CN113373237A - 一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法。所述的引物组由引物对1和引物对2组成，其中，引物对1的下游引物3’端和++型的基因位点相匹配；引物对2的下游引物的3’端和BB型的基因位点相匹配。将待测样品分别用引物对1和引物对2进行qPCR扩增，扩增结束后根据两个荧光信号达到阈值的顺序即可判断出FecB基因型。该方法与传统的PCR‑Sanger测序及Taqman探针方法检测相比，节省检测成本、缩短检测周期和提高检测精准性。本发明提供的方法能快速有效地检测出绵羊FecB的BB基因型，为从大群体中筛选出产羔率更高的FecB的BB基因型亲本提供了一种简便易行、廉价有效的方法。

Description

一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其 方法
技术领域
本发明涉及一种检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法，特别涉及一 种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引物组及其方法。本发明属于分 子生物学辅助育种领域。
背景技术
绵羊产羔数是一个极其复杂的性状，受诸多因素影响。目前，国内外学者已 对影响绵羊产羔数的众多候选基因进行了深入研究，已定位的主要基因包括骨形 态发生蛋白受体1B(Bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B，FecB)、 骨形态发生蛋白15(Bone morpho-genetic protein 15，BMP15，FecX)、生长分 化因子9基因(Growthdifferentiation factor-9，GDF9，FecG)和糖基化酶β-1， 4-N-乙酰半乳糖胺转移酶2(Glycosylation enzymebeta-1, 4-N-acetyl-galactosaminyltransferase2，B4GA-LNT2，FecL)等，这些基因在调控 绵羊产羔性状方面起到至关重要的作用。目前全世界仅有少数绵羊品种产羔率能 达200％，大多数绵羊属于季节性发情、单羔品种。同时绵羊产羔性状的遗传力 较低(仅为0.1左右)。
研究表明，FecB基因(BMPR-1B)编码区第746位碱基发生A-G的突变， 导致第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸(Q249R)，降低了其对配体BMP4 和GDF5的敏感性，进而高浓度的GDF5抑制孕酮分泌，促使排卵数增加。FecB 基因是第一个被发现的绵羊高繁殖力主效基因，与绵羊排卵数和产羔数紧密相关。 一个FecB基因拷贝可以增加排卵数1.3～1.6枚，产羔数增加0.9～1.2只；两个FecB 基因拷贝可以增加排卵数2.73枚，产羔数增加1.1～1.7只。继布鲁拉羊中发现FecB 基因之后，进一步的研究发现，在亚洲绵羊品种中FecB基因的分布较为广泛。 在印度绵羊品种Kendrapada、Garole和Bonpala，印度尼西亚Javenese羊，中国 的小尾寒羊等绵羊品种中均存在该基因。Chen等利用FecB基因效应，使用小尾 寒羊和杜泊羊进行杂交培育多羔新品系，杂交后代平均产羔数显著高于杜泊羊(P<0.05)。
目前常用的检测FecB基因多态性的常用方法包括PCR-Sanger测序、 PCR-RFLP、PCR-SSCP、Taqman MGB探针及ELISA等方法。PCR-Sanger技术 准确率高，但价格昂贵，且Sanger测序需要一定的时间周期，相对而言速度较慢。 PCR-RFLP、PCR-SSCP及ELISA技术程序繁琐、通量低。PCR-RFLP技术引入 了限制性内切酶，在实际操作中限制性内切酶在工作中易因为切割条件的变化出 现星活性，故假阳性率相对较高。PCR-SSCP分析技术需要对PCR产物进行变性 处理后于不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。变性后单链DNA形成 不同的二级结构，其在电泳中的迁移速率不同，但该方法对电泳条件要求较为严苛，同时PCR产物中其他位置的突变会对目标突变的判断产生干扰，准确率相 对较低。Taqman MGB探针法准确率高，但成本也高，不适用于大规模的检测。 ELISA的方法需要制备或购买相对应的单克隆抗体，检测过程繁琐，假阳性率高， BB型个体的检出率仅能达到96％左右，且不能很好的鉴别杂合性个体与BB型 个体。
因此，找到一种简便宜行、廉价有效鉴定FecB的不同基因型(BB型、B+ 型和++型)的方法极其重要，不仅能够筛选出高繁绵羊群体，而且能够极大提高 了养羊业的经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的引 物组及其方法，从而加快高繁绵羊良种的选育速度。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
首先，本发明提出了一种用于检测绵羊FecB基因多态性的引物组，所述的 引物组由引物对1和引物对2组成，其中，引物对1的下游引物3’端和++型的基 因位点相匹配；引物对2的下游引物的3’端和BB型的基因位点相匹配；BB型 代表FecB基因的编码区第746位碱基发生A-G的突变(g.A746G)，导致第249 位氨基酸由谷氨酰胺转变为精氨酸(p.Q249R)；++型代表FecB基因的编码区第 746位碱基未发生改变，仍为A；
所述引物对的核苷酸序列如下：
引物对1：
上游引物:5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’
下游引物:5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’
引物对2：
上游引物:5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’
下游引物:5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’。
进一步的，本发明还提出了一种含有所述引物组的用于检测绵羊FecB基因 多态性的试剂盒。
其中，优选的，所述的试剂盒还包括荧光染料。
其中，优选的，所述的荧光染料为SYBR GreenI荧光染料。
其中，优选的，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+以及PCR 反应缓冲液中的一种或多种。
更进一步的，本发明还提出了一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态 性的方法，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，分别进行两个体系的qPCR扩增，体 系1采用所述的引物对1，体系2采用所述的引物对2，扩增后待测样品在体系1 和体系2中分别产生一个荧光信号强度变化曲线；
3)根据体系1和体系2中检测到的荧光阈值出现的顺序辨别出待测样品的 FecB基因型，当体系1先达到荧光阈值时，即可判定待测样品的FecB基因型为 ++型(即FecB正常型)；当体系2先达到荧光阈值时，即可判定待测样品的FecB 基因型为BB型(即FecB突变纯合型)；当体系1和体系2的荧光信号同时达 到阈值时，即可判定待测样品的FecB基因型为B+型(即FecB突变杂合型)。
其中，优选的，步骤2)中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以10μl 计为：5-1000ng/μL基因组DNA 1μL，2×SYBR FAST qPCR Master Mix 5μL， 10μmol/L上游引物0.3μL，10μmol/L下游引物0.3μL，去离子水3.4μL，总体系 为10μL。
其中，优选的，步骤2)中实时荧光定量PCR反应的扩增程序为：95℃预变 性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
再进一步的，本发明还提出了所述的引物组在绵羊分子标记辅助育种中的应 用。以及
所述的试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种利用错配引物的qPCR检测FecB多态性的一种方法。该 方法与传统的PCR-Sanger测序及Taqman探针方法检测相比，节省检测成本、缩 短检测周期和提高检测精准性。本发明提供的方法能快速有效地检测出绵羊FecB 的BB基因型，为从大群体中筛选出产羔率更高的FecB的BB基因型亲本提供了 一种简便宜行、廉价有效的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施过程中的技术方案，下面结合附图和实施例对 本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护 范围的限制。
图1为实施例1中样品PCR过程中的荧光信号变化图。体系1的荧光信号 强度先达到阈值，即可判定待测样品FecB基因为++型(FecB正常型)。
图2为实施例1中样品PCR过程中的荧光信号变化图。体系1和体系2的 荧光信号强度同时达到阈值，即可判定待测样品FecB基因为B+型(FecB突变 杂合型)。
图3为实施例1中样品PCR过程中的荧光信号变化图。体系2的荧光信号 强度先达到阈值，即可判定待测样品FecB基因为BB型(FecB突变纯合型)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实 验方法，若无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特 殊说明，均为常规生化试剂商处购得。实施例中，SYBR FAST qPCR Master Mix： 北京全式金生物技术有限公司；所用的绵羊基因组DNA样本来自滩羊的血液或 湖羊的血液；提取试剂盒：康为世纪血液基因组试剂盒进行基因组DNA提取试 剂盒。
实施例1引物设计
根据FecB基因的核苷酸序列，设计引物对1和引物对2，其中引物对1的下 游引物3’端和++型的基因位点相匹配，命名为++型引物；引物对2的下游引物的 3’端和BB型的基因位点相匹配，命名为BB型引物；两对引物的上游引物相同。
其中，BB型代表FecB基因的编码区第746位碱基发生A-G的突变(g.A746G)， 导致第249位氨基酸由谷氨酰胺转变为精氨酸(p.Q249R)；++型代表FecB基因 的编码区第746位碱基未发生改变，仍为A。
所述的BB型引物的下游引物序列为：5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’； ++型引物的下游引物序列为：5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’；BB型和++型 引物的共同上游引物序列为：5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’。
实施例2绵羊FecB基因多态性的qPCR检测
1、绵羊基因组DNA的提取
使用康为世纪血液基因组试剂盒进行待测绵羊血液基因组DNA的提取，具 体操作如下：
(1)取100-200μL待测绵羊血液加入2ml离心管中，继续添加500μl RCL 进行吹打混匀，10000rpm离心1min，弃上清，留下沉淀；继续添加500μl RCL， 振荡至彻底混匀，10000rpm离心1min，弃上清，直到留下白色沉淀为止。
(2)加入200μl BufferGR，同时添加20μLProteinase K，振荡至混匀，放在 56℃摇床，直至沉淀完全溶解。
(3)从摇床取出后短暂离心，加入200μL的Buffer GL，上下颠倒混匀，放 在65℃的水浴锅中10min，期间不断上下颠倒混匀。
(4)水浴锅中取出后短暂离心，加入200μL无水乙醇，上下颠倒混匀后， 进行短暂离心。
(5)将所得的溶液全部加入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃废液。
(6)向吸附柱中添加500μL的GW1缓冲液进行洗涤，12000rpm离心1min， 弃废液。
(7)向吸附柱中添加500μL的GW2缓冲液进行洗涤，12000rpm离心1min， 弃废液。
(8)12000rpm空离2min。
(9)把吸附柱放回新的1.5ml的离心管中，在室温下放置10min，彻底晾干 吸附柱。
(10)向吸附柱的中间部位悬空滴加50μL的超纯水(已灭菌)，室温静置 5min，10000rpm离心1min，收集溶液并涡旋离心。
(11)用核酸定量仪测定DNA浓度。
2、qPCR检测
将已知FecB基因型为++的滩羊基因组DNA分别在体系1和体系2中同时 进行qPCR扩增并采集荧光信号，监测每个样品在体系1和体系2中的荧光信号 强度变化。
其中体系1采用所述的++型引物，即引物对1(上游引物： 5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’)，体系2采用所述的BB型引物，即引物对2 (上游引物：5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’)。
qPCR反应的操作如下：取待测样品基因组DNA 1μl作为模板，加入2×SYBR FASTqPCR Master Mix 5μL，10μmol/L的上游引物0.3μL，10μmol/L下游引物 0.3μL，去离子水3.4μL，总体系为10μL进行qPCR扩增，扩增体系的反应程序 为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
随着qPCR反应的进行，体系1和体系2中反应产物不断累积，每扩增一次 收集一次荧光信号，荧光信号强度呈比例增加，根据体系1和体系2中荧光信号 达到阈值的先后顺序判定FecB的基因型。当体系1的荧光信号强度先达到阈值 时，即可判定待测样品FecB基因为++型(即FecB正常型)；当体系2的荧光信 号强度先达到阈值时，即可判定待测样品FecB基因为BB型(即FecB突变纯合 型)；当体系1和体系2的荧光信号同时达到阈值时，即可判定待测样品FecB 基因为B+型(即FecB突变杂合型)。
结果如图1所示，体系1(即++型引物)的荧光强度先达到阈值，说明待测 样品来自FecB基因型为++的绵羊，与实际情况相符。
实施例3绵羊FecB基因多态性的qPCR检测
1、绵羊基因组DNA的提取
具体操作同实施例2。
2、qPCR检测
将已知FecB基因型为B+的滩羊基因组DNA分别在体系1和体系2中同时 进行qPCR扩增并采集荧光信号，监测每个样品在体系1和体系2中的荧光信号 强度变化。
其中体系1采用所述的++型引物，即引物对1(上游引物： 5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’)，体系2采用所述的BB型引物，即引物对2 (上游引物：5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’)。
qPCR反应的操作如下：取待测样品基因组DNA 1μl作为模板，加入2×SYBR FASTqPCR Master Mix 5μL，10μmol/L的上游引物0.3μL，10μmol/L下游引物 0.3μL，去离子水3.4μL，总体系为10μL进行qPCR扩增，扩增体系的反应程序 为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
随着qPCR反应的进行，体系1和体系2中反应产物不断累积，每扩增一次 收集一次荧光信号，荧光信号强度呈比例增加，根据体系1和体系2中荧光信号 达到阈值的先后顺序判定FecB的基因型。当体系1的荧光信号强度先达到阈值 时，即可判定待测样品FecB基因为++型(即FecB正常型)；当体系2的荧光信 号强度先达到阈值时，即可判定待测样品FecB基因为BB型(即FecB突变纯合 型)；当体系1和体系2的荧光信号同时达到阈值时，即可判定待测样品FecB 基因为B+型(即FecB突变杂合型)。
结果如图2所示，体系1(即++型引物)和体系2(即BB型引物)的荧光 强度同时达到阈值，说明待测样品来自FecB基因型为B+的绵羊，与实际情况相 符。
实施例4绵羊FecB基因多态性的qPCR检测
1、绵羊基因组DNA的提取
具体操作同实施例2。
2、qPCR检测
将已知FecB基因型为BB型的滩羊基因组DNA分别在体系1和体系2中同 时进行qPCR扩增并采集荧光信号，监测每个样品在体系1和体系2中的荧光信 号强度变化。
其中体系1采用所述的++型引物，即引物对1(上游引物： 5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’)，体系2采用所述的BB型引物，即引物对2 (上游引物：5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’)。
qPCR反应的操作如下：取待测样品基因组DNA 1μl作为模板，加入2×SYBR FASTqPCR Master Mix 5μL，10μmol/L的上游引物0.3μL，10μmol/L下游引物 0.3μL，去离子水3.4μL，总体系为10μL进行qPCR扩增，扩增体系的反应程序 为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
随着qPCR反应的进行，体系1和体系2中反应产物不断累积，每扩增一次 收集一次荧光信号，荧光信号强度呈比例增加，根据体系1和体系2中荧光信号 达到阈值的先后顺序判定FecB的基因型。当体系1的荧光信号强度先达到阈值 时，即可判定待测样品FecB基因为++型(即FecB正常型)；当体系2的荧光信 号强度先达到阈值时，即可判定待测样品FecB基因为BB型(即FecB突变纯合 型)；当体系1和体系2的荧光信号同时达到阈值时，即可判定待测样品FecB 基因为B+型(即FecB突变杂合型)。
结果如图3所示，体系2(即BB型引物)的荧光强度先达到阈值，说明待 测样品来自FecB基因型为BB的绵羊，与实际情况相符。
实施例5本发明方法与PCR-Sanger测序法准确率的比较
1、绵羊基因组DNA的提取
具体操作同实施例2。
2、qPCR检测
将已知FecB基因型的85只滩羊基因组DNA作为待测样品分别在体系1和 体系2中同时进行qPCR扩增并采集荧光信号，监测每个样品在体系1和体系2 中的荧光信号强度变化。
其中体系1采用所述的++型引物，即引物对1(上游引物： 5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’)，体系2采用所述的BB型引物，即引物对2 (上游引物：5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物：5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’)。
qPCR反应的操作如下：取待测样品基因组DNA 1μl作为模板，加入2×SYBR FASTqPCR Master Mix 5μL，10μmol/L的上游引物0.3μL，10μmol/L下游引物 0.3μL，去离子水3.4μL，总体系为10μL进行qPCR扩增，扩增体系的反应程序 为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
随着qPCR反应的进行，体系1和体系2中反应产物不断累积，每扩增一次 收集一次荧光信号，荧光信号强度呈比例增加，根据体系1和体系2中荧光信号 达到阈值的先后顺序判定FecB的基因型。当体系1的荧光信号强度先达到阈值 时，即可判定待测样品FecB基因为++型(即FecB正常型)；当体系2的荧光信 号强度先达到阈值时，即可判定待测样品FecB基因为BB型(即FecB突变纯合 型)；当体系1和体系2的荧光信号同时达到阈值时，即可判定待测样品FecB 基因为B+型(即FecB突变杂合型)。
同时对已知FecB基因型的85只滩羊进行FecB基因扩增，并进行Sanger测 序。扩增所用的引物，F:AGGTCCAGAGGACGATAGCA；R: AGGAAACCCTGAACATCGCTAA。扩增体系为：取待测样品基因组DNA50ng 作为模板，加入KOD polymerase 0.5μL，Buffer 2.5μL，dNTPs 2.5μL，MgSO41.5μL， 10μmol/L的上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，总体系为10μL，其余用去离子水补齐，进行qPCR扩增。扩增程序：98℃预变性2min；98℃变性30sec， 60℃退火1min，40个循环。
qPCR法检测的结果如图1、2、3所示，在待测样品为++型时，体系1的荧 光强度先达到阈值；在待测样品为B+型时，体系1和体系2荧光强度同时达到 阈值；在待测样品为BB型时，体系2的荧光强度先达到阈值；PCR-Sanger测序 法检测的结果显示，在待测样品为++型时，目标位点测得的碱基为A；在待测样 品为B+型时，目标位点测得的碱基为A和G的套峰；在待测样品为BB型时， 目标位点测得的碱基为G。对85只已知基因型的个体通过两种方法检测后进行 检测准确率统计，如表1所示。qPCR法对BB型、B+型及++型的检测准确率均 为100％，PCR-Sanger测序法对BB型、B+型及++型的检测准确率分别为100％、 94.7％和100％，表明本发明提供的检测方法对三种基因型的准确率均为100％。
表1两种检测方法准确率的比较
Figure BDA0003037195890000101
实施例6绵羊FecB基因多态性的qPCR检测
1、绵羊基因组DNA的提取
具体操作同实施例2。
2、qPCR检测
将2039个待检测的湖羊基因组DNA和2916个待检测的滩羊DNA样品分别 在体系1和体系2中同时进行qPCR扩增并采集荧光信号，监测每个样品在体系 1和体系2中的荧光信号强度变化。
其中体系1采用所述的++型引物，即引物对1(上游引物： 5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’)，体系2采用所述的BB型引物，即引物对2 (上游引物：5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’；下游引物： 5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’)。
其中qPCR反应的操作如下：取待测样品基因组DNA 1μl作为模板，加入 2×SYBRFAST qPCRMasterMix 5μL，10μmol/L的上游引物0.3μL，10μmol/L下 游引物0.3μL，去离子水3.4μL，总体系为10μL进行qPCR扩增，扩增体系的反 应程序为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
随着qPCR反应的进行，体系1和体系2中反应产物不断累积，每扩增一次 收集一次荧光信号，荧光信号强度呈比例增加，根据体系1和体系2中荧光信号 达到阈值的先后顺序判定FecB的基因型。当体系1的荧光信号强度先达到阈值 时，即可判定待测样品FecB基因为++型(即FecB正常型)；当体系2的荧光信 号强度先达到阈值时，即可判定待测样品FecB基因为BB型(即FecB突变纯合 型)；当体系1和体系2的荧光信号同时达到阈值时，即可判定待测样品FecB 基因为B+型(即FecB突变杂合型)。
结果如表2所示，2039个湖羊样本FecB基因为BB型、B+型及++型的个体 分别为1555个、429个和55个，2916个滩羊样本FecB基因为BB型、B+型及 ++型的个体分别为20个，309个和2587个。表明本发明提供的方法简单、快速、 低成本的检测出绵羊FecB的基因型。
表2 qPCR法检测绵羊FecB基因型结果统计表
Figure BDA0003037195890000111
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本领域技术的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到的变化 或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检测绵羊FecB基因多态性的引物组，其特征在于，所述的引物组由引物对1和引物对2组成，其中，引物对1的下游引物3’端和++型的基因位点相匹配；引物对2的下游引物的3’端和BB型的基因位点相匹配；BB型代表FecB基因的编码区第746位碱基发生A-G的突变(g.A746G)，导致第249位氨基酸由谷氨酰胺转变为精氨酸(p.Q249R)；++型代表FecB基因的编码区第746位碱基未发生改变，仍为A；
所述引物对的核苷酸序列如下：
引物对1：
上游引物:5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’
下游引物:5’-TGCCTCATCAACACCGTCt-3’
引物对2：
上游引物:5’-ATTGGAAAAGGTCGCTATGGG-3’
下游引物:5’-TGCCTCATCAACACCGTCc-3’。
2.含有权利要求1所述引物组的用于检测绵羊FecB基因多态性的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括荧光染料。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的荧光染料为SYBR Green I荧光染料。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+以及PCR反应缓冲液中的一种或多种。
6.一种利用qPCR技术检测绵羊FecB基因多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测绵羊的基因组DNA；
2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，分别进行两个体系的qPCR扩增，体系1采用权利要求1中所述的引物对1，体系2采用权利要求1中所述的引物对2，扩增后待测样品在体系1和体系2中分别产生一个荧光信号强度变化曲线；
3)根据体系1和体系2中检测到的荧光阈值出现的顺序辨别出待测样品的FecB基因型，当体系1先达到荧光阈值时，即可判定待测样品的FecB基因型为++型；当体系2先达到荧光阈值时，即可判定待测样品的FecB基因型为BB型；当体系1和体系2的荧光信号同时达到阈值时，即可判定待测样品的FecB基因型为B+型。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以10μl计为：5-1000ng/μL基因组DNA 1μL，2×SYBR FAST qPCR Master Mix 5μL，10μmol/L上游引物0.3μL，10μmol/L下游引物0.3μL，去离子水3.4μL，总体系为10μL。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中实时荧光定量PCR反应的扩增程序为：95℃预变性10min；95℃变性30sec，60℃退火1min，40个循环。
9.权利要求1所述的引物组在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
10.权利要求2-5任一项所述的试剂盒在绵羊分子标记辅助育种中的应用。
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