CN116622836A - 一种用于检测β-地中海贫血基因突变的引物探针组合及其应用 - Google Patents

一种用于检测β-地中海贫血基因突变的引物探针组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测β‑地中海贫血基因突变的引物探针组合及其应用。所引物组合包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物。本发明提供一种用于检测6个β‑地贫修饰基因(包括有BCL11A、KLF1、HBS1L‑MYBintergenicpolymorphism(HMIP)、HBG2、DNMT1、GATAD2A)的23个SNPs位点的引物组，包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物，在一个反应管中完成6个β‑地贫修饰基因的23个SNPs位点检测，对比Sanger测序技术检测耗时更短、通量更高且花费成本更低。

Description

一种用于检测β-地中海贫血基因突变的引物探针组合及其 应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，涉及一种用于检测β-地中海贫血基因突变的引物探针组合及其应用。
背景技术
β-地中海贫血主要是由β珠蛋白基因突变导致，现已发现三百多种β珠蛋白基因突变，其中导致β-球蛋白链产生相对轻微减少的突变为β+，导致β-球蛋白链合成完全缺失的严重突变为β0。β-地中海贫血患者根据其α-珠蛋白或β-珠蛋白链的失衡、贫血的严重程度和临床表现，通常被分为轻型、中间型和重型。重型和中间型可由β-球蛋白基因突变的纯合子或复合杂合子遗传引起，临床表型呈现多样性，重型患者通常在婴儿期出现贫血，并需要终生依赖输血。中间型患者出现轻中度贫血，依赖不规则输血来治疗，中重型患者还会出现很多并发症，如肝脾肿大，骨骼方面疾病等。一些修饰基因的存在重新激活γ珠蛋白的表达，使得HbF升高，从而减轻了由β珠蛋白表达减少导致的严重临床表型，因此致病变异和修饰变异的联合分析是准确的临床分型的关键因素。
β-地中海贫血修饰基因突变可以通过Sanger测序检测，但由于需要检测的β-地贫修饰基因为多个并且位点数量多，Sanger测序一个反应只能对1至2个位点进行检测，检测通量低，不利于临床的简便、快速和大规模的检测。NGS测序可以检测β-地贫修饰基因位点突变，NGS测序技术通量高，但操作复杂，实验流程耗时长，如CN106755329A公开一种基于二代测序技术检测α和β地中海贫血点突变的方法及试剂盒，检测方法包括α和β地中海贫血累及的HBA1和HBA2以及HBB三个基因的外显子、调控、转录区间的PCR扩增引物序列SEQ IDNO.1～17和5’端PCR标记引物序列SEQ ID NO.18～115以及3’端PCR标记引物序列SEQ IDNO.116～213；检测步骤为：(1)、构建第二代测序文库；(2)、第二代测序文库纯化；(3)、第二代测序仪测序；(4)、生物信息学分析，获得结果；检测用的试剂盒包括前述所述的引物序列及第二代测序仪solexa。
综上所述，开发准确、快速和大规模的检测β-地中海贫血修饰基因突变方法是目前亟需解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种用于检测β-地中海贫血基因突变的引物探针组合及其应用，设计用于检测β-地贫修饰基因相关SNP位点的引物组，并开发准确、快速和大规模地检测β-地中海贫血修饰基因突变方法。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合，所引物组合包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物，所述扩增引物的核酸序列分别包括以下所示序列：(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19；(2)SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20；(3)SEQID NO.3和SEQ ID NO.21；(4)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22；(5)SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.23；(6)SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24；(7)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.25；(8)SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.26；(9)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.27；(10)SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.28；(11)SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.29；(12)SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30；(13)SEQID NO.13和SEQ ID NO.31；(14)SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.32；(15)SEQ ID NO.15和SEQID NO.13；(16)SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.34；(17)SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.35；(18)SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.36；
所述质量探针延伸引物的核酸序列包括SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.59所示的序列。
本发明中，设计用于检测6个β-地贫修饰基因(包括BCL11A、KLF1、HBS1L-MYBintergenic polymorphism(HMIP)、HBG2、DNMT1、GATAD2A)的23个SNPs位点的引物组，包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物，可在一个反应管中完成6个β-地贫修饰基因的23个SNPs位点检测，且具备高特异性和灵敏度。
第二方面，本发明提供第一方面所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合在制备β-地中海贫血修饰基因突变的检测产品中的应用。
第三方面，本发明提供一种检测β-地中海贫血修饰基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合。
优选地，所述试剂盒还包括PCR反应试剂、虾碱性磷酸酶(Shrimp AlkalinePhosphatase，SAP)反应试剂和质量探针延伸(Mass Primer Extension，MPE)反应试剂。
优选地，所述SAP反应试剂包括虾碱性磷酸酶。
优选地，所述MPE反应试剂包括单碱基延伸酶(Single Base Extension，SBE)。
第四方面，本发明提供第一方面所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合或第三方面所述的检测β-地中海贫血修饰基因突变的试剂盒在检测β-地中海贫血修饰基因突变中的应用。
第五方面，本发明提供一种以非疾病诊断为目的的检测β-地中海贫血修饰基因突变的方法，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合依次进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶反应(SAP反应)和质量探针延伸反应(MPE反应)，取MPE反应产物进行质谱检测，根据质谱检测结果判断基因分型。
本发明中，设计18对扩增引物和23条质量探针延伸引物，通过多重PCR技术、单碱基延申技术和MALDITOF技术的联用来检测检测β-地贫修饰基因突变，可在一个反应管中完成6个β-地贫修饰基因的23个SNPs位点检测，与传统Sanger测序技术相比，检测耗时短、通量高且花费成本更低。
优选地，所述PCR扩增的条件包括：
95℃预变性15min；
95℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；
60℃、10min；
4℃、维持。
优选地，所述SAP反应的条件包括：
37℃、40min；85℃、5min；4℃、维持。
优选地，所述MPE反应的条件包括：
优选地，所述方法还包括对MPE反应产物进行除盐的步骤。
第六方面，本发明提供一种检测β-地中海贫血修饰基因突变的装置，所述装置包括提取单元、反应单元和分析单元；
所述提取单元用于执行包括：
提取待测样本中核酸；
所述反应单元用于执行包括：
以待测样本中核酸为模板，利用第一方面所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合依次进行PCR扩增、SAP反应和MPE反应；
所述分析单元用于执行包括：
取MPE反应产物进行质谱检测，根据质谱检测结果判断基因分型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种用于检测6个β-地贫修饰基因(包括有BCL11A、KLF1、HBS1L-MYBintergenic polymorphism(HMIP)、HBG2、DNMT1、GATAD2A)的23个SNPs位点的引物组合，包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物，在一个反应管中完成6个β-地贫修饰基因的23个SNPs位点检测。对比Sanger测序技术检测耗时更短、通量更高且花费成本更低。
附图说明
图1A为SNPs位点(rs1160065459、rs10189857、rs372615040、rs7599488、rs137852688、rs483352840、rs6545816、rs9494142、rs483352838、rs7482144和rs4671393)的整体图谱；
图1B为SNPs位点(rs483352841、rs483352839、rs483352842、rs766432、rs1427407、rs6934903、rs387907598和rs375867652)的整体图谱；
图1C为SNPs位点(rs61749494、rs772591609、rs4895440和rs7776054)的整体图谱；
图2为rs7599488位点野生型结果(CC)质谱图；
图3为rs7599488位点突变杂合型结果(CT)质谱图；
图4为rs7599488位点突变纯合型结果(TT)质谱图；
图5为BCL11A基因rs1427407位点的核酸质谱结果：突变杂合GT；
图6为BCL11A基因rs1427407位点的Sanger测序结果图，突变杂合GT；
图7为BCL11A基因rs1427407位点的核酸质谱结果图，突变纯合GG；
图8为BCL11A基因rs1427407位点的Sanger测序结果图，突变纯合GG；
图9为BCL11A基因rs1427407位点的核酸质谱结果图，野生纯合TT；
图10为BCL11A基因rs1427407位点的Sanger测序结果图，野生纯合TT。
图11为HMIP基因rs372615040位点的重复性实验第1天核酸质谱结果图，突变杂合delCCCTGinsACTA；
图12为HMIP基因rs372615040位点的重复性实验第2天核酸质谱结果图，突变杂合delCCCTGinsACTA；
图13为HMIP基因rs372615040位点的重复性实验第3天核酸质谱结果图，突变杂合delCCCTGinsACTA；
图14为HMIP基因rs372615040位点的重复性实验第4天核酸质谱结果图，突变杂合delCCCTGinsACTA；
图15为HMIP基因rs372615040位点的重复性实验第5天核酸质谱结果图，突变杂合delCCCTGinsACTA。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例设计用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合。
β-地贫修饰基因的23个SNPs位点信息如表1所示。
表1
18对扩增引物序列如表2所示。
表2
引物编号 正向扩增引物序列 引物编号 反向向扩增引物序列
SEQ ID NO.1 acgttggatggccggaagcctctctcgatact SEQ ID NO.19 acgttggatggcaacacgcacagaacactcat
SEQ ID NO.2 acgttggatgttctgctctggttctcctctcc SEQ ID NO.20 acgttggatgatggtccacccacagaacaagg
SEQ ID NO.3 acgttggatgcaaccacaccagcctttaacga SEQ ID NO.21 acgttggatgagctgtccatgttcctcttcat
SEQ ID NO.4 acgttggatggtaccagcacagcatgtgacat SEQ ID NO.22 acgttggatgcatttgctcttctccagggtgt
SEQ ID NO.5 acgttggatgatgtgccaaccagactgtgcg SEQ ID NO.23 acgttggatggtgtccatgtttgctgccctct
SEQ ID NO.6 acgttggatgcagacagacttggttccactcc SEQ ID NO.24 acgttggatgagactggtggacgtgttctgt
SEQ ID NO.7 acgttggatggccttgggaagaaagacagcat SEQ ID NO.25 acgttggatgggtccttctgcttcctgttcac
SEQ ID NO.8 acgttggatggggtgggagaagaaataatgga SEQ ID NO.26 acgttggatgagaagcactttggcaagcat
SEQ ID NO.9 acgttggatgaaaccagtttagaaagcgtggc SEQ ID NO.27 acgttggatgagccagtaacattagcctcctt
SEQ ID NO.10 acgttggatgacgctgacttccttctgcaact SEQ ID NO.28 acgttggatgagcctgggtgacagagtgagac
SEQ ID NO.11 acgttggatgatcgctggactcgttgcattgg SEQ ID NO.29 acgttggatgtttgtgcctagccctagcctgt
SEQ ID NO.12 acgttggatgcctggcctcactggatactct SEQ ID NO.30 acgttggatgctgaatcggaacaaggcaaagg
SEQ ID NO.13 acgttggatgtacccggacagtagcccgta SEQ ID NO.31 acgttggatgttgggttcggaggatcactcg
SEQ ID NO.14 acgttggatgaggaggcactcactctcagagg SEQ ID NO.32 acgttggatgggttgcggcaagagctacac
SEQ ID NO.15 acgttggatgaacaggcttcttgtcccatccc SEQ ID NO.33 acgttggatgaaggctgcggctggagattc
SEQ ID NO.16 acgttggatggcggtcagtgtgctgatgga SEQ ID NO.34 acgttggatggccttgccttgctttgccttat
SEQ ID NO.17 acgttggatggaagccaaccagacggaagca SEQ ID NO.35 acgttggatggggacgacgggaagacctactt
SEQ ID NO.18 acgttggatgggcaccttcattgcacccagtt SEQ ID NO.36 acgttggatgtcaccctcatgtctccgtcagt
23条质量探针延伸引物序列信息如表3所示。
表3
本实施例还提供检测β-地中海贫血修饰基因突变的试剂盒，包括上述设计的引物组合以及市售的PCR反应试剂、SAP反应试剂和MPE反应试剂。
实施例2
本实施例进行β-地中海贫血修饰基因突变检测。
1、主要试剂和仪器：SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.59引物干粉(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司)，核酸提取仪及其配套试剂(厂家：广州瑞能医学科技有限公司)；融智SNP通用基础试剂及宽谱定量MALDI-TOF质谱仪(厂家：融智生物科技(青岛)有限公司)。
2、PCR引物混合液配制。
18对扩增引物，编号为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.36，参照DNA合成报告对应项或管上标签提示，加入适量的无酶水到管装的干粉引物中，稀释单管扩增引物至浓度100μM，再根据表4进行PCR引物混合液配制。
表4
3、MPE引物混合液配制。
23条质量探针延申引物，编号为SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.59，参照DNA合成报告对应项或管上标签提示，加入适量的无酶水到管装的干粉引物中，稀释单管质量探针延申引物至浓度500μM，再根据表5进行MPE引物混合液配制。
表5
4、DNA提取。
使用核酸提取仪及其配套试剂进行DNA提取，对DNA进行质检，在微量紫外分光光度计上测定OD260和OD280的值，OD260/OD280值在1.8-2.0之间为合格，将DNA浓度稀释至20-30ng/μL，用于后续实验。
5、PCR扩增。
(1)PCR反应体系如表6所示。
表6
试剂组分 1Test(μL)
PCR预混液 2
PCR引物混合液 1
DNA 2
总体积 5
(2)扩增程序如表7所示。
表7
6、SAP反应。
(1)SAP反应体系如表8所示。
表8
试剂组分 1Test(μL)
无酶水 1.53
SAP缓冲液 0.17
SAP酶 0.3
总体积 2
加入2μL以上配好的试剂到上步骤的PCR反应后产物中。
(2)反应程序如表9所示。
表9
7、MPE反应(单碱基延申反应)。
(1)MPE反应体系如表10所示。
表10
试剂组分 1Test(μL)
E-ddNTPmix 1
SBE缓冲液 1.4
SBE酶 0.6
MPE引物混合液 1
总体积 4
加入4μL以上配好的试剂到上步骤的SAP反应后产物中。
(2)反应程序如表11所示。
表11
8、树脂除盐。
向MPE反应后产物中加入14μL无酶水，加入树脂，震荡混匀，在仪器上旋转40min。
9、点样和上机。
将样本点到Oligoplate靶板上，结晶干燥后上机进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测。
质谱检测结果图谱(经Sanger测序进行验证过以下结果)，23个SNPs位点的整体图谱如图1所示，以rs7599488位点为例进行示例性展示，rs7599488位点野生型结果(CC)质谱图如图2所示，rs7599488位点突变杂合型结果(CT)质谱图如图3所示，rs7599488位点突变纯合型结果(TT)质谱图如图4所示，表明本发明方法能够有效分析基因分型。
实施例3
一、符合率评价
随机选取20例做常规地贫基因检测样本，进行核酸质谱23位点检测(实验步骤参照实施例2)；同时用sanger测序对每例样本23个位点进行对比验证，对比结果全部一致，两种检测方法的符合率为100％(表12)。
表12
示例性展示部分实验结果图，如图5～图10所示，能够有效分析基因分型。
二、重复性评价
选取3例sanger测序验证过的已知基因型的样本，S1、S2和S3进行重复性评价，连续检测5天，每个样本每次检测重复3次，所有位点结果与sanger测序结果一致，重复性结果符合率为100％。
示例性展示部分实验结果图，如图11～图15所示，能够有效分析基因分型。
综上所述，本发明提供一种用于检测6个β-地贫修饰基因(包括有BCL11A、KLF1、HBS1L-MYB intergenic polymorphism(HMIP)、HBG2、DNMT1、GATAD2A)的23个SNPs位点的引物组，包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物，在一个反应管中完成6个β-地贫修饰基因的23个SNPs位点检测。对比Sanger测序技术检测耗时更短、通量更高且花费成本更低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合，其特征在于，所引物组合包括18对扩增引物和23条质量探针延伸引物；
所述扩增引物的核酸序列分别包括以下所示序列：
(1)SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.19；(2)SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.20；(3)SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.21；(4)SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.22；(5)SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.23；(6)SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.24；(7)SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.25；(8)SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.26；(9)SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.27；(10)SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.28；(11)SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.29；(12)SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.30；(13)SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.31；(14)SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.32；(15)SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.13；(16)SEQID NO.16和SEQ ID NO.34；(17)SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.35；(18)SEQ ID NO.18和SEQID NO.36；
所述质量探针延伸引物的河岸序列包括SEQ ID NO.37～SEQ ID NO.59所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合在制备β-地中海贫血修饰基因突变的检测产品中的应用。
3.一种检测β-地中海贫血修饰基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合。
4.根据权利要求3所述的检测β-地中海贫血修饰基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂、虾碱性磷酸酶反应试剂和质量探针延伸反应试剂；
优选地，所述虾碱性磷酸酶反应试剂包括虾碱性磷酸酶；
优选地，所述质量探针延伸反应试剂包括单碱基延伸酶。
5.权利要求1所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合或权利要求3或4所述的检测β-地中海贫血修饰基因突变的试剂盒在检测β-地中海贫血修饰基因突变中的应用。
6.一种以非疾病诊断为目的的检测β-地中海贫血修饰基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：
以待测样本中核酸为模板，利用权利要求1所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合依次进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶反应和质量探针延伸反应，取MPE反应产物进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测，根据质谱检测结果判断基因分型。
7.根据权利要求6所述的以非疾病诊断为目的的检测β-地中海贫血修饰基因突变的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：
95℃预变性15min；
95℃变性15s，59℃退火30s，72℃延伸30s，进行30～40个循环；
60℃、10min；
4℃、维持。
8.根据权利要求6或7所述的以非疾病诊断为目的的检测β-地中海贫血修饰基因突变的方法，其特征在于，所述虾碱性磷酸酶反应的条件包括：
37℃、40min；85℃、5min；4℃、维持。
9.根据权利要求6或7所述的以非疾病诊断为目的的检测β-地中海贫血修饰基因突变的方法，其特征在于，所述方法还包括对质量探针延伸反应产物进行除盐的步骤。
10.一种检测β-地中海贫血修饰基因突变的装置，其特征在于，所述装置包括提取单元、反应单元和分析单元；
所述提取单元用于执行包括：
提取待测样本中核酸；
所述反应单元用于执行包括：
以待测样本中核酸为模板，利用权利要求1所述的用于检测β-地中海贫血修饰基因突变的引物组合依次进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶反应和质量探针延伸反应；
所述分析单元用于执行包括：
取质量探针延伸反应产物进行质谱检测，根据质谱检测结果判断基因分型。
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