CN114854674A - dbcAMP在制备原始卵泡体外激活剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，特别涉及dbcAMP在制备原始卵泡体外激活剂中的应用。本发明提供了小分子药物dbcAMP在制备原始卵泡激活的制剂中的应用。实验表明，dbcAMP可以在体外培养小鼠卵巢时提高PI3K/mTOR信号通路上关键蛋白的磷酸化水平，从而放大这一信号级联途径的作用，进一步促进原始卵泡的激活。同时，在体内卵巢原位注射dbcAMP也可以刺激原始卵泡的激活。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及dbcAMP在制备原始卵泡体外激活剂中的应用。
背景技术
辅助生殖技术是现阶段最有效的助孕手段。传统辅助生殖技术的一个先决条件是成熟健康的卵母细胞，这就要求女性患者卵巢内必须存在能够对促性腺激素做出响应的生长卵泡。然而，卵巢早衰、多囊卵巢综合征和罹患癌症后放/化疗等患者卵巢内并没有足够的可对促性腺激素做出响应的生长卵泡，因而难以获得成熟的卵母细胞。
为解决这一问题，必须改善传统辅助生殖技术。实际上，这部分患者卵巢内还是具有一定数目的原始卵泡资源的，因此能否利用这部分原始卵泡帮助她们生育后代引起了人们的关注。
近年来借助转基因小鼠等模型，已有多项研究证实两细胞两通路在原始卵泡激活中的关键作用，即卵母细胞中的PTEN-PI3K/AKT信号通路以及前颗粒细胞中的mTORC1信号通路在激活的过程中均发挥了关键的作用。以现有的有关原始卵泡激活的机制为基础，经过临床转化应用研究，一种新的体外辅助生殖技术诞生了，即：原始卵泡体外激活技术(英文缩写为in vitro activation,IVA)。
IVA通过有效手段，利用药物体外激活原始卵泡，待其生长至可以响应激素的阶段，再进行传统的辅助生殖，这一技术已成功帮助部分不孕不育患者成功孕育出下一代。但是，在现有的IVA临床策略中，相关药物的安全性及成功率还是一大隐患，同时病人需经过多次腹腔镜手术，手术时间长，增加了患者的痛苦。因此，开发更加高效的原始卵泡体外激活体系显得极为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了dbcAMP在制备原始卵泡体外激活剂中的应用，dbcAMP可以提高PI3K/mTOR信号通路上关键蛋白的磷酸化水平，进一步促进原始卵泡的激活。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了dbcAMP在制备mTOR激动剂和/或PI3K/AKT信号通路关键蛋白激动剂中的应用。
本发明还提供了dbcAMP在制备提高mTOR和/或PI3K/AKT信号通路关键蛋白的磷酸化水平的制剂中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，上述应用中所述mTOR和/或PI3K/AKT信号通路关键蛋白来源于卵巢。
本发明还提供了dbcAMP在制备原始卵泡体外激活的药物中的应用。
本发明还提供了dbcAMP在制备促进原始卵泡向初级卵泡转化的药物中的应用。
本发明还提供了dbcAMP在制备辅助生殖的药物中的应用，所述辅助生殖包括助孕。
本发明还提供了原始卵泡体外激活的药物，包括dbcAMP以及可接受的辅料和/或助剂。
在本发明的一些具体实施方案中，上述药物中所述辅料和/或助剂包括Matrigel。
在本发明的一些具体实施方案中，上述药物中所述dbcAMP的含量包括1μmol/L～10μmol/L。
在本发明的一些具体实施方案中，上述药物中所述dbcAMP的含量为10μmol/L。
在本发明的一些具体实施方案中，上述药物中所述辅料和/或助剂包括黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、等渗调节剂、增溶剂、助溶剂、防腐剂、着色剂、助悬剂、润湿剂、乳化剂和/或表面活性剂。
本发明还提供了原始卵泡的激活方法，将上述药物注射进卵巢中。
在本发明的一些具体实施方案中，上述原始卵泡的激活方法还包括将上述药物注射进卵巢囊中。
本发明还提供了原始卵泡体外激活方法，取卵巢组织于体外激活试剂中培养；
所述体外激活试剂包括dbcAMP。
本发明有如下效果：
1、添加dbcAMP体外培养小鼠卵巢能够促进其中存在的原始卵泡的激活。研究发现，小鼠卵巢组织中mTOR、PI3K/AKT信号通路关键蛋白水平的磷酸化形式提高，但其总蛋白均不变；添加dbcAMP培养新生小鼠卵巢过程中，其总的卵泡数不变但激活卵泡数增加；
2、dbcAMP能够通过卵巢原位注射在体内促进原始卵泡的激活，而不影响卵泡总数。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示本发明实施例中新生2日龄小鼠卵巢添加10μmol/L的dbcAMP，一天后收集样本检测PI3K/AKT及mTOR信号通路上关键蛋白的表达；其中左边为所述关键蛋白的总蛋白；右边为磷酸化的所述关键蛋白；“Control”为不添加dbcAMP的对照组；结果显示：新生小鼠卵巢体外经过dbcAMP培养后结果发现dbcAMP虽然不影响这些分子总蛋白的表达量，但是却导致其活性形式均发生显著上调，提示dbcAMP促进原始卵泡的激活是通过PI3K/AKT、mTOR通路的活化引起；
图2示本发明中添加dbcAMP培养新生小鼠卵巢中卵泡的影响；其中A为卵巢组织切片；B为dbcAMP培养5天对卵泡总数以及激活生长卵泡数目的影响；C为dbcAMP在第3、5、7天对总卵泡数的影响；D为dbcAMP在第3、5、7天对卵泡激活比例的影响；研究发现添加dbcAMP培养新生小鼠卵巢过程中，其总的卵泡数没有显著差异但生长卵泡数增加，说明添加dbcAMP培养小鼠卵巢能够促进原始卵泡激活；新生小鼠卵巢体外培养3天、5天以及7天的结果分别进行统计，结果均发现：dbcAMP可显著促进原始卵泡激活，但不影响卵巢中的总卵泡数目；标尺：50μm；
图3示本发明实施例中23日龄小鼠卵巢原位注射dbcAMP两周后，收集卵巢组织进行组织切片染色并统计各级卵泡数目；其中，A为卵巢组织切片；B为dbcAMP对体内总卵泡数的影响；C为dbcAMP对体内生长卵泡数的影响；结果显示：dbcAMP在体内也可显著促进原始卵泡的激活，而不影响卵泡总数；标尺：100μm。
具体实施方式
本发明公开了dbcAMP在制备原始卵泡体外激活剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
目前关于cAMP在雌性生殖系统中的作用多关注于其与物卵母细胞减数分裂进程的关系。处于生长卵泡中的卵母细胞胞质内高水平的cAMP可维持卵母细胞第一次减数分裂长期处于阻滞状态，只有当cAMP的合成被下调或其被降解时，卵母细胞才能恢复减数分裂并成熟。研究表明，cAMP类似物dbcAMP可以抑制来自有腔卵泡中卵母细胞的减数分裂恢复，即抑制卵母细胞成熟。此外，在早期卵母细胞进入减数第一次分裂时需要cAMP水平的升高，而在体外利用药物改变cAMP水平会影响原始卵泡库形成。由于卵泡的生理性发育过程具有鲜明的时空特异性，原始卵泡的激活过程可能与卵母细胞的成熟和原始卵泡的形成存在着截然不同的生理调节机制。在本发明开展相关研究之前，人们并不清楚cAMP是否对小鼠原始卵泡激活发挥作用。
本发明要解决的技术问题在于提供dbcAMP在制备原始卵泡体外激活剂中的应用。研究表明，培养新生小鼠卵巢过程中添加dbcAMP，其总的卵泡数不变，而初级卵泡数增加，说明卵巢中部分原始卵泡被激活转变为初级卵泡。
本发明提供了dbcAMP在制备激活mTOR的制剂中的应用。
mTOR(mammalian target of rapamycin)是一种保守的酪氨酸激酶，在调节细胞增殖、生长、存活、分裂、运动和血管生成中起到关键作用。本发明中，所述mTOR为卵巢中的mTOR。本发明研究表明，dbcAMP处理能够提高小鼠卵巢中磷酸化mTOR的水平。即本发明提供了dbcAMP在制备提高磷酸化mTOR的水平的制剂中的应用。
本发明还提供了dbcAMP在制备激活PI3K/AKT信号通路上关键蛋白的制剂中的应用。
PI3K是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要通过激活AKT的活性，对细胞代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等多种生物学过程进行调控。本发明中，所述PI3K/AKT信号通路为卵巢中的PI3K/AKT信号通路。本发明研究表明，dbcAMP处理能够提高小鼠卵巢中磷酸化形式的PI3K/AKT信号通路关键蛋白(AKT、FOXO3a、rpS6)的水平。即本发明提供了dbcAMP在制备提高磷酸化PI3K/AKT信号通路关键蛋白的水平的制剂中的应用。
本发明还提供了dbcAMP在制备原始卵泡的体外激活剂中的应用。
本发明所述原始卵泡为小鼠的原始卵泡。本发明研究表明，在体外培养条件下，dbcAMP对卵巢中mTOR和AKT存在激动作用，对于小鼠卵巢内原始卵泡向初级卵泡的转化存在促进作用。换而言之，dbcAMP可作为原始卵泡的体外激活剂。
本发明提供了一种原始卵泡的体外激活制剂，其包括dbcAMP。
在本发明提供的制剂中，所述dbcAMP的浓度为1μmol/L～10μmol/L。
一些具体实施例中，所述dbcAMP的浓度为10μmol/L。
在本发明中，所述制剂中还包括卵巢基础培养基和相变生物凝胶(Matrigel)。每100mL所述卵巢基础培养基由水和DMEM 0.5g、F12 0.53g、HEPES 0.357g、NaHCO3 0.2438g、青霉素0.006g、链霉素0.005g。
本发明提供的原始卵泡的体外激活方法，将卵巢组织于所述的体外激活试剂中培养。具体的，该方法包括：将所述的体外激活试剂37℃预热，将新生小鼠卵巢在无菌环境下分离干净后，转移到预热好的激活培养液中培养1～5天，隔天换液。
本发明提供的原始卵泡的体内激活方法，采用卵巢原位注射方法将上述制剂注射进卵巢。
上述卵巢原位注射方法包括：在冰上将药物与Matrigel充分混匀后，麻醉小鼠后在其背部卵巢所在位置开一小口，找到卵巢用镊子夹出放在乳胶垫上，在卵巢囊处注射混有药物的Matrigel，注射完成后将卵巢移回腹腔，缝合伤口。
本发明提供了小分子药物dbcAMP在制备原始卵泡激活的制剂中的应用，实验表明，dbcAMP通过提高mTOR或PI3K/AKT信号通路关键蛋白的磷酸化水平，促进原始卵泡的激活，从而提高初级卵泡的数量。
如无特殊说明，本发明所用原料、试剂、耗材以及采用的仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
1、实验材料：
2日龄ICR雌鼠，23日龄ICR雌鼠。
2、实验试剂：
试剂A：卵巢基础培养基，具体配方如表1所示，配制过程须无菌操作。
表1卵巢基础培养基配方
| DMEM | 0.5g |
| F12 | 0.53g |
| HEPES | 0.357g |
| NaHCO3 | 0.2438g |
| 青霉素 | 0.006g |
| 链霉素 | 0.005g |
| 超纯水 | 定容至100mL |
试剂B：10mM dbcAMP(溶剂为卵巢基础培养基)
试剂C：无菌PBS
试剂D：Matrigel
3、实验过程
(1)往6孔板中依次加入3mL试剂A和3μL试剂B，每个孔内放一个细胞培养膜，然后置于细胞培养箱中37℃预热；
(2)将2日龄小鼠的卵巢在试剂C中分离干净后转移到步骤1的培养膜上，放入细胞培养箱中培养，体外激活原始卵泡。一天后收集并检测小鼠卵巢组织中磷酸化形式的mTOR、AKT、FOXO3a、rpS6(p-mTOR、p-AKT、p-FOXO3a、p-rpS6)，以及其总蛋白的水平(结果如图1所示)；
(3)体外培养2日龄小鼠卵巢3～7天后收集卵巢组织，切片观察各级卵泡发育情况并统计卵泡数目(结果如图2、表2、表3、表4所示)；
表2dbcAMP培养浓度对生长卵泡数和总卵泡数的影响(单位：个)
表3dbcAMP对总卵泡数的影响(单位：个)
表4dbcAMP对生长卵泡数的影响(单位：个)
(4)对23日龄小鼠卵巢进行卵巢原位注射，左侧卵巢只注射Matrigel作为对照组，右侧卵巢注射混有dbcAMP的Matrigel(dbcAMP在Matrigel中的含量为：10μmol/L)作为处理组，手术后两周收集卵巢并切片观察各级卵泡发育情况并统计卵泡数目(结果如图3、表5所示)。
表5原位注射Matrigel或dbcAMP对卵泡激活的影响
结果表明：1、添加dbcAMP体外培养小鼠卵巢能够促进其中存在的原始卵泡的激活。进一步研究发现，dbcAMP通过激活mTOR和PI3K/AKT信号通路促进小鼠原始卵泡的体外激活；2、dbcAMP能够通过卵巢原位注射在体内促进原始卵泡的激活。因此，dbcAMP可以作为临床上体外激活原始卵泡的新的安全有效激活药物靶点，对于未来模拟生理状态下原始卵泡的激活来进一步改善IVA技术有一定帮助。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.dbcAMP在制备mTOR激动剂和/或PI3K/AKT信号通路关键蛋白激动剂中的应用。
2.dbcAMP在制备提高mTOR和/或PI3K/AKT信号通路关键蛋白的磷酸化水平的制剂中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述mTOR和/或PI3K/AKT信号通路关键蛋白来源于卵巢。
4.dbcAMP在制备原始卵泡体外激活的药物中的应用。
5.dbcAMP在制备促进原始卵泡向初级卵泡转化的药物中的应用。
6.dbcAMP在制备辅助生殖的药物中的应用，所述辅助生殖包括助孕。
7.原始卵泡体外激活的药物，其特征在于，包括dbcAMP以及可接受的辅料和/或助剂。
8.如权利要求7所述的药物，其特征在于，所述辅料和/或助剂包括Matrigel。
9.如权利要求7或8所述的药物，其特征在于，所述dbcAMP的含量包括1μmol/L～10μmol/L。
10.非疾病诊疗目的原始卵泡的体外激活方法，其特征在于，取卵巢组织于体外激活试剂中培养；
所述体外激活试剂包括dbcAMP。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2199663A1 (en) * | 1997-03-11 | 1998-09-11 | Ruth Miriam Moses | In vitro maturation and fertilization of mammalian oocytes |
| WO2010108028A2 (en) * | 2009-03-19 | 2010-09-23 | Fate Therapeutics, Inc. | Compositions comprising cyclic amp enhancers and/or ep ligands, and methods of preparing and using the same |
| CN103387960A (zh) * | 2013-07-22 | 2013-11-13 | 南京医科大学 | mTOR信号通路激活剂及其在原始卵泡体外激活中的应用 |
| CN103461323A (zh) * | 2013-07-09 | 2013-12-25 | 浙江省农业科学院 | 一种可用于体外延时保存卵母细胞生物活性的方法 |
| CN110923198A (zh) * | 2018-09-19 | 2020-03-27 | 中国农业大学 | 白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法 |
-
2022
- 2022-06-20 CN CN202210697751.8A patent/CN114854674A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2199663A1 (en) * | 1997-03-11 | 1998-09-11 | Ruth Miriam Moses | In vitro maturation and fertilization of mammalian oocytes |
| WO2010108028A2 (en) * | 2009-03-19 | 2010-09-23 | Fate Therapeutics, Inc. | Compositions comprising cyclic amp enhancers and/or ep ligands, and methods of preparing and using the same |
| CN103461323A (zh) * | 2013-07-09 | 2013-12-25 | 浙江省农业科学院 | 一种可用于体外延时保存卵母细胞生物活性的方法 |
| CN103387960A (zh) * | 2013-07-22 | 2013-11-13 | 南京医科大学 | mTOR信号通路激活剂及其在原始卵泡体外激活中的应用 |
| CN110923198A (zh) * | 2018-09-19 | 2020-03-27 | 中国农业大学 | 白藜芦醇的用途及原始卵泡的体外激活试剂与方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "In vitro effect of cyclic adenosine 3\", J ASSIST REPROD GENET., vol. 21, no. 8 * |
| LAN-XUE ZHAO等: "M1 muscarinic receptors regulate the phosphorylation of AMPA receptor subunit GluA1 via a signaling pathway linking cAMP-PKA and PI3K-Akt", FASEB J., vol. 33, no. 5, pages 1 - 2 * |
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| Samy | Department of Obstetrics and Gynecology, King Abdulaziz University, Jeddah, Saudi Arabia |
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