CN110894511A - 一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因敲除技术领域，特别是公开了一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ppm1g基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9‑mRNA，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养50h后，通过选取胚胎进行基因型分析，从而证实了所选位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中突变特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，突变任意数目的单个基因。且对ppm1g基因表达进行干扰，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示心脏发育的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上心脏疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。

Description

一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法
技术领域
本发明涉及基因敲除领域，特别是公开了一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法。
背景技术
ppm1g（protein phosphatase, Mg2+/Mn2+ dependent, 1G）基因位于斑马鱼第13号染色体上，包含10个外显子，cDNA全长1488bp，同时通过基因差异表达谱分析和基因组关联分析等，发现ppm1g基因在人类胚胎早期的多个组织中都有表达，特别的是，该基因与斑马鱼的神经发育密切相关。
斑马鱼与人类心脏发育过程中的基因、信号通路有高度同源性，且ppm1g基因进化上较为保守，研究发现ppm1g在斑马鱼胚胎早期表达量较高。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育且透明等优点。
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ppm1g基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养50h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。
基因打靶技术起源于20世纪80年代末，是一种通过对基因组进行定点修饰来研究基因功能的重要方法手段，也可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体内特定基因在生长发育过程中的作用，所以这类技术手段已成为现代分子生物学研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(ESC) 和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中突变特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，突变任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
发明内容
本发明为了克服上述技术问题的不足，提供了一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，找到了合适的打靶位点，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，选育出ppm1g基因突变型斑马鱼。
解决上述技术问题的技术方案如下：
1） 设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼ppm1g基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计ppm1g基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响ppm1g基因的整个结构域，从而来改变基因的表达
两对特异性靶位点PCR 引物如下：
F1（靶位点a正向引物）：
TGTAATACGACTCACTATAGgaagccactatgacaatcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
F2（靶位点b正向引物）：
TGTAATACGACTCACTATAGGtttggttctgtccgtagcGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R（共用的反向引物）：AAGCACCGACTCGGTGCCACT
PCR 检测引物
F (5’-CAGGACACTGTTCAAATTCCTTC-3’)
R (5’-GACTTTTCAGCTGATCCTTCAGA-3)；
2）构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上
b， 特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
p42250载体 2μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1.5μL
ddH2O 14.5 μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴，酶切4h以上
c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列20bp+sgRNA上游骨架；反向引物R：20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系（50μL）如下：
ddH2O 18 μL
10× Buffer（含20mM Mg2+） 25 μL
dNTPs（10 mM） 1 μL
Primer F1（或F2，10 uM） 2 μL
Primer R（10 uM） 2 μL
模板（p42250载体） 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；
e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系（20 μL）：
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2 μL
rATP（10 mM） 1 μL
rUTP（10 mM） 1 μL
rCTP（10 mM） 1 μL
rGTP（10 mM） 1 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入1.5 mL RNase-Free 的EP管中，混匀之后，放置于37 ℃水浴锅中反应2.5h，向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1 μL的gRNA样品，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20 ℃；取纯化之后的gRNA溶液1μL测定浓度；
3）斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 蛋白的终浓度为5 μg/μL，gRNA 的终浓度为30 -40ng/μL。注射约1.8nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水中，28 ℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下：
Cas9 蛋白5μg/μL
gRNA 30-40 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4）Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其ppm1g基因是否存在突变；
a,提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精50小时后（50 hpf），分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mL Ep管中，每管5颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入100 μL细胞裂解液，1 μL蛋白酶K，放置于55 ℃水浴锅中裂解过夜；
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000rpm离心10 min，倒掉上清液；
加入75 %乙醇500 μL，于4 ℃条件下，12000rpm离心5 min，弃上清液，室温风干8-10min；
加入10 μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率；
b，PCR扩增目的序列
提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约100-250bp的基因组区域，利用PrimerPremier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；
PCR反应体系如下：
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 0.6 μL
Primer R (10 μM) 0.6 μL
模板(基因组DNA) 1 μL
ddH2O 7.8 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；
c，用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；
d，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；
e,注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；
5）目的序列的TA克隆
对PCR初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
6）菌液的Sanger测序
将菌液PCR结果显示条带大小符合预期结果的菌液送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
7）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，对F1代斑马鱼进行遗传性鉴定，受精两天后，每个突变体F1代分别取5个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出612bp的靶位点附近区域，进行Sanger测序，如果此突变可以遗传到F1代，测序峰图有双峰；将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月，分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，PCR、TA克隆等步骤，并将阳性菌液送测序，通过序列比对结果可知，靶位点a位置上插入了11bp的序列。
本发明的有益效果是：
通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，在斑马鱼的ppm1g基因上设计合适的打靶位点，在体外合成的特异性sgRNA和Cas9蛋白，显微共注射进入斑马鱼一细胞内，胚胎培养50h后，通过选取胚胎进行基因型分析，鉴定所设打靶位点的有效性。本发明能更高效且更精确地在生物体基因组中突变特定基因，且制作简单、成本低，且可同时对靶基因上多个位点进行剪切，突变任意数目的单个基因。且干扰掉ppm1g基因，并且通过遗传学手段研究其功能，有助于进一步揭示心脏发育的整个过程以及调控这些过程的分子机制，在医学上心脏疾病病理的理解和新的治疗方案的研发中具有十分重要的意义。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9 打靶系统的原理图；
图2为 ppm1g基因上靶位点的结构图；
图3为斑马鱼F1代电泳结果图；
图4为证明斑马鱼F0代打靶有效的峰图；
图5为突变型和WT型基因序列正向对比；
图6为靶位点附近缺失对比。
具体实施方式
实施例1：
1） 设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼ppm1g基因的基因组DNA序列，在网站SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计ppm1g基因的靶位点。靶点的选择必须遵循此标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’。其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分，设计靶位点时可以不受此限制，但是必须保证靶位点的3’端是NGG。靶点的选择位置必须在基因的结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响ppm1g基因的整个结构域，从而来改变基因的表达
两对特异性靶位点PCR 引物如下：
F1（靶位点a正向引物）：
TgTAATACGACTCACTATAgGAAGCCACTATGACAATCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
F2（靶位点b正向引物）：
TgTAATACGACTCACTATAGgTTTGGTTCTGTCCGTAGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R（共用的反向引物）：AAGCACCGACTCGGTGCCACT
PCR 检测引物
F (5’-CAGGACACTGTTCAAATTCCTTC-3’)
R (5’-GACTTTTCAGCTGATCCTTCAGA-3)；
2）构建gRNA表达载体以及gRNA体外合成
a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上
b， 特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒。一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
p42250载体 2μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1.5μL
ddH2O 14.5μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴，酶切4h以上
c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列20bp+sgRNA上游骨架；反向引物R：20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系（50μL）如下：
ddH2O 18 μL
10× Buffer（含20mM Mg2+） 25 μL
dNTPs（10 mM） 1 μL
Primer F1（或F2，10 uM） 2 μL
Primer R（10 uM） 2 μL
模板（p42250载体） 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。待反应结束后，离心PCR产物，取1μL样品点样于1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物
e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA。转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系（20 μL）：
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2 μL
rATP（10 mM） 1 μL
rUTP（10 mM） 1 μL
rCTP（10 mM） 1 μL
rGTP（10 mM） 1 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入1.5 mL RNase-Free 的EP管中，混匀之后，放置于37 ℃水浴锅中反应2.5h，向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1 μL的gRNA样品，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20 ℃。吸取纯化后的gRNA溶液1 μL进行浓度检测
3）斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 蛋白的终浓度为5 μg/μL，gRNA 的终浓度为30 -40ng/μL。注射约1.8nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内。注射过的受精卵放置于E3水中，28 ℃孵化。在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下：
Cas9 蛋白5μg/μL
gRNA 30-40 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4）Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其ppm1g基因是否存在突变，可以提前确认此次选择的靶位点是否有效果，显微注射操作是否规范
a、提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精50小时后（50 hpf），分别收集野生型（做对照）和注射后胚胎于1.5mLEp管中（每管5颗胚胎），按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入100 μL细胞裂解液，1 μL蛋白酶K，放置于55 ℃水浴锅中裂解过夜
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积（100μL）异丙醇（预先冷却）于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000rpm离心10 min，倒掉上清液；
加入75 %乙醇500 μL，于4 ℃条件下，12000rpm离心5 min，弃上清液，室温风干8-10min；
加入60 μL去离子水，充分吹打混匀，得到斑马鱼基因组DNA；
b、PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后，根据CRISPR靶位点上下游约150-200bp的基因组区域，利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段
PCR反应体系（20 μL）如下：
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 0.6 μL
Primer R (10 μM) 0.6 μL
模板(基因组DNA) 1 μL
ddH2O 7.8 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应。反应条件为：预变性95℃5 min，（变性95℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72 ℃45 s) 30个循环，再72 ℃8 min
c、1.8 %琼脂糖凝胶上进行电泳，检测PCR产物大小是否正确
d、送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息
e、注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤
5）目的序列的TA克隆
对PCR初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
6）菌液的Sanger测序
将菌液PCR结果显示条带大小符合预期结果的菌液送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
7）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，对F1代斑马鱼进行遗传性鉴定，受精两天后，每个突变体F1代分别取5个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出612bp的靶位点附近区域，进行Sanger测序，如果此突变可以遗传到F1代，测序峰图有双峰；将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月，分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，PCR、TA克隆等步骤，并将阳性菌液送测序，通过序列比对结果可知，靶位点a位置上插入了11bp的序列（具体方法如前面所述）。
图1为 CRISPR/Cas9 打靶系统的原理图；图2为ppm1g基因上打靶位点的结构图；图3为WT型和突变型F1代成鱼PCR电泳图，将测序结果与野生型序列（612bp）进行对比；图4为证明斑马鱼F0代打靶有效的峰图，可以看到出现靶位点a处开始出现双峰，靶位点a和靶位点b均有双峰，说明打靶成功；图5缺失型和WT型基因序列正向对比图，发现在靶位点a处插入了11bp的序列，靶位点b处打靶效率不高，序列未出现变化；图6为靶位点附近插入对比，由于筛选到的突变体F1代的ppm1g基因部分碱基插入造成整个基因的移码突变，这会严重影响斑马鱼ppm1g基因的表达，从而对斑马鱼心脏发育造成了一定影响。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质上对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖南师范大学
<120> 一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 59
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 1
tgtaatacga ctcactatag gaagccacta tgacaatcgg ttttagagct agaaatagc 59
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 2
tgtaatacga ctcactatag gtttggttct gtccgtagcg ttttagagct agaaatagc 59
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 3
aagcaccgac tcggtgccac t 21
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 4
caggacactg ttcaaattcc ttc 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 5
gacttttcag ctgatccttc aga 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 6
agaagccact atgacaatcg agg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 7
tcttcggtga tactgttagc tcc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 8
cccgctacgg acagaaccaa aac 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 9
gggcgatgcc tgtcttggtt ttg 23
<210> 10
<211> 623
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 10
ttcaggacac tgttcaaatt ccttccgcac ccagaagcaa aacctgtgtg actaaaatag 60
cttcatgtct taatttgatt ttagttcgat tatgacttga gtcagattaa ggtcatcaaa 120
aaacgctgtt tacatggtag agtcttaatc agaatattgt attatttctt attaaaatcg 180
gagtaatggt gtccatgtaa gcatactaat tgtttgggta ttaaaatgca tgaatgtttc 240
cgctaataca aattacaaaa aataaatcca atattttttt gttttgtctt attgtcagtt 300
gataatgaag aagctgctct gctgcatgaa gaagccacta tgacggggct tctcacttcg 360
aggagctgct cacccgctac ggacagaacc aaaacaaaaa tgtcaaaaag ccatgtcccg 420
aggccactaa agagtccgag gatggggaga aatctcatgc cgagaaggga atcaacggcg 480
agacagaatg cgggccatct gttgctgaca gtattgggaa gaagccggct ggtgctggaa 540
atgcagctga aggctccaag atgagggcct gcagacgagc ggctgcttcc ggcggctcag 600
cttctgaagg atcagccaaa agt 623
<210> 11
<211> 613
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 11
ttcaggacac tgttcaaatt ccttccgcac ccaaaagcaa aacctgtgtg actaaaatag 60
cttcatgtct taattagatt ttagttcgat tatgacttga gtcagattaa ggtcatcaaa 120
aaaacgctgt ttacatggtt gagtcttaat cagaatattg tattaatctt aataaaatcg 180
gagtaatggt gtccatgtaa gcatactaat tgttttgggt attaatgcat gaatgtttcc 240
gctaatacaa attataaaaa ataaatccaa tatttttttt gttttgtctt attgtcagtt 300
gataatgaag aagctgctct gctgcatgaa gaagccacta tgacaatcga ggagctgctc 360
acccgctacg gacagaacca aaacaaaaat gccaaaaagc catgtcccga ggcctctaaa 420
gagtccgagg atggggagaa atctcatgcc gagaagggaa tcaacggcga gacagaatgc 480
gggccatctg ttgttgacag tattgggaag aagccggctg gtgctggaaa tgcagctgaa 540
ggctccaaga tgagggcctg cagacgagcg gctgcttccg gcggctcagc ttctgaagga 600
tcagctgaaa agt 613
<210> 12
<211> 66
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 12
ctgctgcatg aagaagccac tatgacaatc gaggagctgc tcacccgcta cggacagaac 60
caaaac 66
<210> 13
<211> 77
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 13
ctgctgcatg aagaagccac tatgacgggg cttctcactt cgaggagctg ctcacccgct 60
acggacagaa ccaaaac 77
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 14
gttttggttc tgtccgtagc gggtgagcag ctcctcgatt gtcatagtgg cttcttcatg 60
cagcag 66
<210> 15
<211> 77
<212> DNA
<213> 斑马鱼(Danio rerio)
<400> 15
gttttggttc tgtccgtagc gggtgagcag ctcctcgaag tgagaagccc cgtcatagtg 60
gcttcttcat gcagcag 77

Claims (6)

1.一种基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）分别设计CRISPR/Cas9基因敲除靶位点和检测引物
在National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查询斑马鱼ppm1g基因的基因组DNA序列，在网站SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）上分析其功能结构域，根据CRISPR/Cas敲除原理，在网站The ZiFiT Targeter (http://zifit.partners.org/ZiFiT/) 上设计ppm1g基因的靶位点；
两对特异性靶位点PCR 引物如下：
F1（靶位点a正向引物）：
TGTAATACGACTCACTATAGgaagccactatgacaatcgGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
F2（靶位点b正向引物）：
TGTAATACGACTCACTATAGGtttggttctgtccgtagcGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
R（共用的反向引物）：AAGCACCGACTCGGTGCCACT
PCR 检测引物
F (5’-CAGGACACTGTTCAAATTCCTTC-3’)
R (5’-GACTTTTCAGCTGATCCTTCAGA-3)；
2）构建gRNA表达载体以及特异性gRNA体外合成
a，首先将gRNA骨架克隆到p42250载体上；
b， 特异性gRNA体外合成
用BsaI限制性内切酶线性化此质粒
一般来说，酶切反应总体积为20μL，体系如下：
p42250载体 2μL
10× Buffer 2μL
BsaI限制性内切酶 1.5μL
ddH2O 14.5μL
总体积 20μL
混匀后于37 ℃水浴，酶切4h以上
c，以线性化的p42250载体为模板，通过下面特异性引物进行PCR，扩增出用于特异性gRNA合成的双链DNA
正向特异性靶位点引物F1或F2：T7启动子+20pb靶序列20bp+sgRNA上游骨架；反向引物R：20bp sgRNA下游骨架
PCR反应体系（50μL）如下：
ddH2O 18 μL
10× Buffer（含20mM Mg2+） 25 μL
dNTPs（10 mM） 1 μL
Primer F1（或F2，10 uM） 2 μL
Primer R（10 uM） 2 μL
模板（p42250载体） 1 μL
Ex-Taq DNA聚合酶 1 μL
总体积 50 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应
待反应结束后，离心PCR产物，取1 μL样品点样于1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统拍摄结果
d，检测确定条带正确之后，进行琼脂糖凝胶DNA回收，纯化回收PCR产物；
e，测定纯化的DNA浓度，再以此DNA为模板，用20 μL体系进行体外转录，合成特异性gRNA
转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free产品，具体操作如下：
体外转录反应体系（20 μL）：
模板DNA 12 μL
10×Buffer 2 μL
rATP（10 mM） 1 μL
rUTP（10 mM） 1 μL
rCTP（10 mM） 1 μL
rGTP（10 mM） 1 μL
T7 RNA聚合酶 2 μL
总体积 20 μL
将反应物都加入1.5 mL RNase-Free 的EP管中，混匀之后，放置于37 ℃水浴锅中反应2.5h，向转录体系中加入1 μL DNA酶，放置于37 ℃水浴锅中反应30min，以消化DNA模板，然后取1 μL的gRNA样品，进行琼脂糖凝胶电泳，以检测转录结果，若转录产物大小与预期的相符，则说明转录成功；
f，特异性gRNA的纯化
用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的gRNA，保存于-20 ℃；取纯化之后的gRNA溶液1μL测定浓度；
3）斑马鱼胚胎的显微注射
在受精后30 min 之内，用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中
在进行显微注射之前，将Cas9 mRNA和gRNA配成混合液，充分混匀，使Cas9 蛋白的终浓度为5 μg/μL，gRNA 的终浓度为30 -40ng/μL
注射约1.8nL Cas9 蛋白和gRNA混合液于一细胞期的受精卵内
注射过的受精卵放置于E3水中，28 ℃孵化
在体式显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎用于靶位点突变分析
显微注射体系如下：
Cas9 蛋白5μg/μL
gRNA 30-40 ng/μL
Nuclease free H2O
Total 3μL
4）Sanger测序检测靶位点的有效性
对斑马鱼胚胎进行显微注射之后，挑选部分发育正常的早期胚胎，检测其ppm1g基因是否存在突变；
a,提取斑马鱼基因组
斑马鱼胚胎受精50小时后（50 hpf），分别收集野生型和注射后胚胎于1.5mL Ep管中，每管5颗胚胎，按照下述方法提取基因组DNA，具体步骤如下：
向装有胚胎的Ep管中加入100 μL细胞裂解液，1 μL蛋白酶K，放置于55 ℃水浴锅中裂解过夜；
裂解完成后，放在振荡器上充分震荡，加入等体积预先冷却的异丙醇于Ep管中，充分颠倒混匀，于4 ℃条件下，12000rpm离心10 min，倒掉上清液；
加入75 %乙醇500 μL，于4 ℃条件下，12000rpm离心5 min，弃上清液，室温风干8-10min；
加入10 μL去离子水，充分吹打混匀，琼脂糖凝胶电泳检测提取效率；
b，PCR扩增目的序列
提取基因组DNA后，根据CRISPR靶位点上下游约100-250bp的基因组区域，利用PrimerPremier 5.0软件设计引物序列以扩增出目的DNA片段；
PCR反应体系如下：
2×Es Taq MasterMix 10 μL
Primer F (10 μM) 0.6 μL
Primer R (10 μM) 0.6 μL
模板(基因组DNA) 1 μL
ddH2O 7.8 μL
总体积 20 μL
震荡混匀之后，4 ℃离心，于PCR仪上进行扩增反应；
c，用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；
d，送部分纯化之后的目的DNA片段进行Sanger测序，由测序的峰图来初步获得插入或缺失的信息；
e,注射两个月之后，进行剪尾鉴定，同上鉴定步骤；
5）目的序列的TA克隆
对PCR初步鉴定有突变可能的目的序列再进行Sanger测序，若测序峰图有双峰，并且测序结果显示有插入或缺失现象的目的序列，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；
6）菌液的Sanger测序
将菌液PCR结果显示条带大小符合预期结果的菌液送往测序，根据测序之后给出的峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；
7）获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代
通过前面一系列筛选确定了斑马鱼突变体F0代，紧接着将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，置于28 ℃培养，对F1代斑马鱼进行遗传性鉴定，受精两天后，每个突变体F1代分别取5个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后PCR扩增出612bp的靶位点附近区域，进行Sanger测序，如果此突变可以遗传到F1代，测序峰图有双峰；将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月，分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾，PCR、TA克隆等步骤，并将阳性菌液送测序，通过序列比对结果可知，靶位点a位置上插入了11bp的序列。
2.根据权利要求1所述的基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤1）中靶位点的选择遵循以下标准：5’-GG-(N)18-NGG-3’；其中5’端的 GG 二核苷酸是T7启动子的一部分，保证靶位点的3’端是NGG；靶点的选择位置在基因的结构域内。
3.根据权利要求1所述的基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤2）中所述的转录实验中所用Tip头，EP管均为DEPC处理过的RNase-Free。
4.根据权利要求1所述的基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤2）的c步骤中所述的于PCR仪上进行扩增反应，其反应条件为：预变性95 ℃5 min，再重复30次循环以下步骤：变性95 ℃15 s----退火60℃15 s---延伸72 ℃45 s，再72 ℃8min；待反应结束后，离心PCR产物，进行电泳。
5.根据权利要求1所述的基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤3）中所述的E3水为5 mmol/L NaCl， 0.33mmol/L CaCl2，0.33mmol/L MgSO4，0.17mmol/L KCl的混合物。
6.根据权利要求1所述的基因编辑选育ppm1g基因突变型斑马鱼的方法，其特征在于，步骤4）的b步骤中所述的于PCR仪上进行扩增反应，其反应条件为：预变性95℃5 min，再重复30次循环以下步骤：变性95℃ 30 s---退火60℃ 30 s---延伸72 ℃45 s，再72 ℃8min；待反应结束后，离心PCR产物，进行电泳。
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