CN114774556A - 单位点鉴别km小鼠和icr小鼠的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法,方法包括以下步骤:选择SNP位点rs3089604,设计引物序列;提取小鼠样品的基因组DNA;进行PCR扩增,得到扩增产物;扩增产物进行凝胶电泳,使用质量体积比浓度为1.0%的琼脂糖凝胶,电泳,显示电泳图;扩增产物进行测序,得到测序峰图;比对测序峰图,判断小鼠样品为KM小鼠或ICR小鼠,若SNP位点rs3089604处显示单峰且为T基因型,则小鼠样品为ICR小鼠,若SNP位点rs3089604位点处显示单峰且为C基因型,则小鼠样品为KM小鼠,鉴别方法简单准确。
Description
技术领域
本发明属于在生物检测的领域,具体涉及一种单位点鉴别KM小鼠和ICR 小鼠的引物、试剂盒和方法。
背景技术
目前,封闭群ICR小鼠与KM小鼠(昆明小鼠)是常用的两种不同的封闭群小鼠品种。ICR小鼠是国际通用的动物品种,是Hauschka用Swiss小鼠群以多产为目标进行选育,后又被美国癌症研究所送到各国饲养繁育,各国称之为ICR小鼠。而KM小鼠是1944年从印度Hoffkine研究所引进Swiss小鼠后饲养在中国昆明,并进一步繁育而来。KM小鼠基因库大,基因杂合率高,且不同地饲养的KM小鼠封闭群的生长发育与繁殖性能存在一定差异。两种封闭群小鼠均有价格便宜、肿瘤自发率低、抗病力和适应力很强,繁殖率和成活率高的特点,是我国生产量和使用量最大的两种封闭群小鼠群体,两种小鼠均被广泛应用于科研教学、生殖、药理学研究、毒理学研究,和药品、生物制品的生产与检定。
进行高质量的研究时,我们需要明确动物的遗传背景,但是KM小鼠和 ICR小鼠品种均源自Swiss小鼠,外表相似度极高,很难通过外表进行明确判定两种小鼠的品系,两种小鼠的鉴别和品系判断一直是科研和实验动物市场的缺陷。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法,解决了判定KM小鼠和ICR小鼠两种小鼠的品系困难的问题。
为了实现上述目的,本发明提供的一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物,所述单位点为SNP位点rs3089604,所述引物包括SNP位点rs3089604 的引物序列:
上游引物序列rs3089604-F:SEQ ID NO.1;
下游引物序列rs3089604-R:SEQ ID NO.2。
本发明还提供一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的试剂盒,包括上述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物,还包括PCR扩增反应体系。
进一步地,所述PCR扩增反应体系包括2×PCR Mix,上游引物序列,下游引物序列和水。
本发明还提供一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,包括以下步骤:
(1)选择SNP位点rs3089604,针对所述SNP位点rs3089604设计引物序列;
(2)提取小鼠样品的基因组DNA;
(3)以步骤(2)得到的小鼠样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到扩增产物;
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行凝胶电泳,使用质量体积比浓度为1.0%的琼脂糖凝胶,电泳,显示电泳图;
(5)将步骤(3)得到的扩增产物进行Sanger测序,得到测序峰图;
(6)使用SnapGene软件比对测序峰图,判断小鼠样品为KM小鼠或ICR 小鼠,若SNP位点rs3089604处显示单峰且为T基因型,则小鼠样品为ICR 小鼠,若SNP位点rs3089604位点处显示单峰且为C基因型,则小鼠样品为 KM小鼠。
进一步地,所述引物序列由上述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物组成。
优选地,所述小鼠样品为小鼠的组织、细胞或鼠尾尖。
本发明提供的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法,具有如下有益效果:
单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠,只需要区分一个SNP位点rs3089604,若SNP位点rs3089604的基因型显示为C,则为KM小鼠,若SNP位点 rs3089604的基因型显示为T,则为ICR小鼠,鉴别方法简单准确。
附图说明
图1为本具体实施方式中单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法的流程图以及测序结果和测序峰图。
图2为本实施例1中10只ICR小鼠样品的rs3089604位点的基因分型结果。
图3为本实施例1中编号为GT-45-1-1.GT_45F.P111151956的ICR小鼠样品的Sanger测序峰图。
图4为本实施例2中10只KM小鼠样品的rs3089604位点的基因分型结果。
图5为本实施例2中编号为KM-3-8.GT_45F.P112011295的KM小鼠样品的Sanger测序峰图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,找出在KM小鼠和ICR小鼠中表现为单态、并且两种小鼠基因表型不一致的SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性)位点,采用基因组DNA(deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸)提取、PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)扩增、Sanger测序技术鉴别SNP的基因型来鉴别KM小鼠和ICR小鼠。
找出SNP位点,找出在KM小鼠和ICR小鼠中表现为单态、并且两种小鼠基因表型不一致的SNP(single nucleotide polymorphism,单核苷酸多态性) 位点,找出SNP位点rs3089604,若SNP位点rs3089604的基因型显示为C,则为KM小鼠,若SNP位点rs3089604的基因型显示为T,则为ICR小鼠。
设计以待检样本基因组DNA为模板进行PCR扩增的SNP位点的上下游引物,以待检样本基因组DNA为模板进行PCR扩增,上游引物序列为: rs3089604-F:5'-AGGGCCAAAGCAGACTGTAA-3'(SEQ ID NO.1);下游引物为:rs3089604-R:5'-AGCCACAAACCCTTCTGGTC-3'(SEQ ID NO.2)。
如图1所示,单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,包括以下步骤:
1、合成SNP位点rs3089604的上游引物序列和下游引物
rs3089604-F:5'-AGGGCCAAAGCAGACTGTAA-3'(SEQ ID NO.1);
rs3089604-R:5'-AGCCACAAACCCTTCTGGTC-3'(SEQ ID NO.2)。
2、小鼠样品的DNA提取
小鼠样品为KM小鼠或ICR小鼠的组织或细胞或鼠尾尖,取0.1g小鼠的组织或细胞,或者2mm左右鼠尾尖,放入1.5mL无菌离心管中,使用血液/ 细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技,目录号DP304)提取基因组DNA,步骤如下:
(1)向1.5mL无菌离心管中加入200μL Buffer GA和10μL蛋白酶K 于56℃水浴锅中过夜、裂解;
(2)向1.5mL无菌离心管中加入200μL Buffer GB,颠倒混匀,于70℃水浴锅中放置10min;
(3)向1.5mL无菌离心管中加入200μL无水乙醇,震荡混匀,12000rmp 离心10s,去除挂壁的液体;
(4)将1.5mL无菌离心管中的液体全部转移到吸附柱中,将吸附柱放入2mL圆底离心管中,12000rmp离心30s,弃废液;
(5)向吸附柱中加入500μL Buffer GD,12000rmp离心30s,弃废液;
(6)向吸附柱中加入600μL Buffer PW,12000rmp离心30s,弃废液;
(7)向吸附柱中加入600μL Buffer PW,12000rmp离心30s,弃废液;
(8)吸附柱12000rmp离心2min,将吸附柱从原2mL圆底离心管中取出,将吸附柱放置在新的无菌EP管中,打开吸附柱管盖,室温静置5min;
(9)向吸附柱中加入60μL Buffer TE,室温静置5min后,12000rmp 离心30s,得到小鼠样品的基因组DNA。
提取得到的小鼠样品的基因组DNA,可以放置于-20℃下长期保存。
3、以小鼠样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增
PCR扩增反应体系为20μL,其中含2×PCR Mix,2μL;上游引物(引物浓度为100pmol/μL)1μL,下游引物(引物浓度为100pmol/μL)1μL,小鼠样品的基因组DNA,1μL(50~100ng);其余为纯水(ddH2O)。
PCR反应程序为:95℃预变性,5min;95℃变性,30s,退火温度60℃, 30s,72℃延伸,45s,30个循环;72℃继续延伸7min;扩增产物在4℃下进行保存。
扩增产物理论长度为400bp,其中ICR小鼠的扩增产物的理论序列为(其中标注下划线的碱基为SNP位点rs3089604碱基):
AGGGCCAAAGCAGACTGTAATAGCCGGAATGGGAAAAGAATGCAA AATAGTTTGATTAAAGTTCTCTAATGCCAGAGAAGGAGAATTGCTAGCCA TTGCTTTCAGCAGCCTGCAGTGCTGTATTCCTGGGCTTGCCCTCTACAAT GAGTAGCTGTGAGTGGCACTCAGTCACTGTTCTTGCCTCTCTAGGTTTCC TTCTTTCTTTTGGTACGCACCTCAATTAATATATGCATTCAACTCCTTATAC TGAACACAAAAGTAAAAAGGGGGACTTAGTTAGGAGGAACTATAAGGA GTCATTTCAAATGATGGAGAAGAGCAGATTGGGAAGTGCACCCAGACG CACGAAGGAGGGGCAAAAGAGAAGGTACAAATCTACAGACCAGAAGG GTTTGTGGCT(SEQ ID NO.3)。
其中KM小鼠的扩增产物的理论序列为(其中标注下划线的碱基为SNP 位点rs3089604碱基):
AGGGCCAAAGCAGACTGTAATAGCCGGAATGGGAAAAGAATGCAA AATAGTTTGATTAAAGTTCTCTAATGCCAGAGAAGGAGAATTGCTAGCCA TTGCTTTCAGCAGCCTGCAGTGCTGTATTCCTGGGCTTGCCCTCTACAAT GAGTAGCTGTGAGTGGCACTCAGTCACTGTTCCTGCCTCTCTAGGTTTCC TTCTTTCTTTTGGTACGCACCTCAATTAATATATGCATTCAACTCCTTATAC TGAACACAAAAGTAAAAAGGGGGACTTAGTTAGGAGGAACTATAAGGA GTCATTTCAAATGATGGAGAAGAGCAGATTGGGAAGTGCACCCAGACG CACGAAGGAGGGGCAAAAGAGAAGGTACAAATCTACAGACCAGAAGG GTTTGTGGCT(SEQ ID NO.4)。
4、凝胶电泳
将步骤3中得到的扩增产物取5μL,进行1%琼脂糖凝胶电泳,出现电泳图,确认PCR扩增成功。
5、测序,结果比对
将步骤3中得到的扩增产物进行Sanger测序,得到测序结果和测序峰图,如图1所示,使用SnapGene软件比对测序结果和观察测序峰图,SNP位点 rs3089604处显示单峰(仅有单个颜色的一个峰),且为T基因型(红色峰,测序峰图中,一般红色为T、蓝色为C、黑色为G、绿色为A),则为ICR 小鼠,图1中显示ICR小鼠的测序峰图;SNP位点rs3089604位点处显示单峰(仅有单个颜色的一个峰),且为C基因型(蓝色峰),则为KM小鼠,图1中显示KM小鼠的测序峰图。
实施例1
随意采样10只ICR小鼠鼠尾进行rs3089604位点验证。
选取斯贝福和中国食品药品检定研究院来源的各5只ICR小鼠按照上述步骤检测rs3089604位点的基因分型,10个ICR小鼠样品的结果显示如图2 所示,其中编号为GT-45-1-1.GT_45F.P111151956的ICR小鼠样品的测序峰图如图3所示,随机抽检的两个来源ICR小鼠rs3089604位点均为T/T基因型,初步说明该方法鉴定有效。
实施例2
随意采样斯贝福的10只KM小鼠(引种自中国食品药品检定研究院)鼠尾进行rs3089604位点验证。
随机选取10只KM小鼠按照上述步骤检测rs3089604位点的基因分型, 10只KM小鼠样品的结果显示如图4所示,其中编号为 KM-3-8.GT_45F.P112011295的KM小鼠样品的测序峰图如图5所示,随机抽检的10只KM小鼠rs3089604位点均为C/C基因型,说明该方法鉴定有效。
单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,可以用于KM小鼠和ICR小鼠的鉴别,且方法简单准确。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离该发明构思的前提下,所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 斯贝福(北京)生物技术有限公司
<120> 单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法
<130> P20210157
<141> 2021-12-29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cttatactga acacaaaagt aaaaaggggg acttagttag gaggaactat aaggagtcat 300
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Claims (6)
1.一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物,其特征在于,所述单位点为SNP位点rs3089604,所述引物包括SNP位点rs3089604的引物序列:
上游引物序列rs3089604-F:SEQ ID NO.1;
下游引物序列rs3089604-R:SEQ ID NO.2。
2.一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物,还包括PCR扩增反应体系。
3.根据权利要求2所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的试剂盒,其特征在于,所述PCR扩增反应体系包括2×PCR Mix,上游引物序列,下游引物序列和水。
4.一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)选择SNP位点rs3089604,针对所述SNP位点rs3089604设计引物序列;
(2)提取小鼠样品的基因组DNA;
(3)以步骤(2)得到的小鼠样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到扩增产物;
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行凝胶电泳,使用质量体积比浓度为1.0%的琼脂糖凝胶,电泳,显示电泳图;
(5)将步骤(3)得到的扩增产物进行Sanger测序,得到测序峰图;
(6)使用SnapGene软件比对测序峰图,判断小鼠样品为KM小鼠或ICR小鼠,若SNP位点rs3089604处显示单峰且为T基因型,则小鼠样品为ICR小鼠,若SNP位点rs3089604位点处显示单峰且为C基因型,则小鼠样品为KM小鼠。
5.根据权利要求4所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,其特征在于,所述引物序列由权利要求1所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物组成。
6.根据权利要求4所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法,其特征在于,所述小鼠样品为小鼠的组织、细胞或鼠尾尖。
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崔淑芳等: "双色荧光杂交芯片在近交系小鼠遗传监测中的应用" * |
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