CN109825569A - 基因dpy19l2外显子的pcr引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及基因DPY19L2外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法。公开了一种扩增人类DPY19L2(Gene ID:283417)基因1‑22号外显子的44个PCR引物的核苷酸序列，共22对，包含该引物组的试剂盒或者扩增体系,用于圆头精子症致病基因DPY19L2基因突变的直接检测，也可用于对二代测序结果中DPY19L2基因突变的验证，具有操作方便、快速高效等优点。

Description

基因DPY19L2外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测 方法

技术领域

本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及基因DPY19L2外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法。

背景技术

圆头精子症(globozoospermia,round-headed spermatozoa)是一种由精子生成缺陷导致男性不育的罕见疾病，在男性不育患者中的发生率低于0.1％，患者精子头部多呈圆形、无顶体或顶体异常，可能伴有杂乱的中部和尾部。由于顶体内含有精子和卵细胞结合所必须的酶类，因此顶体缺失或异常的精子都不易使卵细胞受精。圆头精子症患者临床表现为不育，需要借助辅助生殖手段孕育下一代。最新的研究表明，DPY19L2是圆头精子症的主要致病基因，该基因负责编码一个跨膜结构域蛋白。

DPY19L2基因位于12号染色体短臂上，共有22个外显子，该基因在7号染色体和10号染色体上共有5个假基因，局部相似度高达95％，普通PCR以及高通量测序技术很难区分DPY19L2基因和其假基因，给临床诊断带来了困扰，且上述测序方式并不能很好与现有的二代测序基因相互配合，也不符合目前遗传筛查的技术发展趋势，因此，本领域仍然需要对DPY19L2基因突变进行更简便高效，低廉的检测。

发明内容

针对现有技术中存在不足，本发明所提供的技术方案是：

基因DPY19L2外显子的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括22对引物，详述如下：

基因DPY19L2外显子1的引物组为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2；

基因DPY19L2外显子2的引物组为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4；

基因DPY19L2外显子3的引物组为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6；

基因DPY19L2外显子4的引物组为正向引物SEQ ID NO:7和SEQ ID反向引物NO:8；

基因DPY19L2外显子5的引物组为正向引物SEQ ID NO:9和反向引物SEQ ID NO:10；

基因DPY19L2外显子6的引物组为正向引物SEQ ID NO:11和反向引物SEQ ID NO:12；

基因DPY19L2外显子7的引物组为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14；

基因DPY19L2外显子8的引物组为正向引物SEQ ID NO:15和反向引物SEQ ID NO:16；

基因DPY19L2外显子9的引物组为正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:18；

基因DPY19L2外显子10的引物组为正向引物SEQ ID NO:19和反向引物SEQ ID NO:20；

基因DPY19L2外显子11的引物组为正向引物SEQ ID NO:21和反向引物SEQ ID NO:22；

基因DPY19L2外显子12的引物组为正向引物SEQ ID NO:23和反向引物SEQ ID NO:24；

基因DPY19L2外显子13的引物组为正向引物SEQ ID NO:25和反向引物SEQ ID NO:26；

基因DPY19L2外显子14的引物组为正向引物SEQ ID NO:27和反向引物SEQ ID NO:28；

基因DPY19L2外显子15的引物组为正向引物SEQ ID NO:29和反向引物SEQ ID NO:30；

基因DPY19L2外显子16的引物组为正向引物SEQ ID NO:31和反向引物SEQ ID NO:32；

基因DPY19L2外显子17的引物组为正向引物SEQ ID NO:33和反向引物SEQ ID NO:34；

基因DPY19L2外显子18的引物组为正向引物SEQ ID NO:35和反向引物SEQ ID NO:36；

基因DPY19L2外显子19的引物组为正向引物SEQ ID NO:37和反向引物SEQ ID NO:38；

基因DPY19L2外显子20的引物组为正向引物SEQ ID NO:39和反向引物SEQ ID NO:40；

基因DPY19L2外显子21的引物组为正向引物SEQ ID NO:41和反向引物SEQ ID NO:42；

基因DPY19L2外显子22的引物组为正向引物SEQ ID NO:43和反向引物SEQ ID NO:44；

所述引物的核苷酸序列分别如下所示：

SEQ ID NO:1GGGAGCACGTGAGGGGACACTCAGGC，

SEQ ID NO:2CTGTGACAGAAGAATGTCCCCTGGACCACGGCT，

SEQ ID NO:3AGTAGCTCCTAGGTCTGGGCTCTTGGAAAGT，

SEQ ID NO:4GAGTCAAGATCACGCCACTGCACTCTAGCCG，

SEQ ID NO:5GAGGCAACGTACCTGGCCACAGTTAAC，

SEQ ID NO:6TTGCGCAATTTTGGCATTTGCTATCCCGCTTAA，

SEQ ID NO:7ACATAGCGTTTGTGAGCAACAATAGTCAATTGACACTGAGA，

SEQ ID NO:8ACTCTTACTGTCCCTTCACGTGGTCATCATGCTA，

SEQ ID NO:9GAATGATGGTTTCCAGCTTCATCCATGTCACTATAAAGC，

SEQ ID NO:10GTGGCTCTGAATGAGAGTCTCAAGGGACGGCACA，

SEQ ID NO:11TTGCAAAGCACTGAGATAATTATGCCCAATTGCCTTAGT，

SEQ ID NO:12CCGTGCTGGATAGTATTCCTGGCACAACACTGT，

SEQ ID NO:13AGCCTGGGCAACAGAGCAAGATCCCAG，

SEQ ID NO:14CCTCTTTCATTGTTGTTAAGGGGAGTGCAATGTATACT，

SEQ ID NO:15TGCTGGTTTCTGGACATGGTAGTTAATTGCTGTCTAA，

SEQ ID NO:16CTCAAGTGATCCACCCACCTCAGCTTCCCT，

SEQ ID NO:17 GTTGAGGTGTGCAGGGGCAGTGCTGA，

SEQ ID NO:18 CTATTACAAAGACACGTGCACCCATGTCTTCATTGCAC，

SEQ ID NO:19 AGATACCTCTGGGAGAAAAGTGGCCTAAAAG，

SEQ ID NO:20 CCAATACCATATGTATTAAATATTACCAAAGAGGAGGTACCGTATAT，

SEQ ID NO:21 AGGTTCTCAGAGTTTATAAAATCGAAGTGATTCTGTTTTATACGGTAA，

SEQ ID NO:22 GGAGACTGCACACTTATTCTAATTATCTTGCCATCACTCAT，

SEQ ID NO:23 GCAGAAAATGGTCAGGGTATTTAAGTGAGGAAATAATGAGGA，

SEQ ID NO:24 TGAGTTATGTTGAAGGGAAGGTTAATTGAAGCTAGAGAGT，

SEQ ID NO:25 TCTCTGTACGGGGAGCTGTTTTCTTTTTCCG，

SEQ ID NO:26 ACTCTGCCAATAACTCGTCTAGAGACCTTAGAGAAC，

SEQ ID NO:27 GAGGATCAGGTCTCATATTCAATGGTTTGAATATATGTCTATAAAT，

SEQ ID NO:28 GGTCCCATATTTCCAAGTGGCCTAGATTATCAAAAC，

SEQ ID NO:29 ACTTTTAAGGAATGTTATCATGGCACTTAGTTTGACATAGGTGTTG，

SEQ ID NO:30 CCAAGACAGGAGCGGCCAGGTTTG，

SEQ ID NO:31 GCCTGTTTCTTTTCCATCAAGGCAAAATGTCAAATTT，

SEQ ID NO:32 CTGTTGTGGGGTAGGGGGAGAGGGGT，

SEQ ID NO:33 GAAGGTCATCCTATTCATTTATTAATGAGAGGTACAATCTC，

SEQ ID NO:34 ATTTATCACCAATGCTGAACAACTCACTACTGAAGGTGA，

SEQ ID NO:35 CAGAAGAGTACCTGGAACATAGTAGACATTCGATAAATTATTGCTGAAG，

SEQ ID NO:36 CTTAGTGTGTTTATATTTTGAATTAGTCAGCAAAGCCACAGTAAA，

SEQ ID NO:37TCCACAAAAGGCAGCCAAGGATGCAAGGT，

SEQ ID NO:38GCTATAATGCTGTCTGAGAGTTAAAGGACATAACTTATGAAT，

SEQ ID NO:39TGGAGCACAATTTCTAGCCCCAAGATAGTATTTT，

SEQ ID NO:40ACTCTTCCAACTACCTAGTAGTTTTACTGGAATACATACACT，

SEQ ID NO:41TCCCCAAAATAATTGATGCTGTTTTGAGTCATGTATATCGGTGTG，

SEQ ID NO:42GCCTAAACAAAGGCCTCATAAGATCAATTACACACCTTAC，

SEQ ID NO:43CTTGGATCATTTCATGCTAATCCAAGGCAGTTTACGCTAT，

SEQ ID NO:44ACCTAGTTGGATGAAAAAGGACTTACATACCCCTGATG。

所述引物的碱基的修饰，具体包括：

荧光基团、RNA碱基、2F-RNA碱基、XNA碱基、C3spacer、C6Spacer、Spacer 9、Spacer18、PO3、Biotin、SH C6或5-硝基吲哚中的一种或多种。

所述试剂盒和反应体系含有上述的PCR引物组。

所述反应体系还包括DNA聚合酶，缓冲液，Rnase(核糖核酸)酶，dNTP(deoxy-ribonucleotide triphosphate，脱氧核糖核苷酸)混合物；所述dNTP混合物为dATP(腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)、dTTP(胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)、dGTP(鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸)和dCTP(胞嘧啶脱氧核糖核苷酸)。

所述DNA聚合酶为ABI amplitaq DNA聚合酶(ABI扩增型耐热DNA聚合酶),NEBvent DNA聚合酶，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶或Clontech Titanium Taq DNA聚合酶中的一种或几种。

基因DPY19L2外显子的PCR检测方法，包括以下步骤：

获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA，并采用Nanodrop(超微量分光光度剂)测定DNA浓度和A260/A280(核酸纯度的指示值)的比值；所述样品为血液样品、唾液样本、精液样本、细胞或组织中的任一一种；

按照预定的配制方法配制包含上述PCR引物组的PCR反应体系；

将所述PCR反应体系混合离心后，在预设的扩增程序下进行PCR反应，获得PCR扩增产物；

将所述PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法和Sanger(双脱氧链终止法)测序法进行检测。

所述按照预定的配制方法配制PCR反应体系的方法具体包括：

选取所述A260/280比值在1.8-2.0的基因组DNA，用去核酸酶水稀释至10ng/μL；

选取权利要求1所述的引物组，用去核酸酶水稀释至10μmol/L；

按照预定的配比将所述基因组DNA，PCR引物组，DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物混合获得PCR反应体系；

所述配比具体包括：gDNA(10ng/μL)1份，10×Titanium Taq PCR Buffer 2份，10mmol/L dNTP混合物0.4份，正向引物(10μmol/L)0.4份，反向引物(10μmol/L)0.4份，Rnase酶(5mU/μL)2份，50×Titanium Taq DNA聚合酶0.4份，去核酸酶水13.4份。

所述预设的扩增程序为：

第一步，94℃热启动和预变性1min；第二步，94℃变性30s；第三步65℃退火和延伸1min；

循环所述第二、三步40次，4℃保存。

有益效果：

本发明开发的基因DPY19L2外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系及其检测方法具有特异性强的特性，其临床应用广泛，可用于检测和验证DPY19L22基因突变，应用于一代Sanger测序、高通量测序、PCR扩增、分子杂交、酶联免疫等技术领域。

附图说明

图1为DPY19L2基因1-22号外显子PCR扩增产物电泳图；

图2为DPY19L2基因1号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图3为DPY19L2基因2号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图4为DPY19L2基因3号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图5为DPY19L2基因4号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果

图6为DPY19L2基因5号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果

图7为DPY19L2基因6号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图8为DPY19L2基因7号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图9为DPY19L2基因8号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图10为DPY19L2基因9号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图11为DPY19L2基因10号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图12为DPY19L2基因11号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图13为DPY19L2基因12号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图14为DPY19L2基因13号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图15为DPY19L2基因14号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图16为DPY19L2基因15号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图17为DPY19L2基因16号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图18为DPY19L2基因17号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图19为DPY19L2基因18号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图20为DPY19L2基因19号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图21为DPY19L2基因20号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图22为DPY19L2基因21号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；

图23为DPY19L2基因22号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果。

具体实施方式

为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本发明通过引物设计原则和多种计算机程序，设计获得了多种基因DPY19L2的PCR引物组，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，共有22对引物，每对引物组对应基因DPY19L2不同的外显子，具体如表1所示。

表1扩增DPY19L2基因1-22号外显子的引物和产物片段长度

其中引物碱基上的修饰包括但不限于：荧光基团(6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、Quasar 670、Cy5、CY5.5、Methylene Blue、BHQ1、BHQ2、Dabcyl)修饰、RNA碱基、2F-RNA碱基、XNA碱基、C3spacer、C6Spacer、Spacer 9、Spacer 18、PO3、Biotin、SH C6和5-硝基吲哚等。

实施例2

本发明公开了含有上述PCR引物组的试剂盒和PCR反应体系，其中反应体系包括以下成分：实施例1中所述的引物组中的任一一组引物组，DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物，其中DNA聚合酶为ABI amplitaq DNA聚合酶,NEB vent DNA聚合酶，TaKaRa LA TaqDNA聚合酶或Clontech Titanium Taq DNA聚合酶中的一种或几种；dNTP为dATP、dTTP、dGTP和dCTP脱氧核糖核苷。

实施例3

本实施例包括基因DPY19L2外显子的PCR检测方法，具体包括：

基因组DNA提取：

本实施例以从血液中提取基因组DNA为例，本血液抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司，具体步骤如下：

1)取200μL血液样本到2.0mL的离心管中。若提取小于200μL血液样品时，可加入缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验。

2)加入200μL Buffer GB和20μL蛋白酶K溶液至上述样品中，充分振荡混匀。

3)在56℃孵育10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(若溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。

4)室温放置2-5min后加入350μL Buffer BD，充分颠倒混匀，短暂离心将反应液收集至管底。

5)将所有溶液分转移到离心柱中(离心柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。

6)加入500μL Buffer GDB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。

7)加入600μL Buffer PWB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。

8)重复上一步骤。

9)12000rpm(～13400×g)离心2min，将离心柱转入一个新的1.5mL离心管中，开盖室温放置5min，以彻底风干吸附膜上的残余的缓冲液。

10)向离心柱的吸附膜中心悬空加入50μL洗脱液TE(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.0)，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将洗脱液收集到离心管中。

将所述获得基因组DNA用Nanodrop测定DNA浓度和A260/A280的比值。应当理解的是，本发明公开的扩增人类DPY19L2基因外显子的PCR引物组、试剂盒和扩增体系不仅仅适用于从血液样本中抽提得到的DNA，还包括从唾液，精液，细胞，组织，FFPE(石蜡包埋)等样本中抽提合格的DNA。

PCR反应体系的配制：

按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR反应体系，其中基因组DNA(gDNA)，A260/280比值在1.8-2.0之间，用nuclease free water(无核酸酶去离子水)稀释至10ng/μL；正向引物和反向引物为如SEQ ID NO:1-44所示碱基序列的引物，用无核酸酶去离子水稀释至10μmol/L。其中20μL PCR反应体系配制比例如表2所示。

表2 PCR反应体系各原料比例

PCR扩增：

将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动PCR反应，其扩增程序为：第一步，94℃热启动和预变性1min；第二步，94℃变性30s；第三步65℃退火和延伸1min；重复第二步、第三步共40个循环；4℃保存。

实施例4

本实施例具体公开了采用琼脂糖凝胶电泳分析实施例3获得的PCR扩增产物，其具体步骤如下：

1)琼脂糖凝胶的配制：称取1.5g的琼脂糖，放入200mL的锥形瓶中，加入100mL的TAE缓冲液(1х)，在微波炉中以中高火加热2-3min至溶液清亮，室温冷却8-10min(约65℃)，加入GelRed染料10μL，倒胶，插入齿梳，室温冷却20min后即可使用。

2)点样和电泳：吸取1μL实施例3PCR扩增的产物，混合1μL 6×loading buffer和4μL超纯水，加入上样孔，并点上6μL Marker；盖上电泳槽盖，以120V电泳30min，电泳完后于凝胶成像系统中拍照保存。

其检测结果如附图1所示，1，24泳道为1500bp Marker，片段长度由上而下依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；2泳道为外显子1的扩增产物，大小为1133bp；3泳道为外显子2的扩增产物，大小为983bp；4泳道为外显子3的扩增产物，大小为861bp；5泳道为外显子4的扩增产物，大小为1064bp；6泳道为外显子5的扩增产物，大小为918bp；7泳道为外显子6的扩增产物，大小为1310bp；8泳道为外显子7的扩增产物，大小为1073bp；9泳道为外显子8的扩增产物，大小为406bp；10泳道为外显子9的扩增产物，大小为946bp；11泳道为外显子10的扩增产物，大小为504bp；12泳道为外显子11的扩增产物，大小为1438bp；13泳道为外显子12的扩增产物，大小为658bp；14泳道为外显子13的扩增产物，大小为537bp；15泳道为外显子14的扩增产物，大小为922bp；16泳道为外显子15的扩增产物，大小为459bp；17泳道为外显子16的扩增产物，大小为1275bp；18泳道为外显子17的扩增产物，大小为453bp；19泳道为外显子18的扩增产物，大小为400bp；20泳道为外显子19的扩增产物，大小为820bp；21泳道为外显子20的扩增产物，大小为633bp；22泳道为外显子21的扩增产物，大小为786bp；23泳道为外显子22的扩增产物，大小为921bp。

由图1可见，采用本发明的引物扩增产物特异性高，无非特异性扩增条带产生。

实施例5

将PCR产物委托铂尚生物技术有限公司进行Sanger测序，并分析测序结果，其检测结果如图2-图23所示，可见扩增产物与DPY19L2基因参考序列一致，而非DPY19L2基因的同源基因序列，说明采用本发明的引物扩增产物特异性高。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

序列表

<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司

<120> 基因DPY19L2外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法

<160> 44

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 1

gggagcacgt gaggggacac tcaggc 26

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgtgacaga agaatgtccc ctggaccacg gct 33

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 3

agtagctcct aggtctgggc tcttggaaag t 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 4

gagtcaagat cacgccactg cactctagcc g 31

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggcaacgt acctggccac agttaac 27

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgcgcaatt ttggcatttg ctatcccgct taa 33

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 7

acatagcgtt tgtgagcaac aatagtcaat tgacactgag a 41

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 8

actcttactg tcccttcacg tggtcatcat gcta 34

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 9

gaatgatggt ttccagcttc atccatgtca ctataaagc 39

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 10

gtggctctga atgagagtct caagggacgg caca 34

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 11

ttgcaaagca ctgagataat tatgcccaat tgccttagt 39

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgtgctgga tagtattcct ggcacaacac tgt 33

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 13

agcctgggca acagagcaag atcccag 27

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 14

cctctttcat tgttgttaag gggagtgcaa tgtatact 38

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 15

tgctggtttc tggacatggt agttaattgc tgtctaa 37

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcaagtgat ccacccacct cagcttccct 30

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 17

gttgaggtgt gcaggggcag tgctga 26

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 18

ctattacaaa gacacgtgca cccatgtctt cattgcac 38

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 19

agatacctct gggagaaaag tggcctaaaa g 31

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 20

ccaataccat atgtattaaa tattaccaaa gaggaggtac cgtatat 47

<210> 21

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 21

aggttctcag agtttataaa atcgaagtga ttctgtttta tacggtaa 48

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 22

ggagactgca cacttattct aattatcttg ccatcactca t 41

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 23

gcagaaaatg gtcagggtat ttaagtgagg aaataatgag ga 42

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 24

tgagttatgt tgaagggaag gttaattgaa gctagagagt 40

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 25

tctctgtacg gggagctgtt ttctttttcc g 31

<210> 26

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 26

actctgccaa taactcgtct agagacctta gagaac 36

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 27

gaggatcagg tctcatattc aatggtttga atatatgtct ataaat 46

<210> 28

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 28

ggtcccatat ttccaagtgg cctagattat caaaac 36

<210> 29

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 29

acttttaagg aatgttatca tggcacttag tttgacatag gtgttg 46

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 30

ccaagacagg agcggccagg tttg 24

<210> 31

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 31

gcctgtttct tttccatcaa ggcaaaatgt caaattt 37

<210> 32

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 32

ctgttgtggg gtagggggag aggggt 26

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 33

gaaggtcatc ctattcattt attaatgaga ggtacaatct c 41

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 34

atttatcacc aatgctgaac aactcactac tgaaggtga 39

<210> 35

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 35

cagaagagta cctggaacat agtagacatt cgataaatta ttgctgaag 49

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 36

cttagtgtgt ttatattttg aattagtcag caaagccaca gtaaa 45

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 37

tccacaaaag gcagccaagg atgcaaggt 29

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 38

gctataatgc tgtctgagag ttaaaggaca taacttatga at 42

<210> 39

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 39

tggagcacaa tttctagccc caagatagta tttt 34

<210> 40

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 40

actcttccaa ctacctagta gttttactgg aatacataca ct 42

<210> 41

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 41

tccccaaaat aattgatgct gttttgagtc atgtatatcg gtgtg 45

<210> 42

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 42

gcctaaacaa aggcctcata agatcaatta cacaccttac 40

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 43

cttggatcat ttcatgctaa tccaaggcag tttacgctat 40

<210> 44

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial Sequence)

<400> 44

acctagttgg atgaaaaagg acttacatac ccctgatg 38

Claims (10)

1.基因DPY19L2外显子的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括22对引物，具体包括：

基因DPY19L2外显子1的引物组为正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2；

基因DPY19L2外显子2的引物组为正向引物SEQ ID NO:3和反向引物SEQ ID NO:4；

基因DPY19L2外显子3的引物组为正向引物SEQ ID NO:5和反向引物SEQ ID NO:6；

基因DPY19L2外显子4的引物组为正向引物SEQ ID NO:7和SEQ ID反向引物NO:8；

基因DPY19L2外显子5的引物组为正向引物SEQ ID NO:9和反向引物SEQ ID NO:10；

基因DPY19L2外显子6的引物组为正向引物SEQ ID NO:11和反向引物SEQ ID NO:12；

基因DPY19L2外显子7的引物组为正向引物SEQ ID NO:13和反向引物SEQ ID NO:14；

基因DPY19L2外显子8的引物组为正向引物SEQ ID NO:15和反向引物SEQ ID NO:16；

基因DPY19L2外显子9的引物组为正向引物SEQ ID NO:17和反向引物SEQ ID NO:18；

基因DPY19L2外显子10的引物组为正向引物SEQ ID NO:19和反向引物SEQ ID NO:20；

基因DPY19L2外显子11的引物组为正向引物SEQ ID NO:21和反向引物SEQ ID NO:22；

基因DPY19L2外显子12的引物组为正向引物SEQ ID NO:23和反向引物SEQ ID NO:24；

基因DPY19L2外显子13的引物组为正向引物SEQ ID NO:25和反向引物SEQ ID NO:26；

基因DPY19L2外显子14的引物组为正向引物SEQ ID NO:27和反向引物SEQ ID NO:28；

基因DPY19L2外显子15的引物组为正向引物SEQ ID NO:29和反向引物SEQ ID NO:30；

基因DPY19L2外显子16的引物组为正向引物SEQ ID NO:31和反向引物SEQ ID NO:32；

基因DPY19L2外显子17的引物组为正向引物SEQ ID NO:33和反向引物SEQ ID NO:34；

基因DPY19L2外显子18的引物组为正向引物SEQ ID NO:35和反向引物SEQ ID NO:36；

基因DPY19L2外显子19的引物组为正向引物SEQ ID NO:37和反向引物SEQ ID NO:38；

基因DPY19L2外显子20的引物组为正向引物SEQ ID NO:39和反向引物SEQ ID NO:40；

基因DPY19L2外显子21的引物组为正向引物SEQ ID NO:41和反向引物SEQ ID NO:42；

基因DPY19L2外显子22的引物组为正向引物SEQ ID NO:43和反向引物SEQ ID NO:44；

所述引物的核苷酸序列分别如下所示：

SEQ ID NO:1 GGGAGCACGTGAGGGGACACTCAGGC，

SEQ ID NO:2 CTGTGACAGAAGAATGTCCCCTGGACCACGGCT，

SEQ ID NO:3 AGTAGCTCCTAGGTCTGGGCTCTTGGAAAGT，

SEQ ID NO:4 GAGTCAAGATCACGCCACTGCACTCTAGCCG，

SEQ ID NO:5 GAGGCAACGTACCTGGCCACAGTTAAC，

SEQ ID NO:6 TTGCGCAATTTTGGCATTTGCTATCCCGCTTAA，

SEQ ID NO:7 ACATAGCGTTTGTGAGCAACAATAGTCAATTGACACTGAGA，

SEQ ID NO:8 ACTCTTACTGTCCCTTCACGTGGTCATCATGCTA，

SEQ ID NO:9 GAATGATGGTTTCCAGCTTCATCCATGTCACTATAAAGC，

SEQ ID NO:10 GTGGCTCTGAATGAGAGTCTCAAGGGACGGCACA，

SEQ ID NO:11 TTGCAAAGCACTGAGATAATTATGCCCAATTGCCTTAGT，

SEQ ID NO:12 CCGTGCTGGATAGTATTCCTGGCACAACACTGT，

SEQ ID NO:13 AGCCTGGGCAACAGAGCAAGATCCCAG，

SEQ ID NO:14 CCTCTTTCATTGTTGTTAAGGGGAGTGCAATGTATACT，

SEQ ID NO:15 TGCTGGTTTCTGGACATGGTAGTTAATTGCTGTCTAA，

SEQ ID NO:16 CTCAAGTGATCCACCCACCTCAGCTTCCCT，

SEQ ID NO:17 GTTGAGGTGTGCAGGGGCAGTGCTGA，

SEQ ID NO:18 CTATTACAAAGACACGTGCACCCATGTCTTCATTGCAC，

SEQ ID NO:19 AGATACCTCTGGGAGAAAAGTGGCCTAAAAG，

SEQ ID NO:20 CCAATACCATATGTATTAAATATTACCAAAGAGGAGGTACCGTATAT，

SEQ ID NO:21 AGGTTCTCAGAGTTTATAAAATCGAAGTGATTCTGTTTTATACGGTAA，

SEQ ID NO:22 GGAGACTGCACACTTATTCTAATTATCTTGCCATCACTCAT，

SEQ ID NO:23 GCAGAAAATGGTCAGGGTATTTAAGTGAGGAAATAATGAGGA，

SEQ ID NO:24 TGAGTTATGTTGAAGGGAAGGTTAATTGAAGCTAGAGAGT，

SEQ ID NO:25 TCTCTGTACGGGGAGCTGTTTTCTTTTTCCG，

SEQ ID NO:26 ACTCTGCCAATAACTCGTCTAGAGACCTTAGAGAAC，

SEQ ID NO:27 GAGGATCAGGTCTCATATTCAATGGTTTGAATATATGTCTATAAAT，

SEQ ID NO:28 GGTCCCATATTTCCAAGTGGCCTAGATTATCAAAAC，

SEQ ID NO:29 ACTTTTAAGGAATGTTATCATGGCACTTAGTTTGACATAGGTGTTG，

SEQ ID NO:30 CCAAGACAGGAGCGGCCAGGTTTG，

SEQ ID NO:31 GCCTGTTTCTTTTCCATCAAGGCAAAATGTCAAATTT，

SEQ ID NO:32 CTGTTGTGGGGTAGGGGGAGAGGGGT，

SEQ ID NO:33 GAAGGTCATCCTATTCATTTATTAATGAGAGGTACAATCTC，

SEQ ID NO:34 ATTTATCACCAATGCTGAACAACTCACTACTGAAGGTGA，

SEQ ID NO:35 CAGAAGAGTACCTGGAACATAGTAGACATTCGATAAATTATTGCTGAAG，

SEQ ID NO:36 CTTAGTGTGTTTATATTTTGAATTAGTCAGCAAAGCCACAGTAAA，

SEQ ID NO:37 TCCACAAAAGGCAGCCAAGGATGCAAGGT，

SEQ ID NO:38 GCTATAATGCTGTCTGAGAGTTAAAGGACATAACTTATGAAT，

SEQ ID NO:39 TGGAGCACAATTTCTAGCCCCAAGATAGTATTTT，

SEQ ID NO:40 ACTCTTCCAACTACCTAGTAGTTTTACTGGAATACATACACT，

SEQ ID NO:41 TCCCCAAAATAATTGATGCTGTTTTGAGTCATGTATATCGGTGTG，

SEQ ID NO:42 GCCTAAACAAAGGCCTCATAAGATCAATTACACACCTTAC，

SEQ ID NO:43 CTTGGATCATTTCATGCTAATCCAAGGCAGTTTACGCTAT，

SEQ ID NO:44 ACCTAGTTGGATGAAAAAGGACTTACATACCCCTGATG。

2.根据权利要求1所述的基因DPY19L2外显子的PCR引物组，其特征在于，所述引物的碱基进行修饰，所述修饰具体包括：

荧光基团、RNA碱基、2F-RNA碱基、XNA碱基、C3 spacer、C6 Spacer、Spacer 9、Spacer18、PO3、Biotin、SH C6或5-硝基吲哚中的一种或多种。

3.基因DPY19L2外显子的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的PCR引物组。

4.基因DPY19L2外显子的PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系含有权利要求1或2所述的PCR引物组。

5.根据权利要求4所述的PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物；所述dNTP混合物包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP。

6.根据权利要求5所述的PCR反应体系，其特征在于，所述DNA聚合酶为ABI amplitaqDNA polymerase,NEB vent DNA polymerase，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶或ClontechTitanium Taq DNA聚合酶中的一种或几种。

7.基因DPY19L2外显子的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA，并采用Nanodrop测定DNA浓度和A260/A280的比值；

按照预定的配制方法配制权利要求4-6任一所述的PCR反应体系；

将所述PCR反应体系混合离心后，在预设的扩增程序下进行PCR反应，获得PCR扩增产物；

将所述PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法和Sanger测序法进行检测。

8.根据权利要求7所述的基因DPY19L2外显子的PCR检测方法，其特征在于，所述按照预定的配制方法配制PCR反应体系的方法具体包括：

选取所述A260/280比值在1.8-2.0的基因组DNA，用缓冲液稀释至10ng/μL；

选取权利要求1所述的引物组，用缓冲液稀释至10μmol/L；

按照预定的配比将所述基因组DNA，PCR引物组，DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物混合获得PCR反应体系；

所述配比具体包括：基因组DNA(10ng/μL)1份，10×Titanium Taq PCR Buffer 2份，10mmol/L dNTP混合物0.4份，正向引物(10μmol/L)0.4份，反向引物(10μmol/L)0.4份，Rnase酶(5mU/μL)2份，50×Titanium Taq DNA聚合酶0.4份，去核酸酶水13.4份。

9.根据权利要求7所述的基因DPY19L2外显子的PCR检测方法，其特征在于，所述预设的扩增程序为：

第一步，94℃热启动和预变性1min；第二步，94℃变性30s；第三步65℃退火和延伸1min；

循环所述第二和三步40次，4℃保存。

10.权利要求1或2所述的PCR引物组在检测和验证DPY19L2基因突变上的应用。