CN115948531A - 一种检测非缺失型地贫的引物组、方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测非缺失型地贫的引物组,所述引物组序列包括如Seq_ID NO.1‑22所示多重扩增引物序列和如Seq_ID NO.23‑46所示延伸引物序列;所述多重扩增引物序列分成2组,第一组扩增引物序列包括Seq_ID NO.1‑12,19‑20,第二组扩增引物序列包括Seq_ID NO.3‑6,11‑22;所述延伸引物组序列分成2组,第一组延伸引物组序列包括Seq_ID NO.23‑34,第二组延伸引物组序列包括Seq_ID NO.35‑46。本发明更符合我国的人群特点,克服了现有技术中一次性检测SNP位点较少的缺陷,具有准确性强、灵敏度高、重复性好以及成本低、检测周期短的特点,有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域,具体涉及一种基于MassArray核酸质谱技术检测非缺失型地贫的引物组、方法及其应用。
背景技术
地中海贫血(Thalassaemia),简称地贫,是遗传性溶血性贫血,是由于基因缺陷致使血红蛋白中一种或几种珠蛋白链合成缺失或不足而导致的贫血或病理状态;是世界上最常见的单基因遗传病之一,主要分布在包括我国南方在内的世界上热带和亚热带疟疾高发地区。据世界卫生组织(WHO)估计,全球约3.5亿人是地贫基因携带者,每年出生的重症地贫患儿约6万例,其中α-地贫、β-地贫是最常见的地贫类型。
α-地贫是由于α珠蛋白表达减少或完全缺失导致的突变类型;其编码基因α珠蛋白基因簇定位于16号染色体16p13.3;属于世界范围内高发的单基因遗传病,其致病携带率约占世界人口的5%;中国人群中主要发生于长江以南地区。
β-地贫是一种常染色体隐性遗传病,主要由β珠蛋白基因HBB缺陷所致,该基因位于11号染色体末端11p15.3位点,其发病机制由于β球蛋白肽链合成减少或缺如,使RBC的主要结构蛋白-Hb生成障碍,导致无效造血和RBC破坏而产生溶血性贫血。在我国的广西、广东及海南省三个地区发病率最高,其人群中的基因携带率为2%-30%,其中重型β-地中海贫血的发生率达0.4%。
α-地贫和β-地贫目前都存在无法完全治愈或者需要高昂的治疗费用,并不适用所有人群;因此α-地贫和β-地贫作为中国人群中常见的遗传病,筛查仍然是预防或评估患病风险的重要途径。
目前通用的检测方法很多,如MLPA、NGS、微阵列芯片等,存在成本较高,操作技术要求高,检测周期较长等局限性;中国专利(公开号CN110577990 B)公开了一种检测地贫基因突变的试剂盒,采用了MALDI-TOF飞行质谱平台,但是检测位点有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以一次性快速、准确、高通量检测地中海贫血症状,该方法更全面地检测地中海贫血点突变组合,更符合中国人群特点。
因此本发明的目的之一在于提供一种引物组。
本发明的另一目的在于提供一种上述引物组检测非缺失型地贫的方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述引物组在制备检测非缺失型地贫产品中的应用。
为了实现本发明的目的,拟采用以下技术方案:
基于MassArray核酸质谱技术检测非缺失型地贫的引物组,所述引物组序列包括如Seq_ID NO.1-22所示多重扩增引物序列和如Seq_ID NO.23-46所示延伸引物序列;所述多重扩增引物序列分成2组,第一组扩增引物序列包括Seq_ID NO.1-12,19-20,第二组扩增引物序列包括Seq_ID NO.3-6,11-22;所述延伸引物组序列分成2组,第一组延伸引物组序列包括Seq_ID NO.23-34,第二组延伸引物组序列包括Seq_ID NO.35-46。
基于MassArray核酸质谱技术检测非缺失型地贫的方法,应用上述的用于检测非缺失型地贫引物组对待测对象基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,再应用MassARRAY平台对反应产物进行筛查,确定所述待测对象基因组中SNP位点的基因型。
本发明还提供一种上述的引物组在制备筛查非缺失型地贫产品中的应用。
本发明还提供一种上述的引物组在核酸质谱检测中的应用。
本发明还提供一种用于非缺失型地贫筛查的组合物/产品/试剂盒,所述组合物/产品/试剂盒包括上述的引物组。
与现有技术相比,本发明提供的非缺失型地贫SNP位点的引物组,能够实现对点突变和小片段缺失/插入突变样本进行准确的分型。
本发明提供的SNP位点引物组,覆盖α-地贫常见的3个点突变HBA2:c.369C>G(WS)、c.377T>C(QS)、c.427T>C(CS);β-地贫的21个包括点突变和小片段缺失突变位点HBB:c.-140C>T、c.-82C>A、c.-80T>C、c.-79A>G、c.-78A>G、c.-50A>C、c.-11_-8de1AAAC、c.2T>G、c.45_46insG、c.52A>T、c.79G>A、c.84_85insC、c.92+1G>T、c.92+5G>C、c.94delC、c.113G>A、c.114G>A、c.126_129delCTTT、c.130G>T、c.216_217insA、c.316-197C>T,更符合我国的人群特点,克服了现有技术中一次性检测SNP位点较少的缺陷,且成本低廉,检测周期短,适用于广泛推广;本发明所需样本的适应性强,对外周血和干血片均能较好的检出。
本发明提供的用于为非缺失型地贫疾病筛查的方法,能够对上述突变位点实现特异性检测,具有准确性强、灵敏度高、重复性好以及成本低、检测周期短且结果直观无需生信介入等优势。
本发明适用于婴幼儿以及需要生育者,可以帮助有疑似家族史的受检者筛查致病位点,评估致病效力,辅助再生殖;高风险携带者可及早采取针对性措施,提升治疗效果,降低新生儿患病风险,为非缺失型地贫的防治提供有效的科学依据。
附图说明
图1为HBA2:c.427T>C聚类分析图;
图2为HBB:c.316-197C>T聚类分析图;
图3为HBB:c.2T>G聚类分析图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例:针对非缺失型地贫的HBA2和HBB基因的引物组
本实施例非长片段缺失型地贫对应的SNP位点包括HBA2:c.369C>G(WS)、c.377T>C(QS)、c.427T>C(CS)3个位点;HBB:c.-140C>T、c.-82C>A、c.-80T>C、c.-79A>G、c.-78A>G、c.-50A>C、c.-11_-8de1AAAC、c.2T>G、c.45_46insG、c.52A>T、c.79G>A、c.84_85insC、c.92+1G>T、c.92+5G>C、c.94delC、c.113G>A、c.114G>A、c.126_129delCTTT、c.130G>T、c.216_217insA、c.316-197C>T 21个位点;
所述扩增引物组序列分别如Seq_ID NO.1-22所示。
表1:SNP位点扩增引物序列
将所述扩增引物组分为如下2组:
第一组包括检测HBA2:c.369C>G(WS)、c.377T>C(QS)、c.427T>C(CS)3个位点;HBB:c.-140C>T、c.-80T>C、c.-79A>G、c.-78A>G、c.84_85insC、c.92+1G>T、c.94delC、c.130G>T、c.316-197C>T 9个位点共12个SNP位点的扩增引物组Seq_ID NO.1-12,19-20;
第二组包括检测HBB:c.-82C>A、c.-50A>C、c.-11_-8de1AAAC、c.2T>G、c.45_46insG、c.52A>T、c.79G>A、c.92+5G>C、c.113G>A、c.114G>A、c.126_129delCTTT、c.216_217insA 12个SNP位点的扩增引物组Seq_ID NO.3-6,11-22;
该分组综合考虑到扩增引物特异性等因素,保证了每组内引物间互相无干扰或者相互作用不影响最终结果;
当实际应用需要延伸引物时,所述引物组还包括Seq_ID NO.23-46所示的24条单碱基延伸引物;
表2:SNP位点单碱基延伸引物序列
可以理解的是,将所述延伸引物组分为如下2组:
第一组包括检测HBA2:c.369C>G(WS)、c.377T>C(QS)、c.427T>C(CS)3个位点;HBB:c.-140C>T、c.-80T>C、c.-79A>G、c.-78A>G、c.84_85insC、c.92+1G>T、c.94delC、c.130G>T、c.316-197C>T 9个位点共12个SNP位点的延伸引物组Seq_ID NO.23-34;
第二组包括检测HBB:c.-82C>A、c.-50A>C、c.-11_-8de1AAAC、c.2T>G、c.45_46insG、c.52A>T、c.79G>A、c.92+5G>C、c.113G>A、c.114G>A、c.126_129delCTTT、c.216_217insA 12个SNP位点的延伸引物组Seq_ID NO.35-46;
该分组综合考虑到延伸引物分子量等因素,保证了每组内引物间互相无干扰或者相互作用不影响最终结果。
实施例:检测非缺失型地贫SNP位点的方法
本实施例方法包括应用上述的扩增引物组和单碱基延伸引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸进行检测;
该方法应用本发明提供的引物组能够对α-地贫常见的3个点突变、β-地贫的21个包括点突变和小片段缺失突变位点进行检测,具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观无需生信介入等特点;
本实施例中,应用上述的引物组对待测样品基因组进行PCR扩增和碱基延伸反应,然后应用MassARRAY系统对反应得到的产物进行检测,确定所述待测样品基因组中SNP位点的核苷酸;
实施例:上述的引物组在核酸质谱检测中的应用
本实施例采用MassARRAY系统进行检测,实现了运用单一平台对多基因位点的检测方法,极大的提高了检测效率,特别适用于批量检测,为非缺失型地贫和筛查提供了科学有效地临床依据。并且,所需样本的适应性强,外周血和干血斑均能较好的检出;
本实施例中用到的主要试剂信息如下:
本发明实施例中用到的主要仪器信息如下:
本发明非缺失型地贫检测位点的选择:
根据现有技术中已公开与地中海贫血检测相关的位点、2020年中华遗传学杂志发表的地中海贫血实践指南及专家共识,综合2021年国家EQA文件,选择真正具有中国人群临床检测筛查意义位点组合。本发明的待测位点选择要求:1))参考1000Genomes,dbSNP,ClinVar,HGMD等数据库,确定位点的突变型已通过文献论证具有明确的致病作用或疑似致病作用;2)结合中国人群特点,筛选出具有中国人群筛查意义的突变型位点。
本发明随后通过临床验证,确定了包括已得到临床认可的“致病性”“疑似致病性”的位点,具体的基因和位点见下表:
表3:非缺失型地贫SNP位点基因型
本发明引物的设计及初步反应体系的建立:
首先,本发明通过MassARRAY网址的引物设计软件(AssayDesign Suite),调整相关参数,完成24个位点的PCR和UEP的引物的初步设计,导出设计好的引物及各参数文件。
鉴于多重PCR对引物的要求以及出于成本的考虑进行优化,将AssayDesign Suite初步设计完成的参数文档进行修改,使6孔设计文件优化至2孔,并通过MFE/NCBI在线软件确认同管扩增引物间没有影响或者其影响很小可以忽略不计。
由于初始设计文件经过修改已将6孔设计转为2孔降低检测成本,则手动加入的扩增引物其对应的UEP引物需要手动计算mass并调整单孔内各UEP引物之间差值≥16,同时确保单孔UEP引物间没有互相影响。
合成引物,按照要求配置扩增引物MIX使各引物浓度在MIX中为0.5uM,按配置表格配置UEP引物MIX并调整使其符合检测要求。
引物测试及优化具体操作如下:
1)样本DNA稀释至10-15ng/uL,并按下表配置反应体系并标记,封膜,离心,进行PCR热循环:
表4PCR扩增反应体系配置表:
表5PCR反应程序:
2)虾碱性磷酸化酶消化处理(SAP):小心撕开封膜,将配置好的SAP反应液加入反应孔,每孔2uL;封新膜,离心,进行SAP反应;体系及热循环程序见下表;
表6SAP反应体系:
表7SAP反应程序:
STEP | TEMP(℃) | TIME |
1 | 37 | 40:00min |
2 | 85 | 5:00min |
3 | 4 | 0:00min |
3)单碱基延伸反应:小心撕开封膜,将配置好的iPLEX反应液加入对应的反应孔,每孔2uL;封新膜,离心,进行iPLEX反应;体系及热循环程序见下表;
表8单碱基延伸反应体系:
表9单碱基反应程序:
4)样本脱盐:把洁净树脂(Resin)铺平在96/15mg dimple plate上(384/6mg),风干最少10分钟。在样本板的每一个有样本的孔里加入41ul水(96孔板加入41ul水,384孔板加入16ul水)然后离心。轻轻将样本板凌空反转,放在已放树脂的dimple plate上,然后将dimple plate连样本板一起反转(过程中两快板不可水平移动),让树脂掉到孔里。用膜把板封好,放在旋转器上颠倒摇匀15分钟。以3200g(标准板离心机的4000rpm)将板离心5分钟。
5)点样到芯片上:用MassARRAYTMRS 1000点样仪将样本点到对应的SpectroCHIP(芯片)上。
6)使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据。
本发明性能验证:
1)准确性验证:实验选取37个样本分别进行本发明的核酸质谱检测及sanger法检测24个突变位点,结果保持一致,准确性达到100%;
2)重复性验证:随机选取8个样本进行检测,第一天每个样本重复3次检测一个批次,第二天检测一批次,第三天检测一批次,进行批内与批间的重复性验证;结果显示8例样本5次重复结果一致性到100%;
表10准确性验证结果:
综合比对37例massarray检测结果与sanger检测结果可知,本发明的检测准确性可达100%,由于本发明检测位点颇多,因此选择纯合变异的如图1HBA2:c.427T>C聚类分析图所示,杂合变异的HBB:c.316-197C>T位点如图2所示、无突变样本的HBB:c.2T>G位点如图3所示来展示聚类分析图。
表11批内重复性验证结果:
表12批间重复性验证结果:
综合比对8例样本5次重复massarray检测结果可知,本发明的检测批内重复性与批间重复性可达100%。
Claims (5)
1.一种检测非缺失型地贫的引物组,其特征在于:所述引物组序列包括如Seq_IDNO.1-22所示多重扩增引物序列和如Seq_ID NO.23-46所示延伸引物序列;所述多重扩增引物序列分成2组,第一组扩增引物序列包括Seq_ID NO.1-12,19-20,第二组扩增引物序列包括Seq_ID NO.3-6,11-22;所述延伸引物组序列分成2组,第一组延伸引物组序列包括Seq_ID NO.23-34,第二组延伸引物组序列包括Seq_ID NO.35-46。
2.一种检测非缺失型地贫的方法,其特征在于:应用上述的用于检测非缺失型地贫引物组对待测对象基因组进行PCR扩增和单碱基延伸反应,再应用MassARRAY平台对反应产物进行筛查,确定所述待测对象基因组中SNP位点的基因型。
3.一种如权利要求1所述的引物组在制备筛查非缺失型地贫产品中的应用。
4.一种如权利要求1所述的引物组在核酸质谱检测中的应用。
5.一种用于非缺失型地贫筛查的组合物/产品/试剂盒,其特征在于:组合物/产品/试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。
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