CN110305947B - 染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法,涉及生物技术领域,该检测方法包括通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型,通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型,对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读,判断待测样品是否有染色体长片段插入。本发明通过增设第二检测单元,并结合第一检测单元和第二检测单元的鉴别结果对染色体长片段插入进行检测,能够对长片段插入进行有效的检测,并且有效减少假阴性结果,同时还能够有效减少假阳性结果。此外,采用本发明提供的染色体长片段插入的检测方法,还具有拓宽待测样本类型的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其是涉及一种染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法。
背景技术
染色体较长片段的插入与疾病的发生和药物代谢差异有相关性。当靶序列中有较长片段的插入时,由于竞争或PCR偏好性等原因,在同一体系内实现共扩增时,含插入序列的较长片段(突变型)扩增效率低于不含插入序列的较短片段(野生型)。当样本类型为杂合子时,因2条链扩增效率差异不同,会导致杂合子不能检出含插入序列的较长片段误报为纯合野生型,出现假阴性。插入序列越长,模板DNA片段化越严重(如口腔脱落细胞片段化程高于外周血),杂合子假阴性倾向越明显。分别检测野生型(无插入)和突变型(有插入),特别是不检测插入序列全长而只检测其中一小段序列时,常因本底波动或样本间交叉污染出现假阳性,使得纯合野生型被误报为杂合子。样本检测量越多,插入序列检测片段越短,假阳性倾向越明显。应用广泛的NGS在长片段插入检测上也有明显短板:NGS单端测序有效片段长度为150bp,双端测序有效片段长度为300bp,均不能涵盖长片段插入。
染色体长片段插入常用的检测方法包括PCR-直接测序法、基因扩增- 单链构象多态分析(PCR-SSCP)、荧光定量PCR法、Gap PCR-电泳等多种方法,每种方法技术原理及优缺点见下:
1、PCR-直接测序法:也称PCR-Sanger测序,将引物设计在插入序列两侧翼,一对引物实现对插入/非插入链同时扩增,通过毛细管电泳分离这些片段后读取待测核酸的碱基序列。但毛细管电泳受毛吸管长度影响,每次测序长度不宜超过1kb;对于长片段插入需要进行拼接测序,对样本消耗大,且操作繁琐,判读复杂。
2、PCR-SSCP:设计一对引物,发生插入时,靶序列构象发生变化,引起泳动变位,通过显色或显影后在凝胶上就会显示出带型的差别。优点是对DNA原始材料纯度要求不高且所需量较少,实验操作简便;缺点是假阴性比例高,对于大于300bp的DNA片段,随着DNA片段长度的增加,检测的敏感性逐渐降低,多用于定性。
3、荧光定量PCR法:分别针对插入/非插入设计不同荧光标记的2条探针和2套PCR引物。杂合子易出现假阴性判读为纯合子,纯合子又易因为样本污染或本底波动出现假阳性判读为杂合子。
4、Gap PCR-电泳:将引物设计在插入序列两侧翼,一对引物实现对插入/非插入链同时扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析,根据PCR 产物大小进行判读。该方法属于定性检测,操作简单成本低,但通量和准确性都较低。
综上所述,现有的技术都存在一定的缺陷,亟需一种快速、有效、易操作、成本低的提高长片段插入检测准确性的方法。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种染色体长片段插入的检测方法,以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供上述检测方法在检测药物代谢中的应用。
本发明提供了一种染色体长片段插入的检测方法,所述检测方法包括:
通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型,通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型,对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读,判断待测样品是否有染色体长片段插入;
当第一检测单元显示为野生型且第二检测单元显示不为突变型时,所述待测样品为纯合野生型;
当第一检测单元显示为突变型且第二检测单元显示为突变型时,所述待测样品为纯合突变型;
当第一检测单元显示为野生型和突变型且第二检测单元显示为突变型时,所述待测样品为杂合型。
进一步地,所述染色体长片段的片段长度大于150bp,优选大于300bp。
进一步地,应用MassARRAY分别对所述第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别,判断待测样品是否有染色体长片段插入:
当第一检测单元仅野生峰出峰且第二检测单元不出峰时,所述待测样品为纯合野生型;
当第一检测单元仅突变峰出峰且第二检测单元出峰时,所述待测样品为纯合突变型;
当第一检测单元野生峰和突变峰同时出峰且第二检测单元出峰时,所述待测样品为杂合型。
进一步地,当第一检测单元野生峰和突变峰同时出峰且第二检测单元出峰,并且所述第二检测单元峰信噪比:第一检测单元野生峰信噪比为0.5-2 时,所述待测样品为杂合型。
进一步地,在应用MassARRAY对第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别前,进行如下步骤中的至少一种:
(a)对所述第一检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,或,
(b)对所述第二检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应。
进一步地,所述第一检测单元包括野生型鉴别引物和突变型鉴别引物;
优选地,所述野生型鉴别引物包括野生型正向引物和野生型反向引物,所述突变型鉴别引物包括突变型正向引物和突变型反向引物;
优选地,所述野生型正向引物和所述突变型正向引物序列相同;
优选地,所述第一检测单元包括共享正向引物、野生型反向引物和突变型反向引物。
进一步地,所述第二检测单元包括突变型鉴别引物;
优选地,所述突变型鉴别引物包括突变型正向引物和突变型反向引物。
进一步地,所述第一检测单元和第二检测单元的突变型鉴别引物相同,单碱基延伸引物也相同。
进一步地,所述PCR扩增的退火温度为55-60℃,优选为56℃。
进一步地,步骤(a)或步骤(b)还独立地包括在单碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤;
优选地,步骤(a)或步骤(b)还独立地包括在单碱基延伸反应后对所述反应产物进行纯化的步骤,然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。
在一些实施方式中,所述染色体插入检测是针对ACE基因的插入检测,所述野生型和突变型引入如表1所示,单碱基延伸引物如表2所示。
另外,本发明还提供了一种基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法,采用多重PCR联合质谱检测,通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型,通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型。
进一步的,所述第一检测单元和第二检测单元与上述相同。
本发明的有益技术效果:
本发明提供的染色体长片段插入的检测方法,包括通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型,通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型,对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读,判断待测样品是否有染色体长片段插入。本发明通过增设第二检测单元,并结合第一检测单元和第二检测单元的鉴别结果对染色体长片段插入进行检测,相比于现有的检测方法,能够对长片段插入进行有效的检测,并且有效减少假阴性结果,尤其能够改善片段化程度高、质量差的杂合子样本的检测正确率,同时,还能够有效减少假阳性结果,特别是能够提高大量样本检测时纯合野生型样本正确率。此外,采用本发明提供的染色体长片段插入的检测方法,还具有拓宽待测样本类型的特点,使用外周血(有创)采样或口咽(无创)采样等均可实现检测,待测样品消耗小,且均能够保证检测结果的准确性。本发明提供的检测方法还具有操作简单,易于判读的优点。
本发明基于MassARRAY检测可在一孔内实现20-30重检测,通量高。且不需要生信分析,简化实验流程,降低实验成本;同时检测片段长度不受插入片段长度影响,只与单碱基延伸引物长度相关;此外,由于质谱分析对质量的灵敏度特别高,因此该技术能够有效将仅有一个不同碱基的两段基因序列区别开,进而能够准确鉴定野生型和/或突变型,检测限低、灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1A为本发明实施例1提供的退火温度60℃口咽样本杂合子孔二峰图;
图1B为本发明实施例1提供的退火温度56℃口咽样本杂合子孔二峰图;
图2A为本发明实施例1提供的外周血纯合野生型孔一出峰结果图;
图2B为本发明实施例1提供的外周血纯合野生型孔二出峰结果图;
图3A为本发明实施例1提供的外周血纯合突变型孔一出峰结果图;
图3B为本发明实施例1提供的外周血纯合突变型孔二出峰结果图;
图4A为本发明实施例1提供的外周血杂合子孔一出峰结果图;
图4B为本发明实施例1提供的外周血杂合子孔二出峰结果图;
图5A为本发明实施例1提供的口咽拭子纯合野生型孔一出峰结果图;
图5B为本发明实施例1提供的口咽拭子纯合野生型孔二出峰结果图;
图6A为本发明实施例1提供的口咽拭子纯合突变型孔一出峰结果图;
图6B为本发明实施例1提供的口咽拭子纯合突变型孔二出峰结果图;
图7A为本发明实施例1提供的口咽拭子杂合子孔一出峰结果图;
图7B为本发明实施例1提供的口咽拭子杂合子孔二出峰结果图;
图8A为本发明对比例1提供的外周血样本检测聚类图;
图8B为本发明对比例1提供的外周血杂合子样本检测峰图;
图9A为本发明对比例1提供的口咽拭子样本检测聚类图;
图9B为本发明对比例1提供的口咽拭子杂合子样本检测峰图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
除非本文另有定义,连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰,然而,在任何潜在不明确性的情况下,本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中,除非另有说明,“或”的使用意味着“和/或”。此外,术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地,连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明,本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知,且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行,所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
为了解决现有的染色体长片段插入的检测方法存在的操作繁琐,判读复杂,易出现假阴性或假阳性导致检测结果不准确等技术问题,本发明提供了一种染色体长片段插入的检测方法,所述检测方法包括:
通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型,通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型,对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读,判断待测样品是否有染色体长片段插入:
当第一检测单元显示为野生型且第二检测单元显示不为突变型时,所述待测样品为纯合野生型;
当第一检测单元显示为突变型且第二检测单元显示为突变型时,所述待测样品为纯合突变型;
当第一检测单元显示为野生型和突变型且第二检测单元显示为突变型时,所述待测样品为杂合型。
本发明通过增设第二检测单元,并结合第一检测单元和第二检测单元的鉴别结果对染色体长片段插入进行检测,相比于现有的检测方法,能够对长片段插入进行有效的检测,并且有效减少假阴性结果,尤其能够改善片段化程度高、质量差的杂合子样本的检测正确率,同时,还能够有效减少假阳性结果,特别是能够提高大量样本检测时纯合野生型样本正确率。此外,采用本发明提供的染色体长片段插入的检测方法,还具有拓宽待测样本类型的特点,使用外周血(有创)采样或口咽(无创)采样等均可实现检测,待测样品消耗小,且均能够保证检测结果的准确性。本发明提供的检测方法还具有操作简单,易于判读的优点。
可以理解的是,通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/ 或突变型,指的是第一检测单元对待测样品的鉴别结果可以为野生型或者突变型,也可以既为野生型又为突变型。
需要说明的是,在本发明中,对第一检测单元中待测样品的鉴别和对第二检测单元中待测样品的鉴别可以使用相同的方法,也可以使用不同的方法,凡是能够有效鉴别是否为野生型和/或突变型即可。优选使用相同的方法,使用相同的方法进行鉴别,能够有效减少鉴别过程中产生的变量,提高检测结果准确性。
本发明中的“第一检测单元”和“第二检测单元”并不具有特定的单元结构或单元组成,凡是能够实现同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型的单元均可作为本发明中的第一检测单元,凡是能够实现鉴别待测样品是否为突变型的单元均可作为本发明中的第二检测单元,典型的第一检测单元和第二检测单元为孔板中独立的检测孔。
本发明中的“野生型”指的是不含插入染色体长片段的较短片段。
本发明中的“突变型”指的是含插入染色体长片段的较长片段。
除上述鉴别结果外,典型的还包括如下异常鉴别结果:
当第一检测单元显示为野生型且第二检测单元显示为突变型时,所述检测结果为杂合子假阴性或纯合子的假阳性;
当第一检测单元显示为野生型和突变型且第二检测单元显示不为突变型时,所述检测结果为纯合子的假阳性;
当第一检测单元显示不为野生型和不为突变型且第二检测单元显示为突变型时,所述检测结果为杂合子假阴性。
当应用本发明提供的检测方法检测得到上述异常鉴别结果时,均不能判断待测样品是否有染色体长片段插入,需要重新检测。
在一些优选的实施方式中,所述染色体长片段的片段长度大于150bp,优选大于300bp。
应用本发明提供的检测方法能够对长度大于150bp的染色体长片段进行准确的检测,当染色体长片段的长度大于300bp时,同样能够得到准确、有效的检测结果。
在一些优选的实施方式中,应用MassARRAY分别对所述第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别,判断待测样品是否有染色体长片段插入:
当第一检测单元仅野生峰出峰且第二检测单元不出峰时,所述待测样品为纯合野生型;
当第一检测单元仅突变峰出峰且第二检测单元出峰时,所述待测样品为纯合突变型;
当第一检测单元野生峰和突变峰同时出峰且第二检测单元出峰时,所述待测样品为杂合型。
MassARRAY技术为基于MALDT-TOF飞行时间质谱技术而得到的基因分析技术。一代测序(Sanger测序)测序通量较低,由于采用毛吸管电泳分离技术,测序读长受限于毛吸管长度,通常在700bp以下,不超过 1000bp;二代测序(NGS)测序通量高,通常采用扩增子测序或探针捕获法,这两种方法读长均不超过300bp,且需探针设计及后期生信分析,过程复杂,费用较高。与上述两种方法相比,MassARRAY技术在SNP分型上有较明显优势:第一,基于多重PCR技术,可在一孔内实现20-30重检测,通量介于Sanger测序和NGS间;第二,探针无需标计荧光且不需要生信分析,简化实验流程,降低实验成本;第三,依赖单碱基延伸技术,MassARRAY 检测片段长度不受插入片段长度影响,只与单碱基延伸引物长度相关。此外,由于质谱分析对质量的灵敏度特别高,因此该技术能够有效将仅有一个不同碱基的两段基因序列区别开,进而能够准确鉴定野生型和/或突变型,检测限低、灵敏度高。
通过MassARRAY技术对第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别,对出峰情况及聚类情况进行分析,以出峰明显且聚类清晰为位点检测成功指标;如不成功,重新设计引物并重复上述流程。
需要说明的是,本发明中的“野生峰”指的是应用MassARRAY进行检测鉴定结果显示为野生型;
本发明中的“突变峰”指的是应用MassARRAY进行检测鉴定结果显示为突变型。
在一些优选的实施方式中,当第一检测单元野生峰和突变峰同时出峰且第二检测单元出峰,并且所述第二检测单元峰信噪比:第一检测单元野生峰信噪比为0.5-2时,所述待测样品为杂合型。信噪比区域设定提高了检测准确性。人源胚系DNA为二倍体,理论上杂合子出峰应等高,信噪比为1。考虑到实验过程中扩增差异、检测差异等,基于经验将比值上下调动至 0.5-2范围。如超出此范围,证实较低出峰并非是杂合子出峰,可能是纯合子样本受到污染或引物非特异扩增,结果不予采信。
其中,第一检测单元野生峰信噪比例如可以为,但不限于0.5、0.8、1、 1.2、1.5、1.8或2。
需要说明的是,“信噪比”SNR或S/N(SIGNAL-NOISE RATIO),又称为讯噪比,是指一个电子设备或者电子系统中信号与噪声的比例,在本发明中信噪比指的是MassARRAY系统中信号与噪声的比例。
“第二检测单元峰信噪比”指的是第二检测单元检测出峰(突变峰) 的信噪比。
“第一检测单元野生峰信噪比”指的是第一检测单元检测出的野生峰和突变峰中野生峰的信噪比。
在一些优选的实施方式中,在应用MassARRAY对第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别前,进行如下步骤中的至少一种:
(a)对所述第一检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,或,
(b)对所述第二检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应。
可以理解的是,在应用MassARRAY对第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别前,可以对所述第一检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,或者对所述第二检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,或者对所述第一检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应并且对所述第二检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应。优选对第一检测单元的待测样品的基因组和第二检测单元的待测样品的基因组均进行PCR扩增和单碱基延伸反应。
在一些优选的实施方式中,所述第一检测单元包括野生型鉴别引物和突变型鉴别引物。
当待测样品为纯合野生型时,野生型鉴别引物能够有效扩增该样品序列,并在后续检测中得到野生峰;当待测样品为纯合突变型时,突变型鉴别引物能够有效扩增该样品序列,并在后续检测中得到突变峰;当待测样品为杂合型时,野生型鉴别引物和突变型鉴别引物均能够有效扩增该样品序列,并在后续检测中同时得到野生峰和突变峰。
优选地,所述野生型鉴别引物包括野生型正向引物和野生型反向引物,所述突变型鉴别引物包括突变型正向引物和突变型反向引物;
优选地,所述野生型正向引物和所述突变型正向引物序列相同。
当野生型正向引物和突变型正向引物序列相同时,野生型反向引物和突变型反向引物均可与其搭配使用,因此,在一个优选的实施方式中,所述第一检测单元包括共享正向引物、野生型反向引物和突变型反向引物。共享正向引物确保在体系中简化扩增产物:
1、野生型纯合子:仅1种扩增产物,为正向引物与野生型反向引物扩增产物1;
2、突变型纯合子:2种扩增产物,较短片段为正向引物与突变型反向引物扩增产物,较长片段为正向引物与野生型反向引物扩增产物2。
3、杂合子:3种扩增产物,插入链扩增情况同突变型纯合子,非插入链扩增情况同野生型纯合子。插入链正向引物与野生型反向引物扩增产物2 长于非插入链正向引物与野生型反向引物扩增产物1,但二者单碱基延伸产物相同。
如分别设计野生型正向引物与突变型正向引物,则扩增产物分布如下:
1、野生型纯合子:仅1种扩增产物,为野生型正向引物与野生型反向引物扩增产物1;
2、突变型纯合子:4种扩增产物,分别为野生型正向引物与野生型反向引物扩增产物2、野生型正向引物与突变型反向引物扩增产物、突变型正向引物与野生型反向引物扩增产物、突变型正向引物与突变型反向引物扩增产物;
3、杂合子:5种扩增产物,插入链扩增情况同突变型纯合子,非插入链扩增情况同野生型纯合子。插入链正向引物与野生型反向引物扩增产物2 长于非插入链正向引物与野生型反向引物扩增产物1,但二者单碱基延伸产物相同;野生型正向引物与突变型反向引物扩增产物长于突变型正向引物与突变型反向引物扩增产物,但二者单碱基延伸产物相同。
综上,为简化体系,本申请设计了共享正向引物。
在一些优选的实施方式中,所述第二检测单元包括突变型鉴别引物。
当待测样品为纯合突变型或杂合型时,突变型鉴别引物均能够有效扩增该样品序列,并在后续检测中得到突变峰;当待测样品为纯合野生型时,突变型鉴别引物不能扩增出该样品序列,在后续检测中不出峰。
优选地,所述突变型鉴别引物包括突变型正向引物和突变型反向引物。
在一些优选的实施方式中,所述PCR反应的退火温度为55-60℃,例如可以为,但不限于55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃。
当退火温度为55-60℃时,各种类待测样品,例如外周血或口咽样本等,均能够有效出峰。
优选地,所述PCR反应的退火温度为56℃。
当退火温度为56℃时,各种类待测样品的出峰率均有显著提升,出峰成功率能够达到95%。
在一些优选的实施方式中,步骤(a)或步骤(b)还独立地包括在单碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤。
通过对PCR产物进行去磷酸化,能够防止DNA片段自身连接,提高 PCR产物的利用率,提升检测结果的准确性。
具体地,使用虾碱性磷酸酶对PCR产物进行去磷酸化。
优选地,步骤(a)或步骤(b)还独立地包括在单碱基延伸反应后对所述反应产物进行纯化的步骤,然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。具体地,可使用树脂盐脱的方式对反应产物进行纯化。
根据本发明的第二方面,还提供了上述的染色体长片段插入的检测方法在检测药物代谢中的应用。
染色体较长片段的插入与药物代谢差异有较大的相关性,应用本发明提供的检测方法检测药物代谢,能够有效提高检测结果的准确率,同时兼具操作简单,易于判读的优点。
需要说明的是,本发明中提供的在检测药物代谢中的应用,为非疾病的诊断与治疗目的。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明,但是,应当理解为,这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用,而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下:
实施例1
下面以ACE基因rs4646994为例,rs4646994-F为共享正向引物, rs4646994-R1为野生型反向引物,rs4646994-R2为插入型反向引物;野生型和插入型单碱基延伸引物相同。
表1 PCR引物序列
PCR_ID | PCR_SEQ |
rs4646994-F | ACGTTGGACTGGAGACCACTCCCATCCTTT |
rs4646994-R1 | ACGTTGATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT |
rs4646994-R2 | ACGTTGATTGAGACCATCCCGGCTAAAACG |
表2 单碱基延伸引物序列
SNP_ID | UEP_SEQ |
rs4646994 | GACCTGCTGCCTATACAGTCACTTTT |
1、gDNA提取:初始外周血投入量200μl,使用QIAamp DNA Mini Kit 提取,50μl TB洗脱;
口咽采样器一支,口腔内刮拭40次,使用Hi-Swab DNA Kit提取,50 μl TB洗脱;
2、PCR流程
(1)样本稀释至10ng/μl;
(2)按下表配制PCR反应体系(以下为单个样本量);
表3 PCR反应体系
(3)封膜,vortex混匀30秒,500g离心1分钟;
(4)退火温度
当PCR反应退火温度设为60℃时,口咽样本有约10%比例孔二出峰较低;经反复实验,当PCR反应退火温度降低至56℃时,口咽样本孔二出峰成功率均接近95%(见图1A和1B),此时外周血样本成功率与60℃时变化不大,仍在95%以上。因此,将退火温度设定为56℃。
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环:
3、SAP流程
(1)取出PCR板,500g离心3分钟;
(2)按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量);
表4 SAP反应体系
(3)每孔加2μl SAP混液;
(4)封膜,vortex混匀30秒,500g离心1分钟;
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环:
温度(℃) | 时间 |
37 | 40min |
85 | 5min |
4 | 保温 |
4、EXT(单碱基延伸)流程
(1)取出PCR板,500g离心3分钟;
(2)按下表配制EXT反应体系(以下为单个样本量);
表5 EXT反应体系
试剂 | W1[μl] | W2[μl] |
Nanopure water | 0.62 | 0.62 |
iPLEX Buffer | 0.2 | 0.2 |
iPLEX Termination mix | 0.2 | 0.2 |
Extend Primer Mix | 0.94 | 0.94 |
iPLEX Enzyme | 0.04 | 0.04 |
总体积[μL] | 2.00 | 2.00 |
(3)加入2μl iPLEX延伸混液;
(4)封膜,vortex混匀30秒,500g离心1分钟;
(5)将板放上PCR仪进行以下热循环:
5、树脂脱盐
(1)取出PCR板,500g离心3分钟;
(2)把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上,风干最少10 分钟;
(3)样本板每一个有样本的孔里加入16μl水;
(4)封板,vortex 10秒,500g离心1分钟;
(5)轻轻将样本板凌空反转,放在已放树脂的dimple plate上,然后将dimpleplate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动),让树脂掉到孔里;
(6)取下dimple plate,样本板封板,旋转器上颠倒摇匀15分钟;
(7)2000g离心5分钟。
6、Dispensing点样
7、使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据,外周血纯合野生型、纯合插入型及杂合子出峰图分别见图2A、2B、图3A、3B和图4A、4B;口咽拭子样本纯合野生型、纯合插入型及杂合子出峰图分别见图5A、5B、图6A、6B和图7A、7B。
从上述结果图中可以看出纯合野生型在孔二不出峰,纯合插入型出峰同孔一,杂合子孔二插入型出峰明显增高。说明增设孔二后,纯合野生型和纯合插入型判读不受影响,杂合子假阴性明显降低。
对比例1
以ACE基因rs4646994为例,rs4646994-F为共享正向引物, rs4646994-R1为野生型反向引物,rs4646994-R2为插入型反向引物;野生型和插入型单碱基延伸引物相同。仅使用单孔进行检测,应用与实施例1 相同的处理方法,并使用相同的MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据,检测结果如图8A、8B和图9A、9B所示,其中方块表示杂合子样本,正向三角表示纯合野生型(无插入),反向三角表示纯合突变型(有插入)。
从上述结果图中可以看出仅设一孔检测时,杂合子中插入峰出峰较低,但聚类与野生纯合子和突变纯合子可区分;增设孔二后,杂合子插入峰明显升高。说明增设孔二后,可明显改善杂合子中插入峰出峰情况,减少假阴性;此外,依赖孔一聚类情况,可排除孔二的假阳性。
由上述实施例和对比例的检测结果可知,仅在一个孔内同时扩增野生型和插入型时,杂合子的插入型扩增拷贝数低于野生型,易出现假阴性;且DNA片段程度越高,假阴性趋势越明显,同一人口咽拭子来源DNA杂合子假阴性趋势较外周血来源DNA杂合子假阴性趋势明显。而增设孔二进行检测,同时合并两孔结果判读,结果证实,纯合野生型在第二孔不出峰,纯合插入型出峰同孔一,杂合子孔二插入型出峰明显增高。说明增设孔二后,纯合野生型和纯合插入型判读不受影响,杂合子假阴性明显降低。
实验例
本实验例主要验证应用本发明通过的双孔检测的方法的准确性、特异性、灵敏度及精密度。
本实验例准确性验证方案:各位点检测20例,与Sanger测序比较,预期目标95%。
本实验例特异性验证方案:包含在准确性中,预期目标95%。
本实验例灵敏度验证方案:包含在准确性中,预期目标95%。
本实验例精密度验证方案(含批内、批间、人员比对,不涉及仪器间比对)如下表6所示:
批内精密度:每一例样本同一批次重复3次,比较批内精密度;
批间精密度:同一操作者分多批次检验相同样本,比较批间精密度;
人员间比对:2位操作者检测相同样本,比较人员间结果的差异;
试剂间比对:不同配比批次引物mix检测相同样本,比较试剂批次间差异。
表6 精密度验证方案设计
各位点准确性(包含灵敏度及特异性)及精密度验证结果如表7所示:
表7 准确性、灵敏度、特异性验证结果
SNP_ID | 准确性 | 灵敏度 | 特异性 | 批内精密度 | 批间精密度 | 人员对比 | 试剂对比 |
rs4646994 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (5)
1.一种染色体长片段插入的检测方法,其特征在于,应用MassARRAY分别对第一检测单元的待测样品和第二检测单元的待测样品进行鉴别,判断待测样品是否有染色体长片段插入,所述检测方法包括:
通过第一检测单元同时鉴别待测样品是否为野生型和/或突变型,通过第二检测单元鉴别待测样品是否为突变型,对第一检测单元的鉴别结果和第二检测单元的鉴别结果进行判读,判断待测样品是否有染色体长片段插入:
当第一检测单元仅野生峰出峰且第二检测单元不出峰时,所述待测样品为纯合野生型;
当第一检测单元仅突变峰出峰且第二检测单元出峰时,所述待测样品为纯合突变型;
当第一检测单元野生峰和突变峰同时出峰且第二检测单元出峰,并且第二检测单元峰信噪比:第一检测单元野生峰信噪比为0.5-2时,所述待测样品为杂合型;
其中,
所述第一检测单元包括野生型鉴别引物和突变型鉴别引物;
所述野生型鉴别引物包括野生型正向引物和野生型反向引物,所述突变型鉴别引物包括突变型正向引物和突变型反向引物;
所述野生型正向引物和所述突变型正向引物序列相同;
所述第二检测单元包括突变型鉴别引物;
所述突变型鉴别引物包括突变型正向引物和突变型反向引物;
所述染色体长片段的片段长度大于150bp。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述染色体长片段的片段长度大于300bp。
3.根据权利要求1或2所述的检测方法,其特征在于,在应用MassARRAY对第一检测单元的待测样品和所述第二检测单元的待测样品进行鉴别前,进行如下步骤中的至少一种:
(a)对所述第一检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,或,
(b)对所述第二检测单元的待测样品的基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其特征在于,所述第一检测单元和第二检测单元的突变型鉴别引物相同,单碱基延伸引物也相同。
5.根据权利要求4所述的检测方法,其特征在于,所述PCR扩增的退火温度为55-60℃;
步骤(a)或步骤(b)还独立地包括在单碱基延伸反应前对PCR产物进行去磷酸化的步骤;
步骤(a)或步骤(b)还独立地包括在单碱基延伸反应后对反应产物进行纯化的步骤,然后再应用MassARRAY检测所述反应产物。
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