CN113583964B - 利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 - Google Patents
利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113583964B CN113583964B CN202110363273.2A CN202110363273A CN113583964B CN 113583964 B CN113583964 B CN 113583964B CN 202110363273 A CN202110363273 A CN 202110363273A CN 113583964 B CN113583964 B CN 113583964B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mir
- cells
- ovarian
- proliferation
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种利用miR‑212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法,属于细胞工程和生物工程的技术领域,本发明以miR‑212为研究对象,首次实现利用miR‑212在猪卵巢颗粒细胞增值方面的方法,该方法包括步骤:将miR‑212转染入卵巢颗粒细胞中。本发明提供了一种显著的调控卵巢颗粒细胞的增值,本发明方法简单、易于实施推广。本发明的研究表明,通过对猪卵巢颗粒细胞进行分离、培养,转染miR‑212后显著促进颗粒细胞的增殖能力,为后续卵泡发育相关研究提供理论基础。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程以及基因工程技术领域,具体涉及一种利用 miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。
背景技术
卵泡颗粒细胞是卵泡发育和维持正常功能的重要条件,对维持卵 巢繁殖功能发挥着极其重要的作用。有研究者发现,卵泡闭锁退化的 过程是由卵泡中颗粒细胞的凋亡触发的,颗粒细胞的凋亡最终会导致 卵泡的闭锁。在卵泡颗粒细胞中可以分泌类固醇激素、促卵泡素和促 黄体素等激素,还可以产生一些细胞因子(孕酮、干细胞生长因子和 表皮生长因子等),调控着卵泡和卵母细胞的生长发育。
在生猪生产中仔猪的出生率与生产的经济效益显著正相关,如何 提高产子数在现代猪遗传育种工作中都扮演至关重要的角色。目前对 于提高母猪产子数主要依赖遗传辅助标记选择,对于标志基因纯合或 杂合个体的筛选以及与产子性能较好的猪种如太湖猪等杂交育种,除 此之外暂无极为显著的提高方法。然而,母猪的产子数还与卵泡的发育相关,卵巢颗粒细胞直接影响卵泡的发育,因此探究影响卵巢颗粒 细胞增殖的条件在生产实践中对于促进卵泡发育、排卵具有重要意义。
miRNA是一类长度22nt左右的小分子绝大多数不具备编码能力 的小分子RNA,主要依赖于2-8位的种子序列与编码基因的3’端非 翻译区相结合,从而沉默复合靶基因发挥生物学功能。大量研究表明miRNA在调控卵泡发育、闭锁等生物过程中扮演重要角色,并且在 卵巢癌症等相关领域也有大量报道。然而,如何利用miRNA调控卵 巢颗粒细胞的增值,目前仍待研究。
发明内容
针对现有技术的缺点和需求,本发明的目的在于提供一种利用 miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法。
为了实现上述目的,本发明提供的方案如下:
将miR-212转染入卵巢颗粒细胞中。
作为本发明的优选技术方案,在进行所述转染前,还包括分离、 接种、传代培养和收样操作。
作为本发明的一个实施方案,所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。
作为本发明的一个实施方案,进行所述分离操作时,按照如下方 法进行:
1)于母猪屠宰后取出卵巢,置于PBS中清洗后,将卵巢保存在 38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞;
2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后,用手术刀 将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破,收集卵泡液,将吸取后的卵 泡液放入15ml离心管,1000rpm离心8分钟,弃上清,用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次;
3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20%FBS加DMEM以及1%的 抗生素。
作为本发明的一个实施方案,在进行接种前,待卵巢颗粒细胞增 殖到85%后,弃掉原培养基,用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml 胰酶,放入37度细胞培养箱,放置2min后加入新鲜培养基终止消化, 将细胞吹打下来,将悬液吸入15ml离心管;最终将细胞用培养液冲 匀接种到12孔板中进行培养。
作为本发明的一个实施方案,在细胞转染前一天,将处于细胞接 种至12孔培养板中,当增殖细胞密度达到35~45%时,进行转染,48 小时候后收样。
作为本发明的优选实施方案,在进行转染时,按照 lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。
作为本发明的优选实施方案,所述抗生素为青霉素、链霉素和两 性霉素。
作为本发明的优选实施方案,进行所述收样时,将RNAisoPlus 加入每个孔,裂解一分钟后反复吹打吸出,并将样品于-80℃下保存。
作为本发明的优选实施方案,在步骤(2)中,细胞密度培养到 40%。
本发明的有益效果:
本发明提供了一种显著的调控卵巢颗粒细胞的增值,本发明方法 简单、易于实施推广。本发明的研究表明,通过对猪卵巢颗粒细胞进 行分离、培养,转染miR-212后显著促进颗粒细胞的增殖能力,为后 续卵泡发育相关研究提供理论基础。
附图说明
图1为miR-212二级结构
图2为本发明转染效率实验结果图;
图3为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC,inhibitor NC 加入CCK试剂检测细胞增殖情况实验结果图;
图4为对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC,inhibitor NC 检测CyclinD基因表达量实验结果图;
图5对卵巢颗粒细胞转染mimics inhibitor mimics NC,inhibitor NC 检测CyclinE基因表达量实验结果图;
图6为使用双荧光素酶报告系统检测miR-212与FGF16的靶标关系 图;
图7为对卵巢颗粒细胞转染FGF16 siRNA干扰其表达后检测CyclinD 基因表达量实验结果图;
图8为对卵巢颗粒细胞转染FGF16 siRNA干扰其表达后检测P53蛋 白表达量实验结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述,有必要在此指出的是以 下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明,不能理解为对本发明 保护范围的限制,该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的 一些非本质的改进和调整,仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一、实验方案
1.猪卵巢颗粒细胞分离及培养
于母猪屠宰后取出卵巢,置于PBS中清洗后,将卵巢保存在38 摄氏度的生理盐水中于1小时内带回实验室分离卵巢颗粒细胞。
将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后,用手术刀将 卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破,收集卵泡液,将吸取后的卵泡 液放入15ml离心管,1000rpm离心8分钟,弃上清,用预热的PBS 轻轻吹打均匀清洗离心重复两次。
配制的卵巢颗粒细胞培养液为20%FBS加DMEM以及1%三抗 (青霉素、链霉素和两性霉素)
2.细胞接种、传代、转染、收样
待卵巢颗粒细胞增殖到85%弃掉原培养基,用PBS清洗两次后 用巴氏吸管加入1ml胰酶,放入37度细胞培养箱,2min后,加入新 鲜培养基终止消化,将细胞吹打下来,将悬液吸入15ml离心管。最 终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。细胞转染前一天, 将处于细胞接种至12孔培养板中(根据实验需求接种相应的密度), 当增殖细胞密度达到40%时,即可进行第一次转染miR-212,48小时 候收样。收样,将RNAisoPlus加入每个孔,裂解一分钟后反复吹打 吸出,并将样品于-80℃保存。
3.细胞转染
待细胞密度长到40%开始转染,转染按照lipofectamine3000试剂 盒的说明书进行,48小时后进行收样处理或进行后续检测。
二、检测方案
1.RNA抽提及反转录
TRIpure试剂盒被用来提取组织和细胞总RNA,具体步骤如下:
(1)组织匀浆:取50-100mg组织在研磨中磨至粉末(边加液 氮边磨),给磨完后的样品中加入1ml的TRIpure。12孔C2C12细胞 样品则直接在细胞培养板孔里加入1ml的TRIpure溶解,通过移液枪 移出细胞裂解物至EP管中。
(2)蛋白质/RNA/DNA分离阶段:将加了TRIpure的匀浆样品 在15-30℃条件下孵育5分钟后每1ml TRIpure加200微升氯仿。用 涡旋仪剧烈涡旋震荡使其充分裂解,随后常温下孵育2~3分钟。 12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟(2-8℃)。
(3)上述溶液离心后会得到三层水样溶液,用移液枪轻轻将最 上层水样层转移到干净的EP管中。随后向其加入异丙醇的量是上述 裂解液的一半量。混合的溶液上下轻轻颠倒混匀,常温孵育10分钟, 离心10分钟(12,000×g)。这一步骤用于RNA的沉淀。
(4)上述离心后的溶液轻轻倒掉上层悬液,加入75%的乙醇(1ml) 洗涤一次。500×g离心5分钟。这一步骤用于RNA的漂洗。
(5)倒掉上述离心管中的上清液,在空气中干燥几分钟。用移 液枪吸取30毫升无RNA酶的水溶解RNA,用NanoDrop ND-2000 分光光度计检测RNA质量和浓度,最后保存RNA(-80℃)。
2.反转录PCR
2.1 mRNA反转录
1st Strand cDNA Synthesis试剂盒被用来反转录 mRNA,具体步骤如下:
(1)去除基因组DNA反应
为了保证实验的质量,在冰上进行操作,将反应试剂加入到PCR 管中,瞬离混匀后在42℃下反应2分钟。
(2)cDNA制备
在上述反应PCR管中继续加入反应体系试剂。瞬离混匀。反应 程序为37℃,15min;85℃,5s,反应结束后将其稀释至100ul,混匀 并-20℃保存。
2.2 miRNA反转录
按照miRNA RT-QPCR试剂盒说明书进行miRNA反转录。反应 液在37℃的条件下反应60min;85℃反应5min。反应结束后,稀 释至100ul,混匀并分装,-20℃保存和备用。
3.CCK-8实验
将颗粒细胞接种到96孔细胞板中,每个处理9个重复,待细胞 密度40%左右,进行细胞转染,48小时后使用庄盟CCK-8试剂盒检 测细胞上清液吸光度。
4.EDU实验
(1)将卵巢颗粒细胞接种到96孔细胞板里,转染细胞后要染色 的细胞孔里加入100μL EdU稀释液进行反应。EdU稀释液可按照EdU 溶液(试剂A)与细胞培养基比例为1:1000的配置,最终浓度为 50μM;
(2)PBS在37℃水浴锅中预热,并用PBS清洗细胞1-2次,脱 色摇床洗1-3次;
(3)每孔加入50-100μL的4%多聚甲醛放置室温孵育,30min 后丢弃甲醛,用PBS清洗3-5次,脱色摇床摇2-3次;
(4)每孔加入100μL现配的Apollo液染色(此燃料需现配现用, 500μL体系的Apollo染色液配制顺序:469μL去离子水;25μL试剂 B;5μL试剂C;1.5μL试剂D;5mg试剂E),避光处理且室温、孵 育30min后丢弃染液,每孔加入0.5%TritonX-100 100μL,15分钟后在脱色摇床上清洗3-4次;
(5)核燃料的配置是Hochest(试剂F)与去离子水按1:100 配置,每孔加入50μL核染液,避光处理且室温、孵育30min后丢弃 染液,每孔加入100μL PBS洗2-3次;
(6)在荧光显微镜下观察并照相。
5.qRT-PCR
5.1mRNA荧光定量
配制PCR反应液。混好的反应体系置于CFX96 Real-Time PCR detection system仪器上完成。PCR反应程序分为两步。首先:预变性 反应为95℃3min;其次:PCR反应为40次循环,95℃下30s,其中 退火温度根据温度梯度反应结果选取最佳退火温度。PCR反应结果以 β-actin为内参来校正结果。mRNA的相对表达量通过2-ΔΔCt方法计 算。
5.2miRNA荧光定量
混好的反应体系置于CFX96 Real-Time PCR仪器上完成。同时, 以U6作为miRNA定量的内参,采用2-ΔΔCt方法计算miRNA相对表达量。每个样本都做三次技术性重复。miRNA的上游引物是miRNA 本身的成熟序列,而下游引物是试剂盒中提供的通用引物。
6.WesternBlot
6.1蛋白提取
1).用PBS冲洗细胞2-3次,最后一次清洗完,倒掉PBS,用 移液器尽量吸干残留液体;
2).加入适当体积的RIPA裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑 制剂)于培养板/培养瓶内3-5min。期间反复晃动培养板/瓶,使试剂 与细胞充分接触;
3).用细胞刮刀将细胞刮下,转移到1.5ml离心管中;
4).冰上裂解30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞完全裂解。 然后12000rpm,4℃,离心10min,收集上清,即为总蛋白溶液。
6.2蛋白浓度测定
取未变性的蛋白溶液,用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测。
6.3蛋白变性
将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液,沸 水浴变性15min,收入-20℃冰箱保存备用;
6.4SDS-PAGE电泳
1).清洗玻璃板;
2).制胶与上样;
2.1)待玻璃板自然晾干后,将一块凹玻璃板和一块平玻璃组成一 对,放入制胶器,插入斜插板将玻璃板固定,检查底部是否对齐,避 免漏胶;
2.2)根据实验需求配制不同浓度的分离胶,加入TEMED后立即 混合均匀,将分离胶灌到适当的的高度,灌胶之前可以用梳子试一下, 梳子齿距离分离胶上液面大约5-8mm为宜。然后将纯水缓慢均匀加 入到分离胶上层,直至加满。大约30min后待分离胶凝固即可倒去 分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干;
2.3)按照上述配方配制5%的浓缩胶,加入TEMED后立即混合 均匀,即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中, 注意梳子下面不能有气泡。
2.4)等浓缩胶凝固好,取下制胶器,小心拔掉梳子,即可准备开 始电泳;
2.5)将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。浓缩胶 电压75V,分离胶用120V。电泳至溴酚蓝里最底部大约1cm即可终 止电泳,进行转膜。
6.5转膜
1).准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF(0.45um) 膜,PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化2min;
2).在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子,两块海绵垫,一支玻 璃棒,滤纸和经过活化的PVDF膜;
3).将夹子打开,左边白色,右边为黑色,在两边各加一块海绵、 三层滤纸。
4).小心剥下分离胶放在滤纸上,将PVDF膜置于胶上,不要有 气泡,在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫;
5).转膜条件(湿转):300mA恒流转膜半小时,转膜过程中将转膜 设备放在冰水中降温。
6.6免疫反应
1).将转印完的膜放入装有TBST的孵育槽中,快速涮洗一次, 然后加上的脱脂牛奶,放置脱色摇床上,室温下封闭30min;
2).按照抗体说明书,进行一抗稀释,配置好后,倒掉孵育槽中的 封闭液,加入配置好的一抗,4℃孵育摇床过夜(摇床慢摇);
3.回收一抗,用TBST快速涮洗膜三次,然后加入TBST,放置 脱色摇床上快速洗脱,每次5min,洗三次;
4).将二抗用TBST按照1:5000的比例进行稀释,然后加入孵 育槽中,放置摇床上慢摇,室温下孵育30min;
5).用TBST快速涮洗膜三次,然后再加入TBST,放置脱色摇床 上快速洗脱,每次5min,洗三次。
6.7化学发光
在暗室中将ECLA液和ECLB液两种试剂在离心管中等体积 混合,在曝光匣上贴双层PE手套或者其他透明薄膜,将PVDF膜 的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间,加入混合好的ECL溶液 充分反应,1-2min后,去尽残液,盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶 片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光 条件。
6.8凝胶图像分析
将胶片进行扫描存档,PhotoShop整理去色,Alpha软件处理系 统分析目标带的光密度值。
7.数据统计
实验数据采用SPSS(22.0版)进行分析。所有数据都以平均值±标 准误(SEM)表示。组间差异用单因素方差分析或t检验。组间差异的 显著平准确定为P<0.05。
8实验结果
8.1 miR-212转染效率
为深入探究miR-212在脂肪发育过程中的作用,对卵巢颗粒细胞 转染miR-212的过表达模拟物(mimics)、抑制剂(inhibitor)及阴性对 照观察对卵巢颗粒细胞增殖状况的影响。过表达模拟物及抑制剂的转 染显著提高或降低了miR-212在卵巢颗粒细胞中的表达量。
8.2 miR-212对卵巢颗粒细胞增殖的影响
通过CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测过表达及抑制miR-212对 卵巢颗粒细胞增殖的影响,与对照组相比转染miR-212抑制剂显著促 进细胞的增殖,过表达处理组则相反。EdU的结果与CCK结果一致,当用miR-212抑制剂处理细胞时新生细胞数量显著多于对照组,过表 达处理组新生细胞数量显著降低。
8.3 miR-212对增殖标志基因的影响
与上述结果一致,几个细胞周期相关激酶CyclinD以及CyclinE 的表达量也随miR-212的表达量降低而呈现显著上调的趋势,以上结 果表明,miR-212可能通过调控细胞周期蛋白激酶相关基因从而抑制 卵巢颗粒细胞增殖。
8.4 miR-212靶基因的筛选
通过对miR-212在不同物种间的序列比对发现,其在人、小鼠、 大鼠、猕猴等哺乳动物中高度保守。为更深入了解miR-212对卵巢颗 粒细胞分化的分子调控机制,通过pictar、miRBase、TargetScan三个常用靶基因预测数据库对miR-212的靶基因进行预测,预测结果显示 miR-212种子序列可完全靶向结合FGF16的3’UTR区,。
8.5 miR-212与FGF16靶标关系验证
进一步验证FGF16与miR-212之间的结合关系,进行了荧光素 酶报告实验。miR-212的模拟物与WT-FGF16结合荧光素酶活性显著 下降,而在Mut-FGF16组中则荧光素酶活性无显著变化,进一步证 明了miR-212与FGF16的靶标关系。这些结果表明miR-212通过靶向调控FGF16从而促进卵巢颗粒细胞分化。
8.6 FGF16对卵巢颗粒细胞增殖的影响
本实验使用siRNA将靶基因表达量干扰掉,使用荧光定量的方 法检测干扰靶基因后对卵巢颗粒细胞增殖的影响,结果表明,干扰掉 靶基因后显著抑制卵巢颗粒细胞增殖,并且在蛋白水平的到相同结果。
Claims (4)
1.利用miR-212抑制剂促进猪卵巢颗粒细胞体外增殖的方法,其特征在于,所述方法包括将miR-212抑制剂转染入猪卵巢颗粒细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,在进行所述转染前,还包括分离、接种、传代培养和收样操作。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在进行接种前,待卵巢颗粒细胞增殖到85%后,弃掉原培养基,用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶,放入37度细胞培养箱,放置2min后加入新鲜培养基终止消化,将细胞吹打下来,将悬液吸入15ml离心管;最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在进行转染时,按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110363273.2A CN113583964B (zh) | 2021-04-02 | 2021-04-02 | 利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110363273.2A CN113583964B (zh) | 2021-04-02 | 2021-04-02 | 利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113583964A CN113583964A (zh) | 2021-11-02 |
CN113583964B true CN113583964B (zh) | 2023-09-08 |
Family
ID=78238179
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110363273.2A Active CN113583964B (zh) | 2021-04-02 | 2021-04-02 | 利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113583964B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113046323A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-06-29 | 四川农业大学 | 一种基于miR-532-5p及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012070037A2 (en) * | 2010-11-22 | 2012-05-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Methods and materials for classification of tissue of origin of tumor samples |
WO2013034653A1 (en) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The mirna-212/132 family as a therapeutic target |
CN105567686A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-05-11 | 华南农业大学 | miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用 |
US9410956B1 (en) * | 2008-08-01 | 2016-08-09 | University Of South Florida | Micro-RNA profiling in ovarian cancer |
CN106636079A (zh) * | 2015-10-30 | 2017-05-10 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种鼻咽癌microRNA检测试剂盒 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20170246200A1 (en) * | 2014-09-22 | 2017-08-31 | UNIVERSITé LAVAL | Microrna-132/212 for the treatment of neurodegenerative disorders |
-
2021
- 2021-04-02 CN CN202110363273.2A patent/CN113583964B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9410956B1 (en) * | 2008-08-01 | 2016-08-09 | University Of South Florida | Micro-RNA profiling in ovarian cancer |
WO2012070037A2 (en) * | 2010-11-22 | 2012-05-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Methods and materials for classification of tissue of origin of tumor samples |
WO2013034653A1 (en) * | 2011-09-06 | 2013-03-14 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | The mirna-212/132 family as a therapeutic target |
CN104011208A (zh) * | 2011-09-06 | 2014-08-27 | 马普科技促进协会 | 作为治疗靶的miRNA-212/132家族 |
CN106636079A (zh) * | 2015-10-30 | 2017-05-10 | 益善生物技术股份有限公司 | 一种鼻咽癌microRNA检测试剂盒 |
CN105567686A (zh) * | 2016-01-19 | 2016-05-11 | 华南农业大学 | miR-126-3p在猪卵巢颗粒细胞中的应用 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
microRNAs调控哺乳动物卵巢发育的研究进展;孙星虹;葛伟;王俊杰;侯竹美;李兰;;青岛农业大学学报(自然科学版)(第04期);摘要 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113583964A (zh) | 2021-11-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108486159B (zh) | 一种敲除GRIN2D基因的CRISPR-Cas9系统及其应用 | |
CN114404441B (zh) | 一种用于骨髓间充质干细胞成骨分化的促进剂 | |
CN113583964B (zh) | 利用miR-212及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 | |
CN113005095A (zh) | 基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法 | |
CN112852818A (zh) | 一种环状RNA hsa_circ_0001550及其应用 | |
CN113265402B (zh) | 一种调控rspo2基因转录活性的方法 | |
CN111748559B (zh) | Ctnnb1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用 | |
Di Blasio et al. | Basic fibroblast growth factor messenger ribonucleic acid levels in eutopic and ectopic human endometrial stromal cells as assessed by competitive polymerase chain reaction amplification | |
CN111575230B (zh) | 肉苁蓉多糖在促进雌性生殖干细胞增殖分化方面的应用 | |
CN110846280A (zh) | 人肠癌原代细胞及其培养方法与应用 | |
CN113832235A (zh) | 一种与仔猪细菌性腹泻抗性相关的lncRNA标志物及其应用 | |
CN113046323A (zh) | 一种基于miR-532-5p及其靶基因调控卵巢颗粒细胞的方法 | |
CN111548989B (zh) | 一种通过sfrp4促进棕色脂肪分化的方法及应用 | |
CN113041258A (zh) | 一种用于修复宫腔粘连的生物组合物及其制备方法 | |
CN114574583B (zh) | Tmc5在乳腺癌特异性骨转移中的诊断、治疗的应用 | |
CN115322959B (zh) | 一种16p11.2微缺失综合征相关孤独症诱导性多能干细胞、制备方法及应用 | |
CN113088485B (zh) | 斑马鱼成骨细胞体外培养方法 | |
CN114875143B (zh) | 环状RNA circBRD7在制备鼻咽癌诊断和/或治疗制剂中的应用 | |
CN112695012B (zh) | Tubastatin A在制备原始卵泡体外激活剂中的应用 | |
CN116064767B (zh) | 一种与骨关节炎相关的LncRNA标志物及其应用 | |
CN114908172B (zh) | Apobec3b在前列腺癌诊断、预后预测及治疗中的应用 | |
Li et al. | Growth Arrest Specific Gene 6 Improved in vitro Maturation of Oocytes and the Development Potential of Porcine Embryo after Parthenogenetic Activation. | |
CN117512050A (zh) | 一种利用timp1筛选有效治疗骨关节炎的间充质干细胞的方法及应用 | |
CN111110693A (zh) | 下调环状基因表达的试剂在制备预防和/或治疗肺纤维化的药物中的应用及药物 | |
CN117965721A (zh) | 环状RNA hsa_circ_0001543在诊断和治疗强直性脊柱炎中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |