CN109266687A - 一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因敲除技术领域,特别是公开了一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在斑马鱼的tnni3k基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性gRNA和Cas9‑蛋白,显微共注射进入斑马鱼一细胞内,胚胎培养48h后,通过选取胚胎进行基因型分析,从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因,且制作简单、成本低,且可同时对靶基因上多个位点进行剪切,沉默任意数目的单个基因。且干扰掉tnni3k基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形。
Description
技术领域
本发明涉及基因敲除领域,特别是公开了一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法。
背景技术
tnni3k(TNNI3 interacting kinase)基因位于斑马鱼第8号染色体上,包含25个外显子和24个内含子,cDNA全长2508bp,编码835个氨基酸,tnni3k包含有10个进化上保守的功能结构域,同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等,发现tnni3k在人类胚胎早期的多个组织中都有表达,特别是心脏中强烈表达。
斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性,且tnni3k基因进化上较为保守,研究发现tnni3k在斑马鱼胚胎早期表达量特别高。而且,与其他动物模型相比,斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在斑马鱼的tnni3k基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性sgRNA(终浓度20 ng/μL)和Cas9蛋白(终浓度5 μg/μL),显微共注射进入斑马鱼一细胞内,胚胎培养60h后,通过选取胚胎进行基因型分析,鉴定所设打靶位点的有效性。
基因打靶技术起源于20世纪80年代末,是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段,也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息,并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状,从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用,所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC) 和同源重组技术的基础之上,故打靶技术效率极低。2013年初,一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9,能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因,且制作简单、成本低,且可同时对靶基因上多个位点进行剪切,沉默任意数目的单个基因,但同时该技术存在一定的缺陷,其脱靶率相对较高。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足,提供了一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,找到了合适的打靶位点,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,选育出tnni3k基因缺失型斑马鱼
解决上述技术问题的技术方案如下:
1)设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼tnni3k基因的基因组DNA序列,在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理,在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计tnni3k基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准:5’-GG-(N)18-NGG-3’,其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分,设计靶位点时可以不受此限制,但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内,以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响tnni3k基因的整个结构域,从而来改变基因的表达
两对特异性靶位点PCR 引物如下:
F1(靶位点a正向引物):
TgTAATACGACTCACTATA GGCAGCATTCAAGGTTCATT GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R(共用的反向引物):AAGCACCGACTCGGTGCCACT
PCR 检测引物
PCR检测引物上下游引物分别位于4号外显子和4号内含子上:
F (5’-AAGCTCACATCAGGACCCTC-3’)
R (5’-GTCCAGCACTCACCTCAAGA-3’)
2)构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a,首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上,取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测
b,特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说,酶切反应总体积为20μL,体系如下:
p42250载体 6μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1μL
ddH2O 11μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴,酶切2.5h以上
c,以线性化的p42250载体为模板,通过下面特异性引物进行PCR,扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA。
正向特异性靶位点引物F1:T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架;
反向引物R:20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系(50μL)如下:
模板(p42250载体) 0.5 μL
Primer F1(或F2,10 uM) 2 μL
Primer R(10 uM) 2 μL
2× Buffer(含20mM Mg2+) 25 μL
dNTP mix(10 mM) 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
ddH2O 18.5 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后,4 ℃离心,于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为:预变性95℃5min,(变性95℃30 s,退火60℃30s,延伸72 ℃30s) 30个循环,再72℃8 min。待反应结束后,离心PCR产物,取1 μL样品点样于1.3%琼脂糖凝胶上进行电泳,凝胶成像系统拍摄结果
d,检测确定条带正确之后,进行琼脂糖凝胶DNA回收,纯化回收PCR产物
e,测定纯化的D NA浓度(尽量达到1 μg),再以此DNA为模板,用20 μL体系进行体外转录,合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头,EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品,具体操作如下:
体外转录反应体系(20 μL):
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2μL
rNTP mix(10 mM) 4 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
Nuclease-Free Water 0 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入0.2 mL RNase-Free 的EP管中,混匀之后,于37 ℃水浴2.5 h;
水浴结束后,向转录体系中加入1 μL DNA酶,放置于37 ℃水浴锅中反应30 min,以消化DNA模板,然后取1 μL样品,用配制好的1.3%的琼脂糖凝胶进行电泳,以检测转录结果,若转录产物大小与预期的相符,则说明转录成功;
f,特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA,保存于-20 ℃。吸取纯化后的gRNA溶液1 μL进行琼脂糖凝胶电泳,以检验纯化产物,并测定纯化之后的gRNA浓度
3)斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内,用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前,将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9 蛋白的终浓度为5 μg/μL,gRNA 的终浓度为20 ng/μL。注射约1.8nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5 mmol/L NaCl, 0.33mmol/L CaCl2,0.33mmol/L MgSO4,0.17 mmol/L KCl,)中,28 ℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型,筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下:
Cas9 蛋白 5 μg/μL
gRNA 20 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4)Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,检测其tnni3k基因是否存在突变,可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果,显微注射操作是否规范
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精60小时后(60 hpf),分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10颗胚胎),按照下述方法提取基因组DNA,具体步骤如下:
向装有胚胎的Ep管中加入200 μL细胞裂解液,2 μL蛋白酶K,放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜
裂解完成后,放在振荡器上充分震荡,加入等体积(200μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中,充分颠倒混匀,于4 ℃条件下,12000rpm离心10 min,倒掉上清液;
加入70 %乙醇500 μL,于4 ℃条件下,12000rpm离心5 min,弃上清液,室温风干5-10min;
加入20 μL去离子水,充分吹打混匀,琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后,根据CRISPR靶位点上下游约100-200bp的基因组区域,利用Primer Premier 3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段
PCR反应体系(20 μL)如下:
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 1 μL
Primer R (10 μM) 1 μL
模板(基因组DNA) 1 μL
ddH2O 7 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后,4 ℃离心,于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为:预变性95℃5 min,(变性95℃ 30 s,退火60℃ 30 s,延伸72 ℃30 s) 30个循环,再72℃8 min。待反应结束后,离心PCR产物,取2μL样品点样于1.3 %琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确
c、若PCR产物正确,则用1.3 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,送部分PCR产物进行Sanger测序,由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息
4)注射两个月之后,进行剪尾鉴定,同上鉴定步骤
5)目的序列的TA克隆
PCR鉴定有目的条带后再进行Sanger测序,若测序峰图有双峰,并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列,接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测
6)质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序,将测序之后给出的峰图和序列,在NCBI上与标准目的序列进行对比,根据比对结果,分析出每个单克隆的突变类型
7)获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代,紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28 ℃培养,在初期观察F1代的存活率。受精两天后,每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定。将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR扩增出320bp的靶位点附近区域,再进行Sanger测序,若测序峰图有双峰,并且测序结果显示有缺失现象,则确定为可遗传
如果从F1代胚胎中检测到存在突变,则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月。再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)
本发明的有益效果是:
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,在斑马鱼的tnni3k基因上设计合适的打靶位点,在体外合成的特异性gRNA(终浓度20 ng/μL)和Cas9蛋白(终浓度5 μg/μL),显微共注射进入斑马鱼一细胞内,胚胎培养48h后,通过选取胚胎进行基因型分析,鉴定所设打靶位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因,制作简单、成本低,且可同时对靶基因上多个位点进行剪切,沉默任意数目的单个基因,脱靶率很低,且干扰掉tnni3k基因斑马鱼胚胎出现明显的发育畸形
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9 打靶系统的原理图;
图2为tnni3k基因上靶位点的结构图;
图3为斑马鱼F1代电泳结果图;
图4为缺失型和WT型基因序列正向对比;
图5为靶位点附近缺失对比。
具体实施方式
实施例1:
1)设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼tnni3k基因的基因组DNA序列,在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域,根据CRISPR/Cas9敲除原理,在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计tnni3k基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准:5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分,设计靶位点时可以不受此限制,但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内,以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响tnni3k基因的整个结构域,从而来改变基因的表达
两对特异性靶位点PCR 引物如下:
F1(靶位点a正向引物):
TgTAATACGACTCACTATAGGCAGCATTCAAGGTTCATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R(共用的反向引物):AAGCACCGACTCGGTGCCACT
PCR 检测引物
PCR检测引物上下游引物分别位于4号外显子和4号内含子上:
F (5’-AAGCTCACATCAGGACCCTC-3’)
R (5’-GTCCAGCACTCACCTCAAGA-3’)
3)构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a,首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上,取1-2μL质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测。
b,特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说,酶切反应总体积为20μL,体系如下:
p42250载体 6μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1μL
ddH2O 11μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴,酶切2h以上
c,以线性化的p42250载体为模板,通过下面特异性引物进行PCR,扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2:T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架;反向引物R:20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系(50μL)如下:
模板(p42250载体) 0.5 μL
Primer F1(或F2,10 uM) 2 μL
Primer R(10 uM) 2 μL
2× Buffer(含20mM Mg2+) 25 μL
dNTP mix(10 mM) 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
ddH2O 18.5 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后,4 ℃离心,于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为:预变性95 ℃5 min,(变性95 ℃15 s,退火60℃15 s,延伸72 ℃20 s) 30个循环,再72 ℃8 min。待反应结束后,离心PCR产物,取1 μL样品点样于1.3%琼脂糖凝胶上进行电泳,凝胶成像系统拍摄结果
d,检测确定条带正确之后,进行琼脂糖凝胶DNA回收,纯化回收PCR产物
e, 测定纯化的DNA浓度(尽量达到1 μg),再以此DNA为模板,用20 μL体系进行体外转录,合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头,EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品,具体操作如下:
体外转录反应体系(20 μL):
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2μL
rNTP mix(10 mM) 4 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
Nuclease-Free Water 0 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入0.2 mL RNase-Free 的EP管中,混匀之后,于37 ℃水浴2 .5h;
水浴结束后,向转录体系中加入1 μL DNA酶,放置于37 ℃水浴锅中反应30 min,以消化DNA模板,然后取1 μL样品,用配制好的1.3%的琼脂糖凝胶进行电泳,以检测转录结果,若转录产物大小与预期的相符,则说明转录成功;
f,特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA,保存于-20 ℃。吸取纯化后的gRNA溶液1 μL进行琼脂糖凝胶电泳,以检验纯化产物,并测定纯化之后的gRNA浓度
3)斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内,用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前,将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9 蛋白的终浓度为5μg/μL,gRNA 的终浓度为20 ng/μL。注射约1.8nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水(5 mmol/L NaCl, 0.33mmol/L CaCl2,0.33mmol/L MgSO4,0.17 mmol/L KCl,)中,28 ℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型,筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下:
Cas9 蛋白 5μg/μL
gRNA 20 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4)Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,检测其tnni3k基因是否存在突变,可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果,显微注射操作是否规范
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精60小时后(60 hpf),分别收集野生型(做对照)和注射后胚胎于1.5mLEp管中(每管10颗胚胎),按照下述方法提取基因组DNA,具体步骤如下:
向装有胚胎的Ep管中加入200 μL细胞裂解液,2 μL蛋白酶K,放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜
裂解完成后,放在振荡器上充分震荡,加入等体积(200μL)异丙醇(预先冷却)于Ep管中,充分颠倒混匀,于4 ℃条件下,12000rpm离心10 min,倒掉上清液;
加入70 %乙醇500 μL,于4 ℃条件下,12000rpm离心5 min,弃上清液,室温风干20min;
加入20 μL去离子水,充分吹打混匀,琼脂糖凝胶电泳检测提取效率
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后,根据CRISPR靶位点上下游约100-200bp的基因组区域,利用Primer Premier 3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段
PCR反应体系(20 μL)如下:
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 1 μL
Primer R (10 μM) 1 μL
模板(基因组DNA) 1μL
ddH2O 7 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后,4 ℃离心,于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为:预变性95℃5 min,(变性95℃ 30 s,退火60℃ 30 s,延伸72 ℃30 s) 30个循环,再72 ℃8 min。待反应结束后,离心PCR产物,取2 μL样品点样于1.3 %琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确
c、若PCR产物正确,则用1.3 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,送PCR产物进行Sanger测序,由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息
4)注射两个月之后,进行剪尾鉴定,同上鉴定步骤
5)目的序列的TA克隆
PCR初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序,若测序峰图有双峰,并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列,接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测
6)质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序,根据测序之后给出的峰图和序列,在NCBI上与标准目的序列进行对比,根据比对结果,分析出每个单克隆的突变类型
7)获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代,紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28 ℃培养,在初期观察F1代的存活率。受精两天后,每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定。将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR扩增出320bp的靶位点附近区域,再进行Sanger测序,若测序峰图有双峰,并且测序结果显示有缺失现象,则确定为可遗传
如果从F1代胚胎中检测到存在突变,则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月。再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选F1代突变体(具体方法如前面所述)
图1为CRISPR/Cas9打靶系统的原理图;图2为tnni3k基因上打靶位点的结构图;图3为WT型和缺失型F1代成鱼PCR电泳图,将测序结果与野生型序列(320bp)进行对比,发现tnni3k的打靶位点有碱基缺失,共有连续的4个碱基的缺失;图4为缺失型和WT型基因序列对比图;图5为靶位点附近缺失对比。由于筛选到的突变体的F1代中,存在tnni3k基因部分碱基缺失(缺失4个碱基),这会造成整个基因的移码突变,改变斑马鱼tnni3k基因的表达,从而影响斑马鱼的心脏的发育
以上所述,仅是本发明的较佳实施例,并非对本发明做任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化,均落入本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上查询斑马鱼tnni3k基因的基因组DNA序列,在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域,根据CRISPR/Cas敲除原理,在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计tnni3k基因的靶位点;
两对特异性靶位点PCR 引物如下:
F1(靶位点a正向引物):
TgTAATACGACTCACTATAGGCAGCATTCAAGGTTCATTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R(共用的反向引物):AAGCACCGACTCGGTGCCACT
PCR 检测引物
PCR检测引物上下游引物分别位于4号外显子以及4号内含子上:
F (5’-AAGCTCACATCAGGACCCTC-3’)
R (5’-AAGCTCACATCAGGACCCTC-3’)
2)构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成
a,首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上;
b,特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒;酶切反应总体积为20μL,体系如下:
p42250载体 6μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1μL
ddH2O 11μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴,酶切2h以上;
c,以线性化的p42250载体为模板,通过下面特异性引物进行PCR,扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA;
正向特异性靶位点引物F1:T7启动子+20pb靶序列+20bp sgRNA上游骨架,反向引物R:20bp sgRNA下游骨架,
PCR反应体系如下:
模板(p42250载体) 0.5 μL
Primer F1(10 uM) 2μL
Primer R(10 uM) 2 μL
2× Buffer(含20mM Mg2+) 25 μL
dNTP mix(10 mM) 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
ddH2O 18.5 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后,4 ℃离心,于PCR仪上进行扩增反应;
d,检测确定条带正确之后,进行琼脂糖凝胶DNA回收,纯化回收PCR产物;
e,测定纯化的DNA浓度,再以此DNA为模板,用20 μL体系进行体外转录,合成特异性gRNA;具体操作如下:
体外转录反应体系:
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2μL
rNTP mix(10 mM) 4 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
Nuclease-Free Water 0 μL
总体积 20 μL
将反应物全部加入0.2 mL EP管中,混匀之后,于37 ℃水浴2.5 h;
水浴结束后,消化DNA模板,然后电泳;
f,特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA,保存于-20 ℃;进行琼脂糖凝胶电泳,以检验纯化产物,并测定纯化之后的gRNA浓度;
3)斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内,用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中,
在进行显微注射之前,将Cas9 蛋白和gRNA配成混合液,充分混匀,使Cas9 蛋白的终浓度为5μg/μL,gRNA 的终浓度为20 ng/μL,注射1.8nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内;注射过的受精卵放置于E3水中,28 ℃孵化;在体式显微镜下观察胚胎表型,筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析;
显微注射体系如下:
Cas9 蛋白 5μg/μL
gRNA 20 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL;
4)Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后,挑选部分发育正常的早期胚胎,检测其tnni3k基因是否存在突变;
a,提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精48小时后(48 hpf),分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mL Ep管中,每管10颗胚胎,按照下述方法提取基因组DNA,具体步骤如下:
向装有胚胎的Ep管中加入200 μL细胞裂解液,2 μL蛋白酶K,放置于55 ℃恒温箱中裂解过夜;
裂解完成后,放在振荡器上充分震荡,加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中,充分颠倒混匀,于4 ℃条件下,12000rpm离心10 min,倒掉上清液;
加入70 %乙醇500 μL,于4 ℃条件下,12000rpm离心5 min,弃上清液,室温风干20min;
加入20 μL去离子水,充分吹打混匀,琼脂糖凝胶电泳检测提取效率;
b,PCR扩增目的序列
提取基因组DNA后,根据CRISPR靶位点上下游约320bp的基因组区域,利用PrimerPremier 3.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段;
PCR反应体系如下:
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 1 μL
Primer R (10 μM) 1 μL
模板(基因组DNA) 1 μL
ddH2O 7 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后,4 ℃离心,于PCR仪上进行扩增反应;
c,用1.3 %琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,在紫外下切下目的条带,进行纯化回收;
d,送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序,由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息;
e,注射两个月之后,进行剪尾鉴定,同上鉴定步骤;
5)目的序列的TA克隆
PCR鉴定有目的条带后再进行Sanger测序,若测序峰图有双峰,并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列,接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测;
6)质粒的Sanger测序
将双酶切检测结果显示条带大小符合预期结果的质粒送往测序,将测序之后给出的峰图和序列,在NCBI上与标准目的序列进行对比,根据比对结果,分析出每个单克隆的突变类型;
7)获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代,紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎,置于28 ℃培养,在初期观察F1代的存活率;受精两天后,每个突变体F1代分别取10个胚胎进行突变遗传性鉴定;将每个胚胎单独提取基因组,然后PCR扩增出320bp的靶位点附近区域,再进行Sanger测序,若测序峰图有双峰,并且测序结果显示有缺失现象,则确定为可遗传。
2.如果从F1代胚胎中检测到存在突变,则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月;再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾,筛选F1代突变体;
根据权利要求1所述的基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,步骤1)中靶位点的选择遵循以下标准:5’-GG-(N)18-NGG-3’;其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分,保证靶位点的3’端是NGG;靶点的选择位置在基因的结构域内。
3.根据权利要求1所述的基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,步骤2)中所述的转录实验中所用Tip头,EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品。
4.根据权利要求1所述的基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,步骤2)的c步骤中所述的于PCR仪上进行扩增反应,其反应条件为:预变性95 ℃5 min,再重复30次循环以下步骤:变性95 ℃30 s----退火60℃30 s---延伸72 ℃30s,再72 ℃8min;待反应结束后,离心PCR产物,进行电泳。
5.根据权利要求1所述的基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,步骤3)中所述的E3水为5 mmol/L NaCl, 0.33mmol/L CaCl2,0.33mmol/L MgSO4,0.17mmol/L KCl的混合物。
6.根据权利要求1所述的基因敲除选育tnni3k基因缺失型斑马鱼的方法,其特征在于,步骤4)的b步骤中所述的于PCR仪上进行扩增反应,其反应条件为:预变性95℃5 min,再重复30次循环以下步骤:变性95℃ 30 s---退火60℃ 30 s---延伸72 ℃30 s,再72 ℃8min;待反应结束后,离心PCR产物,进行电泳。
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