CN113005095A - 基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于circ‑Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法，该方法包括如下步骤：(1)对巢颗粒细胞进行接种和传代培养；(2)待细胞密度培养到35～45％时，将circ‑Atp5BP基因或pik3基因转染至巢颗粒细胞中。本发明首次证明circ‑Atp5BP及pik3在猪卵巢颗粒细胞增值调控中的应用，以及circ‑Atp5BP与pi3k靶向调控关系。本发明可以显著的调控卵巢颗粒细胞的增值。
Description
技术领域
本发明属于细胞工程以及基因工程技术领域，具体涉及一种基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法。
背景技术
卵巢是决定雌性动物繁殖力的重要器官，它的主要功能之一就是卵泡发育和排卵。卵巢功能异常会导致生殖降低，这些功能异常情况包括卵巢早衰(Premature ovarianfailure，POF)、多囊卵巢综合症(polycystic ovarian syndrome，PCOS)以及卵巢癌症等。其中卵巢早衰的主要原因：一是在胚胎时期没有形成足够多的原始卵泡(先天不足)；二是原始卵泡的激活和抑制受到影响，也有研究显示卵泡闭锁的加速也能引发卵巢早衰。
在卵泡的发育过程中，颗粒细胞会由扁平状变成立方形进而分化，这一系列的变化都会对卵母细胞的成长发育、原始卵泡生长的启动、生长期卵泡发育的调控以及卵泡闭锁有着重要的作用。此外颗粒细胞凋亡也是启动卵泡闭锁的重要机制。
在生猪生产中仔猪的出生率与生产的经济效益显著正相关，如何提高产子数在现代猪遗传育种工作中都扮演至关重要的角色。目前对于提高母猪产子数主要依赖遗传辅助标记选择，对于标志基因纯合或杂合个体的筛选以及与产子性能较好的猪种如太湖猪等杂交育种，除此之外暂无极为显著的提高方法。然而，母猪的产子数还与卵泡的发育相关，卵巢颗粒细胞直接影响卵泡的发育，因此探究影响卵巢颗粒细胞增殖的条件在生产实践中对于促进卵泡发育、排卵具有重要意义。
环状RNA是一类内源性的非编码RNA，最早发现于1971年。当时研究者发现了一类没有蛋白质外壳包被并且基因组是单链闭合状态的RNA分子可侵染马铃薯植株。1979年，Hsu和Coca-Prados通过电子显微镜观察到真核细胞细胞质中存在圆环形RNA。1993年，研究者发现小鼠精子决定基因Sry在转录过程中存在环状转录。但这些发现在当时并没有引起研究者的注意。直到2012年，借助于高通量测序技术，Salzman等研究发现无论是白血病细胞、Hela细胞系还是正常人原代血细胞均存在通过外显子重排形成非线性的环状转录物现象，约80个环状RNA被首次报道。自此，大量的circRNA分子被相继鉴定。目前对于环状RNA的命名相较于miRNA是较为混乱的，统一并且公认完善的命名规则亟待解决。除此之外，对于环状RNA的形成机制仍然存在争议，目前存在两种主流的环状RNA成环争议，分为套索驱动模型和内含子配对驱动模型。套索模型理论认为套索驱动模型认为pre-RNA在转录过程中由于RNA发生了部分折叠，拉近相邻的外显子，从而致使外显子跳跃，之后被跨越的区域由剪接供体(splice donor；SD)与剪接受体(splice acceptor；SA)结合形成了circRNA中间体，并进一步通过套索剪接形成由外显子构成的circRNA分子。该模型认为，任何的外显子跳跃都可以形成一个circRNA。然而，内含子配对驱动模型则认为，内含子区域的反向互补序列导致了内含子区域配对，使与内含子接壤的两个外显子相互靠近，进一步反向剪接形成circRNA分子。
目前，大量研究表明相较于lncRNA，环状RNA具有更好地稳定性、保守性，并且通过测序等数据的计算不难发现circRNA具有组织特异性以及时空特异性。并且circRNA的功能与其在细胞的位置紧密相关，不难推测环状RNA在众多生物学过程中也扮演了重要角色。
发明内容
针对现有技术的不足和需求，本发明的目的在于提供一种一种基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法，该方法能显著的调控卵巢颗粒细胞的增值。
为了实现上述目的，本发明提供的方案如下：
基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对巢颗粒细胞进行接种和传代培养；
(2)待细胞密度培养到35～45％时，将circ-Atp5BP基因或pik3基因转染至巢颗粒细胞中。
作为本发明的一个实施方案，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。
作为本发明的一个实施方案，所述猪卵巢颗粒细胞由如下方法分离和保存：
1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；
2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；
3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的抗生素。
作为本发明的一个实施方案，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增殖到85％后，弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。
作为本发明的一个实施方案，在细胞转染前一天，将处于细胞接种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48小时候后收样。
作为本发明的一个优选方案，在进行转染时，按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。
作为本发明的一个优选方案，所述抗生素为青霉素、链霉素和两性霉素。
作为本发明的一个实施方案，进行所述收样时，将RNAisoPlus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于-80℃下保存。
作为本发明的一个优选方案，在步骤(2)中，细胞密度培养到40％。
本发明的有益效果：
本发明首次证明circ-Atp5BP及pik3在猪卵巢颗粒细胞增值调控中的应用，以及circ-Atp5BP与pi3k靶向调控关系。本发明可以显著的调控卵巢颗粒细胞的增殖。
附图说明
图1为本发明环化位点验证实验结果图；
图2本发明转染效率实验结果图；
图3为对卵巢颗粒细胞转染过表达质粒以及阴性对照后检测CyclinD基因表达量的实验结果图；
图4为对卵巢颗粒细胞转染过表达质粒以及阴性对照后检测CyclinE基因表达量的实验结果图；
图5为对卵巢颗粒细胞转染过表达质粒以及阴性对照后使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况的实验结果图；
图6为对卵巢颗粒细胞转染过表达质粒以及阴性对照后使用EdU试剂盒检测细胞增殖情况的实验结果图；
图7为对卵巢颗粒细胞转染过表达质粒以及阴性对照后检测AKT以及p-AKT蛋白表达情况的实验结果图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
一、实验方案
1.猪卵巢颗粒细胞分离及培养
于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中于1小时内带回实验室分离卵巢颗粒细胞。
将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS轻轻吹打均匀清洗离心重复两次。
配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％三抗(青霉素、链霉素和两性霉素)
2.细胞接种、传代、转染、收样
待卵巢颗粒细胞增殖到85％弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，2min后，加入新鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管。最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。细胞转染前一天，将处于细胞接种至12孔培养板中(根据实验需求接种相应的密度)，当增殖细胞密度达到40％时，即可进行第一次转染circ-Atp5BP基因或pik3基因，48小时候收样。收样，将RNAisoPlus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于-80℃保存。
3.细胞转染
待细胞密度长到40％开始转染，转染按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行，48小时后进行收样处理或进行后续检测。
二、检测方案
1.RNA抽提及反转录
TRIpure试剂盒被用来提取组织和细胞总RNA，具体步骤如下：
(1)组织匀浆：取50-100mg组织在研磨中磨至粉末(边加液氮边磨)，给磨完后的样品中加入1ml的TRIpure。12孔C2C12细胞样品则直接在细胞培养板孔里加入1ml的TRIpure溶解，通过移液枪移出细胞裂解物至EP管中。
(2)蛋白质/RNA/DNA分离阶段：将加了TRIpure的匀浆样品在15-30℃条件下孵育5分钟后每1ml TRIpure加200微升氯仿。用涡旋仪剧烈涡旋震荡使其充分裂解，随后常温下孵育2～3分钟。12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟(2-8℃)。
(3)上述溶液离心后会得到三层水样溶液，用移液枪轻轻将最上层水样层转移到干净的EP管中。随后向其加入异丙醇的量是上述裂解液的一半量。混合的溶液上下轻轻颠倒混匀，常温孵育10分钟，离心10分钟(12,000×g)。这一步骤用于RNA的沉淀。
(4)上述离心后的溶液轻轻倒掉上层悬液，加入75％的乙醇(1ml)洗涤一次。500×g离心5分钟。这一步骤用于RNA的漂洗。
(5)倒掉上述离心管中的上清液，在空气中干燥几分钟。用移液枪吸取30毫升无RNA酶的水溶解RNA，用NanoDrop ND-2000分光光度计检测RNA质量和浓度，最后保存RNA(-80℃)。
2.反转录PCR
2.1mRNA反转录
(1)去除基因组DNA反应
为了保证实验的质量，在冰上进行操作，将反应试剂加入到PCR管中，瞬离混匀后在42℃下反应2分钟。
(2)cDNA制备
在上述反应PCR管中继续加入反应体系试剂。瞬离混匀。反应程序为37℃，15min；85℃,5s，反应结束后将其稀释至100ul，混匀并-20℃保存。
2.2miRNA反转录
按照miRNART-QPCR试剂盒说明书进行miRNA反转录。反应液在37℃的条件下反应60min；85℃反应5min。反应结束后，稀释至100ul，混匀并分装，-20℃保存和备用。
3.CCK-8实验
将颗粒细胞接种到96孔细胞板中，每个处理9个重复，待细胞密度40％左右，进行细胞转染，48小时后使用庄盟CCK-8试剂盒检测细胞上清液吸光度。
4.EDU实验
(1)将卵巢颗粒细胞接种到96孔细胞板里，转染细胞后要染色的细胞孔里加入100μL EdU稀释液进行反应。EdU稀释液可按照EdU溶液(试剂A)与细胞培养基比例为1：1000的配置，最终浓度为50μM；
(2)PBS在37℃水浴锅中预热，并用PBS清洗细胞1-2次，脱色摇床洗1-3次；
(3)每孔加入50-100μL的4％多聚甲醛放置室温孵育，30min后丢弃甲醛，用PBS清洗3-5次，脱色摇床摇2-3次；
(4)每孔加入100μL现配的Apollo液染色(此燃料需现配现用，500μL体系的Apollo染色液配制顺序：469μL去离子水；25μL试剂B；5μL试剂C；1.5μL试剂D；5mg试剂E)，避光处理且室温、孵育30min后丢弃染液，每孔加入0.5％TritonX-100100μL，15分钟后在脱色摇床上清洗3-4次；
(5)核燃料的配置是Hochest(试剂F)与去离子水按1：100配置，每孔加入50μL核染液，避光处理且室温、孵育30min后丢弃染液，每孔加入100μLPBS洗2-3次；
(6)在荧光显微镜下观察并照相。
5.qRT-PCR
5.1mRNA荧光定量
配制PCR反应液。混好的反应体系置于CFX96Real-Time PCR detection system仪器上完成。PCR反应程序分为两步。首先：预变性反应为95℃3min；其次：PCR反应为40次循环，95℃下30s，其中退火温度根据温度梯度反应结果选取最佳退火温度。PCR反应结果以β-actin为内参来校正结果。mRNA的相对表达量通过2-ΔΔCt方法计算。
5.2miRNA荧光定量
混好的反应体系置于CFX96Real-Time PCR仪器上完成。同时，以U6作为miRNA定量的内参，采用2-ΔΔCt方法计算miRNA相对表达量。每个样本都做三次技术性重复。miRNA的上游引物是miRNA本身的成熟序列，而下游引物是试剂盒中提供的通用引物。
6.WesternBlot
6.1蛋白提取
1).用PBS冲洗细胞2-3次，最后一次清洗完，倒掉PBS，用移液器尽量吸干残留液体；
2).加入适当体积的RIPA裂解液(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板/培养瓶内3-5min。期间反复晃动培养板/瓶，使试剂与细胞充分接触；
3).用细胞刮刀将细胞刮下，转移到1.5ml离心管中；
4).冰上裂解30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。然后12000rpm,4℃，离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。
6.2蛋白浓度测定
取未变性的蛋白溶液，用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测。
6.3蛋白变性
将蛋白溶液按照4:1的比例加入5*还原型蛋白上样缓冲液，沸水浴变性15min，收入-20℃冰箱保存备用；
6.4SDS-PAGE电泳
1).清洗玻璃板；
2).制胶与上样；
2.1)待玻璃板自然晾干后，将一块凹玻璃板和一块平玻璃组成一对，放入制胶器，插入斜插板将玻璃板固定，检查底部是否对齐，避免漏胶；
2.2)根据实验需求配制不同浓度的分离胶，加入TEMED后立即混合均匀，将分离胶灌到适当的的高度，灌胶之前可以用梳子试一下，梳子齿距离分离胶上液面大约5-8mm为宜。然后将纯水缓慢均匀加入到分离胶上层，直至加满。大约30min后待分离胶凝固即可倒去分离胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干；
2.3)按照上述配方配制5％的浓缩胶，加入TEMED后立即混合均匀，即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，注意梳子下面不能有气泡。
2.4)等浓缩胶凝固好，取下制胶器，小心拔掉梳子，即可准备开始电泳；
2.5)将制胶器放入电泳槽后加足够的电泳液后上样电泳。浓缩胶电压75V，分离胶用120V。电泳至溴酚蓝里最底部大约1cm即可终止电泳，进行转膜。
6.5转膜
1).准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的PVDF(0.45um)膜，PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化2min；
2).在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子，两块海绵垫，一支玻璃棒，滤纸和经过活化的PVDF膜；
3).将夹子打开，左边白色，右边为黑色，在两边各加一块海绵、三层滤纸。
4).小心剥下分离胶放在滤纸上，将PVDF膜置于胶上，不要有气泡，在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫；
5).转膜条件(湿转):300mA恒流转膜半小时，转膜过程中将转膜设备放在冰水中降温。
6.6免疫反应
1).将转印完的膜放入装有TBST的孵育槽中，快速涮洗一次，然后加上的脱脂牛奶，放置脱色摇床上，室温下封闭30min；
2).按照抗体说明书，进行一抗稀释，配置好后，倒掉孵育槽中的封闭液，加入配置好的一抗，4℃孵育摇床过夜(摇床慢摇)；
3.回收一抗，用TBST快速涮洗膜三次，然后加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5min，洗三次；
4).将二抗用TBST按照1:5000的比例进行稀释，然后加入孵育槽中，放置摇床上慢摇，室温下孵育30min；
5).用TBST快速涮洗膜三次，然后再加入TBST，放置脱色摇床上快速洗脱，每次5min，洗三次。
6.7化学发光
在暗室中将ECLA液和ECLB液两种试剂在离心管中等体积混合，在曝光匣上贴双层PE手套或者其他透明薄膜，将PVDF膜的蛋白面朝上放在曝光匣两层薄膜之间，加入混合好的ECL溶液充分反应，1-2min后，去尽残液，盖上层薄膜开始压胶片。压完的胶片用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的发光强度调整曝光条件。
6.8凝胶图像分析
将胶片进行扫描存档，PhotoShop整理去色，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。
7.数据统计
实验数据采用SPSS(22.0版)进行分析。所有数据都以平均值±标准误(SEM)表示。组间差异用单因素方差分析或t检验。组间差异的显著平准确定为P<0.05。
8.实验结果
8.1circRNA环化验证
使用发散引物内敛引物对circAtp5BP的环化位点进行扩增，分别使用cDNA模板以及gDNA模板
8.2circ-Atp5BP转染效率
为深入探究circ-Atp5BP在卵巢颗粒细胞发育过程中的作用，对卵巢颗粒细胞转染circ-Atp5BP的过表达质粒及阴性对照观察对卵巢颗粒细胞增殖状况的影响。过表达载体的转染显著提高了circ-Atp5BP在卵巢颗粒细胞中的表达量。
8.3circ-Atp5BP对卵巢颗粒细胞增殖的影响
通过CCK-8细胞增殖检测试剂盒检测过表达及抑制circ-Atp5BP对卵巢颗粒细胞增殖的影响，与对照组相比转染circ-Atp5BP质粒显著促进细胞的增殖。EdU的结果与CCK结果一致，当用circ-Atp5BP质粒处理细胞时新生细胞数量显著多于对照组。
8.4circ-Atp5BP对增殖标志基因的影响
与上述结果一致，几个细胞周期相关激酶cyclinD以及cyclinE的表达量也随circ-Atp5BP的表达量增加而呈现显著上调的趋势。以上结果表明，circ-Atp5BP可能通过调控细胞周期蛋白激酶相关基因从而促进卵巢颗粒细胞增殖。
8.5 circATP5BP对相关通路的影响
对卵巢颗粒细胞转染circAtp5BP质粒后检测AKT通路及其磷酸化蛋白的表达量结果表明转染后显著促进AKT通路及其磷酸化蛋白的表达量。
Claims (9)
1.基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)对巢颗粒细胞进行接种和传代培养；
(2)待细胞密度培养到35～45％时，将circ-Atp5BP基因或pik3基因转染至巢颗粒细胞中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巢颗粒细胞为猪卵巢颗粒细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述猪卵巢颗粒细胞由如下方法分离和保存：
1)于母猪屠宰后取出卵巢，置于PBS中清洗后，将卵巢保存在38摄氏度的生理盐水中于1小时内分离卵巢颗粒细胞；
2)将卵巢放到预热好的37度生理盐水中清洗干净后，用手术刀将卵巢表面每间隔1毫米均匀轻轻划破，收集卵泡液，将吸取后的卵泡液放入15ml离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清，用预热的PBS轻轻吹打均匀清洗离心重复两次；
3)配制的卵巢颗粒细胞培养液为20％FBS加DMEM以及1％的抗生素。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行接种前，待卵巢颗粒细胞增殖到85％后，弃掉原培养基，用PBS清洗两次后用巴氏吸管加入1ml胰酶，放入37度细胞培养箱，放置2min后加入新鲜培养基终止消化，将细胞吹打下来，将悬液吸入15ml离心管；最终将细胞用培养液冲匀接种到12孔板中进行培养。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在细胞转染前一天，将处于细胞接种至12孔培养板中，当增殖细胞密度达到35～45％时，进行转染，48小时候后收样。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行转染时，按照lipofectamine3000试剂盒的说明书进行。
7.根据权利要去3所述的方法，其特征在于，所述抗生素为青霉素、链霉素和两性霉素。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进行所述收样时，将RNAisoPlus加入每个孔，裂解一分钟后反复吹打吸出，并将样品于-80℃下保存。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，细胞密度培养到40％。
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|---|---|---|---|---|
| CN113817846A (zh) * | 2021-10-27 | 2021-12-21 | 金陵科技学院 | 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用 |
| CN115992135A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-04-21 | 华南农业大学 | LncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用 |
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2021
- 2021-04-02 CN CN202110361853.8A patent/CN113005095A/zh active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113817846A (zh) * | 2021-10-27 | 2021-12-21 | 金陵科技学院 | 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用 |
| CN113817846B (zh) * | 2021-10-27 | 2023-09-22 | 金陵科技学院 | 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用 |
| CN115992135A (zh) * | 2022-08-30 | 2023-04-21 | 华南农业大学 | LncRNA IFA及其在猪卵巢颗粒细胞中的应用 |
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