CN108531582A - 一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法 - Google Patents

一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于高通量测序技术检测α‑地中海贫血基因突变的引物组合及其方法，其中，所用的引物组合包括特异性扩增HBA基因和特异性扩增HBA基因上下游2Mb范围内紧密连锁多态性位点(SNP)的引物。本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，可以对所有α‑地贫突变进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。

Description

一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法
技术领域
本发明提供了一种基于高通量测序技术检测人类胚胎中α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法，属于基因检测技术领域。
背景技术
地中海贫血(以下简称“地贫”)是世界上最常见的人类单基因遗传血液病之一，被世界卫生组织列入危害人类健康的6种常见病，也是中国南方各省最常见、危害最大的遗传病。在我国南方α-地贫的高发区，总发病率为2.46％，其中广西、广东、江西、四川和浙江各省(区)的发病率分别为14.95％、4.11％、2.60％、1.92％和1.20％。地贫分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。目前，α-地贫还没有效的根治方法，主要以预防为主。因此开展检测，提早发现贫异常基因的携带者对指导婚前及产前诊断具有重要的意义。
随着下一代测序技术的广泛应用，单基因遗传性疾病相关检测也发展较快。针对多种疾病相关的Panel检测也不断应用，在欧美发达国家结合核酸质谱技术、基因芯片技术等开展近3000多个单基因遗传疾病的检测项目，我国的单基因疾病检测也在不断发展中，已由传统只检测几个基因突变位点的一代测序技术、Real-time PCR技术逐步地向多基因多位点检测方面扩展。
传统PCR虽然灵敏，但应用于PGD的时候，存在污染、等位基因脱扣、扩增失败等缺点。单细胞PCR的扩增失败率大约是5％～10％。扩增失败可能与样本的准备过程有关，如未移入细胞、靶DNA的丢失和变性以及细胞的裂解过程。污染是导致误诊的重要原因，通过设立严格的阴性和阳性对照、严格的实验室操作以及单精子卵胞浆内注射技术的应用可以减少污染。等位基因脱扣(allele dropout，ADO)是指在单细胞扩增时，杂合子的两个等位基因之一出现扩增，而另一个等位基因无扩增产物。ADO是导致误诊的主要原因之一，通常有5％～20％的单细胞扩增出现等位基因脱扣。其发生机理复杂，可能与染色体嵌合体、部分二倍体细胞中存在单倍体细胞和PCR变性的温度有关，α-地贫HBA基因上有区域位于16号染色体短臂端粒，同源性较高，多态性很低，高GC等原因，导致PCR扩增失败，可选择的有效的SNP位点也很少，最终导致构建单体型失败。
为了克服现有技术的上述局限性，该试剂盒设计了一种基于高通量测序技术检测α-地贫的方法。提供了一种用于检测α-地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异扩增中国人群α-地贫SEA、4.2kb、3.7kb三种最常见缺失型突变和CS、WS、QS三种最常见点突变的引物，以及特异扩增人类染色体chr16：1-334700区域(包括啦α-珠蛋白基因HBA1、HBA2基因)以及HBA基因下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(总共1354对引物)。这些引物的特点为：1)在目标染色体上序列唯一；2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；3)多对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行多重反应；4)通过高通量测序分析既能对地贫进行基因检测，又能通过SNP连锁分析判断胚胎的致病性，也能通过目标区域覆盖深度判断拷贝数异常。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人类胚胎α-地中海贫血突变检测的引物组合及方法，该技术基于家系SNP连锁分析原理，可以对所有α-地贫突变进行胚胎移植前诊断。
为了实现本发明，我们采用了以下技术方案：
1、采用了单细胞全基因组扩增技术，可以将微量细胞的基因组放大，使其达到能够检测的量。该技术首先通过特殊的随机引物跟基因组随机结合、延伸，这些引物末端带有一段特殊的通用序列，可以使扩增子的结尾互补成环，从而很大程度上防止DNA的指数性扩增，增加了全基因组扩增的均一性；最后，用一对引物进行指数扩增，增加扩增产量。随后将扩增的基因组随机打断，在打断的DNA片段两端加上通用的测序接头，构建好可以用于测序的测序文库。利用乳液PCR技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，通过对阳性模板进行富集以达到测序要求，然后通过基于半导体测序技术进行测序。
2、靶向捕获方法：是一种大规模的多重PCR扩增技术，能够实现几千甚至上万重引物对进行快速扩增目标区域检测低频率或稀有突变，是一种准确、经济、高效的基因组目标区域深度平行测序技术。本发明设计了一种基于高通量测序技术检测α-地贫的方法。尤其提供了一种用于检测α-地中海贫血基因突变的引物组合物，其由特异扩增中国人群α-地贫SEA、4.2kb、3.7kb三种最常见缺失型突变和CS、WS、QS三种最常见点突变的引物，以及特异扩增人类染色体chr16：1-334700区域(包括了α-珠蛋白基因HBA1、HBA2基因)以及HBA基因下游2Mb范围内紧密连锁的单核苷酸多态性(SNP)位点的引物组成(总共1354对引物)。这些引物的特点为：1)在目标染色体上序列唯一；2)位置特异的寡核苷酸具有相同的退火温度；3)多对引物混合到两个PCR反应管中，在两个PCR反应管中能进行多重反应；(4)通过高通量测序分析既能对地贫进行基因检测，又能通过SNP连锁分析判断胚胎的致病性，也能通过目标区域覆盖深度判断拷贝数异常；在涉及的每个致病外显子或突变位点，设计一对或多对引物探针来覆盖，而两端的DNA序列则设计目的基因5’端前和3’端后几个bp至十几个bp，保证靶向捕获技术的高覆盖度；采用涉及多重PCR引物对目的基因进行扩增，将微量DNA信息放大到可以检测到的信号，实现高灵敏度的目的；在涉及到的百种基因DNA序列的保守且避免二级结构的区域设计高密度的多重PCR引物，引物长度约15-30bp，扩增长度120-220bp左右并使扩增的DNA序列GC含量尽量均一，同时对设计的引物进行5’端生物素、荧光素、地高辛等修饰，但3’端不做任何修饰以便使顺利延伸，避免各引物间相互干扰，达到高分辨率的目的。
3、高通量测序方法：主要包括采用设计好的引物Panel，条形码和微量的DNA构建文库，对构建好的文库进行质检，将质检通过的文库转移到模板制备及富集系统进行模板扩增，扩增富集的文库模板的阳性模板被放置到Ion Torrent进行测序实验。主要包括对文库构建流程、文库定量流程及上机测序流程进行研发和优化；对靶向捕获的DNA序列进行接头序列的连接及文库DNA纯化，尽量避免引物二聚体或者大片段的干扰；对文库DNA进行尽量精确定量，使得尽量多的样本量能够混合一次测序；对上机测序过程进行优化，获得更多质量高的数据量可以用于分析；对高通量测序数据的生物信息学技术进行优化，精确基因突变算法，得到高准确度的结果信息。
3、生物信息分析方法：
(1)地贫基因检测分析方法：高通量测序下机数据利用Torrent_Server_5.0_VM软件对PGM测序仪产生的原始数据去除接头序列、用Tmap软件比对到人类hg19参考基因组、分析单体型SNP覆盖倍数和基因型。利用父母和先证者与α-地贫致病基因HBA1紧密连锁多态性位点(SNP)在染色体上的位置和基因型构建单体型。利用已经建好的单体型对胚胎是否致病进行判断。
(2)Ampliseq目标区域拷贝数分析方法：利用确定正常的样本构建数据库，计算每个样本SEA缺失区域染色体的相对序列值(RC)，通过不同样本的平均值，统计分析、确定参考值的范围。根据参考值对样本的缺失型进行判断。
(3)缺失区域SNP位点判断胚胎致病性方法：在SEA缺失区域选择父母有区别的SNP位点，通过孟德尔遗传规律，判断后代的致病性。
比如：母亲基因型：--SEA/αα；父亲基因型：--SEA/αα(见附图1)。
(4)单体型技术原理：单基因遗传病检测采用目标序列捕获结合高通量测序技术，对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序和生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型，辅助临床上选择无致病基因携带或受遗传病影响最小的胚胎进行植入(见附图2)。
本发明中检测地贫相关基因突变情况采用特异性引物多重PCR扩增的方法建库并测序。作为本发明进一步的方案：α-地中海贫血相关基因突变检测的多重PCR扩增引物依次为：SEQ ID NO：1～1354，如下所示：
本发明同时也提供了一种基于Ion Torrent测序平台的α-地中海贫血相关基因突变检测方法，具体步骤如下：
(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取：将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，和全血DNA提取，得到DNA后进行浓度测定；
(2)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；
(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；
(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；
(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；
(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；
(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序；
(9)生物信息学分析：对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序后进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。
作为本发明进一步的方案：步骤(1)中的试剂盒为QiagenSingle CellKit(24)：
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中的反应体系为20μL体系，反应体系的组成成分具体为：
作为本发明进一步的方案：步骤(2)中多重PCR反应的条件如下：
99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。
作为本发明进一步的方案：步骤(3)中引物消除试剂为Life Technologines公司的FuPa Reagent，加入量为20μL PCR反应体系加入2μL引物消除试剂。
作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的P1接头为：
作为本发明进一步的方案：步骤(4)中的特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcode x：
Barcode x代表的具体序列如下：
Barcode 1：
Barcode 2：
Barcode 3：
Barcode 4：
Barcode 5：
Barcode 6：
Barcode 7：
Barcode 8：
Barcode 9：
Barcode 10：
Barcode 11：
Barcode 12：
Barcode 13：
Barcode 14：
Barcode 15：
Barcode 16：
作为本发明进一步的方案：步骤(4)所述接头连接反应的体系为30μL，接头连接反应的体系具体为：
作为本发明进一步的方案：步骤(5)中所用磁珠为XPReagent。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增反应液为PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity，文库扩增引物为Library Amplification Primer Mix。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中文库扩增体系为52μL，具体为向步骤(5)产物中加入50μL PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity和2μL Library AmplificationPrimer Mix。
作为本发明进一步的方案：步骤(6)中所述的PCR扩增反应条件如下：
98℃预变性2min，1个循环；98℃变性15sec，60℃退火和延伸1min，5～7个循环；10℃终止。
本发明提供了一种试剂，该试剂包括上述引物对。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的方法具有通用性、多位点SNP测序、高通量、成本低、高灵敏度、特异性强的优点，防止扩增等位基因脱扣(ADO)造成的检测误诊，可以对所有α-地贫突变进行胚胎移植前检测，并且检测过程更加快速，检测结果也更为准确。
附图说明
图1缺失区域SNP位点判断胚胎致病性原理图。
图2 SNP单体型技术原理图。
图3 SEA区域覆盖拷贝数，说明该样本为纯合缺失。
图4 SEA区域覆盖拷贝数。
图5 SEA区域覆盖拷贝数，说明该样本为纯合缺失。
图6 SEA区域覆盖拷贝数。
图7单体型结果，通过颜色可以区分，M1，F1为缺失链。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
本发明公开了地贫基因突变检测方法，所有试剂均可由市场购得：其中，5×IonAmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1 Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，SwitchSolution(Life公司)，DNA Ligase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix High Fidelity(Life公司)，Library AmplificationPrimer Mix(Life公司)。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：基于Ion Torrent测序平台的4例胚胎α-地贫胚胎移植前检测
本实施例采用以下试剂：5×Ion AmpliseqTM HiFi Master Mix(Life公司)，2×Ion AmpliseqTM Primer Pool(Life公司)，FuPa Reagent(Life公司)，Ion P1 Adapter和Ion XpressTM Barcode X(Life公司)，Switch Solution(Life公司)，DNALigase(Life公司)，XP Reagent(Beckman公司)，PlatiumTM PCR SuperMix HighFidelity(Life公司)，Library Amplification Primer Mix(Life公司)，Nuclease-FreeWater，无水乙醇。
本方法实验前需要新鲜配置一种试剂：75％乙醇。
本实验需要用到的仪器和设备：离心机、磁力架、移液器、PCR仪、振荡器、荧光计Qubit 4.0。
主要实验步骤：
(1)待测样本的DNA提取和全基因组扩增
本实施例中，获取2例α-地贫--SEA/αα父母的全血样本和4枚胚胎活检样本，夫妻双方样本来自外周血样本，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit或QIAamp DNA Mini Kit提取试剂盒，按照试剂盒说明书操作步骤提取。胚胎细胞样本按照QiagenSingleCell Kit(24)标准流程对4个胚胎样本进行全基因组扩增；
(2)对待测样本DNA进行Qubit 4.0浓度测定
本实施例中，DNA样本采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。
(3)目的片段扩增。按照以下体系加入各试剂进行PCR扩增：
反应条件：
(4)引物清除
向PCR产物中加入2μL引物清除试剂FuPa Reagent，涡旋混匀，瞬时离心，根据如下程序进行反应：
(5)接头连接
1)稀释混合接头，形成Barcode Adapter Mix；
2)在清除引物后的PCR产物中加入以下组分，涡旋混匀，瞬时离心。
P1接头为：
样本接头分别如下：
Barcode x：
Barcode x代表的序列如下：
Barcode 1：
Barcode 2：
Barcode 3：
Barcode 4：
Barcode 5：
Barcode 6：
Barcode 7：
Barcode 8：
Barcode 9：
Barcode 10：
Barcode 11：
Barcode 12：
Barcode 13：
Barcode 14：
Barcode 15：
Barcode 16：
(6)纯化连接产物
磁珠纯化连接产物，采用XP Reagent纯化产物：
1)将PCR产物转移至1.5ml EP管内，加入45μLXP Reagent，吹打混匀；
2)室温孵育5min；
3)将样本放置磁力架上，静置3mn至管内溶液澄清，小心吸取上清液并弃去；
4)加入300μL新鲜配制的75％乙醇，转动EP管清洗磁珠，弃去乙醇；
5)重复步骤4)一次；
6)室温晾干磁珠，不要过度干燥(风干即可，不要开裂)。
(7)文库扩增，在纯化后晾干的磁珠中加入50μL文库扩增酶PlatiumTM PCRSuperMix High Fidelity和2μL文库扩增引物Library Amplification Primer Mix，重悬磁珠，转移至PCR管中，涡旋混匀，进行PCR扩增。
反应条件：
(8)文库进行磁珠纯化，采用XP Reagent磁珠纯化产物：
1)每管加入25μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟。
2)将EP管置于磁力架上，吸附3min至溶液变澄清之后，将上清液转移到另一标记的EP管中，注意不要吸到磁珠。
3)每管加入60μL纯化磁珠，涡旋混匀，低速离心，室温孵育5分钟。
4)将EP管置于磁力架上，吸附3分钟至溶液变澄清之后，吸去溶液，注意不要吸到磁珠。
5)吸取300μL 75％的乙醇于EP管，轻轻旋动EP管清洗磁珠。液澄清后吸去溶液，注意不要吸到磁珠。
6)重复上一步。
7)取下EP管，低速离心10秒。将EP管置于磁力架上，用移液枪吸去残留溶液，注意管壁上不能有残留。将EP管盖打开，室温静置5分钟，晾干磁珠。
8)吸取50μL洗脱液于EP管内，涡旋混匀，离心5秒，室温放置5分钟。
9)将EP管置于磁力架上，静置3分钟至溶液澄清后，小心转移液体到新的EP管中，并标记文库名称。
(9)检测文库浓度
DNA文库采用dsDNA HS Assay Kit试剂盒进行浓度测定，按照试剂盒说明书操作步骤进行检测。文库建议根据下列公式稀释到200pmol/L，稀释后使用荧光定量PCR仪定量，等质量混合后上机测序。
(10)高通量测序
对混合文库采用Ion Proton或Ion PGM测序平台进行高通量测序。
通过对Ion Torrent测序平台的测序结果进行分析，所有样本的覆盖度均达到或超过97％，均一性平均达到100％，每次测序反应样本的数据量分布均匀。
对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。
样本拷贝数分析结果：见附图3，4，5，6；
样本单体型结果：见附图7；
样本检测结果显示：
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权力要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权力要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的人和附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (5)

1.一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQ ID NO：1～1354所示序列的多重PCR引物组成。
2.一种基于高通量测序平台检测α-地中海贫血基因突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取：将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，和全血DNA提取，得到DNA后进行浓度测定；
(2)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；
(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；
(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；
(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；
(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；
(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；
(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序；
(9)生物信息学分析：对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的多重PCR反应条件如下：
99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述的P1接头如下：
5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’和
5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’；
所述特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcode x：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’和5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’，Barcode x代表的具体序列如下：
Barcode 1：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’
5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；
Barcode 2：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’
5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；
Barcode 3：
5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’
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5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述的PCR扩增反应条件如下：
98℃预变性2min，1个循环；98℃变性15sec，60℃退火和延伸1min，5～7个循环；10℃终止。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110669724A (zh) * 2019-11-08 2020-01-10 广州达瑞生殖技术有限公司 一种囊胚培养液及其制备方法
CN110669725A (zh) * 2019-11-08 2020-01-10 广州达瑞生殖技术有限公司 一种卵裂胚培养液及其制备方法
CN112342289A (zh) * 2020-11-04 2021-02-09 广州精科医学检验所有限公司 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用
CN113981059A (zh) * 2021-06-29 2022-01-28 上海真固生物科技有限公司 一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂
CN116769906A (zh) * 2023-08-10 2023-09-19 赛雷纳（中国）医疗科技有限公司 用于检测α-地中海贫血的试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894279A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 α-地中海贫血基因突变检测试剂盒
CN108004301A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 格诺思博生物科技南通有限公司 基因目标区域富集方法及建库试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894279A (zh) * 2015-06-25 2015-09-09 北京嘉宝仁和医疗科技有限公司 α-地中海贫血基因突变检测试剂盒
CN108004301A (zh) * 2017-12-15 2018-05-08 格诺思博生物科技南通有限公司 基因目标区域富集方法及建库试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LINJUN CHEN ET AL.: "The clinical application of NGS-based SNP haplotyping for PGD of Hb H disease", 《SYST BIOL REPROD MED》 *
XU YANG ET AL.: "Non‑invasive prenatal diagnosis of thalassemia through multiplex PCR, target capture and next‑generation sequencing", 《MOL MED REP》 *
叶燕绸: "基于高通量测序技术的地中海贫血无创产前筛查研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110669724A (zh) * 2019-11-08 2020-01-10 广州达瑞生殖技术有限公司 一种囊胚培养液及其制备方法
CN110669725A (zh) * 2019-11-08 2020-01-10 广州达瑞生殖技术有限公司 一种卵裂胚培养液及其制备方法
CN112342289A (zh) * 2020-11-04 2021-02-09 广州精科医学检验所有限公司 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用
CN112342289B (zh) * 2020-11-04 2023-08-15 广州精科医学检验所有限公司 用于长片段pcr富集地中海贫血基因的引物组及其应用
CN113981059A (zh) * 2021-06-29 2022-01-28 上海真固生物科技有限公司 一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂
CN113981059B (zh) * 2021-06-29 2023-08-22 上海真固生物科技有限公司 一种地中海贫血症突变基因检测引物组合物及其试剂
CN116769906A (zh) * 2023-08-10 2023-09-19 赛雷纳（中国）医疗科技有限公司 用于检测α-地中海贫血的试剂盒
CN116769906B (zh) * 2023-08-10 2023-11-17 赛雷纳（中国）医疗科技有限公司 用于检测α-地中海贫血的试剂盒

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