CN112430675A - 利用snp标记kz288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，包括蜜蜂幼虫个体取样、蜜蜂幼虫样本DNA提取、合成引物、PCR检测和鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状，根据从该蜂群中随机收集的工蜂幼虫个体在SNP标记KZ288474.1_322717出现G基因的频率P G 和C基因的频率P C 之间是否存在显著差异，鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状。本发明从分子水平，提供了使用中华蜜蜂工蜂幼虫抗囊状幼虫病相关的SNP（KZ288474.1_322717）标记，科学、准确、快速地鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性能，可以大大缩短抗囊状幼虫病中华蜜蜂的选育周期，加快蜜蜂育种速度。

Description

利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状 的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，具体涉及一种利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，属生物技术领域。
背景技术
蜜蜂病毒性疾病的流行是影响养蜂业健康发展的重要问题，造成全球经济损失。蜜蜂囊状幼虫病（Sacbrood virus, SBV）是威胁中华蜜蜂（Apis cerana cerana，简称中蜂）健康的主要疾病之一。蜜蜂易被多种病原体感染，其中，囊状幼虫病毒及其他因素对蜜蜂种群的健康存在严重的威胁。囊状幼虫病病毒最易感染幼虫，也可以感染成年蜜蜂。蜜蜂种群中特别是中华蜜蜂中普遍存在囊状幼虫病毒。囊状幼虫病毒可造成个体蜜蜂的死亡甚至整个蜂群的消失。目前，能够有效治愈囊状幼虫病且不影响蜂产品质量的药物尚未报道，最好的解决方法是培育抗病品种。因此，我们开展了中蜂囊状幼虫病相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNPs）抗病分子标记的研究。一直以来，我国的蜂业科技工作者致力于抗中囊病蜜蜂的相关研究，以期发现抗中囊病机制和抗中囊病性状相关的遗传标记等，加强抗中囊病蜂种的保种和选育工作，充分发挥我国优良蜂种资源的优势。关于抗中囊病性状相关研究、分子标记意义和SNP技术及其在蜜蜂研究领域的应用等方面进行的研究概述如下：
1、遗传标记的研究进展
（1）遗传标记：是表型易于识别的等位基因或遗传物质（郭春燕，2014），遗传标记的发展经历了最初的形态学标记阶段，然后经过细胞学标记、生物化学标记、免疫学标记阶段，一直到现在被广泛使用的分子标记，大体共经过了这五个阶段。外部形态标记与解剖学形态标记都属于形态学标记，都是肉眼可以识别的外部形态特征。细胞学标记是对染色体的形态、数目等方面的分析。生物化学标记则是把生物体内的个别生物化学性状作为遗传标记，比如在蜂学领域使用较多的同工酶标记等。免疫学标记则是以白细胞抗原和红细胞抗原等免疫学的特征作为遗传标记。分子标记的发展主要经历了第一代限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLPs）、第二代的微卫星标记（ShortTandem Repeats, STRs）、第三代的单核苷酸多态性（SNPs）及正在起步发展的第四代基因拷贝数变异（copy number variants, CNVs）。和 SNPs 相比，目前CNVs仍处于发展阶段，检测技术没有SNPs成熟，但是 CNVs 的核苷含量更多，突变率更高，检测 CNVs 可检测出SNPs 检测不出的重要位点，两种方法具有互补性（刘小彦等，2016；许晓芳，2012）。
（2）RFLPs 的特点与应用：RFLPs 分析技术可以不考虑显隐性以及环境的影响，被广泛应用于 DNA 多态性的研究。但是 RFLPs 多态性信息含量比较低，操作繁琐，且对于DNA 样本需求多，质量要求高（郭春燕，2014）。
（3）生化遗传标记：同工酶是生化标记的一种，由于遗传差异可以产生多种酶形式。在蜜蜂领域研究比较多的是苹果酸脱氢酶（MDH），该酶由三个等位基因编码：MDH Ⅰ、MDHⅡ和MDH Ⅲ，只有MDH Ⅱ在蜜蜂的不同级型和发育阶段表现出多态性。关迎辉等（1994）研究发现，“浙农大1号”意蜂的MDH Ⅱ杂合度比其他两种意蜂（湖北意蜂和原种意大利蜜蜂）的高，且新发现了其他两种王浆低产意蜂中所没有的aa、ab 基因型，可作为蜂王浆高产蜂种的生化遗传标记。此外，西方蜜蜂的三个蜜蜂亚种的MDH Ⅱ的基因型频率、基因频率及杂合纯合度均存在极显著差异，这一结果表明，可通过测定MDH Ⅱ的基因频率和杂合纯合度从生化遗传角度对不同蜂种进行鉴定。鲍秀良（1997）研究报道，“浙农大1号”意蜂及其他四种意蜂的MDH Ⅱ多态性呈显著性差异。综上可知，蜜蜂的苹果酸脱氢酶Ⅱ（MDH Ⅱ）有可能成为蜂王浆高产性状相关的生化水平的遗传标记。
（4）分子遗传标记：基因多态性是指在生物体中普遍存在的两种或两种以上的基因型或等位基因。“浙农大1号”、平湖和萧山浆蜂均为蜂王浆高产蜂种，张娅娟等（2001）通过对这三个蜂种的蜜蜂进行随机扩增多态DNA-PCR（RAPD-PCR）分析，得到了共同的特异性DNA片段W316bp，这一现象说明该DNA片段可能与蜂王浆高产性状相关。王尉平等（2002）采用RAPD-PCR技术同时分析了3个蜂王浆高产蜂种和王浆低产蜂种卡尼鄂拉蜂的基因多态性，结果在卡尼鄂拉蜂中没有发现W316bp，而在3种蜂王浆高产蜂种中仍检测到，进一步证明了W316bp可作为蜂王浆高产蜂种的遗传标记。戴英等（2003）不仅研究了3种蜂王浆高产蜂种，而且对本地意蜂、黑环系蜜蜂等也进行了研究，采用特征序列扩增区域（SCARs）法对W316bp进行验证，结果与前人的研究一致，表明了W316bp很可能是蜂王浆高产性状相关的一个分子标志。
微卫星DNA是普遍存在于生物体基因组中简单的核苷酸重复序列，微卫星标记是一种广泛应用于动植物育种中的遗传标记。“浙农大1号”意蜂、原种意大利蜜蜂和本地意大利蜜蜂是我国饲养比较多的西方蜜蜂蜂种，具有不同的产浆能力，李建科等（2003）分析了这3种蜜蜂的10个微卫星位点，发现这些微卫星位点在每种蜜蜂中扩增出来的等位基因数均不同，呈现多态性，其中“浙农大1号”意蜂的特有等位基因最多，并根据等位基因频率的分析结果找到了7个可以作为蜂王浆高产蜂种的微卫星标记。
潘娇等（2012）采用覆盖了蜜蜂基因组的基因芯片技术对蜂王浆高产蜂种和低产蜂种进行了分析，筛选出369个差异表达基因，其中上调表达基因201个，下调表达基因168个，通过生物信息学的分析，发现这些基因可能参与了蜜蜂与分泌蜂王浆相关的生物学过程，如嗅觉系统、神经系统、运动系统以及腺体功能发育等。进一步的qPCR检测和相关性分析表明有3个基因（dop2、SsRbeta和hex71）与蜂王浆高产性状密切相关，认为其可作为蜂王浆高产性状的分子标记。
以上这些关于蜜蜂蜂王浆高产性状相关的研究大多数在蜜蜂基因组测序完成之前进行的，采用的方法比较传统，筛选的范围存在一定的局限性，因而有学者提出质疑。比较可靠的是潘娇等（2012）采用基因芯片技术在蜜蜂基因组范围内筛选出来的3个分子标记，但是采用该方法检测需提取蜜蜂RNA并使用荧光定量仪器，使鉴定过程复杂、成本较高，不利于该方法的普及。
因此，采用成熟、更加科学的分子研究技术从基因水平对蜜蜂状进行研究，从而寻找一种操作简单、可靠性高、成本低的方法来鉴别蜜蜂的优良生产性能显得尤为重要。
2、SNP技术
单核苷酸多态性 (SNPs) 被称为第3代DNA分子标记，是指同一位点的不同等位基因之间个别核苷酸的差异，常见的是单个核苷酸的替换，且常发生在嘌呤碱基 (A与G) 和嘧啶碱基 (C与T) 之间。SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异，被认为是应用前景最好的遗传标记之一。目前，可以通过提取基因组DNA并随机打断、加上接头、上机测序、生物信息学分析等步骤可以准确获得基因组的SNP信息，筛选出与特异性状相关的SNP分子标记。
刘元珍等（2016）验证筛选出一个可以评估蜂群抗白垩病能力的SNP 分子标记SNP-3。该标记位于MRJP5 基因第二个内含子区域内，其在抗白垩病能力强（CR）蜂群中C等位基因频率（P C ）显著大于抗白垩病能力弱（CS）蜂群中的频率（P < 0.05），且SNP-C2587245T位点P C 高的蜂群白垩病发病率较小；蜂王浆优质高产抗白垩病蜂种不同蜂群的抗白垩病能力与SNP-C2587245T位点P C 基因频率相吻合，进一步支持SNP-3 标记可以通过检测蜂群P C 鉴定蜂群抗白垩病能力强弱，蜂群为C/C基因型的蜂王表现出更强的抗白垩病性状，因此SNP-C2587245T可以作为一个分子标记选育抗白垩病的蜂种；SNP 分型方法探索结果表明本研究所涉及的测序法、探针法和PCR法目前只有测序法能准确鉴定SNP-C2587245T基因型及对其所在区域进行基因型分析。
综上所述，中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状相关的SNP分子标记的研究成果和文献未见报道。
作为新一代生物技术，虽然SNP技术具有极高的实用价值、在人类疾病领域的应用已取得一定进展。本发明采用SNP技术对中华蜜蜂成年工蜂抗囊状幼虫病性状进行鉴定，据此可以准确、高效、快速地选择抗囊状幼虫病蜜蜂进行育种，为通过分子辅助选育中华蜜蜂培育抗囊状幼虫病蜂种奠定良好基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，采用SNP技术对中华蜜蜂成年工蜂抗囊状幼虫病性状进行鉴定，据此以准确、高效、快速地选择抗囊状幼虫病蜜蜂进行育种，为选育中华蜜蜂培育抗囊状幼虫病蜂种奠定良好基础。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
本发明采用SNP位点KZ288474.1_322717来鉴定抗囊状幼虫病蜜蜂的方法是经过严格的筛选和验证的。以中华蜜蜂幼虫为研究对象，提取蜜蜂幼虫样本DNA，然后送至北京百迈克生物技术公司采用Illumina NOVA HisSeq X-Ten技术进行单体型测序和分子标记的开发，进一步进行全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）。采集中华蜜蜂抗囊状幼虫病、感染囊状幼虫病蜜蜂幼虫样本，通过PCR和DNA测序技术对初步筛选的SNPs进行验证，筛选出KZ288474.1_322717，作为中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状相关的分子标记。
KZ288474.1_322717 SNP position detected on the genome of Apis ceranacerana 1>1000：
CCGTTATAAATGGAACTAGCAAGACAGCATTTCTTGAATCGTTTCTTGTGTTATTATTCGCAGCGTGTCGGCGTACTAGCCCGCATGTTTGCTCGCGGCGTGACCGGAACGTCATCCACCGATATTATTAACTCCATGGTCCAGAGGATGCAATCGAATCGTGGCGATCGTGGAAAGTGAAGTTTTCGAAAGGAAAAAAGAGAAATCGAAGAAGCGAGAAATCGAGAGACAGAAAGTGGCATTTTTGATGACGCGAGGAACGATGATCGTTGTCAGTGTGAAACTCTCGACGCGTATTATAGTGCTGCGATTTCAGTAAGCGCAAACGAAAATTCGCGAATATACACAAGAGAAGTGACAATATAGAAGTGGTGGAATTTTTAAAGCTTGAAAACATGAAAAGTGATCAAAATTTGAAAATTGTGTTTCATTGTTGGTCAATACACGATAAATTCTCAGTTTCGTGATTGCACGCTCGTTTAAATTGGCTGTCACAATTCAAATACTCGGTACCGATTTGTTCCCGAGAAGATTGCAACCGTCGAGCCAGTGAATCACATACGAGAGTGATATTTCGAAAGATCGATGTGTTGTTGAACTTAAAAAGGCTCTTACTCAATGCCGTTTATCGCGCTATTGGAGAGCATGCTTGGAATGAACGTTGCATATTCAACTGCTATGTGAAGTTGTCTTACAGTTTGAATGTGATTAGTGGATGTGCTGCAAGCGACCGAGTGTCATCGGTTGCTTTGCAATGCGAGTGTATAGAAGCTTCGTGCAGAGACAAAACAATTGAGAAACAAATTAAACAAGTCAGTTTATAGCTTTTCATTTTAAAATCTTTAATTCAGTATATATGCATTTAAAGGAAATATTTATAATCAACTTATAAAAATTGATAACAATTTTTTTTATATATGAATGTCAATATAAACTATAGTTTCTAAAAAATTATAGTTTTTGAAAATCACTCAGTATTGTGTTTATATTTATAAACATT。
本发明所述利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状的方法，步骤如下：
（1）蜜蜂幼虫取样：从被检测的中华蜜蜂蜂群中，收集工蜂幼虫个体，随机取样，每群以100只幼虫代表整个蜂群，将蜜蜂样本放于-80℃冰箱中冷冻备用；
（2）蜜蜂幼虫DNA的提取：分别将步骤（1）中冷冻的幼虫，进行组织破碎，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定；
（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下：
Primer-F：5’- TTATTATTCGCAGCGTGTCG-3’，
Primer-R：5’- GCTTGCAGCACATCCACTAA -3’；
（4）PCR检测： 以步骤（2）幼虫DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；
反应的体系为：总体积25 μL，内含反应混合物Mix 12.5 μL，Primer-F 0.4 μL，Primer-R 0.4 μL，DNA模版 2 μL，ddH2O 9.7 μL；
反应的条件为： 94 ℃预变性1:15 min/s；94℃变性15 s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5 min；
对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；
（5）鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状：将步骤（4）的测序结果用Burrows-Wheeler Alignerversion (0.7.5a-r405)等软件进行序列比对分析，根据蜂群的G等位基因频率P G 值，鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状。当蜂群的G等位基因频率显著大于C等位基因频率时，此蜂群为抗囊状幼虫病蜂群，所述显著指统计学的P<0.05。所述SNP标记为蜜蜂抗囊状幼虫病相关的基因组位点KZ288474.1_322717。
本发明的优点及有益效果：
1、中华蜜蜂的抗囊状幼虫病能力会受到基因型的影响，而且存在抗囊状幼虫病蜂群中特定等位基因显著高于易感的蜂群。该SNP标记等位基因C基因频率PC在抗囊状幼虫病幼虫和感染囊状幼虫病幼虫中的差异极显著，即抗囊状幼虫病幼虫中C等位基因频率显著高于感染囊状幼虫病幼虫中T等位基因频率，因此根据此结果可以方便、快捷、准确地鉴定中华蜜蜂是否具有抗囊状幼虫病的能力。
2、根据统计指标判断蜂群的抗囊状幼虫病能力：蜂群中随机采集的蜜蜂幼虫个体在该SNP位点 P G > P C （P< 0.05）的是抗囊状幼虫病蜂群， P G < P C （P< 0.05）的是易感蜂群。据此选择抗囊状幼虫病的蜂群，提高蜂群的抗病能力，从而增加蜂农的收入。采用本发明利用蜜蜂抗囊状幼虫病相关的SNP标记鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，可以大大提高效率。
3、使用本发明方法目前主要在实验室从分子水平掌握蜜蜂的抗囊状幼虫病机制，检测与抗囊状幼虫病性状相关的分子遗传标记，并结合分子遗传标记辅助蜜蜂品种选育技术，不但能保证选择的准确性，还可以加快蜜蜂品种选育速度，大大提高了选育抗囊状幼虫病蜂种的成功率，可以安全、有效、快速地进行抗囊状幼虫病蜂种的鉴别。
附图说明
附图为蜜蜂抗囊状幼虫病相关的SNP标记KZ288474.1_322717的基因型判断参考峰图。其中：
图1中方框标注的SNP标记基因型为纯合GG，主要存在于抗囊状幼虫病蜂群中；
图2中方框标注的SNP标记基因型为纯合CC，主要存在易感蜂群中；
图3中方框标注的SNP标记基因型为杂合CG，在抗囊状幼虫病、易感蜂群中均有出现。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的阐述。
实施例1
本发明采用的主要试剂如下（所有化学试剂均为分析纯）：
无水乙醇，异丙醇，氯仿，超纯水，全式金Trans DNA Marker I，全式金2×EasyTaq PCRSuperMix，全式金琼脂糖，全式金Gelstain，生工50×TAE电泳缓冲液，核糖核酸快速提取试剂盒SK8222，上下游引物由合成，核酸酶A。
本发明所使用的仪器主要如下：
Axygen 1.5 mL离心管，Axygen PCR管，微波炉，电子天平，震荡器，小型离心机，水浴锅，微量移液枪，电泳仪，ABI公司96孔PCR仪，上海培清科技有限公司凝胶成像分析仪，高速离心机，低温冰箱，高压灭菌锅，NanoDrop 2000等。
一种利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状的方法，包括以下步骤：
（1）蜜蜂取样：抗囊状幼虫病蜜蜂幼虫个体和感染囊状幼虫病蜜蜂幼虫个体各取100只，收集工蜂幼虫个体，将每个个体分别放在一个离心管中，于-80℃冷冻保存备用；
（2）蜜蜂样本DNA的提取（使用生工公司的动物基因组快速提取试剂盒，SK8222）
Figure DEST_PATH_IMAGE001
将步骤（1）的工蜂幼虫个体放于盛有液氮的研钵中，用研磨棒破碎，然后转移到1.5mL离心管中，加入800 μL CTAB Buffer，震荡均匀，65 ℃水浴1 h至细胞完全裂解。然后取出上清液加入10 μL 的RNA酶A（10mg·mL-1），静置5 min。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
加入200 μL Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5 min。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
室温10000 rpm离心5 min，将上清液400 μL 转移到新的1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿混匀，12000 rpm离心取上清。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
加入400 μL异丙醇，手工震荡1 min，室温放置2 min，室温10000 rpm离心5min，弃上清液。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
加入1 mL 体积比为75%的乙醇（超纯水稀释），轻微震荡1 min，使沉淀悬浮起来，室温10000 rpm离心2 min，弃上清液。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
重复步骤
Figure 282864DEST_PATH_IMAGE005
一次。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
打开离心管盖倒置在干净纸巾上，至残留的乙醇完全挥发，获得DNA。
Figure DEST_PATH_IMAGE008
将得到的DNA用50 μL TAE Buffer溶解，用琼脂糖凝胶和NanoDrop 2000紫外分光光度计检测提取的DNA质量，最后将其放于-20℃保存备用。
（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下
Primer-F：5’- TCCTTCGGCCTCCAGAAA -3’，
Primer-R：5’- CGAATGTGGATCTCTTCGTGT -3’；
将其稀释至10 μmol/μL，用后-20℃保存。
（4）PCR检测： 以步骤（2）的每个蜜蜂个体的DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序。
PCR反应体系(25 μL):
Mix: 12.5 μL
Primer-F: 0.4 μL
Primer-R: 0.4 μL
Template: 2 μL
ddH2O: 9.7 μL
反应条件：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
（5）SNP标记的筛选和对获得的测序结果分析：
下面是PCR产物的DNA序列，该SNP（KZ288474.1_322717）标记在序列中的位置标记为C/ G。
5’-CCTCTCACGTCCACGTCTTCTACCGTGTATTATTAACTCCATGGTCCAGAGGATGCAATCGAATCGTGGCGATCGTGGAAAGTGAAGTTTTCGAAAGGAAAAAAGAGAAATCGAAGAAGCGAGAAATCGAGAGACAGAAAGTGGCATTTTTGATGACGCGAGGAACGATGATCGTTGTCAGTGTGAAACTCTCGACGCGTATTATAGTGCTGCGATTTCAGTAAGCGCAAACGAAAATTCGCGAATATACACAAGAGAAGTGACAATATAGAAGTGGTGGAATTTTTAAAGCTTGAAAACATGAAAAGTGATCAAAATTTGAAAATTGTGTTTCATTGTTGGTCAATACACGATAAATTCTCAGTTTCGTGATTGCACGCTCGTTTAAATTGGCTGTCACAATTC/GAAATACTCGGTACCGATTTGTTCCCGAGAAGATTGCAACCGTCGAGCCAGTGAATCACATACGAGAGTGATATTTCGAAAGATCGATGTGTTGTTGAACTTAAAAAGGCTCTTACTCAATGCCGTTTATCGCGCTATTGGAGAGCATGCTTGGAATGAACGTTGCATATTCAACTGCTATGTGAAGTTGTCTTACAGTTTGAATGTGATTAGTGGATGTG-3’。
查看PCR产物测序峰图，定位该SNP标记在峰图中的位置，基因型峰图标准如图1、图2和图3标记位置，判断每个样本该标记是纯合GG、杂合CC或纯合CG三种类型中的哪种基因型并统计。
（6）利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别中华蜜蜂抗囊状幼虫病性状：将步骤（4）的PCR测序结果用Alignment软件进行序列比对、统计该标记峰图类型，计算出基因型和基因频率，如表1所示。根据分析结果，如果鉴定蜂群的G等位基因频率显著大于C等位基因频率，判断蜂群为抗囊状幼虫病蜂群。
表1 不同基因型对中华蜜蜂抗囊状幼虫病能力的影响及基因频率分布情况
Figure DEST_PATH_IMAGE010
表1通过χ2卡方检验 (Chi-Square Test) 统计得到P= 0.003171<0.05，表明中华蜜蜂抗囊状幼虫病能与不同基因型之间存在极显著差异，具有统计学意义，表明中华蜜蜂的抗囊状幼虫病能力会受到基因型的影响。易感组的P G 、P C 差异不显著，而抗囊状幼虫病组中P G 显著大于P C 。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttattattcg cagcgtgtcg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcttgcagca catccactaa 20
<210> 3
<211> 626
<212> DNA
<213> Sample sequenced and SNP validation
<400> 3
cctctcacgt ccacgtcttc taccgtgtat tattaactcc atggtccaga ggatgcaatc 60
gaatcgtggc gatcgtggaa agtgaagttt tcgaaaggaa aaaagagaaa tcgaagaagc 120
gagaaatcga gagacagaaa gtggcatttt tgatgacgcg aggaacgatg atcgttgtca 180
gtgtgaaact ctcgacgcgt attatagtgc tgcgatttca gtaagcgcaa acgaaaattc 240
gcgaatatac acaagagaag tgacaatata gaagtggtgg aatttttaaa gcttgaaaac 300
atgaaaagtg atcaaaattt gaaaattgtg tttcattgtt ggtcaataca cgataaattc 360
tcagtttcgt gattgcacgc tcgtttaaat tggctgtcac aattcgaaat actcggtacc 420
gatttgttcc cgagaagatt gcaaccgtcg agccagtgaa tcacatacga gagtgatatt 480
tcgaaagatc gatgtgttgt tgaacttaaa aaggctctta ctcaatgccg tttatcgcgc 540
tattggagag catgcttgga atgaacgttg catattcaac tgctatgtga agttgtctta 600
cagtttgaat gtgattagtg gatgtg 626
<210> 4
<211> 1000
<212> DNA
<213> KZ288474.1_322717 SNP position detected on the genome of Apiscerana cerana 1>1000
<400> 4
ccgttataaa tggaactagc aagacagcat ttcttgaatc gtttcttgtg ttattattcg 60
cagcgtgtcg gcgtactagc ccgcatgttt gctcgcggcg tgaccggaac gtcatccacc 120
gatattatta actccatggt ccagaggatg caatcgaatc gtggcgatcg tggaaagtga 180
agttttcgaa aggaaaaaag agaaatcgaa gaagcgagaa atcgagagac agaaagtggc 240
atttttgatg acgcgaggaa cgatgatcgt tgtcagtgtg aaactctcga cgcgtattat 300
agtgctgcga tttcagtaag cgcaaacgaa aattcgcgaa tatacacaag agaagtgaca 360
atatagaagt ggtggaattt ttaaagcttg aaaacatgaa aagtgatcaa aatttgaaaa 420
ttgtgtttca ttgttggtca atacacgata aattctcagt ttcgtgattg cacgctcgtt 480
taaattggct gtcacaattc aaatactcgg taccgatttg ttcccgagaa gattgcaacc 540
gtcgagccag tgaatcacat acgagagtga tatttcgaaa gatcgatgtg ttgttgaact 600
taaaaaggct cttactcaat gccgtttatc gcgctattgg agagcatgct tggaatgaac 660
gttgcatatt caactgctat gtgaagttgt cttacagttt gaatgtgatt agtggatgtg 720
ctgcaagcga ccgagtgtca tcggttgctt tgcaatgcga gtgtatagaa gcttcgtgca 780
gagacaaaac aattgagaaa caaattaaac aagtcagttt atagcttttc attttaaaat 840
ctttaattca gtatatatgc atttaaagga aatatttata atcaacttat aaaaattgat 900
aacaattttt tttatatatg aatgtcaata taaactatag tttctaaaaa attatagttt 960
ttgaaaatca ctcagtattg tgtttatatt tataaacatt 1000

Claims (2)

1.一种利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，其特征在于：鉴别步骤如下：
（1）蜜蜂幼虫取样：从被检测的中华蜜蜂蜂群中，收集工蜂幼虫个体，随机取样，每群以100只幼虫代表整个蜂群，将蜜蜂样本置于-80℃冰箱中冷冻备用；
（2）蜜蜂幼虫DNA的提取：分别将步骤（1）中冷冻的幼虫，进行组织破碎，提取基因组DNA，并进行DNA浓度和纯度测定；
（3）合成引物：引物对Primer-F和Primer-R的序列如下：
Primer-F：5’- TTATTATTCGCAGCGTGTCG-3’，
Primer-R：5’- GCTTGCAGCACATCCACTAA -3’；
（4）PCR检测： 以步骤（2）幼虫DNA为模版，以Primer-F和Primer-R为引物进行PCR；
反应的体系为：总体积25 μL，内含反应混合物Mix 12.5 μL，Primer-F 0.4 μL，Primer-R 0.4 μL，DNA模版 2μL，ddH2O 9.7 μL；
反应的条件为：94 ℃预变性1:15 min/s；94℃变性15 s，57 ℃退火30 s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5 min；
对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将出现目的条带的PCR反应液进行测序；
（5）鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状：将步骤（4）的测序结果用Alignment软件进行序列比对分析，计算被检测蜂群KZ288474.1_322717位点的基因频率，根据蜂群的G基因频率P G 值，鉴别蜂群抗囊状幼虫病能力强弱。
2.根据权利要求1所述的一种利用SNP标记KZ288474.1_322717鉴别蜂群抗囊状幼虫病性状的方法，其特征在于：当蜂群的G基因频率P G 显著大于C等位基因频率P C 时，此蜂群为抗囊状幼虫病蜂群，所述显著指统计学的P<0.05。
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