CN110669725A - 一种卵裂胚培养液及其制备方法 - Google Patents

一种卵裂胚培养液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卵裂胚培养液及其制备方法。它包括水、无机盐、能量物质、螯合剂、抗氧化剂、抗菌剂、大分子物质、指示剂，其特征在于，所述的抗氧化剂是柠檬酸钠、谷胱甘肽，柠檬酸钠的浓度为0.85~1.12mmol/L、谷胱甘肽的浓度范围为0.91~1.15mmol/L。本发明所述的卵裂胚培养液中高浓度丙酮酸钠及乳酸钠作为能量物质的同时，与柠檬酸钠及谷胱甘肽联合作为抗氧化剂，四种抗氧化剂联合发挥作用能有效减低环境及自身产生的氧化物对胚胎的毒害，为胚胎体外发育营造良好的发育环境。

Description

一种卵裂胚培养液及其制备方法
技术领域
本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种卵裂胚培养液及其制备方法，其是主要用于原核期至卵裂期胚胎培养，为胚胎体外培养提供发育环境及所需的营养物质。
背景技术
卵裂胚培养液是辅助生殖技术中必不可少的试剂产品，应用于原核期至卵裂期胚胎培养，在辅助生殖医学技术中应用为该时期培养体外培养提供必需的环境和营养。卵裂胚培养液的用途：在辅助生殖中心胚胎实验室的二氧化碳培养箱环境下对人的原核期至卵裂期胚胎进行培养。
目前，国内辅助生殖用液依赖进口，而国内暂无对这类产品进行自主生产，缺乏议价空间，价格高昂从而患者的医疗成本较高，增加了经济负担。进口产品往往需要通过长途运输，长途运输过程中因存储条件无法得到保证，运输时间较长，使得培养液使用效果下降，无法对临床的胚胎培养提高最佳效果，直接影响胚胎的发育，造成不良后果。在国内生产人类辅助生殖医学技术培养液，避免了国外进口产品因长途运输带来的不明因素，减轻患者的经济负担。
目前，临床使用的常规卵裂胚培养液的在提供较高浓度的丙酮酸钠及乳酸钠的同时，亦会提供相对较高浓度的葡萄糖成分或不提供葡萄糖，但两种提供葡萄糖的方式均对该时期胚胎细胞的发育有阻滞影响，不利于该时期胚胎发育。本发明在提供高浓度的丙酮酸钠及乳酸钠的同时，提供低浓度的葡萄糖，促进该时期胚胎细胞生长发育。此外，常规卵裂胚培养液通常添加相近浓度水平的非必需氨基酸，并没有充分考虑原核期至卵裂期胚胎对特定氨基酸的需求，会导致培养后期营养物质供给失衡，胚胎发育受到抑制。常规卵裂胚培养液往往存在抗氧化能力不足的现象，抗氧化性低会导致氧化物对胚胎产生毒害作用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种能量物质配比适宜、满足胚胎发育特殊营养需求及抗氧化性强的卵裂胚培养液，不仅能为原核期至卵裂期胚胎体外培养提供充足的物质营养需求，提高卵裂率，也为胚胎体外培育提供良好的发育环境，降低培养过程中环境中过自身产生的氧化物对胚胎的毒害作用，为胚胎体外培养提供理想的环境。
为实现上述目标，本发明所提供的技术方案是：
一种卵裂胚培养液，包括水、无机盐、能量物质、螯合剂、抗氧化剂、抗菌剂、大分子物质、指示剂，其特征在于，所述抗氧化剂为柠檬酸钠、谷胱甘肽，所述柠檬酸钠的浓度为0.80~2.40mmol/L、谷胱甘肽的浓度范围为0.80~2.40mmol/L。进一步优选为柠檬酸钠的浓度为0.85~1.12mmol/L、谷胱甘肽的浓度范围为0.91~1.15mmol/L。
优选，所述的能量物质包括乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖，其中乳酸钠的浓度为24.0~29.0mmol/L，丙酮酸钠的浓度为1.1~2.3mmol/L，葡萄糖的浓度为0.05~0.3mmol/L。所述的丙酮酸钠、乳酸钠除作为能量物质外亦是抗氧化剂，丙酮酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠、谷胱甘肽作为抗氧化剂联合使用。
优选，所述的氨基酸包括丙氨酰谷氨酰胺和非必需氨基酸，所述的丙氨酰谷氨酰胺浓度为0.80~1.30mmol/L，所述的非必需氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸，其中甘氨酸浓度为2.50~5.30mmol/L、丙氨酸浓度为2.50~5.30mmol/L、丝氨酸浓度为2.50~5.30mmol/L，天冬酰胺浓度为0.50~1.20mmol/L、天冬氨酸浓度为0.50~1.20mmol/L、谷氨酸浓度为0.50~1.20mmol/L、脯氨酸浓度为0.50~1.20mmol/L。
优选的：所述无机盐包括氯化钠80.0~108.0mmol/L、硫酸镁0.10~0.80mmol/L、氯化钾2.5~7.5mmol/L、氯化钙1.4~3.2mmol/L。
优选的：所述螯合剂为乙二氨四醋酸四钠，浓度为0.005~0.043mmol/L。
优选的：所述抗菌剂为庆大霉素，最佳浓度为9.5~12.0mg/L
优选的：所述大分子物质为人血清白蛋白按9.5~11.0mg/mL的浓度添加至溶液中。或不添加人血清白蛋白，但在临床使用时按9.5~11.0mg/mL的浓度添加人血清白蛋白
优选的：所述缓冲系统为HCO3 -/CO2系统，有缓冲物质碳酸氢钠，浓度24.5~28.6mmol/L。
优选的：所述指示剂为酚红，最佳浓度为0.009mmol/L。
优选，所述的卵裂胚培养液包括碳酸氢钠26.4mmol/L、氯化钙2.2mmol/L、氯化钾5.3mmol/L、氯化钠105.6mmol/L、硫酸镁0.31mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.014mmol/L、酚红0.009mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.05mmol/L、葡萄糖0.18mmol/L、丙酮酸钠为1.67mmol/L乳酸钠为28.3mmol/L、庆大霉素11.4mg/L、甘氨酸5.10mmol/L、丙氨酸4.30mmol/L、丝氨酸3.20mmol/L，天冬酰胺0.92mmol/L、天冬氨酸1.13mmol/L、谷氨酸0.86mmol/L、脯氨酸0.54mmol/L、柠檬酸钠1.12mmol/L、谷胱甘肽1.15mmol/L和人血清白蛋白10.8mg/mL，溶剂为水。
本发明的目的还提供了所述卵裂胚培养液的制备方法，包括以下步骤：
先将无机盐成分、能量物质、缓冲物质等成分按先固体后液体的顺序溶入注射用水中，并持续搅拌，具体是将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后依次将氨基酸（丙氨酰谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸）、抗氧化剂（柠檬酸钠、谷胱甘肽）、抗菌剂（庆大霉素）、螯合剂（乙二氨四醋酸四钠）、指示剂（酚红）加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的CO2气体，然后将人血清白蛋白按9.5~11.0mg/mL的比例添加或在临床使用时按9.5~11.0mg/mL人血清白蛋白；
（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到卵裂胚培养液，取样测试；测试参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
鼠胚试验：1-细胞鼠胚试验96小时内扩张囊胚率≥80%
（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标。
有益效果
本发明所述的卵裂胚培养液具有高丙酮酸钠及乳酸钠，低葡萄糖的特点，本发明采用添加较低浓度的葡萄糖而并非不添加或添加高浓度的葡萄糖，在匹配原核期至卵裂期胚胎对能力物质利用特点的同时，防止物质缺失或浓度过高对胚胎发育造成阻滞，有效促进胚胎的发育。此外，针对性地提高甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的浓度，为该时期胚胎发育所需的特殊营养物质，满足该时期对营养物质的需求。高浓度丙酮酸钠及乳酸钠作为能量物质的同时，与柠檬酸钠及谷胱甘肽联合作为抗氧化剂，四种抗氧化剂联合发挥作用能有效减低环境及自身产生的氧化物对胚胎的毒害，为胚胎体外发育营造良好的发育环境。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本说明做进一步说明。
实施例1
配方1、配方2、配方3、配方4、配方5成分如表1所示，水为溶剂，
表1
Figure 694816DEST_PATH_IMAGE001
按照配方表称量好所有组分，备用；按表1的成分表，先将无机盐成分、能量物质、缓冲物质等成分按先固体后液体的顺序溶入注射用水中，并持续搅拌，具体是将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后依次将氨基酸（丙氨酰谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸）、抗氧化剂（柠檬酸钠、谷胱甘肽）、抗菌剂（庆大霉素）、螯合剂（乙二氨四醋酸四钠）、指示剂（酚红）加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的CO2气体，然后再加入人血清白蛋白，补注射用水，使各组分达到相应浓度；
（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到卵裂胚培养液，取样测试；测试参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标。
所述配方1、配方2、配方3、配方4、配方5主要是葡萄糖浓度不同，其他组分含量均一致，配方1葡萄糖含量与常规卵裂胚培养液含量相当。使用配方1、配方2、配方3、配方4、配方5配制并检测合格的产品进行卵裂期胚胎培养试验，记录不同配方产品的卵裂率。
注：配方表中“—”代表不添加该组分。
使用配方1~配方5配制的卵裂胚培养液分别对100个小鼠受精卵进行体外培养至卵裂胚。将100个受精卵平均分为10组，每组10个，且每组均加入相同体积的培养液，培养至第3天后在显微镜下观察统计卵裂率，结果如表2：
表2
组别 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5
葡萄糖mmol/L 2.65 0.18 — 0.30 0.05
测试受精卵数（个） 100 100 100 100 100
卵裂胚数量（个） 72 98 57 94 85
卵裂率（%） 72 98 57 94 85
数据结果表明，配方1与常规卵裂胚培养液中葡萄糖浓度相近，该配方卵裂胚培养液培养胚胎的卵裂率只有72%；配方4当葡萄糖浓度降低至0.30mmol/L时，卵裂率明显提高，可达94%，配方2当葡萄糖浓度为0.18mmol/L时取得最高卵裂率98%；配方5当葡萄糖浓度降低至0.05mmol/L时，卵裂率会降低至85%，但仍高于配方1取得的卵裂率，说明高葡萄糖的卵裂胚培养液不利于卵裂期胚胎培养，对该时期胚胎产生阻滞作用。配方3培养液中不添加葡萄糖时，卵裂率明显降低只有57%，比配方2取得的卵裂率降低了39%，亦明显低于配方1高葡萄糖的卵裂率。因此，卵裂胚培养液中葡萄糖浓度过高或不添加均不利于卵裂期胚胎培养，只有提供适宜浓度的葡萄糖才能有效促进卵裂期胚胎的发育，卵裂胚培养液中葡萄糖浓度在0.10~0.30mmol/L时能取得较佳的培养效果，有利于卵裂期胚胎的生长。
实施例2
根据配方A、配方B、配方C、配方D、配方E成分表（表3），称取相应物料按照以下制备方法配制卵裂胚培养液。
表3
组分名称 配方A 配方B 配方C 配方D 配方E
碳酸氢钠mmol/L 26.4 26.4 26.4 26.4 26.4
氯化钙mmol/L 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2
氯化钾mmol/L 5.3 5.3 5.3 5.3 5.3
氯化钠mmol/L 105.6 105.6 105.6 105.6 105.6
硫酸镁mmol/L 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31
乙二氨四醋酸四钠mmol/L 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014
酚红mmol/L 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009
丙氨酰谷氨酰胺mmol/L 1.05 1.05 1.05 1.05 1.05
葡萄糖mmol/L 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18
丙酮酸钠mmol/L 1.67 1.67 1.67 1.67 1.67
乳酸钠mmol/L 28.3 28.3 28.3 28.3 28.3
庆大霉素mg/L 11.4 11.4 11.4 11.4 11.4
甘氨酸mmol/L 1.34 5.11 3.22 4.54 8.74
丙氨酸mmol/L 1.12 4.34 2.66 3.61 6.92
丝氨酸mmol/L 1.06 3.20 2.51 3.53 5.30
天冬酰胺mmol/L 0.92 0.92 0.92 0.92 0.92
天冬氨酸mmol/L 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13
谷氨酸mmol/L 0.86 0.86 0.86 0.86 0.86
脯氨酸mmol/L 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54
柠檬酸钠mmol/L 1.12 1.12 1.12 1.12 1.12
谷胱甘肽mmol/L 1.15 1.15 1.15 1.15 1.15
人血清白蛋白mg/mL 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8
按照配方表称量好所有组分，备用；按表3的成分表，先将无机盐成分、能量物质、缓冲物质等成分按先固体后液体的顺序溶入注射用水中，并持续搅拌，具体是将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后依次将氨基酸（丙氨酰谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸）、抗氧化剂（柠檬酸钠、谷胱甘肽）、抗菌剂（庆大霉素）、螯合剂（乙二氨四醋酸四钠）、指示剂（酚红）加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的CO2气体，然后再加入人血清白蛋白，补注射用水，使各组分达到相应浓度；
（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到卵裂胚培养液，取样测试；测试参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标。
所述配方A、配方B、配方C、配方D、配方E主要是甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸三种氨基酸含量不同，其他组分含量均一致，配方A甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸含量与常规卵裂胚培养液含量相当。使用配方A、配方B、配方C、配方D、配方E配制并检测合格的产品对小鼠受精卵进行体外培养至卵裂期，记录不同配方产品的卵裂率。
使用配方A~配方E配制的培养液分别培养100个小鼠受精卵至卵裂期。将100个受精卵平均分为10组，每组10个，且每组均加入相同体积的培养液，培养至第3天后在显微镜下观察统计卵裂率，并将配方B~E原核胚数据分别与配方A原核胚数据进行差异性比较，结果如下（表4）：
表4
组别 配方A 配方B 配方C 配方D 配方E
甘氨酸mmol/L 1.34 5.11 3.22 4.54 8.74
丙氨酸mmol/L 1.12 4.34 2.66 3.61 6.92
丝氨酸mmol/L 1.06 3.20 2.51 3.53 5.34
测试受精卵数量（个） 100 100 100 100 100
卵裂率（%） 74 98 88 93 79
P值 — 2.52×10<sup>-6</sup> 0.0023 1.27×10<sup>-4</sup> 0.196
数据结果表明，当适当提高甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的浓度时受精卵发育的卵裂率明显提高。配方A的卵裂胚培养液甘氨酸1.34mmol/L、丙氨酸1.12mmol/L、丝氨酸1.06mmol/L浓度的与常规卵裂胚培养液浓度相当，其原核率只有74%。当甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸浓度提高时，卵裂率大幅度提高，卵裂率达到88%以上，配方B甘氨酸5.11mmol/L、丙氨酸4.34mmol/L、丝氨酸3.20mmol/L取得最佳培养效果，卵裂率达到98%。但当配方E丝氨酸浓度大于5.3mmol/L时，卵裂率会降低至79%，丝氨酸浓度过高对卵裂期胚胎发育亦会有影响。差异性比较结果显示，配方B~D与配方A之间P值均小于0.05，具有显著性差异，而配方E丝氨酸浓度大于5.3mmol/L时，配方E与配方A之间的P值大于0.05，不具有显著性差异。因此，受精卵至卵裂期胚胎对甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸有特殊的需求，适当提高卵裂胚培养液中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的浓度能有效提高胚胎体外培养效果，但浓度过高或过低均不利于该时期胚胎生长，常规卵裂胚培养液中氨基酸的配比不合理，不能有效持续提供胚胎发育所需营养，不利于卵裂胚的形成。
实施例3
根据配方I、配方II、配方III、配方IV、配方V成分表（表5），称取相应物料按照下述制备方法配制卵裂胚培养液。
表5
组分名称 配方I 配方II 配方III 配方IV 配方V
碳酸氢钠mmol/L 26.4 26.4 26.4 26.4 26.4
氯化钙mmol/L 2.2 2.2 2.2 2.2 2.2
氯化钾mmol/L 5.3 5.3 5.3 5.3 5.3
氯化钠mmol/L 105.6 105.6 105.6 105.6 105.6
硫酸镁mmol/L 0.31 0.31 0.31 0.31 0.31
乙二氨四醋酸四钠mmol/L 0.014 0.014 0.014 0.014 0.014
酚红mmol/L 0.009 0.009 0.009 0.009 0.009
丙氨酰谷氨酰胺mmol/L 1.05 1.05 1.05 1.05 1.05
葡萄糖mmol/L 0.18 0.18 0.18 0.18 0.18
丙酮酸钠mmol/L 1.67 1.67 1.67 1.67 1.67
乳酸钠mmol/L 28.3 28.3 28.3 28.3 28.3
庆大霉素mg/L 11.4 11.4 11.4 11.4 11.4
甘氨酸mmol/L 5.1 5.1 5.1 5.1 5.1
丙氨酸mmol/L 4.3 4.3 4.3 4.3 4.3
丝氨酸mmol/L 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2
天冬酰胺mmol/L 0.92 0.92 0.92 0.92 0.92
天冬氨酸mmol/L 1.13 1.13 1.13 1.13 1.13
谷氨酸mmol/L 0.86 0.86 0.86 0.86 0.86
脯氨酸mmol/L 0.54 0.54 0.54 0.54 0.54
柠檬酸钠mmol/L — 2.27 — 1.12 0.85
谷胱甘肽mmol/L — — 2.27 1.15 0.91
人血清白蛋白mg/mL 10.8 10.8 10.8 10.8 10.8
注：配方表中“—”代表不添加该组分。
按照配方表称量好所有组分，备用；按表5的成分表，先将无机盐成分、能量物质、缓冲物质等成分按先固体后液体的顺序溶入注射用水中，并持续搅拌，具体是将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后依次将氨基酸（丙氨酰谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸）、抗氧化剂（柠檬酸钠、谷胱甘肽）、抗菌剂（庆大霉素）、螯合剂（乙二氨四醋酸四钠）、指示剂（酚红）加入，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的CO2气体，然后再加入人血清白蛋白，补注射用水，使各组分达到相应浓度；
（2）检测步骤（1）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（3）将步骤（2）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，由此得到卵裂胚培养液，取样测试；测试参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
（4）将步骤（3）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装，贴标。
所述配方I、配方II、配方III、配方IV、配方V主要是抗氧化剂柠檬酸钠、谷胱甘肽浓度不同，其他组分含量均一致。使用配方I、配方II、配方III、配方IV、配方V配制并检测合格的产品进行卵裂期胚胎培养试验，记录不同配方产品的卵裂率。
使用配方I~配方V配制的培养液分别培养100个小鼠受精卵至卵裂期。将100个受精卵平均分为10组，每组10个，且每组均加入相同体积的培养液，培养至第3天后在显微镜下观察统计卵裂率。将配方I~III、V卵裂胚数据分别与配方IV卵裂胚数据进行差异性比较，结果如下（表6）：
表6
组别 配方I 配方II 配方III 配方IV 配方V
柠檬酸钠mmol/L — 2.27 — 1.12 0.85
谷胱甘肽mmol/L — — 2.27 1.15 0.91
测试受精卵数量（个） 100 100 100 100 100
卵裂率（%） 68 72 74 98 87
P值 4.46×10<sup>-8</sup> 4.89×10<sup>-8</sup> 2.12×10<sup>-8</sup> — 0.06
数据结果表明，配方I~III中不添加或只添加柠檬酸钠和谷胱甘肽其中一种的卵裂胚培养液，卵裂率均低于75%，当培养液中同时添加柠檬酸钠和谷胱甘肽时，卵裂率明显提高，卵裂率≥87%，当添加的柠檬酸钠1.12mmol/L、谷胱甘肽1.15mmol/L时，取得的胚胎培养效果最佳，卵裂率可达98%。配方I~III、V与配方IV进行差异分析数据显示，配方I~III与配方IV的P值小于0.05，具有显著性差异，而添加了两种抗氧化剂的配方V与配方IV之间P值大于0.05，不具有显著性差异，因此可知，在丙酮酸钠、乳酸钠的基础上，同时添加抗氧化剂柠檬酸钠和谷胱甘肽能有效促进胚胎生长发育。虽然培养液中含有另外两种抗氧化剂丙酮酸钠、乳酸钠但缺乏柠檬酸钠和谷胱甘肽或其中一种时，胚胎发育受到阻滞，四种成分联合使用时方可取得最优的培育效果。
实施例3：
本实施例的卵裂胚培养液包括碳酸氢钠24.500mmol/L、氯化钙1.40mmol/L、氯化钾2.5mmol/L、氯化钠80.00mmol/L、硫酸镁0.10mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.005mmol/L、酚红0.009 mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.80mmol/L、葡萄糖0.1mmol/L、丙酮酸钠1.1mmol/L、乳酸钠24.00mmol/L、庆大霉素9.5 mmol/L、甘氨酸2.5mmol/L、丙氨酸2.5mmol/L、丝氨酸2.5mmol/L、天冬酰胺0.5mmol/L、天冬氨酸0.5mmol/L、谷氨酸0.5mmol/L、脯氨酸0.5mmol/L柠檬酸钠0.8 mmol/L、谷胱甘肽0.8 mmol/L和人血清白蛋白9.5mg/mL，溶剂为水。
其制备方法同实施例1，由此得到卵裂胚培养液。
实施例4：
本实施例的卵裂胚培养液包括碳酸氢钠28.600mmol/L、氯化钙3.20mmol/L、氯化钾7.5mmol/L、氯化钠108.00mmol/L、硫酸镁0.80mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.043mmol/L、酚红0.009 mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.30mmol/L、葡萄糖0.3mmol/L、丙酮酸钠2.3mmol/L、乳酸钠29.00mmol/L、庆大霉素12mmol/L、甘氨酸5.3mmol/L、丙氨酸5.3mmol/L、丝氨酸5.3mmol/L、天冬酰胺1.2mmol/L、天冬氨酸1.2mmol/L、谷氨酸1.2mmol/L、脯氨酸1.2mmol/L柠檬酸钠2.4 mmol/L、谷胱甘肽2.4 mmol/L和人血清白蛋白11mg/mL，溶剂为水。
其制备方法同实施例1，由此得到卵裂胚培养液。
以上是实施例仅用以说明本发明的技术方案并非限制，对于本领域的普通技术人员来说，对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明原理的基础上，其均应涵盖在本发明权利要求范围内。

Claims (2)

1.一种卵裂胚培养液，其特征在于，所述的卵裂胚培养液包括碳酸氢钠26.4mmol/L、氯化钙2.2mmol/L、氯化钾5.3mmol/L、氯化钠105.6mmol/L、硫酸镁0.31mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.014mmol/L、酚红0.009mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.05mmol/L、葡萄糖0.18mmol/L、丙酮酸钠为1.67mmol/L乳酸钠为28.3mmol/L、庆大霉素11.4mg/L、甘氨酸5.10mmol/L、丙氨酸4.30mmol/L、丝氨酸3.20mmol/L，天冬酰胺0.92mmol/L、天冬氨酸1.13mmol/L、谷氨酸0.86mmol/L、脯氨酸0.54mmol/L、柠檬酸钠1.12mmol/L、谷胱甘肽1.15mmol/L和人血清白蛋白10.8mg/mL，溶剂为水。
2.一种权利要求1所述的卵裂胚培养液的制备方法，其特征在于，
配方：
所述的卵裂胚培养液包括碳酸氢钠26.4mmol/L、氯化钙2.2mmol/L、氯化钾5.3mmol/L、氯化钠105.6mmol/L、硫酸镁0.31mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.014mmol/L、酚红0.009mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.05mmol/L、葡萄糖0.18mmol/L、丙酮酸钠为1.67mmol/L乳酸钠为28.3mmol/L、庆大霉素11.4mg/L、甘氨酸5.10mmol/L、丙氨酸4.30mmol/L、丝氨酸3.20mmol/L，天冬酰胺0.92mmol/L、天冬氨酸1.13mmol/L、谷氨酸0.86mmol/L、脯氨酸0.54mmol/L、柠檬酸钠1.12mmol/L、谷胱甘肽1.15mmol/L和人血清白蛋白10.8mg/mL，溶剂为水；
将氯化钙、氯化钾、氯化钠、硫酸镁、乳酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠按先固体后液体的顺序溶入注射用水中；然后加入丙氨酰谷氨酰胺、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、柠檬酸钠、谷胱甘肽、庆大霉素、乙二氨四醋酸四钠、酚红，持续搅拌使其充分溶解，并通入5%~6%的CO2气体，然后加入人血清白蛋白，过滤除菌，由此得到卵裂胚培养液。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103173403A (zh) * 2013-02-01 2013-06-26 金星亮 一种分程胚胎培养液及其配制方法
CN104017728A (zh) * 2014-06-23 2014-09-03 余裕炉 用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系
CN104140950A (zh) * 2014-08-08 2014-11-12 山东威高新生医疗器械有限公司 卵裂培养液及其制备方法
US20150218511A1 (en) * 2012-08-21 2015-08-06 National Federation Of Agricultural Cooperative Associations Method for non-freeze low-temperature preservation of mammalian embryo or fertilized egg
CN108251353A (zh) * 2018-01-22 2018-07-06 深圳韦拓生物科技有限公司 一种人胚胎体外培养液及培养系统
CN108531582A (zh) * 2018-05-15 2018-09-14 广州达瑞生殖技术有限公司 一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法
CN108728403A (zh) * 2018-06-05 2018-11-02 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种卵裂培养液及其制备方法
CN110066763A (zh) * 2019-05-21 2019-07-30 天津博裕力牧科技有限公司 促进牛体外胚胎培养受精卵发育的方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150218511A1 (en) * 2012-08-21 2015-08-06 National Federation Of Agricultural Cooperative Associations Method for non-freeze low-temperature preservation of mammalian embryo or fertilized egg
CN103173403A (zh) * 2013-02-01 2013-06-26 金星亮 一种分程胚胎培养液及其配制方法
CN104017728A (zh) * 2014-06-23 2014-09-03 余裕炉 用于人类卵子与精子体外授精及胚胎早期发育的培养装置、培养液及培养体系
CN104140950A (zh) * 2014-08-08 2014-11-12 山东威高新生医疗器械有限公司 卵裂培养液及其制备方法
CN108251353A (zh) * 2018-01-22 2018-07-06 深圳韦拓生物科技有限公司 一种人胚胎体外培养液及培养系统
CN108531582A (zh) * 2018-05-15 2018-09-14 广州达瑞生殖技术有限公司 一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法
CN108728403A (zh) * 2018-06-05 2018-11-02 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种卵裂培养液及其制备方法
CN110066763A (zh) * 2019-05-21 2019-07-30 天津博裕力牧科技有限公司 促进牛体外胚胎培养受精卵发育的方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, ES等: ""Promoting effect of amino acids added to a chemically defined medium on blastocyst formation and blastomere proliferation of bovine embryos cultured in vitro"", 《ANIMAL REPRODUCTION SCIENCE》 *
周世贤: ""小鼠胚胎体外培养体系的优化"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》 *
周荣等: ""胚胎培养液中能量底物对猪体细胞克隆胚胎体外培养的影响"", 《广东畜牧兽医科技》 *
孙思怡等: ""动物早期胚胎体外培养的研究进展"", 《畜牧与饲料科学》 *
尹多: ""抗氧化剂对延边黄牛体细胞克隆胚胎体外发育的影响"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *
豆昌凤等: ""不同葡萄糖浓度对小鼠胚胎体外发育影响"", 《阜阳师范学院学报（自然科学版）》 *
钱怀剑等: ""小鼠胚胎体外发育培养基中氨基酸含量变化"", 《动物学杂志》 *

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