CN115786251A

CN115786251A - 一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用

Info

Publication number: CN115786251A
Application number: CN202211596818.5A
Authority: CN
Inventors: 程金妹; 孙斐; 顾逸敏; 徐俊杰
Original assignee: Nantong University
Current assignee: Nantong University
Priority date: 2022-12-12
Filing date: 2022-12-12
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本申请公开一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用，通过研究不同的添加物改善排卵后卵母细胞体外老化的作用，筛选出一种能延缓排卵后卵母细胞老化的培养基，该培养基是在卵母细胞培养液中添加0.1‑30μM的黄芪甲苷IV而制得，该培养基安全无毒副作用，能够降低排卵后卵母细胞体外培养24小时后的卵碎裂率、活性氧水平和纺锤体异常率，与此同时也能显著提高成熟卵母细胞体外培养24小时后的线粒体膜电位、体外精子结合能力、体外受精原核率和卵裂率，整体提高后期胚胎质量，本发明培养基的应用为辅助生殖技术提供了有利支持，应用前景良好。

Description

一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用

技术领域

本发明属于辅助生殖生物学技术领域，具体涉及一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用。

背景技术

哺乳动物中，排卵后的成熟卵母细胞会一直等待受精，且卵母细胞与精子受精存在一个最佳的时间窗。若排卵后卵母细胞长时间未受精，即会发生老化，最终质量和受精后的胚胎发育能力显著下降。这种类型的卵母细胞老化与年龄无关，而与排卵后的未受精或体外存放停留时间有关。由于在灵长动物中没有可见的排卵迹象，因而没有适当的机制来确保精子输送到雌性生殖道同排卵同步，进而增加了老化的排卵后卵母细胞和新鲜的精子受精的可能性，导致后期胚胎质量下降，妊娠失败。另外，随着生活方式、环境和女性年龄的增加，女性卵母细胞的质量每况愈下。此时，辅助生殖技术的出现给很多家庭带来了希望。辅助生殖中的试管婴儿技术中，排出的卵子在时间窗内及时与精子结合形成受精卵是辅助生殖成功的重要环节。然而，相当一部分成熟卵母细胞不能马上授精，需在培养液中培养一段时间，同时也有相当一部分卵母细胞体外受精失败后需要进行补救，即进行单精子卵胞浆显微注射。但是，这时候卵母细胞已经经历过体外受精18-24小时，发生了体外老化，最终导致单精注射后其受精率和胚胎发育潜能急剧下降。因此迫切需要一种能够改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基，来维持排卵后卵母细胞的质量，提高受孕率。

研究表明，排卵后卵母细胞的体外老化主要体现在活性氧水平的升高、线粒体功能紊乱，染色体分离错误和体外受精能力下降等。如果在体外培养基中添加一些成分，能够缓解排卵后卵母细胞的老化，抑制其胞内活性氧水平的上升、维持线粒体功能和减少染色体排列错误，这就可以大大提高辅助生殖率。另一方面，如果可以，口服这类成分也可能将延长体内卵子等待精子受精的时间，从而提高怀孕率和妊娠率。

黄芪甲苷IV是中药黄芪的主要活性成分之一，分子式是C₁₄H₆₈O₁₄。黄芪甲苷IV是从黄芪中提取的一种羊毛脂醇形四环三萜皂苷。它具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗细胞凋亡、调节代谢、抗纤维化、抑制肿瘤、降糖及改善胰岛素抵抗活性等多种生物活性，并对肾脏、肝脏、神经中枢、心血管和胃肠道等都具有保护作用。鉴于黄芪甲苷IV表现出来的优势，越来越多的科研人员都在进一步发掘其新用途，以充分利用黄芪甲苷IV的药用价值。但是，尚不确定黄芪甲苷能否缓解排卵后卵母细胞体外和体内老化，能否应用于辅助生殖技术，目前也尚无此方面的研究报道。

现有技术任雪华等人公开了黄芪甲苷灌胃可以显著提高T1D雌鼠的超数排卵数量，抑制卵泡颗粒细胞凋亡，改善T1D组卵母细胞的ROS水平等，最终改善T1D对雌性生殖系统造成的损伤。该项技术是通过对小鼠进行黄芪甲苷IV灌胃来进行体内实验。一方面，因为刘晓亚等人通过对黄芪甲苷IV药物动力学和体内外代谢表明，黄芪甲苷IV作为大分子，其口服生物利用率低。并且在体内易发生生物转化，生成皂苷元环黄芪醇发挥药效。环黄芪醇在体外被证明拥有抗氧化功能，并且能激活端粒酶保护端粒(WuJetal.,PhytotherRes2020,WangYetal.,BrJPharmaco2019)，增加细胞的增殖能力，抵抗细胞的凋亡(Seviml-Guetal.,JEthnopharroacol2011)。另一方面，现有技术任雪华等人在其灌胃黄芪甲苷IV抑制卵泡颗粒细胞凋亡缓解糖尿病雌鼠生殖能力中也公开推测其体内代谢物环黄芪醇在抑制颗粒细胞凋亡和改善ROS水平上发挥着作用。因此，该项研究中最终是否是以黄芪甲苷IV在体内发挥作用，还是其生物转化物发挥以及它们之间协同发挥作用均并不知晓。而本申请中首次通过在体外胚胎培养液中直接添加黄芪甲苷IV，直接研究黄芪甲苷IV本身的作用能否缓解排卵后卵母细胞体外老化。此外，现有技术任雪华等人中公开的是黄芪甲苷通过灌胃体内吸收后对卵母细胞体内外成熟这一阶段的影响作用。但是，卵母细胞体内外成熟与成熟后卵母细胞老化走向凋亡所涉及到的信号通络、胞内细胞质变化、结构功能的改变均是不同的。本申请并不可以从该项研究中显而易见得出黄芪甲苷能够改善排卵后成熟卵母细胞的体外老化以及其具体的浓度。

发明内容

解决的技术问题：

本申请针对现有技术的不足，解决了目前排卵后卵母细胞的体外老化主要体现在活性氧水平的升高、线粒体功能紊乱，染色体分离错误和体外受精能力下降等技术问题，提供了一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用，利用该培养基体外改善排卵后卵母细胞质量的方法。

技术方案：

为实现上述目的，本申请通过以下技术方案予以实现：

一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基，所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基由KSOM培养基、FBS、EGF、丙酮酸钠和黄芪甲苷IV组成；所述FBS占最终体系体积5％；EGF占最终体系体积20ng/ml；丙酮酸钠占最终体系体积30ug/ml，所述黄芪甲苷IV的终浓度为0.1-30μM。

本申请还公开了改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基在成熟卵母细胞体外存放过程中保护其质量的应用。

进一步地，所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中黄芪甲苷IV的终浓度为0.3-1μM。

进一步地，所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中黄芪甲苷IV的终浓度为0.3-0.5μM。

进一步地，所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中黄芪甲苷IV的终浓度为0.5μM。上述一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用的原理在于：本申请在KSOM培养基基础上添加了FBS、EGF、丙酮酸钠和黄芪甲苷IV，KSOM培养基与占最终体系体积5％的FBS、20ng/mlEGF、30ug/ml丙酮酸钠和0.1-30μM黄芪甲苷IV之间产生协同作用能，够显著发挥其抗氧化和抗凋亡的作用，改善成熟后卵母细胞体外老化24小时后的线粒体膜电位、体外精卵结合能力、体外受精原核率和卵裂率(2-细胞率)，整体提高后期胚胎质量。

有益效果：

本申请提供了一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基及其应用，与现有技术相比，具备以下有益效果：

1.应用黄芪甲苷IV改善成熟卵母细胞体外老化：本发明首次采用一步体外胚胎培养法，应用黄芪甲苷IV改善成熟卵母细胞的体外老化，特别是体外老化24小时的卵母细胞活性氧水平和线粒体功能，提高成熟卵母细胞体外培养一段时间后的质量和潜在的胚胎发育能力。采用本技术方案增加成熟卵母细胞体外培养的时间，给人们更多的时间和可能性来进行辅助生殖技术或自然受孕，大大提高怀孕率和提高新生儿率。当然，本发明也可以用于改善体内成熟后卵母细胞24小时内的体外或体内老化，给长期困扰于不孕的家庭带来希望。

2.提高小鼠成熟卵母细胞体外培养24小时后的原核和2-细胞率，提高胚胎质量：通过本发明的体外卵母细胞培养方法，成熟卵母细胞体外培养24小时后，其体外原核率为36.4±0.27％，比对照组增加了接近两倍，与对照组相比2-细胞发育率为26.23±0.28％，显著得到增加，胚胎质量有所提高，并提高排卵后卵母细胞体外培养一段时间后的潜在利用价值。

3.为人类和其他哺乳动物的胚胎生物技术提供了支持：本发明培养基有力的改善了排卵后卵母细胞体外培养一段时间后的细胞质量和潜在的胚胎发育能力；这一成果为其他胎生哺乳动物，比如人类、羊、马、猪、熊猫、灵长类生育繁殖技术的发展提供了支持。

4.操作简单，安全无毒性：黄芪甲苷IV作为中药的一种成分已经相传几千年，对细胞安全性高，具有很好透过性，容易进入细胞而对细胞没有损伤，有效剂量范围内没有毒性。操作简单，只需要在常规排卵后卵母细胞体外胚胎培养液中增加一定量的黄芪甲苷IV即可。

附图说明

图1为本申请黄芪甲苷IV的化学式；

图2为本申请对照组和实验组成熟卵母细胞中的线粒体膜电位和ROS水平图；其中图A是对照组(左)和实验组(右)成熟后卵母细胞体外老化24小时后ROS水平的代表荧光图；图B为对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后ROS水平的免疫荧光相对强度图；图C为对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后JC-1红色和绿色荧光代表图，图C中左上图为对照组JC1红色荧光代表图，右上图为实验组JC1红色荧光代表图，左下图为对照组JC1绿色荧光代表图，左下图为实验组JC1荧光代表图；图D为对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后线粒体膜电位相对比值图。

图3为本申请对照组和实验组成熟卵母细胞中早期凋亡信号、染色体排列、微丝分布和纺锤体形态图；其中图A对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后发生早期凋亡的数量统计图；图B为对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后发生染色体错误排列的数量统计图；图C为成熟后卵母细胞体外老化24小时微丝骨架正常(左)和异常(右)分布代表图；图D为对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后微丝分布发生异常的数量统计图；图E为成熟后卵母细胞体外老化24小时纺锤体形态正常(左)和异常(右)代表图；图F为对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后发生纺锤体形态异常的数量统计图。

图4为本申请对照组和实验组成熟卵母细胞中精子结合数量、原核率和卵裂率图；其中图A是体外老化24小时的成熟卵母细胞与精子结合的代表图，其正下方的是对照组和实验组成熟后卵母细胞体外老化24小时后与精子结合的数量统计图；图B小鼠原核胚胎代表图，其正下方对照组和实验组原核形成率的统计图；图C是小鼠2细胞胚胎代表图，其正下方对照组和实验组卵裂率的统计图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实验小鼠是来自于南通大学动物饲养中心，黄芪甲苷IV购自美国Sigma公司。

实施例1：

一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基，由KSOM培养基、FBS、EGF、丙酮酸钠和黄芪甲苷IV组成；所述FBS占最终体系体积5％；EGF占最终体系体积20ng/ml；丙酮酸钠占最终体系体积30ug/ml，所述黄芪甲苷IV的终浓度为0.1-30μM。

所述的改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基在成熟卵母细胞体外存放过程中保护其质量的应用，具体为改善哺乳动物成熟卵母细胞体外存放24小时后的卵母细胞质量，最终表现在提高其体外受精后原核率和/或胚胎发育率中的应用；所述卵母细胞是体内成熟后的卵母细胞或体内成熟后体外培养了24小时的卵母细胞；所述哺乳动物为胎生哺乳动物。所述胎生哺乳动物为人或灵长类，牛、羊、马、鼠、猪、熊猫；所述改善哺乳动物成熟卵母细胞体外存放24小时后的卵母细胞质量的方法，包括以下步骤：

第一步：将排卵后的卵母细胞在最终体系体积含5％FBS、20ng/mlEGF和30ug/ml丙酮酸钠的KSOM培养基中清洗后，再到本申请的改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基清洗；

第二步：清洗后，将排卵后卵母细胞置于改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中，于CO₂培养箱中37℃，5％CO₂，100％湿度中培养；

卵母细胞数量：改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基体积按照1:3-1:10μL的比例，于培养箱中培养12-24小时，培养条件37℃，5％CO₂，100％湿度。优选培养时间应为24小时。

所述第一步的排卵后卵母细胞为小鼠腹腔注射完促黄体素12小时后收集的成熟卵母细胞。

实施例2

小鼠排卵后卵母细胞体外培养：

(1)成熟卵母细胞的收集

对8-10周龄的雌性小鼠通过腹腔注射PMSG5IU,48小时后腹腔注射hCG5IU。12小时后，小鼠安乐死，收集排卵后的卵母细胞。

(2)成熟卵母细胞的体外培养

配制改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基，由KSOM培养基、FBS、EGF、丙酮酸钠和黄芪甲苷IV组成；所述FBS占最终体系体积5％；EGF占最终体系体积20ng/ml；丙酮酸钠占最终体系体积30ug/ml，所述黄芪甲苷IV的终浓度为0.5μM；将改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基在CO₂培养箱中平衡2～3小时；

挑选细胞形态正常，折光性好的排卵后卵母细胞放入到最终体系体积含5％FBS、20ng/ml EGF和30ug/ml丙酮酸钠的KSOM培养基中清洗2-3次，然后放入装有改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基的35mm培养皿中清洗；

清洗后，每孔加入改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基50-65μL，覆盖矿物油，每孔滴放入15-20枚排卵后卵母细胞。最后将培养皿置于培养箱中培养，培养条件为37℃，5％CO₂和100％湿度，培养时间为24小时。

成熟培养24小时后，检测排卵后卵母细胞的碎裂、畸形和细胞形态异常等不正常情况，统计异常率(以常规未添加黄芪甲苷IV的最终体系体积含5％FBS、20ng/ml EGF和30ug/ml丙酮酸钠的KSOM培养基培养的成熟卵母细胞为对照)。结果见表1。以下对照组与实验组的除黄芪甲苷IV是否添加外，其他培养条件均相同。

表1添加黄芪甲苷IV后对成熟卵母细胞体外培养24h后的细胞形态的影响

分组	卵母细胞数量	异常率(％)
			对照组	180	27.5±3.13<sup>a</sup>
实验组	165	8.7±2.12<sup>b</sup>

注：上表用t检验进行统计分析。同列不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

表1实验结果表明改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中培养24小时后，较在常规最终体系体积含5％FBS、20ng/ml EGF和30ug/ml丙酮酸钠的KSOM培养基中培养中的异常率大大下降，且在统计学意义上有显著差异(P＜0.05)。

(3)成熟卵母细胞体外培养24小时后的活性氧和线粒体膜电位水平

用上述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基培养的排卵后卵母细胞进行进一步实验。

活性氧(ROS)水平:将上述培养24小时后的成熟卵母细胞，放入氧化敏感性荧光探针DCFH-DA(1：250)，37℃，5％CO₂培养箱孵育30分钟，通过荧光倒置显微镜下观察发现黄芪甲苷IV添加后能够有效降低排卵后卵母细胞ROS的积累(图2A，2B)。通过图2A，2B可以得出黄芪甲苷IV能够缓解成熟后卵母细胞体外老化过程中的氧化损伤。高水平的ROS会诱导线粒体损伤，利用JC-1染料对上述卵母细胞线粒体膜电位进行检测，结果发现黄芪甲苷IV添加组卵母细胞线粒体膜电位与未添加组相比显著升高，缓解了体外培养成熟后卵母细胞老化的影响(图2C，2D)。图2C，2D表明黄芪甲苷IV对成熟卵母细胞体外老化过程中的线粒体膜具有保护作用。

(4)成熟卵母细胞体外培养24小时后的早期凋亡和染色体排列

通过利用AnnexinV-FITC对体外培养24小时后的成熟卵母细胞早期凋亡水平进行检测。结果发现，黄芪甲苷IV添加组(实验组)卵母细胞凋亡水平明显降低(图3A)。染色体排列通过对细胞核进行DAPI染色，发现黄芪甲IV添加组能够缓解染色体的错误排列(图3B)。

(5)排卵后卵母细胞体外培养24小时后纺锤体和微丝的分布

通过对体外培养24小时后的排卵后卵母细胞进行固定，渗透，封闭和tubulin-FITC或鬼笔环肽-FITC室温孵育1.5小时，它们分别标记纺锤体和微丝。通过荧光共聚焦显微镜下观察微丝分布和纺锤体形态。结果表明，黄芪甲苷IV添加组可以改善微丝异常缺失和纺锤体形态异常的情况(图3C，3D，3E，3F)。

(6)排卵后卵母细胞体外培养24小时后体外精子结合数量、原核率和2-细胞率。

24小时体外培养的排卵后卵母细胞在体外授精6小时后，通过口吸管操作玻璃针洗掉多余的未和卵子结合的精子，然后固定、渗透和染细胞核，统计和卵母细胞结合的精子数量。于此同时，用比较细的玻璃针将卵母细胞周围所有的精子洗掉，然后放入到预先平衡好的最终体系体积含5％FBS、20ng/mlEGF和30ug/ml丙酮酸钠的KSOM培养基中培养6小时和24小时，分别统计原核率和2-细胞(卵裂)率。结果发现，与对照组相比，添加黄芪甲苷IV组的排卵后卵母细胞在24小时体外培养后仍具有较强的精子结合率，较高的原核率和卵裂率(图4A,4B,4C)。这些结果均表明了黄芪甲苷IV具有明显改善排卵后卵母细胞的体外培养一段时间后的受精能力和早期胚胎发育能力。

图1-图4中*所标显著性均是实验组与对照组相比得出的显著性(p<0.05)。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基，其特征在于：所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基由KSOM培养基、FBS、EGF、丙酮酸钠和黄芪甲苷IV组成；所述FBS占最终体系体积5％；EGF占最终体系体积20ng/ml；丙酮酸钠占最终体系体积30ug/ml，所述黄芪甲苷IV的终浓度为0.1-30μM。

2.一种权利要求1所述的改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基在成熟卵母细胞体外存放过程中保护其质量的应用。

3.根据权利要求2所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基的应用，其特征在于：所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中黄芪甲苷IV的终浓度为0.3-1μM。

4.根据权利要求2所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基的应用，其特征在于：所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中黄芪甲苷IV的终浓度为0.3-0.5μM。

5.根据权利要求2所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基的应用，其特征在于：所述改善排卵后卵母细胞体外老化的培养基中黄芪甲苷IV的终浓度为0.5μM。