CN110257381B - 特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用，涉及基因工程技术领域。该成套sgRNA包括sgRNA‑L‑1和sgRNA‑R‑2，其中述sgRNA‑L‑1含有负责识别靶片段的如SEQ ID NO.1所示序列；sgRNA‑R‑2含有负责识别靶片段的如SEQ ID NO.2所示序列。该成套sgRNA特异性识别猪CD13基因的第二外显子，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。

Description

特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和 应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用。

背景技术

猪是我国重要的家畜品种之一，其在农业经济、医学疾病模型和分子遗传学研究中均有重要地位。猪流行性腹泻是一种急性、高度接触性的肠道疾病，该病特征表现为急性肠炎、水样腹泻、呕吐和脱水。其可发生于任何年龄的猪，年龄越小，症状越重，死亡率非常高。特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％；对成年的怀孕母猪来说，感染后繁殖性能受到影响，如怀孕早期的母猪感染后会出现流产，受孕率降低；育肥猪感染后体重下降。仔猪腹泻每年给养猪业造成巨大的经济损失，该疾病主要是由大肠杆菌、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus,TGEV)引起的。

白细胞分化抗原13(Cluster of differentiation 13,CD13)也称为氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)，是一类单次跨膜的II型膜结合金属糖蛋白，也是一种依赖锌离子的蛋白酶，存在于细胞表面。猪CD13含963个氨基酸残基，可被胰蛋白酶分解成2个亚基，分别为95ku的氮端(氨基端)和50ku的碳端(羧基端)。CD13最早作为冠状病毒细胞感染受体的研究是从猪TGEV开始，1992年法国学者研究证实猪CD13为TGEV感染受体，这为抗流行性腹泻病毒猪的新品种培育提供新思路，即通过敲除猪的APN基因来阻止TGEV对猪的感染。有关猪CD13基因的研究还处在起步阶段，猪CD13作用机制、功能区域及遗传变异研究还不清楚。因此，猪CD13的研究成为国内外的研究热点。

建立一种可以快速、准确、有效地敲除猪CD13基因的方法，获取敲除猪CD13基因的胚胎或细胞，对于研究猪流行腹泻以及抗病猪育种方面具有重要的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA，该成套sgRNA敲除效率高且特异性强。

本发明的第二目的在于提供一种成套DNA分子，该成套DNA分子包含编码上述成套sgRNA的DNA分子。

本发明的第三目的在于提供一种上述特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA或上述成套DNA分子的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA，包括：sgRNA-L-1和sgRNA-R-2；

所述sgRNA-L-1含有如SEQ ID NO.1所示序列，所述SEQ ID NO.1所示序列负责识别靶片段；

所述sgRNA-R-2含有如SEQ ID NO.2所示序列，所述SEQ ID NO.2所示序列负责识别靶片段。

优选地，所述sgRNA-L-1含有如SEQ ID NO.5所示序列。

优选地，所述sgRNA-R-2含有如SEQ ID NO.6所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种成套DNA分子，包含编码上述成套sgRNA的DNA分子。

优选地，编码sgRNA-L-1的DNA分子含有如SEQ ID NO.3所示序列。

优选地，编码sgRNA-R-2的DNA分子含有如SEQ ID NO.4所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，包含上述成套sgRNA，或上述成套DNA分子。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述成套sgRNA、上述成套DNA分子或上述试剂盒在对猪基因组中CD13基因进行基因编辑中的应用，所述对猪基因组中CD13基因进行基因编辑包括对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述成套sgRNA、上述成套DNA分子或上述试剂盒在制备对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑的产品中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑的方法，包括将(a)和(b)导入猪源生物材料中，以对猪基因组中CD13基因第2外显子的基因进行编辑；

(a)上述成套sgRNA或上述成套DNA分子；

(b)Cas9分子，所述Cas9分子包括Cas9蛋白分子或Cas9核酸分子；

优选地，所述猪CD13基因的第二外显子含有如SEQ ID NO.8所示序列。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA特异性识别猪CD13基因的第二外显子，本发明通过实验发现，该成套sgRNA敲除效率高且特异性强。在进行序列敲除时，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。本发明提供的该成套sgRNA，能通过CRISPR/Cas9系统对猪CD13基因第2外显子进行修饰，可实现猪CD13基因功能研究和抗病新品种培育等方面的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为sgRNA-L-1与sgRNA-R-2在猪CD13基因第2外显子上的位置示意图；

图2为实施例2中琼脂糖凝胶电泳检测sgRNA-L-1与sgRNA-R-2共同转染猪空肠上皮细胞系后的敲除效率；

图3为实施例2中琼脂糖凝胶电泳检测单克隆细胞基因型电泳图；

图4为实施例2中Western blot检测野生型以及双等位基因纯合敲除CD13基因的猪空肠上皮细胞系中CD13蛋白的表达情况。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA。sgRNA为向导RNA，是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，与Cas9蛋白结合，引导cas9酶靶向基因组DNA进行剪切。sgRNA包含靶序列(crRNA序列)和Cas9核酸酶募集序列(tracrRNA)，crRNA序列是与目的基因同源的序列，引导Cas9核酸酶活性。本发明提供的特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA包括sgRNA-L-1和sgRNA-R-2；其中sgRNA-L-1序列含有如SEQ ID NO.1所示序列，所述SEQ ID NO.1所示序列负责识别靶片段；sgRNA-R-2序列含有如SEQ ID NO.2所示序列，所述SEQ ID NO.2所示序列负责识别靶片段。本发明中“含有”指的是sgRNA-L-1和sgRNA-R-2中除去含有负责识别靶片段的序列外，还可以含有具有其他功能的序列，包括但不限于Cas9核酸酶募集序列以及连接各功能单元的连接单元等。

本发明提供的特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA特异性识别猪CD13基因的第二外显子，本发明通过实验发现，该成套sgRNA敲除效率高且特异性强。在进行序列敲除时，能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象，减少非特异性切割对基因组带来的不利影响。本发明提供的该成套sgRNA，能通过CRISPR/Cas9系统对猪CD13基因第2外显子进行修饰，可实现猪CD13基因功能研究、抗病新品种培育等方面的应用。

所述sgRNA-L-1和sgRNA-R-2中除去负责识别靶片段的序列外，还可以含有Cas9核酸酶募集序列等具有其他功能的序列，参与CRISPR/Cas9对DNA的靶向切割，因此优化sgRNA-L-1和sgRNA-R-2的序列，能够提高CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率。在一些优选的实施方式中，当sgRNA-L-1含有如SEQ ID NO.5所示序列时CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率更佳。在一些优选的实施方式中，当sgRNA-R-2含有如SEQ ID NO.6所示序列时CRISPR/Cas9系统对靶基因的修饰效率更佳。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种成套DNA分子，该成套DNA分子包含编码上述成套sgRNA的DNA分子。可以理解的是，本发明还提供的成套DNA分子中，除去编码sgRNA的DNA分子，还可以含有具有其他功能的DNA元件，或者用于作为载体的DNA分子部分；例如当将包含编码上述成套sgRNA的DNA分子构建于载体中，所述成套的DNA分子包括编码sgRNA的DNA分子以及载体。所述成套DNA分子中还可以包含用于编码CRISPR/Cas9系统中其他作用元件的编码序列，例如编码Cas9蛋白的DNA分子等。

在一些优选的实施方式中，编码sgRNA-L-1的DNA分子含有如SEQ ID NO.3所示序列，为猪CD13基因第2外显子488-507bpDNA分子。所述CD13基因第2外显子含有如SEQ IDNO.8所示序列。

在一些优选的实施方式中，编码sgRNA-R-2的DNA分子含有如SEQ ID NO.4所示序列，为猪CD13基因第2外显子760-779bpDNA分子。所述CD13基因第2外显子含有如SEQ IDNO.8所示序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒用于对猪CD13基因进行基因编辑，其中包含上述特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA或编码上述sgRNA的成套DNA分子。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中包含上述成套sgRNA以及用于贮存该成套sgRNA的试剂，以及Cas9蛋白分子。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒中包含编码上述sgRNA-L-1的载体、编码上述sgRNA-R-2的载体以及编码Cas9蛋白的载体；编码sgRNA-L-1的载体和编码上述sgRNA-R-2的载体包括但不限于pT7-sgRNA载体或pX330载体。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA、编码上述sgRNA的成套DNA分子或上述试剂盒在对猪基因组中CD13基因进行基因编辑中的应用，所述对猪基因组中CD13基因进行基因编辑包括对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑。需要说明的是，本发明提供的应用用于非治疗目的的对猪CD13作用机制进一步研究，包括对猪CD13功能区域以及遗传变异的研究，有助于对猪流行腹泻作用机制的研究，以促进用于治疗猪流行腹泻药物的研发；也可以用于抗病猪育种。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA、编码上述sgRNA的成套DNA分子或上述试剂盒在制备对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑产品中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑的方法，该方法包括将(a)和(b)导入猪源生物材料中，以对猪基因组中CD13基因第2外显子的基因编辑，其中(a)和(b)如下：

(a)上述成套sgRNA或上述成套DNA分子；

(b)Cas9分子，所述Cas9分子包括Cas9蛋白分子或Cas9核酸分子，所述Cas9核酸分子指的是编码Cas9的mRNA或DNA，可以理解的是，Cas9核酸分子还包括和编码Cas9的mRNA或DNA共同作用的功能元件，包括但不限于启动子、终止子、标记基因以及载体等；所述Cas9分子可以为常规的Cas9分子或经过分子生物学改造的Cas9分子，只要具有Cas9分子的剪切功能即可，本发明对此不做限制。

所述猪源生物材料包括但不限于猪源细胞或胚胎。在一些优选的实施方式中，所述猪CD13基因的第二外显子含有如SEQ ID NO.8所示序列。

下面结合优选实施例进一步说明本申请的技术方案和有益效果。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中成套sgRNA，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成。

sgRNA-L-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，其中负责识别靶片段的序列如SEQID NO.1所示，将SEQ ID NO.1所示序列部分命名为sgRNA-L，sgRNA-L的靶序列如SEQ IDNO.3所示，SEQ ID NO.3所示序列为猪CD13基因第2外显子(猪CD13基因第2外显子核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)上488-507位bp DNA分子。

sgRNA-R-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，其中负责识别靶片段的序列如SEQID NO.2所示，将SEQ ID NO.2所示序列部分命名为sgRNA-R，sgRNA-R的靶序列如SEQ IDNO.4所示，SEQ ID NO.4所示序列为猪CD13基因第2外显子上760-779bp DNA分子。sgRNA-L-1和sgRNA-R-2在猪CD13基因第2外显子上的位置如图1所示，其中方框区域为第2外显子序列，左侧方框区域为第二外显子的5'UTR序列，右侧方框为第二外显子上蛋白编码序列。

实施例1成套sgRNA在Cas9系统介导下敲除猪胚胎中CD13基因

1.体外转录载体构建

根据打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送北京天一辉远生物科技有限公司合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下表

将以上两对oligo DNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段CD13-sgL以及CD13-sgR。

将CD13-sgL以及CD13-sgR片段分别连接到Hind III和EcoR I酶切pT7-sgRNA载体中，得到体外转录载体pT7-CD13-sgL与pT7-CD13-sgR。

经过测序，pT7-CD13-sgL载体为将如SEQ ID NO.5所示序列的sgRNA-L-1的编码基因插入pT7-sgRNA载体后得到的载体，转录表达得到sgRNA-L-1。

pT7-CD13-sgR载体为将如SEQ ID NO.6所示序列的sgRNA-R-2的编码基因插入pT7-sgRNA载体后得到的载体，转录表达得到sgRNA-R-2。

2.体外转录sgRNA

分别取步骤1中的体外转录载体pT7-CD13-sgL与pT7-CD13-sgR，使用内切酶单酶切进行线性化，并进行胶回收。取回收后的体外转录载体12μL，按照体外转录试剂盒(Ambion,Maxiscript T7Kit)说明书的要求进行sgRNA的体外转录(无需戴帽和加尾)，得到如SEQ ID NO.5所示序列的sgRNA-L-1和如SEQ ID NO.6所示序列的sgRNA-R-2，人工合成Cas9的mRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.猪胚胎显微注射

取猪体内受精或者体外受精后的离体胚胎，进行胞质显微注射，将上述步骤2制备的sgRNA-R-1、sgRNA-L-2和Cas9的mRNA混合，得到混合体系，且各物质在体系中的终浓度为12.5ng/μLsgRNA-R-1，12.5ng/μLsgRNA-L-2以及125ng/μLCas9的mRNA；将混合体系按照每个胚胎注射量约为10pL注射到猪胚胎中，得到含有sgRNA的猪胚胎。共进行32个猪胚胎的显微注射。注射具体操作参见文献：Lillico,S.G.,et al.,Live pigs produced fromgenome edited zygotes.Scientific Reports,2013.3:p.2847.

4.PCR检测

取步骤1中得到的单个含有sgRNA的猪胚胎，放入单细胞裂解液(北京天恩泽，货号130803-1)中反复吹打几次进行裂解，10000转/分钟离心，取裂解液上清，用以下的引物进行PCR反应，扩增胚胎中CD13基因部分区域。

PCR引物1(扩增长度700bp)：

CD13-F：CTCCCTTCTCACCCTCACC(SEQ ID NO.13)

CD13-R：AAGGTCCCGAATCCAAGC(SEQ ID NO.14)

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

对于未发生CD13基因部分序列删除的胚胎，扩增片段长度为700bp；对于发生CD13基因部分序列删除的胚胎，扩增片段长度约为428bp。可通过计算发生序列删除的胚胎的比例估算成套sgRNA的敲除效率，本实施例中32个猪胚胎的片段敲除效率为37.5％。

实施例2成套sgRNA在Cas9系统介导下敲除猪空肠上皮细胞中CD13基因的应用

1.按照下述方法制备成套sgRNA

根据sgRNA打靶序列设计寡聚核苷酸(Oligo)DNA序列，送北京天一辉远生物科技有限公司合成(每条合成1OD，纯化方式选择PAGE)。具体序列如下：

将以上两对Oligo DNA分别退火，形成带有粘性末端的双链DNA片段CD13-sgL2以及CD13-sgR2。

将上述带有粘性末端的双链DNA片段CD13-sgL2和CD13-sgR2分别连入用限制性内切酶酶切回收后的pX330-GFP和pX330-RFP载体中，得到pX330-GFP-sgL2载体与pX330-RFP-sgR2载体。

经过测序，pX330-GFP-sgL2载体为将如SEQ ID NO.1所示序列的sgRNA-L的编码基因插入pX330载体得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-L-1。

pX330-RFP-sgR2载体为将如SEQ ID NO.2所示序列的sgRNA-R的编码基因插入pX330载体得到的载体，与载体上片段融合表达得到sgRNA-R-2。

将pX330-GFP-sgL2载体与pX330-RFP-sgR2载体共同转入猪空肠上皮细胞。并根据GFP和RFP进行流式分选。

2.敲除效率检测

结果如图2所示，其中泳道M为100bp DNA Ladder Maker；泳道A为未转染细胞；泳道B为转染后48h未分选的细胞；泳道C为转染后48h流式分选的细胞。从图2可以看出，对未转染细胞、转后48h的细胞和流式分选后细胞进行PCR扩增，观察PCR扩增结果。未转染细胞只在700bp处有一条带；转后48h的细胞和流式分选后混池细胞在700bp和428bp处各有一条条带，说明同时转染双gRNA后，CD13发生片段敲除。经灰度值统计显示，富集前和富集后的片段敲除效率分别为11.6％和21.7％。

3.单克隆细胞的基因型鉴定

对流式分选后细胞进行稀释并培养，直到形成单克隆细胞团。挑取少量单克隆细胞裂解并进行PCR扩增，PCR引物同实施例1中的PCR引物1。

将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

如图3所示，提取20株细胞的基因组DNA并进行PCR扩增，其中泳道M为100bp DNALadder Maker；泳道1、2、7、8、9、10、11、12、14、15、17、19、20：未发生片段缺失；泳道3为双等位基因杂合片段缺失；泳道5为单等位基因片段缺失；泳道4、6、13、16、18为双等位基因片段缺失。

4.CD13蛋白表达检测

选择野生型细胞系和纯合敲除型细胞系在蛋白水平上检测CD13表达情况。如图4所示，其中WT为野生型细胞；KO为纯合敲除细胞。Westernblot结果显示，野生型细胞中CD13蛋白表达量较高，而双等位基因纯合敲除型细胞中几乎检测不到CD13的表达，表明利用成套sgRNA可以对CD13基因进行成功敲除。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA及其编码DNA、试剂盒和应用

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

uaccucacuc ccaacgcgga 20

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggggaacuu gccgacgacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪（sus）

<400> 3

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<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 猪（sus）

<400> 4

gggggaactt gccgacgacc 20

<210> 5

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<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

uaccucacuc ccaacgcgga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96

<210> 6

<211> 96

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

gggggaacuu gccgacgacc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugc 96

<210> 7

<211> 4101

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacaagaagu acagcaucgg ccuggacauc ggcaccaacu cugugggcug ggccgugauc 60

accgacgagu acaaggugcc cagcaagaaa uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcccug cuguucgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

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auguacgugg accaggaacu ggacaucaac cggcuguccg acuacgaugu ggaccauauc 2520

gugccucaga gcuuucugaa ggacgacucc aucgacaaca aggugcugac cagaagcgac 2580

aagaaccggg gcaagagcga caacgugccc uccgaagagg ucgugaagaa gaugaagaac 2640

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guggaaaccc ggcagaucac aaagcacgug gcacagaucc uggacucccg gaugaacacu 2820

aaguacgacg agaaugacaa gcugauccgg gaagugaaag ugaucacccu gaaguccaag 2880

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caccacgccc acgacgccua ccugaacgcc gucgugggaa ccgcccugau caaaaaguac 3000

ccuaagcugg aaagcgaguu cguguacggc gacuacaagg uguacgacgu gcggaagaug 3060

aucgccaaga gcgagcagga aaucggcaag gcuaccgcca aguacuucuu cuacagcaac 3120

aucaugaacu uuuucaagac cgagauuacc cuggccaacg gcgagauccg gaagcggccu 3180

cugaucgaga caaacggcga aaccggggag aucguguggg auaagggccg ggauuuugcc 3240

accgugcgga aagugcugag caugccccaa gugaauaucg ugaaaaagac cgaggugcag 3300

acaggcggcu ucagcaaaga gucuauccug cccaagagga acagcgauaa gcugaucgcc 3360

agaaagaagg acugggaccc uaagaaguac ggcggcuucg acagccccac cguggccuau 3420

ucugugcugg ugguggccaa aguggaaaag ggcaagucca agaaacugaa gagugugaaa 3480

gagcugcugg ggaucaccau cauggaaaga agcagcuucg agaagaaucc caucgacuuu 3540

cuggaagcca agggcuacaa agaagugaaa aaggaccuga ucaucaagcu gccuaaguac 3600

ucccuguucg agcuggaaaa cggccggaag agaaugcugg ccucugccgg cgaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcccu gcccuccaaa uaugugaacu uccuguaccu ggccagccac 3720

uaugagaagc ugaagggcuc ccccgaggau aaugagcaga aacagcuguu uguggaacag 3780

cacaagcacu accuggacga gaucaucgag cagaucagcg aguucuccaa gagagugauc 3840

cuggccgacg cuaaucugga caaagugcug uccgccuaca acaagcaccg ggauaagccc 3900

aucagagagc aggccgagaa uaucauccac cuguuuaccc ugaccaaucu gggagccccu 3960

gccgccuuca aguacuuuga caccaccauc gaccggaaga gguacaccag caccaaagag 4020

gugcuggacg ccacccugau ccaccagagc aucaccggcc uguacgagac acggaucgac 4080

cugucucagc ugggaggcga c 4101

<210> 8

<211> 825

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caggcacccc tgagccgcac tccgcacgct gttcctgaat ctcccctcca gaaccggagc 60

agtgtctcta cccagttcag tgaccttcgt ctgtctgagc cctggttaat ttttgcccag 120

tctgcaggct gtggggctcc tccccttcag ggatataagc ctggtccgaa gctgccctgt 180

cccctgcccg tcctgagcct ccccgagctc ccttctcacc ctcaccatgg ccaagggatt 240

ctacatttcc aaggccctgg gcatcctggg catcctcctc ggcgtggcgg ccgtggccac 300

catcatcgct ctgtctgtgg tgtacgccca ggagaagaac aagaatgccg agcatgtccc 360

ccaggccccc acgtcgccca ccatcaccac cacagccgcc atcaccttgg accagagcaa 420

gccgtggaac cggtaccgcc tacccacaac gctgttgcct gattcctaca acgtgacgct 480

gagaccctac ctcactccca acgcggatgg cctgtacatc ttcaagggca aaagcatcgt 540

ccgcttcatc tgccaggagc ccaccgatgt catcatcatc catagcaaga agctcaacta 600

caccacccag gggcacatgg tggtcctgcg gggcgtgggg gactcccagg tcccagagat 660

cgacaggact gagctggtag agctcactga gtacctggtg gtccacctca agggctcgct 720

gcagcccggc cacatgtacg agatggagag tgaattccag ggggaacttg ccgacgacct 780

ggcaggcttc taccgcagcg agtacatgga gggcaacgtc aaaaa 825

<210> 9

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aattctaata cgactcacta taggtacctc actcccaacg cggagtttta gagctagaaa 60

tagcaagtta aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc 120

tttttttaa 129

<210> 10

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agctttaaaa aaagcaccga ctcggtgcca ctttttcaag ttgataacgg actagcctta 60

ttttaacttg ctatttctag ctctaaaact ccgcgttggg agtgaggtac ctatagtgag 120

tcgtattag 129

<210> 11

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aattctaata cgactcacta tagggggaac ttgccgacga ccgttttaga gctagaaata 60

gcaagttaaa ataaggctag tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgctt 120

tttttaa 127

<210> 12

<211> 147

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggtcgtcggc aagttccccc agctttaaaa aaagcaccga ctcggtgcca ctttttcaag 60

ttgataacgg actagcctta ttttaacttg ctatttctag ctctaaaacg gtcgtcggca 120

agttccccct atagtgagtc gtattag 147

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctcccttctc accctcacc 19

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaggtcccga atccaagc 18

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aaacaccgta cctcactccc aacgcgga 28

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctctaaaact ccgcgttggg agtgaggta 29

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aaacaccggg gggaacttgc cgacgacc 28

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctctaaaacg gtcgtcggca agttccccc 29

Claims (7)

1.特异性识别猪CD13基因的成套sgRNA，其特征在于，由sgRNA-L-1和sgRNA-R-2组成，所述sgRNA-L-1的序列为SEQ ID NO.5，所述sgRNA-R-2的序列为SEQ ID NO.6；

所述sgRNA-L-1中负责识别靶片段的序列为SEQ ID NO.1；

所述sgRNA-R-2中负责识别靶片段的序列为SEQ ID NO.2。

2.成套DNA分子，其特征在于，由编码权利要求1所述的sgRNA-L-1的DNA分子和编码权利要求1所述的sgRNA-R-2的DNA分子组成；

编码权利要求1所述的sgRNA-L-1的DNA分子的序列为SEQ ID NO.3；

编码权利要求1所述的sgRNA-R-2的DNA分子的序列为SEQ ID NO.4。

3.试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的成套sgRNA或权利要求2所述的成套DNA分子。

4.权利要求1所述的成套sgRNA、权利要求2所述的成套DNA分子或权利要求3所述的试剂盒在对猪基因组中CD13基因进行基因编辑中的应用，所述应用为非治疗目的的应用，所述对猪基因组中CD13基因进行基因编辑是对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑。

5.权利要求1所述的成套sgRNA、权利要求2所述的成套DNA分子或权利要求3所述的试剂盒在制备对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑的产品中的应用。

6.对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑的方法，其特征在于，所述方法为非治疗目的的方法，所述方法包括将（a）和（b）导入猪源生物材料中，以对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑；

（a）权利要求1所述的成套sgRNA或权利要求2所述的成套DNA分子；

（b）Cas9分子，所述Cas9分子包括Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的对猪基因组中CD13基因第2外显子进行基因编辑的方法，其特征在于，所述猪基因组中CD13基因第二外显子的序列为SEQ ID NO.8。

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