CN110643569B - 一种颗粒细胞剥离液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种颗粒细胞剥离液及其制备方法。它包括含有抗菌剂、酚红指示剂、透明质酸酶20‑22mmol/L和蛋白添加剂人血清白蛋白的基础溶液、HEPES 33‑36mmol/L、TES 10.5‑12.0mmol/L、DIPSO 10.5–12.0mmol/L和精氨酸3.5–5.0mmol/L。本发明的各组合物不仅能为卵母细胞的卵丘细胞及周围的颗粒细胞团的玻璃提供有效的作用，并在此体外剥离操作期间的提供充足的能量物质、提供更加稳定的缓冲系统、提高受精率，也为后期受精阶段的卵母细胞提供该时期所需的特殊营养物质，为卵子体外处理、预培育提供了理想的环境，有助于辅助生殖技术的进一步开展及提高成功率。

Description

一种颗粒细胞剥离液及其制备方法
技术领域
本发明属于人类辅助生殖领域，具体涉及一种应用于人类辅助生殖医学技术的颗粒细胞剥离液及制备方法。
背景技术
颗粒细胞剥离液是辅助生殖技术中广泛使用的一种产品。颗粒细胞剥离液是为了分离卵子周围的卵丘细胞及卵丘复合体，在基础的培养液成分中添加了透明质酸酶。透明质酸酶一种攻击透明质酸的己糖胺键的酶，这种糖胺聚糖构成了将卵丘细胞聚集在一起的细胞外基质，在ICSI（卵胞浆内单精子注射）技术的应用前前对保证卵母细胞的质量及免受损失。
现在，在中国的辅助生殖技术市场，颗粒细胞剥离液的使用依赖于进口成品，不但成本高，更重要的是解决方案的有效性不能得到很好的保证。颗粒细胞剥离液在失去效力后继续使用会影响卵母细胞处理的质量，并对卵母细胞处理后的质量、受精卵的形成及发育造成不良后果。
目前，国内辅助生殖用液依赖进口，而国内暂无对这类产品进行自主生产，缺乏议价空间，价格高昂从而患者的医疗成本较高，增加了经济负担。进口产品往往需要通过长途运输，长途运输过程中因存储条件无法得到保证，运输时间较长，使得培养液使用效果下降，无法对临床的卵子及形成的胚胎培养提供最佳效果，直接影响胚胎的发育，造成不良后果。在国内生产人类辅助生殖医学技术培养液，避免了国外进口产品因长途运输带来的不明因素，减轻患者的经济负担。
由于ICSI技术应用前对卵母细胞剥离卵丘细胞及周围的颗粒细胞团的操作位于体外，为维持一个合适的、更接近于人体的生理环境，在常规的以HEPES(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸)为缓冲物质的颗粒细胞剥离液组合物的基础上可添加两种不同的缓冲物质，及为卵母细胞提供一个更接近生理环境及pH值、渗透压更不容易改变的环境，两种不同缓冲物质分别为TES（2-[[三(羟甲基)甲基]氨基]乙磺酸）、DIPSO(3-双(2-羟乙基)氨基-2-羟基丙磺酸)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种质量合格、稳定的颗粒细胞剥离液，其能在剥离卵丘细胞的同时保持卵母细胞的活力。
为实现上述目标，本方案所提供的技术方案是：
本发明的颗粒细胞剥离液，其特征在于：由下列成分组成：基础溶液、HEPES34.64mmol/L、TES 11mmol/L、DIPSO 11.0 mmol/L和精氨酸7.0mmol/L；所述的基础溶液由以下组分组成：氯化钠119.35mmol/L、氯化钾5.9168mmol/L、磷酸二氢钾0.466mmol/L、氯化钙2.808mmol/L、碳酸氢钠4.2664mmol/L、丙酮酸钠0.676mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.052mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.841mmol/L、葡萄糖5.92mmol/L、乳酸钠7.685mmol/L、庆大霉素 23.5mg/L、酚红指示剂0.05 mg/L、透明质酸酶21.88mmol/L、人血清白蛋白 5g/L，溶剂为注射用水，渗透压保持在260~290mOsm/Kg，pH值维持在7.1~7.5。
本发明的第二个目的是提供一种颗粒细胞剥离液的制备方法，包括以下步骤：
（1）称取氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、丙氨酰谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和透明质酸酶加入到注射用水中，然后依次加入螯合剂乙二氨四醋酸四钠、抗菌剂庆大霉素、酚红指示剂、碳酸氢钠及三种不同的缓冲物质HEPES、TES和DIPSO，并通入5%~6%的CO2气体，制得溶液A；所述的注射用水经中空纤维超滤膜过滤，内毒素＜0.005EU/mL；
（2）将抗氧化物质精氨酸、蛋白添加剂人血清白蛋白加入到溶液A中，到充分溶解为止，并持续通入5%~6%的CO2气体，得到溶液。
（3）检测步骤（2）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（4）将步骤（3）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，得到颗粒细胞剥离液；
（5）将步骤（4）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装、封口，贴标、包装，并至于2~8℃下贮存。
（6）随机抽取包装好的颗粒细胞剥离液成品进行检测，检测项目及其参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
鼠胚试验：1-细胞鼠胚试验96小时内扩张囊胚率≥80%。
有益效果
1、本发明所述的颗粒细胞剥离液是在基础溶液的基础上，添加了三种不同的缓冲物质，使得此制动液的缓冲系统更为稳定，更适宜在卵子长时间在体外进行操作，不受损失，处理过后的卵子的受精率更高。
2、本发明的各组合物不仅能为卵母细胞的卵丘细胞及周围的颗粒细胞团的剥离提供有效的作用，并在此体外剥离操作期间的提供充足的能量物质、提供更加稳定的缓冲系统、提高受精率，也为后期受精阶段的卵母细胞提供该时期所需的特殊营养物质，为卵子体外处理、预培育提供了理想的环境，有助于辅助生殖技术的进一步开展及提高成功率。
3、本发明简便、易用、成本较低，适宜在国内自主进行配制、生产，减少对进口产品的依赖，减轻病患、医院生殖中心医疗经济负担。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本说明做进一步说明。
实施例1
（1）根据表1中的配方1、配方2、配方3、配方4、配方5成分表（溶剂为注射用水），称取氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、丙氨酰谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和透明质酸酶加入到注射用水中，然后依次加入螯合剂乙二氨四醋酸四钠、抗菌剂庆大霉素、酚红指示剂、碳酸氢钠及三种不同的缓冲物质HEPES、TES和DIPSO，并通入5%~6%的CO2气体，制得溶液A；所述的注射用水经中空纤维超滤膜过滤，内毒素＜0.005EU/mL；
（2）将抗氧化物质精氨酸、蛋白添加剂人血清白蛋白加入到溶液A中，到充分溶解为止，并持续通入5%~6%的CO2气体，得到溶液。
（3）检测步骤（2）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（4）将步骤（3）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，得到颗粒细胞剥离液。
（5）将步骤（4）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装、封口，贴标、包装，并至于2~8℃下贮存。
（6）随机抽取包装好的颗粒细胞剥离液成品进行检测，检测项目及其参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
所述配方1仅含有HEPES作为缓冲物质，配方2、配方3、配方4、配方5添加了TES、DIPSO作为缓冲物质，其他组分含量均一致。配方1中HEPES含量与常规颗粒细胞剥离液含量相当。使用配方1、配方2、配方3、配方4、配方5配制并检测合格的产品进行小鼠体外受精试验，记录不同配方产品的受精率。
表1
组分名称 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5
碳酸氢钠mmol/L 4.2664 4.2664 4.2664 4.2664 4.2664
氯化钙mmol/L 2.808 2.808 2.808 2.808 2.808
氯化钾mmol/L 5.9168 5.9168 5.9168 5.9168 5.9168
氯化钠mmol/L 119.35 119.35 119.35 119.35 119.35
磷酸二氢钾mmol/L 0.466 0.466 0.466 0.466 0.466
乙二氨四醋酸四钠mmol/L 0.052 0.052 0.052 0.052 0.052
酚红mmol/L 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
丙氨酰谷氨酰胺mmol/L 1.841 1.841 1.841 1.841 1.841
D-(+)-葡萄糖mmol/L 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92
丙酮酸钠mmol/L 0.676 0.676 0.676 0.676 0.676
庆大霉素mg/L 23.50 23.50 23.50 23.50 23.50
乳酸钠mmol/L 7.685 7.685 7.685 7.685 7.685
人血清白蛋白g/L 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
精氨酸mmol/L 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0
HEPES mmol/L 56.64 35.64 34.64 33.64 32.64
TES mmol/L 0 10.5 11.0 11.5 12.0
DIPSO mmol/L 0 10.5 11.0 11.5 12.0
透明质酸酶mmol/L 21.88 21.88 21.88 21.88 21.88
使用配方1 - 配方5配制的颗粒细胞剥离液应用于小鼠根据常规取卵方法取得的卵母细胞，并将剥离卵母细胞周围颗粒细胞后的卵母细胞应用于已使用同种常规市售精子冲洗液对各组精子进行洗涤、上游离心及获能的小鼠精子，按照常规小鼠IVF操作流程，向各组小鼠卵母细胞加入获能后的精子，进行受精试验。将100个小鼠成熟卵细胞平均分为10组，每组10个，受精17小时后在显微镜下观察统计受精率，并对配方2~5数据分别与配方1数据进行差异性比较，结果如表2：
表2
组别 配方1 配方2 配方3 配方4 配方5
HEPES mmol/L 56.64 35.64 34.64 33.64 32.64
TES mmol/L 0 10.5 11.0 11.5 12.0
DIPSO mmol/L 0 10.5 11.0 11.5 12.0
每组测试卵细胞数（个） 100 100 100 100 100
总受精卵数量（个） 76 87 96 91 89
平均受精率（%） 76 87 96 91 89
数据结果表明配方1 仅含有HEPES时，受精率只有76%，当使用添加了TES、DIPSO两种缓冲物质的配方2、3、4、5处理卵母细胞，各组的受精率有显著的提升，最优配方为配方3。配方2~5数据分别与配方1数据进行差异性分析，P值均小于0.05具有显著性差异。因此，添加适当TES、DIPSO两种缓冲物质可提供更加稳定的缓冲系统、提高受精率。
实施例2
（1）根据表3中的配方A、配方B、配方C、配方D、配方E成分表（溶剂为注射用水），称取氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、丙氨酰谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和透明质酸酶加入到注射用水中，然后依次加入螯合剂乙二氨四醋酸四钠、抗菌剂庆大霉素、酚红指示剂、碳酸氢钠及三种不同的缓冲物质HEPES、TES和DIPSO，并通入5%~6%的CO2气体，制得溶液A；所述的注射用水经中空纤维超滤膜过滤，内毒素＜0.005EU/mL；
（2）将抗氧化物质精氨酸、蛋白添加剂人血白蛋白加入到溶液A中，到充分溶解为止，并持续通入5%~6%的CO2气体，得到溶液。
（3）检测步骤（2）所得溶液的渗透压和pH值，记录最终渗透压和pH值；所述渗透压保持在260~290mOsm/Kg，所述pH值维持在7.1~7.5；
（4）将步骤（3）检验合格后的溶液经0.1μm过滤器过滤到无菌密封罐中，得到颗粒细胞剥离液。
（5）将步骤（4）无菌密封罐转移至百级层流系统中进行无菌灌装、封口，贴标、包装，并至于2~8℃下贮存。
（6）随机抽取包装好的颗粒细胞剥离液成品进行检测，检测项目及其参数：
pH值：7.1~7.5
渗透压：260~290mosm/Kg
内毒素：＜0.05EU/mL
无菌检查：合格
所述配方A中不含有抗氧化物质精氨酸，而所述配方B、配方C、配方D、配方E中的精氨酸含量不同，其他组分含量均一致。
表3
组分名称 配方A 配方B 配方C 配方D 配方E
碳酸氢钠mmol/L 4.2664 4.2664 4.2664 4.2664 4.2664
氯化钙mmol/L 2.808 2.808 2.808 2.808 2.808
氯化钾mmol/L 5.9168 5.9168 5.9168 5.9168 5.9168
氯化钠mmol/L 119.35 119.35 119.35 119.35 119.35
磷酸二氢钾mmol/L 0.466 0.466 0.466 0.466 0.466
乙二氨四醋酸四钠mmol/L 0.052 0.052 0.052 0.052 0.052
酚红mmol/L 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
丙氨酰谷氨酰胺mmol/L 1.841 1.841 1.841 1.841 1.841
D-(+)-葡萄糖mmol/L 5.92 5.92 5.92 5.92 5.92
丙酮酸钠mmol/L 0.676 0.676 0.676 0.676 0.676
庆大霉素mg/L 23.50 23.50 23.50 23.50 23.50
乳酸钠mmol/L 7.685 7.685 7.685 7.685 7.685
人血清白蛋白g/L 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00
精氨酸mmol/L 0 6.5 7.0 7.5 8.0
HEPES mmol/L 34.64 34.64 34.64 34.64 34.64
TES mmol/L 11.0 11.0 11.0 11.0 11.0
DIPSO mmol/L 11.0 11.0 11.0 11.0 11.0
透明质酸酶mmol/L 21.88 21.88 21.88 21.88 21.88
使用配方A~配方E配制的颗粒细胞剥离液应用于小鼠根据常规取卵方法取得的卵母细胞，并将剥离卵母细胞周围颗粒细胞后的卵母细胞应用于已使用同种常规市售精子冲洗液对各组精子进行洗涤、上游离心及获能的小鼠精子，按照常规小鼠IVF操作流程，向各组小鼠卵母细胞加入获能后的精子，进行受精试验。将100个小鼠成熟卵细胞平均分为10组，每组10个，受精17小时后在显微镜下观察统计受精率，并将配方B~E胚数据分别与配方A数据进行差异性比较，统计结果如表4：
表4
组别 配方A 配方B 配方C 配方D 配方E
精氨酸 mmol/L 0 6.5 7.0 7.5 8.0
每组测试卵细胞数（个） 100 100 100 100 100
总受精卵数量（个） 83 87 96 93 92
平均受精率（%） 83 87 96 93 92
P值 - 0.028 0.005 0.0192 0.0173
数据结果表明当颗粒细胞剥离液不含有精氨酸时，平均受精率只有83%，当使用添加了精氨酸的配方B、C、D、E处理卵母细胞，各组的受精率有显著的提升，最优配方为配方C。配方B~E数据分别与配方1数据进行差异性分析，P值均小于0.05具有显著性差异。因此，添加适当精氨酸可提高受精率。
实施例3：
本实施例的颗粒细胞剥离液，包括含有庆大霉素 23.5mg/L、酚红指示剂0.05 mg/L、透明质酸酶20mmol/L、HEPES 33mmol/L、TES 10.5mmol/L、DIPSO 10.5mmol/L、精氨酸3.5mmol/L，氯化钠118mmol/L、氯化钾5.5mmol/L、磷酸二氢钾0.42mmol/L、氯化钙2.0mmol/L、碳酸氢钠4.0mmol/L、丙酮酸钠0.60mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.0051mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.80mmol/L、葡萄糖5.8mmol/L、乳酸钠7.70mmol/L、人血清白蛋白 5g/L，溶剂注射用水。按照实施例1的制备方法制备得到颗粒细胞剥离液。
实施例4：
本实施例的颗粒细胞剥离液，包括庆大霉素 23.5mg/L、酚红指示剂0.05 mg/L、透明质酸酶22mmol/L、HEPES 36mmol/L、TES 12.0mmol/L、DIPSO 12.0mmol/L、精氨酸8.0mmol/L，氯化钠121mmol/L、氯化钾6.0mmol/L、磷酸二氢钾0.52mmol/L、氯化钙3.1mmol/L、碳酸氢钠4.5mmol/L、丙酮酸钠0.70mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.061mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.90mmol/L、葡萄糖6.2mmol/L、乳酸钠8.00mmol/L、人血清白蛋白 5g/L，溶剂为注射用水。按照实施例1的制备方法制备得到颗粒细胞剥离液。
以上是实施例仅用以说明本发明的技术方案并非限制，对于本领域的普通技术人员来说，对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明原理的基础上，其均应涵盖在本发明权利要求范围内。

Claims (2)

1.一种颗粒细胞剥离液，其特征在于：由下列成分组成：基础溶液、HEPES 34.64mmol/L、TES 11mmol/L、DIPSO 11.0 mmol/L和精氨酸7.0mmol/L；所述的基础溶液由以下成分组成：氯化钠119.35mmol/L、氯化钾5.9168mmol/L、磷酸二氢钾0.466mmol/L、氯化钙2.808mmol/L、碳酸氢钠4.2664mmol/L、丙酮酸钠0.676mmol/L、乙二氨四醋酸四钠0.052mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.841mmol/L、葡萄糖5.92mmol/L、乳酸钠7.685mmol/L、庆大霉素 23.5mg/L、酚红指示剂0.05 mg/L、透明质酸酶21.88mmol/L、人血清白蛋白 5g/L，溶剂为注射用水，渗透压保持在260~290mOsm/Kg，pH值维持在7.1~7.5。
2.一种权利要求1所述的颗粒细胞剥离液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）按照权利要求1中的成分组成，称取氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾、丙氨酰谷氨酰胺、葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠和透明质酸酶加入到注射用水中，然后依次加入螯合剂乙二氨四醋酸四钠、抗菌剂庆大霉素、酚红指示剂、碳酸氢钠及三种不同的缓冲物质HEPES、TES和DIPSO，并通入5%~6%的CO2气体，制得溶液A；
（2）将抗氧化物质精氨酸、蛋白添加剂人血清白蛋白加入到溶液A中，到充分溶解为止，并持续通入5%~6%的CO2气体，并渗透压保持在260~290mOsm/Kg，pH值维持在7.1~7.5，得到溶液经过滤除菌得到颗粒细胞剥离液。
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