CN114774556A - 单位点鉴别km小鼠和icr小鼠的引物、试剂盒和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法，方法包括以下步骤：选择SNP位点rs3089604，设计引物序列；提取小鼠样品的基因组DNA；进行PCR扩增，得到扩增产物；扩增产物进行凝胶电泳，使用质量体积比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶，电泳，显示电泳图；扩增产物进行测序，得到测序峰图；比对测序峰图，判断小鼠样品为KM小鼠或ICR小鼠，若SNP位点rs3089604处显示单峰且为T基因型，则小鼠样品为ICR小鼠，若SNP位点rs3089604位点处显示单峰且为C基因型，则小鼠样品为KM小鼠，鉴别方法简单准确。
Description
技术领域
本发明属于在生物检测的领域，具体涉及一种单位点鉴别KM小鼠和ICR 小鼠的引物、试剂盒和方法。
背景技术
目前，封闭群ICR小鼠与KM小鼠(昆明小鼠)是常用的两种不同的封闭群小鼠品种。ICR小鼠是国际通用的动物品种，是Hauschka用Swiss小鼠群以多产为目标进行选育，后又被美国癌症研究所送到各国饲养繁育，各国称之为ICR小鼠。而KM小鼠是1944年从印度Hoffkine研究所引进Swiss小鼠后饲养在中国昆明，并进一步繁育而来。KM小鼠基因库大，基因杂合率高，且不同地饲养的KM小鼠封闭群的生长发育与繁殖性能存在一定差异。两种封闭群小鼠均有价格便宜、肿瘤自发率低、抗病力和适应力很强，繁殖率和成活率高的特点，是我国生产量和使用量最大的两种封闭群小鼠群体，两种小鼠均被广泛应用于科研教学、生殖、药理学研究、毒理学研究，和药品、生物制品的生产与检定。
进行高质量的研究时，我们需要明确动物的遗传背景，但是KM小鼠和 ICR小鼠品种均源自Swiss小鼠，外表相似度极高，很难通过外表进行明确判定两种小鼠的品系，两种小鼠的鉴别和品系判断一直是科研和实验动物市场的缺陷。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法，解决了判定KM小鼠和ICR小鼠两种小鼠的品系困难的问题。
为了实现上述目的，本发明提供的一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物，所述单位点为SNP位点rs3089604，所述引物包括SNP位点rs3089604 的引物序列：
上游引物序列rs3089604-F：SEQ ID NO.1；
下游引物序列rs3089604-R：SEQ ID NO.2。
本发明还提供一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的试剂盒，包括上述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物，还包括PCR扩增反应体系。
进一步地，所述PCR扩增反应体系包括2×PCR Mix，上游引物序列，下游引物序列和水。
本发明还提供一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，包括以下步骤：
(1)选择SNP位点rs3089604，针对所述SNP位点rs3089604设计引物序列；
(2)提取小鼠样品的基因组DNA；
(3)以步骤(2)得到的小鼠样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行凝胶电泳，使用质量体积比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶，电泳，显示电泳图；
(5)将步骤(3)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到测序峰图；
(6)使用SnapGene软件比对测序峰图，判断小鼠样品为KM小鼠或ICR 小鼠，若SNP位点rs3089604处显示单峰且为T基因型，则小鼠样品为ICR 小鼠，若SNP位点rs3089604位点处显示单峰且为C基因型，则小鼠样品为 KM小鼠。
进一步地，所述引物序列由上述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物组成。
优选地，所述小鼠样品为小鼠的组织、细胞或鼠尾尖。
本发明提供的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法，具有如下有益效果：
单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠，只需要区分一个SNP位点rs3089604，若SNP位点rs3089604的基因型显示为C，则为KM小鼠，若SNP位点 rs3089604的基因型显示为T，则为ICR小鼠，鉴别方法简单准确。
附图说明
图1为本具体实施方式中单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法的流程图以及测序结果和测序峰图。
图2为本实施例1中10只ICR小鼠样品的rs3089604位点的基因分型结果。
图3为本实施例1中编号为GT-45-1-1.GT_45F.P111151956的ICR小鼠样品的Sanger测序峰图。
图4为本实施例2中10只KM小鼠样品的rs3089604位点的基因分型结果。
图5为本实施例2中编号为KM-3-8.GT_45F.P112011295的KM小鼠样品的Sanger测序峰图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，找出在KM小鼠和ICR小鼠中表现为单态、并且两种小鼠基因表型不一致的SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)位点，采用基因组DNA(deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)提取、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)扩增、Sanger测序技术鉴别SNP的基因型来鉴别KM小鼠和ICR小鼠。
找出SNP位点，找出在KM小鼠和ICR小鼠中表现为单态、并且两种小鼠基因表型不一致的SNP(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性) 位点，找出SNP位点rs3089604，若SNP位点rs3089604的基因型显示为C，则为KM小鼠，若SNP位点rs3089604的基因型显示为T，则为ICR小鼠。
设计以待检样本基因组DNA为模板进行PCR扩增的SNP位点的上下游引物，以待检样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，上游引物序列为： rs3089604-F：5'-AGGGCCAAAGCAGACTGTAA-3'(SEQ ID NO.1)；下游引物为：rs3089604-R：5'-AGCCACAAACCCTTCTGGTC-3'(SEQ ID NO.2)。
如图1所示，单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，包括以下步骤：
1、合成SNP位点rs3089604的上游引物序列和下游引物
rs3089604-F：5'-AGGGCCAAAGCAGACTGTAA-3'(SEQ ID NO.1)；
rs3089604-R：5'-AGCCACAAACCCTTCTGGTC-3'(SEQ ID NO.2)。
2、小鼠样品的DNA提取
小鼠样品为KM小鼠或ICR小鼠的组织或细胞或鼠尾尖，取0.1g小鼠的组织或细胞，或者2mm左右鼠尾尖，放入1.5mL无菌离心管中，使用血液/ 细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技，目录号DP304)提取基因组DNA，步骤如下：
(1)向1.5mL无菌离心管中加入200μL Buffer GA和10μL蛋白酶K 于56℃水浴锅中过夜、裂解；
(2)向1.5mL无菌离心管中加入200μL Buffer GB，颠倒混匀，于70℃水浴锅中放置10min；
(3)向1.5mL无菌离心管中加入200μL无水乙醇，震荡混匀，12000rmp 离心10s，去除挂壁的液体；
(4)将1.5mL无菌离心管中的液体全部转移到吸附柱中，将吸附柱放入2mL圆底离心管中，12000rmp离心30s，弃废液；
(5)向吸附柱中加入500μL Buffer GD，12000rmp离心30s，弃废液；
(6)向吸附柱中加入600μL Buffer PW，12000rmp离心30s，弃废液；
(7)向吸附柱中加入600μL Buffer PW，12000rmp离心30s，弃废液；
(8)吸附柱12000rmp离心2min，将吸附柱从原2mL圆底离心管中取出，将吸附柱放置在新的无菌EP管中，打开吸附柱管盖，室温静置5min；
(9)向吸附柱中加入60μL Buffer TE，室温静置5min后，12000rmp 离心30s，得到小鼠样品的基因组DNA。
提取得到的小鼠样品的基因组DNA，可以放置于-20℃下长期保存。
3、以小鼠样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增
PCR扩增反应体系为20μL，其中含2×PCR Mix，2μL；上游引物(引物浓度为100pmol/μL)1μL，下游引物(引物浓度为100pmol/μL)1μL，小鼠样品的基因组DNA，1μL(50～100ng)；其余为纯水(ddH2O)。
PCR反应程序为：95℃预变性，5min；95℃变性，30s，退火温度60℃， 30s，72℃延伸，45s，30个循环；72℃继续延伸7min；扩增产物在4℃下进行保存。
扩增产物理论长度为400bp，其中ICR小鼠的扩增产物的理论序列为(其中标注下划线的碱基为SNP位点rs3089604碱基)：
AGGGCCAAAGCAGACTGTAATAGCCGGAATGGGAAAAGAATGCAA AATAGTTTGATTAAAGTTCTCTAATGCCAGAGAAGGAGAATTGCTAGCCA TTGCTTTCAGCAGCCTGCAGTGCTGTATTCCTGGGCTTGCCCTCTACAAT GAGTAGCTGTGAGTGGCACTCAGTCACTGTTCTTGCCTCTCTAGGTTTCC TTCTTTCTTTTGGTACGCACCTCAATTAATATATGCATTCAACTCCTTATAC TGAACACAAAAGTAAAAAGGGGGACTTAGTTAGGAGGAACTATAAGGA GTCATTTCAAATGATGGAGAAGAGCAGATTGGGAAGTGCACCCAGACG CACGAAGGAGGGGCAAAAGAGAAGGTACAAATCTACAGACCAGAAGG GTTTGTGGCT(SEQ ID NO.3)。
其中KM小鼠的扩增产物的理论序列为(其中标注下划线的碱基为SNP 位点rs3089604碱基)：
AGGGCCAAAGCAGACTGTAATAGCCGGAATGGGAAAAGAATGCAA AATAGTTTGATTAAAGTTCTCTAATGCCAGAGAAGGAGAATTGCTAGCCA TTGCTTTCAGCAGCCTGCAGTGCTGTATTCCTGGGCTTGCCCTCTACAAT GAGTAGCTGTGAGTGGCACTCAGTCACTGTTCCTGCCTCTCTAGGTTTCC TTCTTTCTTTTGGTACGCACCTCAATTAATATATGCATTCAACTCCTTATAC TGAACACAAAAGTAAAAAGGGGGACTTAGTTAGGAGGAACTATAAGGA GTCATTTCAAATGATGGAGAAGAGCAGATTGGGAAGTGCACCCAGACG CACGAAGGAGGGGCAAAAGAGAAGGTACAAATCTACAGACCAGAAGG GTTTGTGGCT(SEQ ID NO.4)。
4、凝胶电泳
将步骤3中得到的扩增产物取5μL，进行1％琼脂糖凝胶电泳，出现电泳图，确认PCR扩增成功。
5、测序，结果比对
将步骤3中得到的扩增产物进行Sanger测序，得到测序结果和测序峰图，如图1所示，使用SnapGene软件比对测序结果和观察测序峰图，SNP位点 rs3089604处显示单峰(仅有单个颜色的一个峰)，且为T基因型(红色峰，测序峰图中，一般红色为T、蓝色为C、黑色为G、绿色为A)，则为ICR 小鼠，图1中显示ICR小鼠的测序峰图；SNP位点rs3089604位点处显示单峰(仅有单个颜色的一个峰)，且为C基因型(蓝色峰)，则为KM小鼠，图1中显示KM小鼠的测序峰图。
实施例1
随意采样10只ICR小鼠鼠尾进行rs3089604位点验证。
选取斯贝福和中国食品药品检定研究院来源的各5只ICR小鼠按照上述步骤检测rs3089604位点的基因分型，10个ICR小鼠样品的结果显示如图2 所示，其中编号为GT-45-1-1.GT_45F.P111151956的ICR小鼠样品的测序峰图如图3所示，随机抽检的两个来源ICR小鼠rs3089604位点均为T/T基因型，初步说明该方法鉴定有效。
实施例2
随意采样斯贝福的10只KM小鼠(引种自中国食品药品检定研究院)鼠尾进行rs3089604位点验证。
随机选取10只KM小鼠按照上述步骤检测rs3089604位点的基因分型， 10只KM小鼠样品的结果显示如图4所示，其中编号为 KM-3-8.GT_45F.P112011295的KM小鼠样品的测序峰图如图5所示，随机抽检的10只KM小鼠rs3089604位点均为C/C基因型，说明该方法鉴定有效。
单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，可以用于KM小鼠和ICR小鼠的鉴别，且方法简单准确。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 斯贝福（北京）生物技术有限公司
<120> 单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物、试剂盒和方法
<130> P20210157
<141> 2021-12-29
<160> 4
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Claims (6)
1.一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物，其特征在于，所述单位点为SNP位点rs3089604，所述引物包括SNP位点rs3089604的引物序列：
上游引物序列rs3089604-F：SEQ ID NO.1；
下游引物序列rs3089604-R：SEQ ID NO.2。
2.一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物，还包括PCR扩增反应体系。
3.根据权利要求2所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应体系包括2×PCR Mix，上游引物序列，下游引物序列和水。
4.一种单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择SNP位点rs3089604，针对所述SNP位点rs3089604设计引物序列；
(2)提取小鼠样品的基因组DNA；
(3)以步骤(2)得到的小鼠样品的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物；
(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行凝胶电泳，使用质量体积比浓度为1.0％的琼脂糖凝胶，电泳，显示电泳图；
(5)将步骤(3)得到的扩增产物进行Sanger测序，得到测序峰图；
(6)使用SnapGene软件比对测序峰图，判断小鼠样品为KM小鼠或ICR小鼠，若SNP位点rs3089604处显示单峰且为T基因型，则小鼠样品为ICR小鼠，若SNP位点rs3089604位点处显示单峰且为C基因型，则小鼠样品为KM小鼠。
5.根据权利要求4所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，其特征在于，所述引物序列由权利要求1所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的引物组成。
6.根据权利要求4所述的单位点鉴别KM小鼠和ICR小鼠的方法，其特征在于，所述小鼠样品为小鼠的组织、细胞或鼠尾尖。
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| WO2018215436A1 (de) * | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Gvg Genetic Monitoring Gmbh | Methode zur genotypisierung von mausstämmen |
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 崔淑芳等: "双色荧光杂交芯片在近交系小鼠遗传监测中的应用" * |
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