CN103387960A - mTOR信号通路激活剂及其在原始卵泡体外激活中的应用 - Google Patents
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Abstract
mTOR信号通路激活剂及其在原始卵泡体外激活中的应用，mTOR信号通路激活剂，包括mTOR信号通路激活剂I和II，mTOR信号通路激活剂I为50-200μM磷脂酸，mTOR信号通路激活剂II为20-50μM普萘洛尔。应用原始卵泡体外激活试剂盒处理小鼠或人卵巢皮质，可以激活组织中的原始卵泡并促进卵泡的发育，并且在小鼠能够得到功能完全正常的卵子，受精后胚胎在体外能够发育到囊胚阶段，胚胎移植后得到具有生育能力健康的后代。本发明提供了一种mTOR信号通路激活剂，同时提供了一种可供体外培养操作用的试剂盒，以使该技术应用于更大的医学辅助生殖领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种mTOR信号通路激活剂及其应用，特别涉及一种mTOR信号通路激活剂及其在原始卵泡体外激活试剂盒中的应用。
背景技术
在哺乳动物中，生殖细胞的生长和成熟是一个受到激素精细调节的过程。这些激素包括来自下丘脑的促性腺激素和生殖器官自身产生的激素和生长因子等。在雌性哺乳动物体内，卵泡是一个卵巢的基本功能单位，由位于中央的卵子及外围一层或多层颗粒细胞构成。按照卵泡中卵母细胞的不同生长发育阶段，可以分为原始卵泡，初级卵泡，次级卵泡，腔卵泡，排卵前卵泡。原始卵泡是卵巢中处于静息状态的卵泡库，在哺乳动物出生前或出生后，其数量是固定的，人每个卵巢中的原始卵泡大约有400，000左右。在卵巢的生长发育过程中，卵巢中的原始卵泡不停的被激活，进入生长期经过初级卵泡和次级卵泡阶段。在次级卵泡阶段，在初情期前没有促性腺激素（FSH）分泌的情况下，这些卵泡就会死亡而发生卵泡闭锁，而初情期后，在下丘脑分泌的FSH的刺激下，就会有一个或数个次级卵泡周期性的进一步发育长大直至排卵前卵泡。在这个过程中卵母细胞的体积会增长几百倍，周围颗粒细胞数量也会迅速增加，由最初的单层6-9个细胞增加至数层上千个细胞。除了下丘脑分泌的促性腺激素外，卵泡的发育也受到卵巢内部产生的激素和生长因子的影响，比如在卵泡内卵母细胞和周围的颗粒细胞就可以通过旁分泌的形式互相影响对方的生长发育。最终在排卵前激素峰的总用下，排卵前卵泡中卵母细胞成熟而排卵，而残留的颗粒细胞和theca细胞则发生黄体化，分泌激素为受精卵的发育做准备。
在哺乳动物的卵巢中，原始卵泡库中不停有原始卵泡被激活而进入生长期，这个过程被称为初始招募（initial recruiment）。初始招募并不受FSH的调节，而是受卵巢产生的一些生长因子的影响。许多生长因子都被发现参与了这个过程如PDGF，SDF，EGF等。在人每个月大约有1000个左右的原始卵泡进入生长期，而当原始卵泡库中的原始卵泡不足于1000时，卵巢将不再排卵，而此时女性也将进入绝经期。正常女性进入绝经期的年龄都在50岁左右，而在一些病理条件下，由于卵巢中原始卵泡库中储备不足而令女性提前进入绝境期（40岁之前）而引起卵巢早衰。卵巢早衰是一种非常常见的不孕不育症，在育龄女性中的发病率大概在1%。目前，关于原始卵泡激活的机制研究还不是特别清楚，除了上述提到的一些生长因子，科学家们通过基因敲除小鼠的研究，发现信号通路PTEN-PI3K-FOXO3以及mTOR-p70S6K-rpS6在原始卵泡的激活中发挥重要的作用。因此如何找到一个有效的办法调节原始卵泡的激活将具有非常重要的意义。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种mTOR信号通路激活剂及其在原始卵泡体外激活中的应用，本发明的另一目的是提供一种原始卵泡体外激活试剂盒。
技术方案：mTOR信号通路激活剂，包括mTOR信号通路激活剂I和II，mTOR信号通路激活剂I为50-200μM磷脂酸（phosphatidic acid，PA），mTOR信号通路激活剂II为20-50μM普萘洛尔（Propranolol，PRO）。
所述磷脂酸为200μM，普萘洛尔为50μM。
所述mTOR信号通路激活剂在制备激活原始卵泡并促进卵泡发育药物中的应用。
原始卵泡体外激活试剂盒包括以下组分：
1）mTOR信号通路激活剂I和II；
2）基本激活细胞培养液；
3）L-15培养液(GIBCO,invitrogen)。
所述的试剂盒，一种组成方案为，mTOR信号通路激活剂I为磷脂酸，其用量为：50-200μM；其中，mTOR信号通路激活剂II为普萘洛尔，其用量为：20-50μM；基本激活细胞培养液配方：MEMa(GIBCOTM Minimum Essential Medium(MEM)Alpha Medium(1X)liquid,Invitrogen)为母液，还含有丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10%wt、L-抗坏血酸(维生素C)50μg/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L。
所述的试剂盒，其中另一种试剂组成方案为：
溶液I：基本激活细胞培养液；
试剂I：mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200μM的磷脂酸和20-50μM的普萘洛尔，按照10mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装；
溶液II：L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白10%wt。
所述的试剂盒，第三种组成方案的试剂组成为：
溶液I：基本激活细胞培养液；
试剂I：预混在一起的mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200μM的磷脂酸和20-50μM的普萘洛尔，按照10mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装。
溶液II：L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白10%wt。
所述的试剂盒，将溶液I、试剂I、溶液II分别包装，再一同包装在同一包装盒内。
所述的试剂盒的制备方法，其中
基本激活细胞培养液配制方法如下：
MEMa为母液，还含有丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10%wt、L-抗坏血酸50μg/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L；
所述试剂I含有mTOR信号通路激活剂包括：
(1)mTOR信号通路激活剂I，50-200μM的磷脂酸，
(2)mTOR信号通路激活剂II，20-50μM的普萘洛尔；
其中，溶液II的配制方法如下：
L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白10%wt。
所述试剂盒的应用方法，步骤如下：
1）取卵巢皮质于5mL溶液II，将卵巢皮质切割成1mm3的小块，用溶液II反复清洗；
2）取1mL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配制成10mL的激活细胞培养液；
3）将卵巢皮质培养于含有悬浮小网（Millicell cell culture inserts，Millipore）的24-孔板，在小网下方加入400μL基本激活细胞培养液，培养24小时，培养条件为37℃，5%CO2；
4）24h后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
以上试剂盒和方法经过试验证明效果明显，有关效果试验如下：
1）新生小鼠卵巢体外激活后促进原始卵泡的发育
新生第三天小鼠卵巢用原始卵泡体外激活试剂盒激活并培养6小时后，提取卵巢蛋白检验mTOR信号通路标志分子磷酸化水平的变化。如图1A，经过mTOR信号通路激活剂PA以及propranolol（PRO）处理6h后，mTOR信号通路激活的下游分子，p70S6K和rs6的磷酸化水平显著升高，而受PI3K信号调控的Akt磷酸化水平则不受影响。为了进一步评价原始卵泡激活后卵泡的发育情况，新生第三天小鼠卵巢经体外激活试剂盒处理24后，将卵巢移植入受体鼠的肾被膜下，同时将受体鼠的双侧卵巢切除。术后第二天，每天给小鼠注射FSH至第14天，然后收集卵巢。如图1B所示，在每张图片中上层是对照组卵巢，下层是激活后的卵巢。与对照组相比无论是PA还是PRO都能促进卵巢的发育，并且具有协同作用。H&E染色结果表明，与对照组相比，经PA与PRO处理的卵巢中，可见许多卵泡处于排卵前阶段，在对照组的卵巢中可见成簇存在的原始卵泡，而在PA与PRO处理的卵巢中，大部分原始卵泡都被激活，可见成簇存在的初级卵泡（图1C）。将收集的卵巢进行连续切片并卵泡计数后，PA+PRO处理的卵巢中，其处于生长发育阶段的卵泡比例明显增多，而原始卵泡所占的比例却明显降低（图1D），表明mTOR信号通路激活剂能够激活小鼠卵巢中的原始卵泡并促进卵泡的发育。
2）应用原始卵泡体外激活试剂盒激活原始卵泡后并不影响卵子的质量
将用激活试剂盒处理过的卵巢，移植入受体鼠的肾被膜下，同时将受体鼠的双侧卵巢切除。术后第二天，每天给小鼠注射FSH至第18天，给于一次性腹腔注射hCG（10IU/鼠），12小时后，收集卵巢，针刺排卵卵泡并收集成熟的MII卵子，进行体外受精。其中一部分卵子和受精卵通过免疫荧光的方法评价卵子中纺锤体的结构以及表观遗传学的变化，其余的受精卵通过体外培养以及2-细胞胚胎移植的方法进一步评价卵子的质量。如图2a-c所示，免疫荧光结果表明，经原始卵泡体外激活后产生的成熟卵子（图2a）具有正常的纺锤体结构（图2b）以及甲基化水平（图2c），并且在受精后，雌雄原核具有正常的甲基化变化，即雌原核呈现高甲基化状态，而雄原核呈现去甲基化状态（图2d）。体外培养试验表明，受精卵在体外培养能够发育到囊胚（图2e、f），将其中一部分2细胞胚胎进行胚胎移植后，得到了健康的具有生殖能力的后代（图2g）。通过比较超数排卵卵子与原始卵泡体外激活后产生卵子体外受精后2-细胞的胚胎发育率以及胚胎移植后的出生率，可知虽然体外激活卵子受精后，2-细胞胚胎的发育率低于超排卵子，但胚胎移植后却具有相似的出生率（表1），表明原始卵泡体外激活步骤除了能够加速卵泡的发育，并不会影响卵子的质量。
3）mTOR信号通路激活剂PA和PRO能促进老年鼠卵巢中卵泡的发育
为了验证原始卵泡体外激活方案对于原始卵泡储备不足的老年鼠是否具有同样的激活作用，选取10-12月龄的小鼠，一侧卵巢包膜内注射相同剂量的mTOR信号通路激活剂PA和PRO，而另一侧卵巢包囊内注射生理盐水作为对照。14天后，收集卵巢进行连续切片以及H&E染色，与对照侧卵巢相比（图3A-a、b、e），注射PA和PRO侧卵巢中明显可见正在发育的各阶段卵泡（图3A-c、d、f）。卵巢切片计数结果表明，PA和PRO注射侧卵巢中各发育阶段的卵泡所占比例明显高于对照侧卵巢，而原始卵泡的比例则低于对照组，表明在老龄鼠的卵巢中剩余的原始卵泡仍能被mTOR信号通路激活剂激活并生长发育。
4）应用原始卵泡体外激活试剂盒激活后可以促进人卵巢皮质中原始卵泡的发育
将新鲜的或复苏的卵巢皮质切割成1-2mm3左右的小块后，应用原始卵泡体外激活试剂盒处理后，继续培养6天，如图4，原始卵泡体外激活试剂盒处理过的卵巢皮质中初级卵泡的数量明显增多，并且在组织学形态上明显优于对照组的卵泡。表明原始卵泡体外激活同样能够促进人卵巢皮质中原始卵泡的发育。
本发明根据以上原始卵泡体外激活方法设计了一种试剂盒，该试剂盒可以用于原始卵泡体外激活，通过使用该试剂盒，证明操作简单，省时省力，激活率强，避免了现用现配的麻烦，同时使操作标准化。
本发明的试剂盒，包括以下组分：
（1）mTOR信号通路激活剂PA和PRO；
（2）基本激活细胞培养液；
（3）L-15培养液。
其中，mTOR信号通路激活剂PA，中文名字磷脂酸，为一种小分子化合物，选自：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphate(sodium salt)，属于现有技术，可以从市场上购买得到，其用量为：50-200μM；其中PA的结构式如下：
其中，mTOR信号通路激活剂PRO，中文名字普萘诺尔，为一种小分子化合物，选自：Propranolol hydrochloride，属于现有技术，可以从市场上购买得到，其用量为：20-50μM；
其中，基本激活细胞培养液配方：
MEMa(GIBCOTM Minimum Essential Medium(MEM)Alpha Medium(1X)liquid,Invitrogen)为母液，还含有：
丙酮酸钠0.23mM
人血清白蛋白10%wt
L-抗坏血酸(维生素C)50μg/mL
链霉素50mg/L
青霉素75mg/L
本发明的试剂盒，是由以上组分制备而成的，其包括以下试剂：
溶液I：基本激活细胞培养液；
试剂I：mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200μM的PA和20-50μM的propranolol，按照10mL激活细胞培养液的剂量预先分装。
溶液II：L-15培养液+人血清白蛋白10%wt；
溶液I：基本激活细胞培养液，主要细胞培养液为MEMa，为现有技术可从市场上购买获得；
试剂I：mTOR信号通路激活剂I和II按一定比例混合，其中最优先的配比是：mTOR信号通路激活剂I-PA为200μM；mTOR信号通路激活剂II-propranolol为50μM。然后根据准备10mL激活培养液的剂量进行分装。
溶液II：L-15培养液+人血清白蛋白10%wt；L-15培养液和人血清白蛋白，为现有技术，也可以从市场上购买得到。
其中，溶液I，基本激活细胞培养液配制方法如下：
MEMa(GIBCOTM Minimum Essential Medium(MEM)Alpha Medium(1X)liquid,Invitrogen)为母液，还含有：
丙酮酸钠0.23mM
人血清白蛋白10%wt
L-抗坏血酸(维生素C)50μg/mL
链霉素50mg/L
青霉素75mg/L
试剂I的配制方法如下：
mTOR信号通路激活剂I，50-200μM的PA；
mTOR信号通路激活剂II，20-50μM的propranolol；
其中，溶液II的配制方法如下：
L-15（GIBCO，Invitrogen）+人血清白蛋白10%wt；
本发明的试剂盒，是将溶液I、试剂I、溶液II分别包装，再一同包装在包装盒内，使用时根据说明书中描述的原始卵泡体外激活方法进行操作。
本发明的试剂盒，其应用方法如下：
1）取卵巢皮质于5mL溶液II中将卵巢皮质切割成1mm3左右的小块，用溶液II反复清洗三次以上。
2）取1mL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配置成10mL的激活细胞培养液。
3）将卵巢皮质培养于含有悬浮小网（Millicell cell culture inserts，Millipore）的24-孔板，在小网下方加入400μL激活细胞培养液，培养24小时，培养条件为37℃，5%CO2。
4）24h后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
有益效果：综上，应用原始卵泡体外激活试剂盒处理小鼠或人卵巢皮质，可以激活组织中的原始卵泡并促进卵泡的发育，并且在小鼠能够得到功能完全正常的卵子，受精后胚胎在体外能够发育到囊胚阶段，胚胎移植后得到具有生育能力健康的后代。在体外激活完毕的卵巢皮质，经过外科植入术，可以重新移植回母体，继续正常的发育，直到发育成熟，因此本发明提供了一种mTOR信号通路激活剂，同时提供了一种可供体外培养操作用的试剂盒，以使该技术应用于更大的医学辅助生殖领域。
附图说明
图1为小鼠卵巢原始卵泡体外激活后可以促进卵泡的发育。图1A：小鼠卵巢用原始卵泡体外激活试剂盒处理6h后，收集卵巢组织通过western-blot的方法检测PI3K信号通路激活后下游标志分子Akt以及mTOR信号通路激活后的下游标志分子S6K和rs6的磷酸化变化，p-Akt、p-S6K以及p-rs6为相应蛋白的磷酸化表达水平。图1B：激活后的卵巢皮质移植入受体小鼠肾被膜下14天后，可以促进卵巢的发育。C，对照未处理卵巢；PA，PRO，mTOR激活剂PA和PRO处理的卵巢。图1C：组织学切片H&E染色结果。黑色箭头，原始卵泡；白色箭头，初级卵泡；标尺=100μm；图1D：卵巢连续切片卵泡计数结果。原始，原始卵泡；初级，初级卵泡；次级，次级卵泡；有腔，早期有腔卵泡；大有腔，大有腔卵泡。*，P<0.05，差异显著；**，P<0.01，差异极显著。
图2体外激活处理并不影响卵母细胞的质量。卵巢移植后18天，受体鼠一次性腹腔注射hCG促进排卵，收集卵巢，通过针刺排卵卵泡的方法收集卵子。其中一部分卵子进行体外受精评价胚胎发育情况，一部分卵子和受精卵进行固定及免疫荧光分析。图2a，收集的MII成熟卵子；图2b，MII卵子tubulin免疫荧光结果，视野中长条状为tubulin标记的纺锤体，长条状中心为Hoechst33258染色，标记细胞核；图2c，MII卵子5MeC免疫荧光结果，视野边缘为5MeC染色，标记卵母细胞的甲基化水平，中心为细胞核；图2d，体外受精10h后，雌雄原核形成的受精卵。偏离视野中心的为5MeC染色，标记处于甲基化状态的雌原核，视野中心为Hoechst33258染色，标记细胞核，可见受精卵中的雌雄原核，雄原核呈去甲基化状态，5MeC染色阴性。图2e，2细胞胚胎；图2f，囊胚；图2f，将2细胞进行胚胎移植后生产的健康后代。
图3为原始卵泡体外激活处理能够促进老年鼠体内原始卵泡的发育。选取老年鼠10-12月龄，一侧卵巢包囊内注射mTOR信号通路激活剂PA+PRO，另一侧卵巢包囊内注射生理盐水作为对照。14天后收集卵巢，固定进行连续切片和H&E染色。图3A为卵巢切片H&E染色结果。C：对照侧卵巢，PA+PRO：注射侧卵巢。a、c和b、d来自于两只小鼠，e、f分别是c、d的放大图片，方框内是激活后发育的初级卵泡。标尺=100μm。图3B为卵巢连续切片卵泡计数的统计结果。原始，原始卵泡；初级，初级卵泡；次级，次级卵泡；有腔，早期有腔卵泡；大有腔，大有腔卵泡。*，P<0.05，差异显著。
图4为原始卵泡体外激活试剂盒能够促进人卵巢皮质中原始卵泡的发育。收集的人卵巢皮质经过体外激活处理后继续培养6天，收集组织进行形态学分析。C：对照组卵巢皮质中发育的初级卵泡；PA+PRO：体外激活处理后卵巢中发育的初级卵泡。
具体实施方式：
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
原始卵泡体外激活试剂盒，包括以下组分：其中溶液I，基本激活细胞培养液配制方法如下：
MEMa(GIBCOTM Minimum Essential Medium(MEM)Alpha Medium(1X)liquid,Invitrogen)为母液，还含有人血清白蛋白10%wt、丙酮酸钠0.23mM、L-抗坏血酸(维生素C)50μg/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L；
其中，试剂I配制方法如下：
mTOR信号通路激活剂I和II，含有200μM的PA和50μM的propranolol，按照10mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装。
其中，溶液II的配制方法入下：
L-15（GIBCO，Invitrogen）和人血清白蛋白的混合液，其中人血清白蛋白占溶液II体系10%wt；
将这三种溶液分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，使用时根据说明书中描述的原始卵泡体外激活方法进行操作。
试剂盒使用方法如下：
1）取卵巢皮质于5mL溶液II中，将卵巢皮质切割成1mm3左右的小块，用溶液II反复清洗三次以上。
2）取1mL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配置成10mL的激活细胞培养液。
3）将卵巢皮质培养于含有悬浮小网（Millicell cell culture inserts，Millipore）的24-孔板，在小网下方加入400μL激活细胞培养液，培养24小时，培养条件为37℃，5%CO2。
4）24h后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
实验结果见表1，表1为正常超排卵子与体外激活卵子体外受精后2细胞的胚胎发育率以及胚胎移植后成活率的比较。
表1
| MII | 2细胞胚胎 | (%) | 2细胞胚胎 | 成活仔数 | (%) | |
| 处理组卵 | 129 | 83 | 64.3 | 66 | 33 | 50 |
| 超排卵 | 45 | 39 | 86.7 | 39 | 19 | 49 |
Claims (10)
1.mTOR信号通路激活剂，其特征在于包括mTOR信号通路激活剂I和II，mTOR信号通路激活剂I为50-200μM磷脂酸，mTOR信号通路激活剂II为20-50μM普萘洛尔。
2.根据权利要求1所述mTOR信号通路激活剂，其特征在于所述磷脂酸为200μM，普萘洛尔为50μM。
3.权利要求1所述mTOR信号通路激活剂在制备激活原始卵泡并促进卵泡发育药物中的应用。
4.原始卵泡体外激活试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
mTOR信号通路激活剂I和II；
基本激活细胞培养液；
L-15培养液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其中，mTOR信号通路激活剂I为磷脂酸，其用量为：50-200μM；其中，mTOR信号通路激活剂II为普萘洛尔，其用量为：20-50μM；基本激活细胞培养液配方：MEMa为母液，还含有丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10%wt 、L-抗坏血酸50μg/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂组成为：
溶液I：基本激活细胞培养液；
试剂I：mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200μM 的磷脂酸和20-50μM的普萘洛尔，按照10mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装；
溶液II：L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白10%wt。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，试剂组成为：
溶液I：基本激活细胞培养液；
试剂I：预混在一起的mTOR信号通路激活剂I和II，含有50-200μM 的磷脂酸和20-50μM的普萘洛尔，按照10mL基本激活细胞培养液的剂量预先分装；
溶液II：L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白10%wt。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于将溶液I、试剂I、溶液II分别包装，再一同包装在同一包装盒内。
9.权利要求6所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，其中
基本激活细胞培养液配制方法如下：
MEMa为母液，还含有丙酮酸钠0.23mM、人血清白蛋白10%wt、L-抗坏血酸50μg/mL、链霉素50mg/L和青霉素75mg/L；
所述试剂I含有mTOR信号通路激活剂包括：
(1) mTOR信号通路激活剂I，50-200μM 的磷脂酸，
(2) mTOR信号通路激活剂II，20-50μM的普萘洛尔；
其中，溶液II的配制方法如下：
L-15培养液为母液，还含有人血清白蛋白10%wt。
10.权利要求6~8任一所述的试剂盒的应用方法，步骤如下：
1）取卵巢皮质于5mL溶液II，将卵巢皮质切割成1mm3的小块，用溶液II反复清洗；
2）取1mL溶液I与试剂I混合，待试剂I完全溶解后，用溶液I配制成10mL的激活细胞培养液；
3）将卵巢皮质培养于含有悬浮小网的24-孔板，在小网下方加入400μL 基本激活细胞培养液，培养24小时，培养条件为37℃，5%CO2；
4）24h后，激活过程完成，组织可用于后续操作。
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