CN111979273B

CN111979273B - 一种制备人源化ace2小鼠模型的方法

Info

Publication number: CN111979273B
Application number: CN202010860107.9A
Authority: CN
Inventors: 李振诚; 赖威仲; 徐洁
Original assignee: Suzhou Qichen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Qichen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2022-05-27
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN111979273A

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法，本发明能令对SARS‑CoV2有耐受性的小鼠得以被SARS‑CoV2感染，进而得以利用小鼠作为COVID19感染疾病模型。因小鼠的生长周期短、且成本低廉的优势，因此能够快速推进抗新冠病毒药物及疫苗的研发速度。

Description

一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种制备人源化ACE2 小鼠模型的方法。

技术背景

新型冠状病毒肺炎疫情在全世界范围内的爆发引起了严重的公共卫生安全问题以及经济衰退。新冠肺炎的是由新型冠状病毒 (SARS-CoV2)感染引起的严重急性呼吸系统综合症，该病毒属于冠状病毒科的β冠状病毒亚属。新冠病毒经空气传播进入呼吸系统，发病后会引起包括发烧，干咳和肺炎在内的症状，导致呼吸困难。与其他包括2003年发现的SARS-CoV、2012年发现的中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)和蝙蝠SARS相关冠状病毒(SARSr-CoV) 等β-冠状病毒相似，SARS-CoV2呈球形包膜上存在棘突，直径约为 80-160nm，内部有单股正链RNA基因组。SARS-CoV2包含四种结构蛋白，即包膜(E)，刺突(S)，膜(M)和核衣壳(N)。S，M 和E蛋白一起形成病毒的包膜。M蛋白含量最高，主要负责包膜的形状。E蛋白是最小的结构蛋白。S和M蛋白也是病毒在复制和装配过程中涉及的跨膜蛋白。N蛋白仍与病毒RNA基因组相关联，在包膜内部形成核衣壳(CDC，美国，https：//phil.cdc.gov/)。系统分析表明，蝙蝠冠状病毒RaTG13与SARS-CoV2具有高度相似性，在编码刺突蛋白的S基因中共有93.1％的序列同源性。然而，SARS-CoV和其他SARSr-CoV的S基因序列同源性与SARS-CoV2则相比少于80％的。

病毒与宿主细胞在感染位点之间的相互作用机制对于疾病的发生和发展至关重要。2003年引起SARS大流行的SARS-CoV和2020 年爆发的SARS-CoV2均通过刺突糖蛋白感染宿主细胞。此外，研究发现血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种在气道上皮、I型和II型肺泡上皮细胞高度表达的膜锚定羧肽酶，是SARS-CoVs感染宿主细胞的受体。人类ACE2(hACE2)和小鼠ACE2(mACE2)基因位于X 染色体上，是编码区域(Coding Sequences,CDS)约2.4kb的同源基因，具有非常高的相似度。由于刺突蛋白结合域上的序列差异， mACE2不像hACE2一样能够有效地与SARS-CoVs结合，因此无法使用小鼠作为新冠病毒的感染模型(见附图1：人类与小鼠ACE2蛋白质序列分析)。作为替代方案，与人类的ACE2更接近的非人类灵长类动物已作为模式动物，已被用于SARS-CoV2治疗方案、药物及疫苗的研发。由于使用非人类灵长类动物的高成本和道德问题限制了新冠病毒治疗方法的研发进程，因此需要一种相对成本较低且有效的动物模型例如啮齿类动物。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术存在的问题，提供一种 ACE2人源化小鼠模型的建立方法，以应对全球对COVID-19治疗与疫苗研发小鼠模型的迫切需求。其技术关键点在于采用CRISPR/Cas9 与ssODN介导之同源重组，将小鼠基因组ACE2编码区域置换成人源ACE2编码区域，使小鼠能内源性表达人类SARS-CoV2病毒受体 ACE2。本发明发现小鼠ACE2的exon 2与exon 15具有易靶向插入外源性基因序列的特性，此外，为尽可能保持小鼠基因组完整性避免因矫作(artifact)造成小鼠表型异常，故本发明选择sgRNA靶向exon 2与exon 15，保留exon 15与exon 19之间的序列。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法，包括以下关键步骤：

打靶sgRNA、ssODN的设计：针对小鼠ACE2基因组序列的exon 2与exon 15的序列分别设计上下游两条sgRNA引物序列；针对小鼠ACE2 exon 2与人类ACE2编码区域5’端同源序列以及人类ACE2 编码区域3‘端与小鼠ACE2 exon 15同源序列设计上下游两条ssODN 序列。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述上游 sgRNA引物序列，包含有如SEQ ID NO.1所示的核酸序列；所述下游sgRNA引物序列，包含有如SEQ ID NO.2所示的核酸序列。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述上下游 sgRNA引物序列的5’端均带有T7启动子序列。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述上游 sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述上下游 ssODN序列的5’端均包括人源ACE2编码区同源序列，所述上下游 ssODN序列的3’端均包括小鼠ACE2基因组同源序列。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述上游 ssODN的序列如SEQID NO.5所示，所述下游ssODN的序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，包括以下步骤：

(1)人源ACE2编码序列的获取；

(2)打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备：利用上下游sgRNA 引物合成sgRNA，合成上下游ssODN，制备Cas9 RNP；

(3)小鼠受精胚胎的制备、培养与移植。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述步骤(1) 人源ACE2编码序列的获取中，上下游引物序列分别为SEQ ID NO.7 和SEQ ID NO.8。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，所述步骤(2) 打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备具体包括以下步骤：分别合成上下游sgRNA引物，利用

试剂盒(NewEngland BioLabs)内含T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成并纯化sgRNA到达浓度约1000ng/ul，保存于-80℃备用；合成上下游ssODN，将Cas9重组蛋白、sgRNA、ssODN与人类ACE2编码序列DNA模板于室温混合达下列浓度：Cas9重组蛋白100ng/ul,sgRNA 50ng/ul,ssODN 100ng/ul，人类ACE2编码序列DNA模板20ng/ul。

进一步的，上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法在研发/制备针对新型冠状病毒疾病(COVID19)或严重急性呼吸道症候群冠状病毒2(SARS-CoV2)的药物/疫苗中的应用。

本发明有如下有益效果：

(1)参考Sun等人于2020年发表的文献，其产生hACE2敲入小鼠的概率为22％(10/46)[Sun,S.H.,et al.,A Mouse Model of SARS-CoV-2Infection andPathogenesis.Cell Host Microbe,2020.28(1): p.124-133.e4.]。反之，利用本专利设计获得hACE2敲入小鼠的概率为45％(5/11)。因此，本专利所设计的sgRNA靶向序列、Cas9 RNP切割位点、与ssODN互补序列，能够高效率地引入人源ACE2编码序列定点插入小鼠ACE2基因组。

(2)避免剔除小鼠基因组内源性CTCF结合位点，不影响小鼠正常发育与生理。CTCF(CCCTC-binding factor)是一种必需蛋白、特殊的转录因子、普遍表达于不同的细胞中。作为转录因子，CTCF具有转录抑制因子功能，但也同时具有转录激活因子活性。最引人注目的是，CTCF具有绝缘子活性：位于增强子和基因启动子之间时，它可以阻断它们的通讯并阻止转录激活，亦是表观遗传基因组印记调控基因表达的重要因子。经由系统性的染色质免疫沉淀实验结合高通量测序(ChIP-seq)，人类与小鼠基因组中CTCF结合位置的图谱已被初步绘制。由于CTCF结合位点对正常生理的重要性，进行基因组编辑时须尽可能保持其完整性。通过分析小鼠全基因资料库 (GRCm38.p6,https://asia.ensembl.org/)ACE2基因组结构，本专利发现小鼠ACE2 exon 15到exon 19之间具有两处CTCF结合位点 164,179,601–164,180,200与164,183,401–164,184,400(见附图2：小鼠ACE2基因组序列分析，虚线匡标示CTCF结合区域)。本发明避免了剔除这些结合位点，因此不影响小鼠正常发育与生理，对于药物实验具有明显的优势。

附图说明

图1为人类与小鼠ACE2蛋白质序列分析，灰底标示SARS-CoV2 刺突蛋白结合区域，粗体标示与SARS-CoV2刺突蛋白作用之重要氨基酸。

图2为小鼠ACE2基因组序列分析；虚线匡标示CTCF结合区域 (Chr.X:164,179,601–164,180,200与Chr.X: 164,183,401–164,184,400)，基因组结构与图示如图说明。

图3为利用ssODN介导之同源重组将人ACE2编码序列插入小鼠ACE2基因组的原理图，其中A图为将人源ACE2编码序列插入小鼠ACE2基因组之设计；B图为制备ACE2人源化小鼠的策略。

图4利用ssODN介导之同源重组将人源ACE2编码序列插入小鼠ACE2基因组的实验结果鉴定图，其中图A为移植经原核注射、体外培养至囊胚期的胚胎成功发育成小鼠；图B为采集离乳小鼠尾部并提取基因组DNA进行鉴定基因型。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

表1本发明中的缩略语和关键术语定义。

表2本发明中的核酸序列表

注：下底线标示T7启动子序列；外匡标示sgRNA序列；粗体标示外加“G”碱基；粗斜体标示sgRNA骨干序列；灰字标示人源ACE2 编码区同源序列；斜体标示小鼠ACE2基因组同源序列；小写斜体标示突变PAM序列(避免Cas9-sgRNA RNP作用于ssODN)

实施例

实施例1

克隆人源ACE2编码序列(hACE2 CDS)

利用人类肿瘤细胞株K549来源的RNA，以poly-dT引物与RNA 3’端的poly-A结合，加上Super

IV逆转录酶

制备cDNA库。根据NCBI提供的人类ACE2基因序列(NM_021804.3)，针对编码序列设计引物，上游引物hACE2-Fwd＝SEQ ID NO.7和下游引物hACE2-Rev＝SEQ ID NO.8，以上述cDNA库作为模板、人类 ACE2编码序列引物与DNA聚合酶(

II Fusion DNA Polymerase,Agilent)进行PCR特异性扩增ACE2编码序列。扩增的 ACE2编码序列经过琼脂凝胶电泳、回收、纯化，克隆至pHE(Tools Biotech.)载体，并利用载体上T7启动子与反向测序序列进行ACE2 编码序列测序。选择正确无突变的ACE2编码序列进行DNA克隆，以核酸内切酶XhoI与XbaI切下ACE2编码序列(2.4kb)，经过琼脂凝胶电泳、回收、纯化，作为ssODN介导的同源重组DNA模板。

实施例2

打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备

根据NCBI提供的小鼠ACE2基因组序列 (NC_000086.7:164139342-164188418)，针对exon 2与exon 15的序列设计sgRNA序列，并合成上下游sgRNA引物，在正股序列5‘端加上T7启动子序列；上游sgRNA的引物序列T7-MmAce2_Ex2＝SEQ ID NO.3，下游sgRNA的引物序列T7-MmAce2_Ex15＝SEQ ID NO.4；利用

试剂盒(New England BioLabs)内含T7RNA聚合酶进行体外转录，合成并纯化sgRNA到达浓度约1000ng/ul，保存于-80℃备用。两条ssODN分别带有小鼠ACE2 exon 2与人类ACE2编码区域5’端同源序列以及人类ACE2编码区域3‘端与小鼠ACE2 exon 15 同源序列，经由化学方式合成，上游ssODN的序列ssODN-UP＝SEQ ID NO.5，下游ssODN的序列ssOND-DN＝SEQ ID NO.6。将Cas9重组蛋白(New EnglandBioLabs)、sgRNA靶向exon 2与exon 15、两条 ssODN与人类ACE2编码序列DNA模板于室温混合达下列浓度： Cas9重组蛋白100ng/ul,sgRNA 50ng/ul,ssODN 100ng/ul，人类ACE2 编码序列DNA模板20ng/ul。

实施例3

小鼠受精胚胎的制备、培养与移植，流程如图3B所示。

C57BL6母鼠给予5IU的PMSG，48小时之后给予5IU的h CG 并与C57BL6公鼠进行交配。16小时之后检查母鼠阴道栓，交配成功的母鼠安乐死后，摘取两侧输卵管获取受精卵。受精卵与透明质酸 (Hyaluronidase,0.1％)于室温孵育3分钟脱去卵丘细胞，移至M2操作液(M5910,Sigma-Aldrich)备用。原核注射实施例2中制备得到的蛋白核酸复合物后的小鼠胚胎置于KSOM培养液，覆盖矿物油(M8410, Sigma-Aldrich)置于100％湿度，5％CO2环境培养72小时至囊胚期。与结扎公鼠假交配2.5天之后的ICR母鼠作为胚胎移植受体，利用非手术方式将体外培养至囊胚期的C57BL6胚胎由子宫口移植进入假怀孕ICR母鼠。妊娠20.5天之ICR母鼠，经过剖腹产方式接生仔鼠并交由同期生产的ICR母鼠哺乳，如附图4A所示。

实施例4

人源ACE2编码序列敲入与敲除小鼠基因型检测

小鼠出生出生后21天离乳，采集尾组织用于鉴定。组织块在离心管内加入蛋白酶K后56℃裂解，利用Easy Prep HY Genomic DNA Extraction试剂盒(TE-GD01,ToolsBiotech.)提取组织DNA。以上述小鼠组织DNA作为模板，利用PCR针对人源ACE2编码序列定点插入小鼠ACE2基因组进行基因型鉴定。引物特异性扩增区域如图3A所示，特异性扩增345bp或525bp人源ACE2编码序列5‘端插入位点、 550bp人源ACE2编码序列、与474bp人源ACE2编码序列3‘端插入位点。引物序列详见表2。

若人源ACE2编码序列如预期般插入小鼠ACE2基因组，引物 5’F1与5’R1、5’F2与5’R2、MF与MR、3’F与3’R分别将产生345bp、 525bp、550bp与474bp大小DNA产物(图3A)。PCR结果(图4B) 显示十一只小鼠其中五只(编号3、4、7、8与9)小鼠带有人源ACE2 编码序列，并且其如预期般插定点插入由Cas9 RNPs切割的小鼠 ACE2 exon 2与exon 15位点。编号3、4、7、8与9小鼠与C57BL6 野生型小鼠进行自然繁育，扩大hACE2敲入小鼠种群以利后续实验。

参考Sun等人于2020年发表的文献，其产生hACE2敲入小鼠的概率为22％(10/46)。反之，利用本专利设计获得hACE2敲入小鼠的概率为45％(5/11)。因此，本发明所设计的sgRNA靶向序列、 Cas9 RNP切割位点、与ssODN互补序列，能够高效率地引入人源 ACE2编码序列定点插入小鼠ACE2基因组。

进一步的，相比于实施例3中的小鼠受精胚胎的制备、培养与移植方案，若采用四倍体补偿法作为构建ACE2人源化小鼠的替代方案，更可以大大加快本小鼠模型的制备速度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 苏州启辰生物科技有限公司

<120> 一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法

<130> 202008

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 上游sgRNA引物骨干序列

<400> 1

ggatgggatc ttggcgcacg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 下游sgRNA引物骨干序列

<400> 2

ttaatgcttt ggtcggcatc 20

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> T7-MmAce2_Ex2

<400> 3

ttctaatacg actcactata ggatgggatc ttggcgcacg gttttagagc taga 54

<210> 4

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> T7-MmAce2_Ex1

<400> 4

ttctaatacg actcactata gttaatgctt tggtcggcat cgttttagag ctaga 55

<210> 5

<211> 170

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> ssODN-UP

<400> 5

gtcttggcct gttcctcaat ggtggactga gcagcagtta cagcaacaag gctgagaagg 60

agccaggaag agcttgacat ctttggccgt gcgccaagat cccatccact gagcaacttt 120

ccctagagta aaatctcttc atgagttttt ctctctcatc agcctttgaa 170

<210> 6

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> ssOND-DN

<400> 6

cttatgcctc catcgatatt agcaaaggag aaaataatcc aggattccaa aacactgatg 60

atgttcagac ctccttttag gccgaccaaa gcattaaagt gaggataagc ctaaaatcag 120

ctcttggagc taatgcagtg agtattgttc taaatggtga 160

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> hACE2-Fwd

<400> 7

atgtcaagct cttcctggct cc 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> hACE2-Rev

<400> 8

ctaaaaggag gtctgaacat catc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 5’F1

<400> 9

attggtccag cagcttgttt actg 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 5’R1

<400> 10

gtgttcaacc gtttgctctt gtc 23

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 5’F2

<400> 11

gtgcccaacc caagttcaaa gg 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 5’R2

<400> 12

gggcaagtgt ggactgttcc 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MF

<400> 13

gttcagaaag cagtctgcca tcc 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> MR

<400> 14

ggtaaagggt ccttgtgtaa tatcg 25

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 3’F

<400> 15

gctttccgtc tgaatgacaa cagc 24

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 3’R

<400> 16

gtcagttgaa ggccagagct gg 22

Claims

1.一种制备人源化ACE2小鼠模型的方法，其特征在于，包括以下关键步骤：

打靶sgRNA、ssODN的设计：针对小鼠ACE2基因组序列的exon 2 与exon 15的序列分别设计上下游两条sgRNA引物序列；针对小鼠ACE2 exon 2与人类ACE2编码区域5’端同源序列以及人类ACE2编码区域3‘端与小鼠ACE2 exon 15同源序列设计上下游两条ssODN序列；

所述上下游sgRNA引物序列的5’端均带有T7启动子序列；

所述上游sgRNA的引物序列如SEQ ID NO.3所示；所述下游sgRNA的引物序列如SEQ IDNO.4所示；

所述上下游ssODN序列的5’端均包括人源ACE2编码区同源序列，所述上下游ssODN序列的3’端均包括小鼠ACE2基因组同源序列；

所述上游ssODN的序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游ssODN的序列如SEQ ID NO.6所示；

上述制备人源化ACE2小鼠模型的方法，还包括以下步骤：

（1）人源ACE2编码序列的获取；

（2）打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备：利用上下游sgRNA引物合成sgRNA，合成上下游ssODN，制备Cas9 RNP；

（3）小鼠受精胚胎的制备、培养与移植；

（4）人源ACE2编码序列敲入与敲除小鼠基因型检测：小鼠出生后21天离乳，采集尾组织用于鉴定；组织块在离心管内加入蛋白酶K后56℃裂解，利用Easy Prep HY Genomic DNAExtraction试剂盒提取组织DNA；以上述小鼠组织DNA作为模板，利用PCR针对人源ACE2编码序列定点插入小鼠ACE2基因组进行基因型鉴定；引物序列包括SEQ ID NO.9-16；

所述步骤（1）人源ACE2编码序列的获取中，上下游引物序列分别为SEQ ID NO.7和SEQID NO.8；

所述步骤（2）打靶sgRNA、ssODN与Cas9 RNP制备具体包括以下步骤：分别合成上下游sgRNA引物，利用EnGen^®试剂盒内含T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成并纯化sgRNA到达浓度1000ng/ul，保存于-80°C备用；合成上下游ssODN，将Cas9重组蛋白、sgRNA、ssODN与人类ACE2编码序列DNA模板于室温混合达下列浓度：Cas9重组蛋白100ng/ul, sgRNA 50ng/ul,ssODN 100ng/ul，人类ACE2编码序列DNA模板20ng/ul。

2.如权利要求1所述制备人源化ACE2小鼠模型的方法在研发/制备针对新型冠状病毒疾病或严重急性呼吸道症候群冠状病毒2的药物/疫苗中的应用。