CN109554462A - 基因cyp11b1外显子的pcr引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及基因CYP11B1外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法。本发明公开了一种扩增人类CYP11B1(Gene ID：1584)基因1‑11号外显子的18个PCR引物的核苷酸序列，共9对，包含该引物组的试剂盒或者扩增体系可以用于11β‑羟化酶缺陷症致病基因CYP11B1基因突变的直接检测，也可用于对二代测序结果中CYP11B1基因突变的验证，具有特异性强，快速高效等优点。
Description
技术领域
本发明涉及遗传病基因检测领域，具体涉及基因CYP11B1外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法。
背景技术
先天性肾上腺增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是由于皮质醇合成过程中各种酶缺陷导致的常染色体隐性遗传病。典型的11β-羟化酶缺陷症患者皮质醇合成减少，导致促肾上腺皮质激素(ACTH)增加，引起肾上腺皮质增生。
负责编码11β-羟化酶的为CYP11B1基因，其位于8号染色体长臂上，共有11个外显子(uc010mey.3)，目前，遗传筛查的应用趋势越来越趋向于使用多个基因的中大型panel，以往的这种通过长片段PCR(Polymerase Chain Reaction，多聚酶链式反应)和巢式PCR将CYP11B1基因扩增出来再进行测序的方式。
但是普通PCR以及高通量测序技术很难区分与CYP11B1基因相似的基因，给临床诊断带来了困扰，且上述测序方式不能很好与现有的二代测序基因相互配合，也不符合目前遗传筛查的技术发展趋势。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明所提供的技术方案是：
基因CYP11B1外显子的PCR引物组，所述引物组包括9对引物，详述如下：
基因CYP11B1外显子1-2的引物组为正向引物SEQ(Sequence，序列表)ID(Identity，身份标识)NO：1和反向引物SEQ ID NO：2；
基因CYP11B1外显子3的引物组为正向引物SEQ ID NO：3和反向引物SEQ ID NO：4；
基因CYP11B1外显子4的引物组为正向引物SEQ ID NO：5和反向引物SEQ ID NO：6；
基因CYP11B1外显子5的引物组为正向引物SEQ ID NO：7和SEQ ID反向引物NO：8；
基因CYP11B1外显子6的引物组为正向引物SEQ ID NO：9和反向引物SEQ ID NO：10；
基因CYP11B1外显子7的引物组为正向引物SEQ ID NO：11和反向引物SEQ ID NO：12；
基因CYP11B1外显子8的引物组为正向引物SEQ ID NO：13和反向引物SEQ ID NO：14；
基因CYP11B1外显子9-10的引物组为正向引物SEQ ID NO：15和反向引物SEQ IDNO：16；
基因CYP11B1外显子11的引物组为正向引物SEQ ID NO：17和反向引物SEQ ID NO：18；
上述引物的核苷酸序列分别如下所示：
SEQ ID NO：1CCCAATGAGTCCCTGCCTCCAGCCCTGT，
SEQ ID NO：2GATGGGACCATGTCCCCGCTAGCCCA，
SEQ ID NO：3GCAGGGGATGGTGCAGAGCAAATCCCAC，
SEQ ID NO：4GCAGACACGACCCCACGGAATGGA，
SEQ ID NO：5CATGGGTGTAGTGTCTGTGCACATGTGTACATC，
SEQ ID NO：6GTCATTCCCGGGACCTGGCACCCCAT，
SEQ ID NO：7GTTCCTTTCTTGCAGAAAATCCCTCCCCCCTACG，
SEQ ID NO：8CCCTTCAGTCCCCCATCCCCGTCCCG，
SEQ ID NO：9AGTGCTGTCGCCCAACGCTGTGCT，
SEQ ID NO：10CCAGCCTCGCACCAATCTCCCTGGCAC，
SEQ ID NO：11GGGGATTCCTCACCTTCCTGCCAGGGAC，
SEQ ID NO：12CCATTCCAACCATGGCAACCTGC，
SEQ ID NO：13GGGGTTTGGATGGGCATTAGGATTTGAAG，
SEQ ID NO：14CCGGCCAAACCTCCCCTAACTTAAGCAC，
SEQ ID NO：15GGGCTCAGCAGGTGCAAGGAAG，
SEQ ID NO：16GCCCATGCTGCCCAGACCCCGCCA，
SEQ ID NO：17GCTGGTCAGGAATGAAACAGGTTGGAGGCCAGC，
SEQ ID NO：18CCCTGGCCAGGGGAAGAGGAACAGC。
所述引物的碱基的修饰，具体包括：荧光基团、RNA碱基、2F-RNA碱基、XNA碱基、C3Spacer、C6 Spacer、Spacer 9、Spacer 18、PO3、Biotin、SH C6或5-硝基吲哚中的一种或多种。
本发明还包括基因CYP11B1外显子的PCR试剂盒，所述试剂盒含有权利要求1所述的PCR引物组。
本发明还包括基因CYP11B1外显子的PCR反应体系，所述反应体系含有权利要求1所述的PCR引物组。
所述反应体系还包括DNA聚合酶，缓冲液，Rnase(核糖核酸)酶，dNTP(deoxy-ribonucleotide triphosphate，脱氧核糖核苷酸)混合物，所述dNTP混合物为dATP(腺嘌呤脱氧核糖核苷酸)、dTTP(胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸)、dGTP(鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸)和dCTP(胞嘧啶脱氧核糖核苷酸)。
所述DNA聚合酶为ABI amplitaq DNA聚合酶(ABI扩增型耐热DNA聚合酶)，NEBventDNA聚合酶，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶或Clontech Titanium Taq DNA聚合酶中的一种或几种。
本发明还包括基因CYP11B1外显子的PCR检测方法，包括以下步骤：
获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA，并采用Nanodrop(超微量分光光度计)测定DNA浓度和A260/A280(核酸纯度的指示值)的比值；所述样品为血液样品、唾液样本、精液样本、细胞或组织中的任一一种；
按照预定的配制方法配制上述PCR反应体系；
将所述PCR反应体系混合离心后，在预设的扩增程序下进行PCR反应，获得PCR扩增产物；
将所述PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法和Sanger(双脱氧链终止法)测序法进行检测。
所述按照预定的配制方法配制PCR反应体系的方法具体包括：
选取所述A260/280比值在1.8-2.0的基因组DNA，用缓冲液稀释至10ng/μL；
选取权利要求1所述的引物组，用缓冲液稀释至10μmol/L；
按照预定的配比将所述基因组DNA，PCR引物组，DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物混合获得PCR反应体系；
所述配比具体包括：基因组DNA(10ng/μL)1份，10× Titanium Taq PCR Buffer 2份，10mmol/L dNTP混合物0.4份，正向引物(10μmol/L)0.4份，反向引物(10μmol/L)0.4份，Rnase酶(5mU/μL)2份，50×Titanium Taq DNA聚合酶0.4份，去核酸酶水13.4份。
所述预设的扩增程序为：
第一步，94℃热启动和预变性1min；第二步，94℃变性30s；第三步65℃退火和延伸1min；
循环所述第二、三步40次，4℃保存。
有益效果：
本发明开发的基因CYP11B1外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系及其检测方法具有特异性强的特性，其临床应用广泛，可用于检测和验证CYP11B1基因突变，应用于一代Sanger测序、高通量测序、PCR扩增、分子杂交、酶联免疫等技术领域。
附图说明
图1为CYP11B1基因1-11号外显子PCR扩增产物电泳图；
图2为CYP11B1基因1-2号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；
图3为CYP11B1基因3号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；
图4为CYP11B1基因4号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；
图5为CYP11B1基因5号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果
图6为CYP11B1基因6号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果
图7为CYP11B1基因7号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；
图8为CYP11B1基因8号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；
图9为CYP11B1基因9-10号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果；
图10为CYP11B1基因11号外显子部分扩增产物的Sanger测序结果。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明通过引物设计原则和多种计算机程序，设计获得了多种基因CYP11B1的PCR引物组，并通过大量实验筛选出特异性高的引物序列，共有9对引物，每对引物组对应基因CYP11B1不同的外显子，具体如下所述：
基因CYP11B1外显子1-2的引物组为正向引物SEQ ID NO：1和反向引物SEQ ID NO：2；
基因CYP11B1外显子3的引物组为正向引物SEQ ID NO：3和反向引物SEQ ID NO：4；
基因CYP11B1外显子4的引物组为正向引物SEQ ID NO：5和反向引物SEQ ID NO：6；
基因CYP11B1外显子5的引物组为正向引物SEQ ID NO：7和SEQ ID反向引物NO：8；
基因CYP11B1外显子6的引物组为正向引物SEQ ID NO：9和反向引物SEQ ID NO：10；
基因CYP11B1外显子7的引物组为正向引物SEQ ID NO：11和反向引物SEQ ID NO：12；
基因CYP11B1外显子8的引物组为正向引物SEQ ID NO：13和反向引物SEQ ID NO：14；
基因CYP11B1外显子9-10的引物组为正向引物SEQ ID NO：15和反向引物SEQ IDNO：16；
基因CYP11B1外显子11的引物组为正向引物SEQ ID NO：17和反向引物SEQ ID NO：18；
上述引物的核苷酸序列分别如下所示：
SEQ ID NO：1CCCAATGAGTCCCTGCCTCCAGCCCTGT，
SEQ ID NO：2GATGGGACCATGTCCCCGCTAGCCCA，
SEQ ID NO：3GCAGGGGATGGTGCAGAGCAAATCCCAC，
SEQ ID NO：4GCAGACACGACCCCACGGAATGGA，
SEQ ID NO：5CATGGGTGTAGTGTCTGTGCACATGTGTACATC，
SEQ ID NO：6GTCATTCCCGGGACCTGGCACCCCAT，
SEQ ID NO：7GTTCCTTTCTTGCAGAAAATCCCTCCCCCCTACG，
SEQ ID NO：8CCCTTCAGTCCCCCATCCCCGTCCCG，
SEQ ID NO：9AGTGCTGTCGCCCAACGCTGTGCT，
SEQ ID NO：10CCAGCCTCGCACCAATCTCCCTGGCAC，
SEQ ID NO：11GGGGATTCCTCACCTTCCTGCCAGGGAC，
SEQ ID NO：12CCATTCCAACCATGGCAACCTGC，
SEQ ID NO：13GGGGTTTGGATGGGCATTAGGATTTGAAG，
SEQ ID NO：14CCGGCCAAACCTCCCCTAACTTAAGCAC，
SEQ ID NO：15GGGCTCAGCAGGTGCAAGGAAG，
SEQ ID NO：16GCCCATGCTGCCCAGACCCCGCCA，
SEQ ID NO：17GCTGGTCAGGAATGAAACAGGTTGGAGGCCAGC，
SEQ ID NO：18CCCTGGCCAGGGGAAGAGGAACAGC。
其中引物碱基上的修饰包括但不限于：荧光基团(6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3、TAMRA、ROX、Texas Red、Quasar 670、Cy5、CY5.5、Methylene Blue、BHQ1、BHQ2、Dabcyl)修饰、RNA碱基、2F-RNA碱基、XNA碱基、C3 spacer、C6 Spacer、Spacer 9、Spacer 18、PO3、Biotin、SH C6和5-硝基吲哚等。
实施例2
本发明公开了含有上述PCR引物组的试剂盒和PCR反应体系，其中反应体系包括以下成分：实施例1中所述的引物组，DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物，其中DNA聚合酶为ABI amplitaq DNA聚合酶，NEB vent DNA聚合酶，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶或Clontech Titanium Taq DNA聚合酶中的一种或几种；dNTP包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP脱氧核糖核苷。
实施例3
本实施例公开了基因CYP11B1外显子的PCR检测方法，具体包括：
获取样本，并从所述样本中提取基因组DNA，并采用Nanodrop测定DNA浓度和A260/A280的比值。
本实施例以从血液中提取基因组DNA为例，本血液抽提试剂盒购自天根生化科技有限公司，具体步骤如下：
1)取200μL血液样本到2.0mL的离心管中。若提取小于200μL血液样品时，可加入缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验。
2)加入200μL Buffer GB和20μL蛋白酶K溶液至上述样品中，充分振荡混匀。
3)在56℃孵育10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮(若溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止)。
4)室温放置2-5min后加入350μL Buffer BD，充分颠倒混匀，短暂离心将反应液收集至管底。
5)将所有溶液分转移到离心柱中(离心柱放入收集管中)，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。
6)加入500μL Buffer GDB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。
7)加入600μL Buffer PWB，12000rpm(～13400×g)离心30sec，弃废液，将离心柱放回收集管中。
8)重复上一步骤。
9)12000rpm(～13400×g)离心2min，将离心柱转入一个新的1.5mL离心管中，开盖室温放置5min，以彻底风干吸附膜上的残余的缓冲液。
10)向离心柱的吸附膜中心悬空加入50μL洗脱液TE，室温放置2min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将洗脱液收集到离心管中。
将所述获得基因组DNA用Nanodrop测定DNA浓度和A260/A280的比值。应当说明，本发明公开的扩增人类CYP11B1基因、试剂盒和扩增体系不仅仅适用于从血液样本中抽提得到的DNA，还包括从唾液，精液，细胞，组织，FFPE(石蜡包埋)等样本中抽提合格的DNA。
PCR反应体系的配制：
按照以下体系在灭菌PCR管中配制PCR反应体系，其中基因组DNA(gDNA)，A260/280比值在1.8-2.0之间，用去核酸酶水稀释至10ng/μL；正向引物和反向引物为如SEQ ID NO：1-18所示碱基序列的引物，用去核酸酶水稀释至10μmol/L。其中20μL PCR反应体系配制比例如表1所示。
表1 PCR反应体系各原料比例
| PCR成分 | 加入体积(μL) |
| gDNA(10ng/μL) | 1 |
| 10×Titanium Taq PCR Buffer | 2 |
| 10mmol/L dNTP混合物 | 0.4 |
| 正向引物(10μmol/L) | 0.4 |
| 反向引物(10μmol/L) | 0.4 |
| Rnase酶(5mU/μL) | 2 |
| 50×Titanium Taq DNA聚合酶 | 0.4 |
| 去核酸酶水 | 13.4 |
PCR扩增：
将PCR管混匀离心后放置在PCR热循环仪中，设置如下扩增程序并启动PCR反应，其扩增程序为：第一步，94℃热启动和预变性1min；第二步，94℃变性30s；第三步65℃退火和延伸1min；循环第二步和第三步共40次；4℃保存。
实施例4
本实施例具体公开了采用琼脂糖凝胶电泳分析实施例3获得的PCR扩增产物，其具体步骤如下：
1)琼脂糖凝胶的配制：称取1.5g的琼脂糖，放入200mL的锥形瓶中，加入100mL的TAE(三羟甲基氨基甲烷(Tris base)、乙酸(acetic acid)和乙二胺四乙酸(EDTA)组成的缓冲液)缓冲液(1x)，在微波炉中以中高火加热2-3min至溶液清亮，室温冷却8-10min(约65℃)，加入GelRed(荧光核酸凝胶染色试剂)染料10μL，倒胶，插入齿梳，室温冷却20min后即可使用。
2)点样和电泳：吸取1μL实施例3PCR扩增的产物，混合1μL 6×loading buffer和4μL超纯水，加入上样孔，并点上6μL Marker；盖上电泳槽盖，以120V电泳30min，电泳完后于凝胶成像系统中拍照保存。
其检测结果如附图1所示，其中1泳道为1500bp Marker，片段长度由上而下依次为1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp；2泳道为外显子1-2的扩增产物，大小为749bp；3泳道为外显子3的扩增产物，大小为540bp；4泳道为外显子4的扩增产物，大小为518bp；5泳道为外显子5的扩增产物，大小为622bp；6泳道为外显子6的扩增产物，大小为644bp；7泳道为外显子7的扩增产物，大小为512bp；8泳道为外显子8的扩增产物，大小为576bp；9泳道为外显子9-10的扩增产物，大小为557bp；10泳道为外显子11的扩增产物，大小为649bp。
实施例5
将PCR产物委托铂尚生物技术有限公司进行Sanger测序，并分析测序结果，其检测结果如图2-图10所示，可见扩增产物与CYP11B1基因参考序列一致，而非CYP11B1基因的同源基因序列，说明采用本发明的引物扩增产物特异性高。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 阅尔基因技术（苏州）有限公司
<120> 基因CYP11B1外显子的PCR引物组、试剂盒、扩增体系和检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 1
cccaatgagt ccctgcctcc agccctgt 28
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 2
gatgggacca tgtccccgct agccca 26
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 3
gcaggggatg gtgcagagca aatcccac 28
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 4
gcagacacga ccccacggaa tgga 24
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 5
catgggtgta gtgtctgtgc acatgtgtac atc 33
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 6
gtcattcccg ggacctggca ccccat 26
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 7
gttcctttct tgcagaaaat ccctcccccc tacg 34
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 8
cccttcagtc ccccatcccc gtcccg 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 9
agtgctgtcg cccaacgctg tgct 24
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 10
ccagcctcgc accaatctcc ctggcac 27
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 11
ggggattcct caccttcctg ccagggac 28
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 12
ccattccaac catggcaacc tgc 23
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 13
ggggtttgga tgggcattag gatttgaag 29
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 14
ccggccaaac ctcccctaac ttaagcac 28
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 15
gggctcagca ggttgcaagg aag 23
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 16
gcccatgctg cccagacccc gcca 24
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 17
gctggtcagg aatgaaacag gttggaggcc agc 33
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物(Artificial)
<400> 18
ccctggccag gggaagagga acagc 25
Claims (10)
1.基因CYP11B1外显子的PCR引物组，其特征在于，所述引物组包括9对引物，详述如下：
基因CYP11B1外显子1-2的引物组为正向引物SEQ ID NO：1和反向引物SEQ ID NO：2；
基因CYP11B1外显子3的引物组为正向引物SEQ ID NO：3和反向引物SEQ ID NO：4；
基因CYP11B1外显子4的引物组为正向引物SEQ ID NO：5和反向引物SEQ ID NO：6；
基因CYP11B1外显子5的引物组为正向引物SEQ ID NO：7和SEQ ID反向引物NO：8；
基因CYP11B1外显子6的引物组为正向引物SEQ ID NO：9和反向引物SEQ ID NO：10；
基因CYP11B1外显子7的引物组为正向引物SEQ ID NO：11和反向引物SEQ ID NO：12：
基因CYP11B1外显子8的引物组为正向引物SEQ ID NO：13和反向引物SEQ ID NO：14；
基因CYP11B1外显子9-10的引物组为正向引物SEQ ID NO：15和反向引物SEQ ID NO：16；
基因CYP11B1外显子11的引物组为正向引物SEQ ID NO：17和反向引物SEQ ID NO：18；
所述引物的核苷酸序列分别如下所示：
SEQ ID NO：1CCCAATGAGTCCCTGCCTCCAGCCCTGT，
SEQ ID NO：2GATGGGACCATGTCCCCGCTAGCCCA，
SEQ ID NO：3GCAGGGGATGGTGCAGAGCAAATCCCAC，
SEQ ID NO：4GCAGACACGACCCCACGGAATGGA，
SEQ ID NO：5CATGGGTGTAGTGTCTGTGCACATGTGTACATC，
SEQ ID NO：6GTCATTCCCGGGACCTGGCACCCCAT，
SEQ ID NO：7GTTCCTTTCTTGCAGAAAATCCCTCCCCCCTACG，
SEQ ID NO：8CCCTTCAGTCCCCCATCCCCGTCCCG，
SEQ ID NO：9AGTGCTGTCGCCCAACGCTGTGCT，
SEQ ID NO：10CCAGCCTCGCACCAATCTCCCTGGCAC，
SEQ ID NO：11GGGGATTCCTCACCTTCCTGCCAGGGAC，
SEQ ID NO：12CCATTCCAACCATGGCAACCTGC，
SEQ ID NO：13GGGGTTTGGATGGGCATTAGGATTTGAAG，
SEQ ID NO：14CCGGCCAAACCTCCCCTAACTTAAGCAC，
SEQ ID NO：15GGGCTCAGCAGGTGCAAGGAAG，
SEQ ID NO：16GCCCATGCTGCCCAGACCCCGCCA，
SEQ ID NO：17GCTGGTCAGGAATGAAACAGGTTGGAGGCCAGC，
SEQ ID NO：18CCCTGGCCAGGGGAAGAGGAACAGC。
2.根据权利要求1所述的基因CYP11B1外显子的PCR引物组，其特征在于，所述引物的碱基的修饰，具体包括：
荧光基团、RNA碱基、2F-RNA碱基、XNA碱基、C3 spacer、C6 Spacer、Spacer 9、Spacer18、PO3、Biotin、SH C6或5-硝基吲哚中的一种或多种。
3.基因CYP11B1外显子的PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的PCR引物组。
4.基因CYP11B1外显子的PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系含有权利要求1或2所述的PCR引物组。
5.根据权利要求4所述的PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系还包括DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物；所述dNTP混合物包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP。
6.根据权利要求5所述的PCR反应体系，其特征在于，所述DNA聚合酶为ABI amplitaqDNA polymerase，NEB vent DNA polymerase，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶或ClontechTitaniam Taq DNA聚合酶中的一种或几种。
7.基因CYP11B1外显子的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取样本，从所述样本中提取基因组DNA，并采用Nanodrop测定DNA浓度和A260/A280的比值；所述样品为血液样品、唾液样本、精液样本、细胞或组织中的任一一种；
按照预定的配制方法配制权利要求4-6任一所述的PCR反应体系；
将所述PCR反应体系混合离心后，在预设的扩增程序下进行PCR反应，获得PCR扩增产物；
将所述PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳法和Sanger测序法进行检测。
8.根据权利要求7所述的基因CYP11B1外显子的PCR检测方法，其特征在于，所述按照预定的配制方法配制PCR反应体系的方法具体包括：
选取所述A260/280比值在1.8-2.0的基因组DNA，用去核酸酶水稀释至10ng/μL；
选取权利要求1所述的引物组，用去核酸酶水稀释至10μmol/L；
按照预定的配比将所述基因组DNA，PCR引物组，DNA聚合酶，缓冲液，Rnase酶，dNTP混合物混合获得PCR反应体系；
所述预定的配比具体包括：基因组DNA(10ng/μL)1份，10×Titanium Taq PCR Buffer2份，10mmol/L dNTP混合物0.4份，正向引物(10μmol/L)0.4份，反向引物(10μmol/L)0.4份，Rnase酶(5mU/μL)2份，50×Titanium Taq DNA聚合酶0.4份，去核酸酶水13.4份。
9.根据权利要求7所述的基因CYP11B1外显子的PCR检测方法，其特征在于，所述预设的扩增程序为：
第一步，94℃热启动和预变性1min；第二步，94℃变性30s；第三步65℃退火和延伸1min；
循环所述第二、三步40次，4℃保存。
10.权利要求1或2所述的PCR引物组在检测和验证CYP11B1基因突变上的应用。
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