CN107287301B

CN107287301B - 利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法

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Publication number: CN107287301B
Application number: CN201710501338.9A
Authority: CN
Inventors: 安小鹏; 侯金星; 宋宇轩; 马海东; 李广; 曹斌云
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2017-06-27
Filing date: 2017-06-27
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2037-06-27
Also published as: CN107287301A

Abstract

本发明公开了一种利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法，该方法以山羊基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用4对引物在PCR条件下进行扩增Nucleophosmin(NPM)基因5'UTR区和外显子1，根据琼脂糖凝胶电泳对其进行目的片段大小判定；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物P1‑P4的PCR扩增产物，发现引物P3扩增位点存在18bp的碱基缺失，然后对引物P3的扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊和波尔山羊的生长性状之间进行关联分析；结果表明：Nucleophosmin基因外显子1由引物P3检测的SNPs位点可用作山羊产生长性状选择的分子标记。

Description

利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，具体涉及一种利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法，该方法采用检测山羊新型的核仁磷酸蛋白因子(Nucleophosmin)基因外显子1碱基多态性，并分析其对山羊生长性状的影响，结果表明：Nucleophosmin基因外显子1由引物P3检测的SNPs位点可用作山羊生长性状选择的分子标记。

背景技术

随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction)技术的问世和电泳技术的改进，各种分子遗传标记技术随之兴起，这些技术给家畜的遗传改良和新品种的培育提供了新的途径和方法。特别是分子标记技术与常规育种技术相结合，孕育出一种全新的选种方式，即标记辅助选择法(Marker assistantselection)。它可以克服传统选种过程中根据表型选择导致的环境偏差和抽样误差，提高家畜选种的准确性和高效性，加快优良品种的选育，进一步推动我国畜牧业的发展。

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。SNPs可以是两个或多个等位基因的多态，因此，通常所说的SNPs包括碱基的插入、缺失、插入/缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换(以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤)以及颠换(嘌呤与嘧啶互换)所引起。具有颠换型变异的SNPs约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上，因为CpG(核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后)二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。在任何已知或未知的基因内或附近都可能找到数量不等的SNPs，根据它们在基因组中分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因周边SNPs(pSNPs)和基因间SNPs(iSNPs)等三类。总的说来，cSNP比较少，因为在编码区内的变异率仅占有周围序列的1/5，但它在遗传病和育种的研究中却具重要意义，因此倍受关注。根据对遗传性状的影响，cSNPs又可分为两种：一种是同义cSNPs，即SNP所致编码序列的改变并不影响其所翻译的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的“含义”相同；另一种是非同义cSNPs，即碱基序列的改变将导致编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列的改变，可能最终影响到蛋白质的功能。因此，对编码区SNPs的非同义突变来说，它们可能对基因功能有直接的重要影响，尤其对于编码区突变来说，更可能会导致所编码的蛋白发生重大变化，从而影响它的功能的发挥。基因序列上碱基的插入/缺失突变，同样将导致所编码氨基酸的改变从而产生蛋白质序列改变，以致影响到蛋白的生物学功能，从而造成对个体的表现型具有重要影响。不仅如此，在群体遗传研究中，这些SNPs作为遗传标记在群体遗传和生物进化的研究中也具有重要意义。

由于SNPs是二等位基因分子标记，所以，理论上在一个二倍体生物群体中，SNPs可能是由2个、3个或4个等位基因构成，但实际上3个或4个等位基因的SNPs很罕见，故SNPs通常被简单地称为二等位基因分子标记。目前，主要采用几种不同的路线来发现SNPs：即DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸连接反应等。在这些SNP检测技术中，DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；当然，利用PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阴性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；而引物延伸法和寡核苷酸连接反应技术检测SNP位点，需要平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台，对于一般的分子实验室来说可实施性不强。

核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM)，也称为核磷素B23或核仁间质蛋白，包括NPM1、NPM2及NPM3，3种亚型。NPM1是位于核仁颗粒区的主要蛋白分子之一，能穿梭于核仁、核质和胞质之间，参与核糖体前体运输和合成及中心体的复制，进而调控细胞的周期进程和增殖发育。人类NPM1基因位于染色体5q35，基因全长约23kb，含有12个外显子，编码由294个氨基酸组成的蛋白质。在分子结构上NPM可分为3个区域，分别负责不同的功能，由N端开始，NPM蛋白包含一个疏水区，它参与寡聚化过程，并与NPM分子伴侣活性相关。随后2个富含天冬氨酸和谷氨酸的酸性区，是与组蛋白结合的关键结构。在两个酸性区是核糖核酸酶活性区，与C端的核酸结合结构域一起构成核糖核酸酶活性结构域。NPM主要定位在核仁颗粒区，可通过核仁定位信号在核仁、胞核和胞质之间往返，参与核质间物质的运输。NPM具有多种生物学功能。一方面，NPM在rRNA前体加工过程中发挥核糖核酸内切酶的活性，参与28SrRNA的形成，进而促进核糖体的形成，同时NPM可作为细胞周期依赖性蛋白激酶2(CDK2)/细胞周期蛋白E复合物的直接底物，被CDK2/cyclin E磷酸化，并从中心体中解离出来，启动中心体复制，在调控周期进程和促进细胞增殖中发挥着重要作用。另一方面，NPM可以与HIV-Rev等带有核定位信号的蛋白质结合，促进它们运输至核仁并阻止核仁内多种蛋白质的聚集，还可以结合组蛋白，介导核小体的合成和致密染色质的舒展，发挥分子伴侣功能。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法，其特征在于，按下列步骤进行：

1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P1～引物P4在PCR条件下进行扩增，筛查山羊Nucleophosmin基因外显子1的碱基突变和缺失；

所述引物P1如下：

上游引物1F：5'-TGCTGGAACCAATAGTAGTC-3'；

下游引物1R：5'-GCCTCTGCAACAACAACA-3'；

所述引物P2如下：

上游引物2F：5'-GAAGCAGAGGCGATGAAT-3'；

下游引物2R：5'-GGAACCAAGCTACCACAA-3'；

所述引物P3如下：

上游引物3F：5'-AAAACACCACCTGTGGTCAAAC-3'；

下游引物3R：5'-CTCAACAACCTCATCAAAATCG-3'；

所述引物P4如下：

上游引物4F：5'-AAGTGGTAGCAAGGAACC-3'；

下游引物4R：5'-CAACCTGGTCAGTCATCC-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

25μL反应体系，包括有：DNA模板：50ng，2×Taq MasterMix：12.5μl，10μM的上下游引物：各0.5μl，加灭菌水至25μl；

所述的PCR扩增反应程序如下：

引物P1～引物P4的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度分别为：50℃、50℃、56℃、50℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2)根据琼脂糖凝胶电泳对引物P3的PCR扩增产物进行大小判定，发现引物P3扩增位点存在18bp的碱基缺失；

3)采用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物P3扩增的PCR扩增产物，然后对引物P3的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊和波尔山羊的生长性状之间进行关联分析；结果如下：

纯合型AA在233bp位缺失AGACGATGATGCTGATGA共18个碱基，纯合型AA在体重、体长指标比杂合型AB有明显优势。

本发明的利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法，与现有技术相比，具有以下技术效果：

采取检测山羊的核仁磷酸蛋白(Nucleophosmin)基因外显子1碱基突变多态性，并分析多态性与波尔山羊及其与关中奶山羊杂交的F1、F2代关系；结果表明：Nucleophosmin基因外显子1由引物P3检测的SNPs位点可用作山羊生长性状选择的分子标记：

明确了与山羊生长性状相关的功能基因Nucleophosmin基因外显子1的1个SNPs，其中233bp位缺失18个碱基能够作为一个分子遗传标记，利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。

为Nucleophosmin基因的SNPs与山羊生长性状关系的建立奠定了基础，以便用于山羊生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的山羊种群。

附图说明

图1是利用引物P3扩增Nucleophosmin基因外显子1的12％聚丙烯酰氨凝胶电泳图，图中M表示：Marker；

图2是Nucleophosmin基因外显子1测序图，图中I表示：AA基因型；II表示：AB基因型。

以下通过对山羊样本采集及基因组DNA提取、检测和浓度分析、山羊Nucleophosmin基因外显子1扩增产物的聚丙烯凝胶电泳分析实施例来对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

A、Nucleophosmin基因外显子1的PCR扩增及其多态性的检测

1、山羊血样的采集及处理

取山羊血样5mL，加入0.2μL的ACD(柠檬酸2.4g，柠檬酸三钠6.6g，葡萄糖7.35g，定容至50mL，高压灭菌)抗凝，缓慢颠倒3次后放入冰盒，-80℃保存备用。

本实施例采用3个山羊群体共计743只山羊血样，具体为：波尔山羊血样268份，关中奶山羊和波尔山羊的F1代血样236份，关中奶山羊和波尔山羊的F2代血样239份，均采自陕西麟游县波尔山羊种羊场。

2、血样基因组DNA的提取、纯化

(1)将冷冻血样室温解冻，转移500μL至1.5mL的Eppendorf管，加入等体积PBS缓冲液，充分混匀，12000r/min离心10min(4℃)，弃去上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈淡黄色。

(2)在离心管中加入DNA抽提缓冲液500μL，摇动，使血细胞沉淀脱离离心管管壁，37℃水浴1h。

DNA抽提缓冲液的配制为：0.6057g的Tris、18.612g的EDTA和2.5g的SDS加超纯水500mL，灭菌，调pH至8.0，4℃保存备用。

(3)加入3μL(20mg/mL)的蛋白酶K并混匀，55℃过夜至澄清，尚未澄清者，可补加1μL的蛋白酶K(20mg/mL)混匀，继续消化至澄清。

(4)将反应液冷却至室温，加入Tris-饱和酚500μL，温和摇动离心管20min，使其充分混匀；4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中，重复一次。

(5)加入氯仿500μL，充分混匀20min，4℃，12000r/min离心10min，将上清液转入另一1.5mL离心管中。

(6)加入0.1倍体积的NaAc缓冲液及2倍体积的冰冷的无水乙醇，混合转动离心管直至白色的絮状沉淀析出，-20℃保存30～60min。

(7)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，用浓度为70％的冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。

(8)4℃，12000r/min离心10min，弃去上清液，室温下使乙醇挥发干净。

(9)干燥后的DNA溶于80μL～100μL的TE-缓冲液或超纯水，4℃保存直至DNA完全溶解，用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量，-80℃保存。

(10)500μL的DNA溶液中加入浓度为12％的SDS使其终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到50μg/mL。

(11)5℃保温10h左右。

(12)用苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1配制混合物和氯仿分别抽提一次，其中的苯酚：氯仿：异戊醇的混合物和氯仿等体积。

(13)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

(14)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

(15)倒掉液体，用浓度为70％乙醇洗涤后晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃待检测。

3、DNA池的构建

(1)1％琼脂糖凝胶电泳检测

选部分DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，选择DNA样品条带均一、无拖尾、无降解的样品进行DNA池的构建。

(2)OD值测定

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值，并计算DNA含量和OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(μg/mL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

(3)品种DNA池的构建

DNA检测完毕后，取出一定的量稀释至50ng/μL，然后从波尔山羊268个个体、浓度为50ng/μL的DNA的样品中取5μL混合构建成DNA池；按照同样的方法构建关中奶山羊和布尔山羊的F1代和F2代的DNA池。

4、PCR扩增引物设计

根据NCBI上GenBank提供的山羊Nucleophosmin基因的序列(登录号：NC_007307)设计引物P1～引物P4，在PCR条件下扩增外显子1筛查山羊Nucleophosmin基因P1～引物P4位点的突变。

引物P1如下：

上游引物1F：5'-TGCTGGAACCAATAGTAGTC-3'；

下游引物1R：5'-GCCTCTGCAACAACAACA-3'；

引物P2如下：

上游引物2F：5'-GAAGCAGAGGCGATGAAT-3'；

下游引物2R：5'-GGAACCAAGCTACCACAA-3'；

引物P3如下：

上游引物3F：5'-AAAACACCACCTGTGGTCAAAC-3'；

下游引物3R：5'-CTCAACAACCTCATCAAAATCG-3'；

引物P4如下：

上游引物4F：5'-AAGTGGTAGCAAGGAACC-3'；

下游引物4R：5'-CAACCTGGTCAGTCATCC-3'。

5、PCR扩增山羊Nucleophosmin基因外显子1

分别以3个山羊群体的DNA池为模版，以引物P1～引物P4进行PCR扩增，反应条件及程序如下所示：

所述的PCR扩增的条件是：

所述PCR扩增反应程序如下：

6、山羊Nucleophosmin基因外显子1的1个SNPs的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

利用引物P3对3个山羊群体743份基因组DNA进行PCR扩增，在3个山羊群体中，获得729个包含山羊Nucleophosmin基因外显子1的DNA片段；然后利用如下方法对每个山羊的Nucleophosmin基因外显子1进行基因分型，具体方法如下：

取引物P3的PCR产物各5μL，点样于12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液中，电压112V电泳1h，银染后照相并分型(图1)。银染的方法如下：电泳完后，回收电泳液，取出凝胶放入托盘中，蒸馏水清洗2次后，加入200ml且浓度为0.1％的硝酸银(AgNO3)溶液，避光轻摇染色10min～15min。倒掉AgNO3溶液，用去离子水清洗2次，然后将染色液倒入托盘中，轻摇10min～15min，直到呈现清晰的DNA条带，倒掉染色液，用去离子水清洗2次。

7、不同基因型个体PCR产物的测序验证

将利用引物P3扩增的纯合基因型和杂合基因型产物进行纯化，然后与pMD^TM19-TVector载体连接，将重组质粒转入E.coli JM109感受态细胞中，挑选10个阳性克隆送至上海生工进行正反向测序)，测序结果如图2所示。B、SNP位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某一性状的某种基因型个体数占总个体数的比率。P_AA＝N_AA/N，其中P_AA代表某一位点的AA基因型频率；N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因数对其等位基因总数的相对比率。计算的公式可以写成：P_A＝(2N_AA+N_Aa1+N_Aa2+……+N_Aan)/2N。式中，P_A表示等位基因A频率，N_AA表示群体中具有AA基因型的个体数量，N_Aai表示群体中具有Aai基因型个体数量，a1-an为等位基因A的n个不同的复等位基因；3个羊群体不同多态位点的基因型分布、等位基因频率的统计分析结果如表1所示。

山羊Nucleophosmin基因外显子1(利用引物P3)SNPs的基因型分布、等位基因频率和多态性分析如表1所示。

表1：3个山羊品种的Nucleophosmin基因的遗传结构分析

C、山羊Nucleophosmin基因效应的关联分析

生产数据：三个山羊群体的体重、体高、体长、胸围的测定数据。

关联分析样本：有完整生长性状记录的波尔山羊268头，关中奶山羊和波尔山羊的F1代236头，关中奶山羊和波尔山羊的F2代239头。

利用SPSS(13.0)软件分析品种、年龄、场和基因位点等因素与经济性状的相关性。先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，利用t分析、ANOVA或多元线性模型分析基因型效应。

在数据处理中，根据影生长性状的因素不同，考虑到场效应(Farm)、品种效应(Breed)、种公畜效应(S)、种公畜内母畜间效应(SD)、年龄(Age)、基因型效应(Genotype)及相关的互作效应，采用了以下固定模型进行分析，同时，根据实际情况进行取舍。完整模型如下：

y_ijkmnpq＝μ+Farm_i+Breed_j+S_p+SD_q+Age_k+Genotype_m+X_n+e_ijkmnpq

其中：y_ijkmnpq：个体表型记录；μ：总体均值；Farm_i：场别效应；Breed_j：品种效应；S_p：种公畜效应；SD_q：种公畜内母畜间效应；Age_k：年龄效应；Genotype_m：标记基因型效应；X_n为各种二级和二级以上互作效应,如：Farm×Breed，Farm×Age，Farm×Genotype，Breed×Age，Breed×Genotype，Age×Genotype，Breed×Age×Genogype等；e_ijkmnpq：随机误差；运用SPSS(13.0)软件对数据进行分析，并用最小二乘法拟合线性模型，对各基因型间生长性状指标进行差异显著性检验。分析结果如表2所示。

表2：波尔山羊(BG)及其与关中奶山羊的F1代和F2代品种的Nucleophosmin基因不同基因型与体重、体高、体长、胸围的关联分析

根据对引物P3的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊和波尔山羊的生产性状之间进行关联分析，结果如下：

综上所述，采用引物3扩增的山羊Nucleophosmin基因外显子1与波尔山羊及其与关中奶山羊的F1代和F2的生长性状显著相关，波尔山羊及其与关中奶山羊杂交的F1代、F2纯合基因型AA在体重、体长的生长性状显著高于杂合型基因型AB山羊(P<0.05)；因此，用引物P3检测的SNPs位点可用作山羊生长性状选择的分子标记。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120>利用核仁磷酸蛋白基因选择山羊生长性状的分子标记方法

<160>

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>引物P1的上游引物1F

<220>

<400> 1

5'-TGCTGGAACCAATAGTAGTC-3'

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213>引物P1的下游引物1R

<220>

<400> 2

5'-GCCTCTGCAACAACAACA-3'；

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213>引物P2的上游引物2F

<220>

<400> 3

5'-GAAGCAGAGGCGATGAAT-3'

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213>引物P2的下游引物2R

<220>

<400> 4

5'-GGAACCAAGCTACCACAA-3'

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213>引物P3的上游引物3F

<220>

<400> 5

5'- AAAACACCACCTGTGGTCAAAC-3'

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213>引物P3的下游引物3R

<220>

<400> 6

5'- CTCAACAACCTCATCAAAATCG-3'

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213>引物P4的上游引物4F

<220>

<400> 7

5'-AAGTGGTAGCAAGGAACC-3'

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213>引物P4的下游引物4R

<220>

<400> 8

5'-CAACCTGGTCAGTCATCC-3'

Claims

1.一种利用核仁磷酸蛋白基因的分子标记方法在山羊体重和体长生长性状选择中的应用，其特征在于，所述分子标记方法按下列步骤进行：

1）以山羊基因组DNA为模板，在TaqDNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物P3在PCR条件下进行扩增，筛查山羊Nucleophosmin基因外显子1的碱基缺失；

所述引物P3如下：

上游引物3F：5'- AAAACACCACCTGTGGTCAAAC-3'；

下游引物3R：5'- CTCAACAACCTCATCAAAATCG-3'；

PCR扩增的体系是：

25μL反应体系：DNA模板：50ng， 2×Taq MasterMix：12.5μl，10μM的上下游引物：各0.5μl，加灭菌水至25μl；

PCR扩增反应程序如下：

引物P3的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火温度为56℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行35个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存；

2）根据琼脂糖凝胶电泳对引物P3的PCR扩增产物进行大小判定，引物P3的扩增位点存在18bp的碱基缺失；

3）采用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测引物P3的PCR扩增产物，然后对引物P3的PCR扩增产物进行基因分型和基因频率分析，以及与关中奶山羊和波尔山羊的生产性状之间进行关联分析，结果如下：

纯合型AA在233bp位缺失AGACGATGATGCTGATGA共18个碱基，纯合型AA在体重和体长指标比杂合型AB有明显优势；所述山羊为关中奶山羊和波尔山羊。