CN112695012B - Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用。本发明提供了小分子药物Tubastatin A在制备原始卵泡激活的制剂中的应用。实验表明，Tubastatin A通过提高mTOR总蛋白及磷酸化水平，促进前体颗粒细胞生长分化为颗粒细胞，同时其分泌的KITL增加。配体KITL通过与卵母细胞细胞膜上的受体结合，激活卵母细胞中的PI3K信号，上调AKT的磷酸化水平，促进原始卵泡的激活，从而提高初级卵泡的数量。

Description

Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用。
背景技术
辅助生殖技术是现阶段最有效的助孕手段。然而，目前辅助生殖技术针对女性患者来说必须具备的一个先决条件是卵巢内必须有能够对促性腺激素做出响应的卵泡。然而，卵巢早衰患者卵巢内并没有足够的可对促性腺激素做出响应的卵泡，罹患癌症后放/化疗以及因卵巢冷冻保存或卵巢摘除等特殊群体患者也面临无法生育的问题。
为解决这一类患者的生育问题，必须开发新的辅助生殖技术和新的卵泡资源利用手段。实际上，卵巢早衰患者卵巢内还是具有一定数目的原始卵泡资源的，因此能否利用这部分原始卵泡帮助卵巢早衰患者生育携带自己遗传物质来源的后代引起了人们的关注。
近些年借助转基因小鼠模型，已有多项研究证实两细胞两通路在原始卵泡激活中的关键作用，即当上调原始卵泡中，位于卵母细胞外围的单层前体颗粒细胞中的mTOR之后，前体颗粒细胞生长分化为颗粒细胞。同时，其所分泌的物质KITL的水平增加，后者通过与卵母细胞膜上的受体(KIT)结合进而活化卵母细胞中的PI3K信号通路，从而促进原始卵泡激活。
国际和国内研究人员和临床医生根据上述已知的原始卵泡激活调控机制，经过临床转化应用研究，发明了原始卵泡体外激活(英文缩写为in vitro activation,IVA)技术，成功帮助卵巢早衰患者孕育出了健康的下一代，为上述具有相似问题的患者生育问题带来了希望。但是，由于临床上已经报道的有关原始卵泡体外激活技术用于辅助生殖获得后代的成功率很低、且存在手术时间长(需要1-2小时，患者往往为了等候原始卵泡激活后再接受移植而不得不二次手术)等限制因素，阻碍了原始卵泡体外激活在临床中的应用。因此，开发更加高效的原始卵泡体外激活体系显得极为重要。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用。研究表明，添加Tubastatin A培养新生小鼠卵巢过程中，其总的卵泡数不变但原始卵泡数减少，而初级卵泡数增加，说明部分被激活的原始卵泡转变为了初级卵泡。
本发明提供了Tubastatin A在制备提高mTOR水平和/或激活mTOR的制剂中的应用。
mTOR(mammalian target of rapamycin)是一种保守的酪氨酸激酶，在调节细胞增殖、生长、存活、分裂、运动和血管生成中起到关键作用。本发明中，所述mTOR为卵巢中的mTOR。本发明研究表明，Tubastatin A处理能够提高小鼠卵巢中磷酸化mTOR的水平和总mTOR水平。即本发明提供了Tubastatin A在制备提高磷酸化mTOR的水平和/或总mTOR水平的制剂中的应用。
本发明还提供了Tubastatin A在制备激活AKT的制剂中的应用。
AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，对细胞代谢、细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期等多种生物学过程进行调控。本发明中，所述AKT为卵巢中的AKT。本发明研究表明，Tubastatin A处理能够提高小鼠卵巢中磷酸化AKT的水平和总AKT水平。即本发明提供了Tubastatin A在制备提高磷酸化AKT的水平和/或总AKT水平的制剂中的应用。
本发明还提供了Tubastatin A在制备原始卵泡的体外激活剂中的应用。
本发明所述原始卵泡为小鼠的原始卵泡。本发明研究表明，在体外培养条件下，Tubastatin A对卵巢中mTOR和AKT存在激动作用，对于小鼠卵巢内原始卵泡向初级卵泡的转化存在促进作用。换而言之，Tubastatin A可作为原始卵泡的体外激活剂
本发明提供了一种原始卵泡的体外激活制剂，其包括Tubastatin A。
在本发明提供的制剂中，所述Tubastatin A的浓度为1mmol/L～5mmol/L。
一些具体实施例中，所述Tubastatin A的浓度为4mmol/L。
在本发明中，所述制剂中还包括卵巢基础培养基。每100mL所述卵巢基础培养基由水和DMEM 0.5g、F12 0.53g、HEPES 0.357g、NaHCO3 0.2438g、青霉素0.006g、链霉素0.005g。
本发明提供的原始卵泡的体外激活方法，将卵巢皮质区组织于所述的体外激活试剂中培养。所述培养的条件为37℃，30min。所述卵巢皮质区组织在培养前经无菌PBS溶液清洗。
具体的，该方法包括：将所述的体外激活试剂37℃预热，将含有原始卵泡的卵巢皮质区组织在无菌环境下切割成1mm3小块，进行镜检确定其含有原始卵泡。然后转移到预热好的激活培养液中培养30min，之后便可进行手术移植，让被激活的原始卵泡继续生长发育。
本发明提供了小分子药物Tubastatin A在制备原始卵泡激活的制剂中的应用，实验表明，Tubastatin A通过提高mTOR水平，或者通过提高mTOR或AKT的磷酸化水平，促进原始卵泡的激活，从而提高初级卵泡的数量。
附图说明
图1为本发明实施例中5dpp小鼠卵巢添加1.2μlTubastatin A培养30min，对照组添加1.2μl DMSO(二甲基亚砜)。然后将卵巢组织转移到不含药物的培养基中继续培养12h，收集样本检测mTOR和AKT总蛋白及活性形式的变化；结果显示，mTOR和p-mTOR显著增加，AKT不变但p-AKT显著增加；
图2为本发明实施例中35dpp小鼠卵巢皮质片添加1.2μlTubastatin A培养30min，对照组添加1.2μl DMSO。然后将卵巢组织转移到不含药物的培养基中继续培养12h，收集样本检测mTOR和AKT总蛋白及活性形式的变化；结果显示，mTOR和p-mTOR显著增加，AKT不变而p-AKT显著增加；
图3为本发明中研究发现添加Tubastatin A培养新生小鼠卵巢过程中，其总的卵泡数不变但原始卵泡数减少，而初级卵泡数增加，说明添加Tubastatin A培养小鼠卵巢能够促进原始卵泡激活；当添加mTOR的抑制剂Rapamycin培养之后，则能够逆转Tubastatin A所得到的表型，这说明抑制HDAC6是通过活化mTOR信号通路来调控小鼠原始卵泡激活的；标尺：200μm，TubA：Tubastatin A；Rap：Rapamycin；Total：总的卵泡数；PmF：原始卵泡；PF：初级卵泡；
图4为本发明实施例中Tubastatin A培养5dpp小鼠卵巢30min后，将处理后的卵巢组织移植到免疫缺陷小鼠肾被膜下继续生长发育14天，收集卵巢组织进行组织切片染色并统计各级卵泡数目。结果显示：30min的Tubastatin A处理明显提升其对原始卵泡的体外激活效率；红色箭头指示原始卵泡，白色箭头指示生长卵泡，标尺：200μm；
图5为本发明实施例中Tubastatin A培养35dpp小鼠卵巢30min后，将处理后的卵巢组织移植到免疫缺陷小鼠肾被膜下继续生长发育14天，收集卵巢组织进行组织切片染色并统计各级卵泡数目。结果显示30min的Tubastatin A处理可明显提升期对原始卵泡体外激活的效率，红色箭头指示原始卵泡，白色箭头指示生长卵泡，标尺：200μm。
具体实施方式
本发明提供了Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
大量研究表明，卵泡的生理性发育过程是有发育阶段性特点的。尽管有研究报道称HDAC6的选择性抑制剂培养小鼠卵母细胞可以抑制来自有腔卵泡(对促性腺激素诱导产生响应的后期生长卵泡)中卵母细胞的减数分裂恢复，即抑制卵母细胞成熟。不仅如此，该报道还称在小鼠卵母细胞成熟过程中HDAC6会通过调控组蛋白修饰和促进mRNA的表达来发挥功能。但是，目前的理论普遍认为原始卵泡在雌性的生殖周期(人类为月经周期)的规律性活动中始终能保持静息或休眠状态，并不会因为周期性的促性腺激素的波动性分泌而受影响，这说明原始卵泡的激活过程并不是促性腺激素诱导的。此外，即使是同一种物质，在卵泡发育的不同阶段对其生理功能的影响也是有区别的。例如雌激素在生长卵泡发育阶段的特点主要是通过负反馈机制促进卵泡中体细胞的增殖和卵母细胞的胞质成熟，但并不会诱发卵母细胞恢复减数分裂。但在排卵前卵泡，雌激素的水平出现峰值时就会通过正反馈的调节，促进卵母细胞恢复减数分裂并成熟和排卵。从上述分析可知，原始卵泡激活过程与次级卵泡受促性腺激素诱导的成熟和排卵过程之间存在着截然不同的生理调节机制。在本发明开展相关研究之前，人们并不清楚HDAC6是否对小鼠原始卵泡激活发挥作用。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
实验材料：
初生C57BL/6J雌鼠、5日龄C57BL/6J雌鼠、35日龄C57BL/6J雌鼠。
实验试剂：
试剂A：卵巢基础培养基，具体配方如下，配制过程须无菌操作。
Figure BDA0002831843520000051
试剂B：4mM Tubastatin A(溶剂为二甲基亚砜)
试剂C：无菌PBS
实验方法
1.往6孔板中依次加入1.2ml试剂A和1.2μl试剂B，然后置于细胞培养箱中37℃预热；
2.将取下各日龄小鼠的卵巢皮质区组织，在试剂C中切成1mm3小块后转移到步骤1预热好的培养基中，放入细胞培养箱培养30min，体外激活原始卵泡。将卵巢组织转移到预热好的试剂A中继续培养12小时。检测各日龄小鼠卵巢组织中磷酸化形式的mTOR、AKT，以及总mTOR和AKT蛋白的水平(结果如图1～2)，
3.将体外激活处理30min后的卵巢组织移植到免疫缺陷鼠肾被膜下，让卵巢组织在肾被膜下继续生长14天，收集卵巢组织，切片观察各级卵泡发育情况并统计卵泡数目(结果如图3～5)。
结果表明：1、添加Tubastatin A体外培养小鼠卵巢皮质组织能够促进其中存在的原始卵泡的激活。进一步研究发现，Tubastatin A通过激活mTOR信号通路促进小鼠原始卵泡的体外激活；2、Tubastatin A能够应用于原始卵泡的体外激活，体外激活时间缩短至三十分钟。将体外激活处理的组织移植到免疫缺陷小鼠肾被膜下继续发育，结果显示被短时间处理诱导激活的原始卵泡也能够正常发育。因此Tubastatin A可以作为一种更加高效、安全的新型原始卵泡体外激活药物靶点。如果将来应用于临床，将能够简化手术流程、减轻患者心理负担、降低卵巢组织长时间暴露在外界多带来的未知风险等。在临床应用中，以Tubastatin A处理卵巢组织30min后，便可将休眠的原始卵泡唤醒/激活，接下来便可将卵巢组织进行移植以便让其中被激活的原始卵泡继续发育。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.Tubastatin A在制备原始卵泡的体外激活剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过提高mTOR水平和/或激活mTOR激活原始卵泡。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述mTOR为卵巢中的mTOR。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过激活AKT激活原始卵泡。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述AKT为卵巢中的AKT。
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