞，说明To llip基因功能缺失单克隆细胞系能够显著促进FMDV的复制。
综上结果表明，Tollip基因敲除细胞系能够显著促进小核糖核酸病毒科病毒FMDV的复制，促进小核糖核酸病毒科病毒的复制，可用于小核糖核酸病毒科病毒疫苗的生产。
Claims (2)
1.Tollip基因敲除细胞系作为口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生产细胞系的应用。
2.抑制或者沉默Tollip基因表达的试剂在制备口蹄疫病毒或口蹄疫病毒疫苗生产细胞系中的应用。
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| Sus scrofa toll interacting protein (TOLLIP), mRNA;Shimazu T等;《GenBank》;序列部分 * |
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