CN113817846B - 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用 - Google Patents

一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用；所述circRNA为circSLC41A1，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；本发明针对circSLC41A1设计特异性扩增引物，经PCR扩增、RNase R酶消化及荧光原位杂交验证所述的circSLC41A1的真实存在；利用荧光定量PCR检测到circSLC41A1在猪卵巢中健康有腔卵泡组织中表达高于闭锁卵泡，用siRNA干扰技术证实circSLC41A1对颗粒细胞凋亡具有显著抑制作用；同时，本发明设计并提供一种可作为circSLC41A1抑制剂的小RNA；本发明公开的circSLC41A1有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。

Description

一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其 应用
技术领域
本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用。
背景技术
雌性动物的生殖性能，尤其是产仔数与其排卵数量紧密相关。卵泡闭锁是哺乳动物卵泡发育过程中的一种自然生理现象。在母猪出生前后，其原始卵泡腔形成，其卵泡储备含有大约500万个原始卵泡。然而在生长发育及发情周期过程中，大量卵泡在直径达到6毫米之前发生闭锁和消失，导致最终可实现的排卵率低于14％。作为卵泡的主要组成部分，颗粒细胞通过与卵母细胞和卵泡膜细胞密切相互作用并产生旁分泌物质而发挥功能。研究表明，颗粒细胞增殖和功能在卵泡发育和成熟中至关重要，而颗粒细胞凋亡率随着卵泡闭锁的进展而显著增加，因此颗粒细胞凋亡水平是卵泡闭锁的主要标志之一。
环状RNA(circRNA)是由前体mRNA通过前体RNA的反向剪接产生的一种新型非编码RNA，是由线性RNA3’端与5’端共价连接形成的闭合环状分子，其分布广泛、保守性高、结构稳定不被RNaseR剪切降解。今年来，在高通量测序技术的支持下，circRNA的广泛分布在多种动、植物细胞和组织中被证实。它们位于细胞核或细胞质中，通过转录(如与RNA结合蛋白相互作用)或转录后途径(如吸附miRNA)调节基因表达。越来越多的研究指出，circRNA在细胞分化、发育和功能障碍中具有重要作用。目前circRNA在母猪繁殖尤其是卵泡闭锁机制方面研究还较少，因此寻找影响母猪繁殖性能的circRNAs成为当前母猪繁殖与遗传育种研究及卵巢功能研究的新方向。
发明内容
为了达到上述目的，本发明提供一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA，所述的circRNA为circSLC41A1，circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供一种用于检测样品中circSLC41A1表达水平的试剂，所述circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述试剂含有特异性扩增circSLC41A1的引物对或特异性标记circSLC41A1的荧光原位杂交探针。
优选地，所述引物对的序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3。
优选地，所述探针的序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明提供一种circSLC41A1抑制剂siRNA，所述siRNA序列如SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。
本发明提供上述circRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
本发明提供上述circRNA在母猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
本发明提供上述试剂在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
本发明提供上述试剂在母猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
可以有效检测circRNA在动物细胞或组织中相对表达量，即以circRNA特异引物进行实时定量PCR的方法进行检测；circRNA在猪健康有腔卵泡中的表达量极显著高于闭锁卵泡。
可以有效检测circRNA在动物细胞或组织中定性分布，即以circRNA特异探针进行荧光原位杂交的方法进行检测，circRNA在猪健康卵巢颗粒细胞细胞质中有较高分布，在细胞核中表达极低。
本发明提供一种circSLC41A1抑制剂siRNA在母猪卵巢疾病及卵巢异常治疗药物中的应用，可用于circSLC41A1在细胞、组织、活体中的定向敲减，即脂质体介导的siRNA转染干扰的方法。本发明的siRNA经脂质体转染颗粒细胞后能有效降低颗粒细胞中相应circRNA表达量，显著提高猪卵巢颗粒细胞凋亡。
本发明提供了一种纯化circRNA及对其环状结构鉴定的方法。具体步骤如下：
(1)以RNase R酶消化猪卵巢有腔卵泡环状RNA；
(2)以GAPDH为对照，以cDNA、gDNA为模板，利用Divergent Primer和SLC41A1 mRNAPrimer进行扩增；
(3)以GAPDH为内参基因，利用qRT-PCR检测circRNA对RNase R酶的耐受性。
本发明的circRNA Divergent扩增引物及SLC41A1mRNA引物如SEQ ID NO:2、SEQID NO:3以及SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；GAPDH引物如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供的circRNA结构稳定且与猪卵泡闭锁相关性高，可作为卵泡健康或闭锁状况鉴定的直接指征或判断依据之一。该circRNA可作为分子育种过程中母猪繁殖性能筛选的分子标记，亦可作为人工干涉卵泡发育或闭锁过程的靶点。本发明提供的相关检测试剂中的定量引物和荧光探针特异性强，能明确反应该circRNA的表达水平和亚细胞分布情况。本发明提供的siRNA抑制剂特异性强且效果显著。
附图说明
图1为circSLC41A1反向剪切结构、Divergent定量扩增引物的设计及反向剪接位点测序图；
图2为RNaseR消化处理后样品中线性mRNA与circRNA表达量的对比图；
图3为circSLC41A1在猪健康卵巢颗粒细胞细胞质中分布图，其中，左图：荧光探针标记的circSLC41A1，中图：DAPI染色标记的细胞核，右图：merge，即前两张图的重叠图；
图4为circSLC41A1在猪健康有腔卵泡和闭锁卵泡中的表达量对比图；
图5为siRNA经脂质体转染颗粒细胞后相应circRNA表达量；
图6为特异性敲减circRNA后猪卵巢颗粒细胞凋亡率；左图为流式细胞仪检测结果原图；右图为经统计分析处理后的结果图。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
对序列表的说明：
SEQ ID NO:1是猪circSLC41A1的线性核苷酸序列；
SEQ ID NO:2是特异性扩增circSLC41A1环化位点的引物对的上游引物序列；
SEQ ID NO:3是特异性扩增circSLC41A1环化位点的引物对的下游引物序列；
SEQ ID NO:4是特异性标记circSLC41A1的原位杂交探针序列；
SEQ ID NO:5是特异性敲减circSLC41A1的siRNA序列正链序列；
SEQ ID NO:6是特异性敲减circSLC41A1的siRNA序列负链序列；
SEQ ID NO:7是特异性扩增SLC41A1mRNA的引物对的上游引物序列；
SEQ ID NO:8是特异性扩增SLC41A1mRNA的引物对的下游引物序列；
SEQ ID NO:9是特异性扩增GAPDH的引物对的下游引物序列；
SEQ ID NO:10是特异性扩增GAPDH的引物对的下游引物序列。
实施例1
(1)猪circSLC41A1引物的设计
登录circBase数据库，下载人hsa_circ_0016224线性核苷酸序列，在NCBI数据库寻找并下载与猪同源性较高的核苷酸序列，即NM_001243667.1第二外显子，将此序列的3’端200bp片段移到5’端前端形成新序列，针对新序列设计跨反向剪接位点(back-splicesite)的circSLC41A1的Divergent扩增引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3所示。
(2)猪SLC41A1mRNA引物的设计
在NCBI数据库寻找猪SLC41A1mRNA序列，即NM_001243667.1，按常规方法设计SLC41A1mRNA扩增引物对。引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
(3)猪健康有腔卵泡RNA提取(常规TRIZOL法)
取健康发情前猪卵巢，用小镊子和剪刀分离直径约5mm的健康和闭锁有腔卵泡，按照每个卵泡组织1ml TRIZOL试剂(购自Vazyme南京有限公司)，反复吹打，将匀浆样品移至1.5ml离心管中(RNase free)，室温下置5min使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置3min。于4℃，12000×g离心15min，样品分三层，RNA主要在最上层水相中，吸取600ul上清移至1.5ml离心管，加500ul异丙醇，颠倒混匀，冰浴10min。然后在2-8℃，12000×g下离心10min，弃上清。加入1ml75％浓度的乙醇，振荡混匀，于4℃，7500×g下离心5min，弃上清。室温晾5-10min干燥RNA，加20ul无RNA酶水，混匀，吸取1ul于ThermoNANO Drop2000紫外分光光度计下测量浓度及纯度，取质量合格的RNA放于-80℃下保存。
(4)RNase R处理实验
将提取的健康卵泡样本的RNA分成两等份。一份直接进行下一步反转录，另一份在反转录前通过RNase R(购自美国Epicentre公司)处理。20ul反应系统包括5μg RNA、2μL 10×反应缓冲液、15U RNase R(20U/μL)和无RNase水。使用SYBR预混Ex-Taq酶(购自中国大连Takara公司)，在37℃下进行15分钟的反应，然后在70℃下进行10分钟的反应。
(5)RNA反转录
按照Vazyme反转录试剂盒(R223-01)说明书介绍的操作方法进行RNA反转录，具体步骤如下：(1)基因组DNA去除：1ug RNA，4ul 4×gDNA wiper Mix，RNase free ddH2O至16ul，混匀，于42℃2min。(2)反转录反应：在步骤(1)的反应液中加5×HiScript IIqRTSuperMix II 4ul,混匀，50℃15min，85℃5s。
(6)PCR及Sanger测序
PCR扩增体系：1μL模板，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)各10μM，2×ESTaqMasterMix 5μL(购自Vazyme南京有限公司)，加ddH2O至10μl。95℃预变性5min；35个循环(95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸20s)；72℃10min，产物在1.5％琼脂糖凝胶(含染料)中电泳，将目的片段回收纯化并进行Sanger测序验证。
(7)qRT-PCR
qRT-PCR反应体系：SYBR Green I real-time PCR Mix(购自中国大连Takara生物公司)5μL，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：8，SEQ ID NO：10)0.15μL，200ng cDNA，加水至10μL。反应程序：95℃预变性2min；40个循环(95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸15s)。生物学及技术性重复各3个，利用2-△△Ct法计算基因相对表达量，其中△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参)-(Ct目的基因-Ct内参)最大值，其中内参均用未经RNaseR处理的GAPDH。T检验进行显著性分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
结果
如图1所示，以跨反向剪接位点的特异性引物扩增circSLC41A1，经Sanger测序比对确定其环化位点(箭头处)。证实了circSLC41A1的环状结构。如图2所示，以GAPDH为内参基因，分别使用特异性扩增circSLC41A1环化位点的引物对和特异性扩增SLC41A1mRNA的引物对,分别使用RNase R消化前、后的猪健康卵泡总RNA为模板，qRT-PCR检测得到RNase R消化后线性SLC41A1mRNA量极显著性下降(p<0.01)至痕量，而circSLC41A1量反而显著上升(p<0.01)，表明circSLC41A结构较稳定耐RNase R消化，且符合RNase R消化对circRNA起到富集作用的规律。进一步证实了circSLC41A1的环状结构和稳定性。
实施例2
猪circSLC41A1的细胞定位
(1)猪circSLC41A1荧光探针的设计
根据互补配对原则，设计跨circ SLC41A1反向剪接位点的circ SLC41A1的地高辛标记探针。该探针的序列如SEQ ID NO:4所示。
(2)猪颗粒细胞的爬片培养
用含有庆大霉素(80mg/L)的无菌生理盐水清洗猪卵巢，使用带有20号针头的注射器从直径约为5mm的透明有腔卵泡中抽取卵泡液和颗粒细胞。然后在含有10％胎牛血清(FBS)、100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM/F12培养基(购自美国Gibco公司)中培养猪颗粒细胞，细胞接种在放置盖玻片的六孔板中，培养箱条件为37℃和5％CO2。待细胞贴壁后可取出盖玻片，进行探针孵育。
(3)猪circSLC41A1荧光探针的孵育及显微镜观察
首先用4％多聚甲醛(含DEPC)对盖玻片上培养的猪颗粒细胞进行固定20分钟，用PBS(pH 7.4)摇动洗涤三次，最后添加蛋白酶K(20μg/ml)5分钟进行消化。探针预杂交、杂交、洗涤，采用细胞爬片荧光探针原位杂交双标(TSA)实验试剂盒(中国武汉塞维尔生物科技公司)进行鼠抗地高辛标记过氧化物酶(anti-DIG-HRP)、DAPI复染核。使用尼康直立荧光显微镜(日本尼康DS-U3)获取荧光图像。CY3红光激发波长510-560，发射波长590nm，发红光。紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光。实验进行三次生物学重复。
结果
如图3所示，左图：荧光探针标记的circSLC41A1，中图：DAPI染色标记的细胞核，右图：merge，即前两张图的重叠图，可以体现circSLC41A1和细胞核的相对位置；荧光原位杂交检测猪颗粒细胞中circSLC41A1用红色荧光标记，细胞核用DAPI(蓝色)染色，其中circSLC41A1的定位主要在细胞质中。标尺为20μm。进一步证实了circSLC41A1在猪颗粒细胞的存在及其在细胞质中的分布情况。
实施例3
(1)猪SLC41A1mRNA引物的设计：同实施例1(1)。
(2)猪健康、闭锁有腔卵泡RNA提取(常规TRIZOL法)
分离猪健康、闭锁有腔泡，RNA提取方法同实施例1(3)，反转录方法同实施例1(5)。
(3)猪健康、闭锁有腔卵泡circSLC41A1表达qRT-PCR
分别以猪健康、闭锁有腔卵泡cDNA为模板，以SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：9，SEQ ID NO：10为引物进行qRT-PCR，反应体系及分析方法同实施例1(7)。
结果
如图4所示，以GAPDH为内参基因，qRT-PCR检测circSLC41A1在猪健康、闭锁有腔卵泡中的表达量，结果显示circSLC41A1在猪健康有腔卵泡中的表达量极显著高于闭锁卵泡。circSLC41A1的功能可能于维持卵泡健康，抑制卵泡闭锁相关。
实施例4
(1)特异性敲减circSLC41A1的双链siRNA设计
以circSLC41A1序列反向剪切位点位置为模板，采用siDirect网站(http://sidirect2.rnai.jp)设计双链siRNA并命名为si-circSLC41A1，其序列见SEQ ID NO：5，SEQID NO：6。
(2)猪颗粒细胞si-circSLC41A1的转染
培养猪颗粒细胞36小时，使细胞达到50-80％汇合时进行转染。使用LipofectamineTM 3000转染试剂和Opti MEM培养液(购自Invitrogen公司)进行转染。实验进行三次生物学重复。
(3)si-circSLC41A1敲减效率的检测
分别以转染si-circSLC41A1和NC的猪颗粒细胞cDNA为模板，以circSLC41A1特异性引物，进行qPCR扩增，比较染前、后猪颗粒细胞中circSLC41A1的表达量差异。反应体系及分析方法见1.7。生物学及技术性重复各3个
(4)猪颗粒细胞凋亡检测
转染后72小时，消化猪颗粒细胞，用Annexin V-FITC/PI染色试剂盒(购自Vazyme南京有限公司)根据制造商的说明，进行细胞凋亡染色标记。通过流式细胞术检测凋亡细胞的百分比(Beckman Coulter，Brea，Cal，USA)。使用FlowJo v7.6软件(美国加利福尼亚州斯坦福大学)对数据进行分析。生物学及技术性重复各3个。
结果
如图5所示，qRT-PCR检测可见转染si-circSLC41A1的猪颗粒细胞中circSLC41A1的表达量显著低于转染NC的猪颗粒细胞(p<0.01)，结果显示si-circSLC41A1具有特异性敲减circSLC41A1的效果。如图6所示，流式细胞术检测可见转染si-circSLC41A1的猪颗粒细胞凋亡率显著高于转染NC的猪颗粒细胞(p<0.001)，结果显示si-circSLC41A1可导致猪颗粒细胞凋亡，而circSLC41A1可以维持猪颗粒细胞正常生理状态。circSLC41A1的功能可能于维持卵泡健康，抑制卵泡闭锁相关。因此，有望作为母猪繁殖相关的分子标志物，为猪繁殖性状的评价，繁殖力提升，为人类卵泡异常相关疾病的发生和预防提供新的理论基础和潜在的分子标靶。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 金陵科技学院
<120> 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的circRNA、其siRNA抑制剂及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1027
<212> DNA/RNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<400> 1
gtgttccata cagattcttg tgacttttaa ggaccaggga tttgggaagg tgcaggatct 60
tcccaggaag aaagaacatt tctgggaaaa aggagaaaga cggcaggtac tgccttggga 120
cccgcagagc ctgaggagct gtgggaagct gacggagccc agttgagagg cgggggaagg 180
agccgaagcc cagggccgag gctgcctttt gaaagatctg aactcaagct acttttcatg 240
aaagaagagc cacctaagag ggcaccccag acttgactgg cctcttctgc tctggatgcc 300
ccctgctctg aggagcctgt gctaagaacc aaagaagtta ggaggcagga ggagtttccc 360
ccaagcacgg cgccggctgg ctgggtcagg catccgcatc cctagtgacc cggctgcagt 420
ctggggagga ctttcttgct tccctcccgt ttgcggcttc ggtgcttgat ggggctgtct 480
gttggtggat cagattttgc agcgcctctt aggagcgggg agccgtggga agaggtcccg 540
cggtggccaa gcctgggatc accccaagac taagttcttt cccaagttag aaagggagag 600
aaagcaaaaa gagaaagagg aaagttctcc cttctcctcc tcccttcccg tcatgtcctc 660
gaagccggag ccgaaggaca cccaccagct gaacgggact ggccctacgg cctcaccctg 720
ctcttcagat ggccccgggc gagagcccat ggccgggacc tcagagttcc tggggcctga 780
cggggctggg gtagaggtgg tggtgattga gtctcgggcc aacgccaagg gggttcggga 840
ggaggatgcc ctgctggaga acgggagcca gagcaatgaa agtgacgatg tcagcacaga 900
ccgtggccct gcgccaccct ccccgctcaa ggagacctcc ttttccatcg ggctgcaagt 960
gctgttcccc ttcctcctgg caggctttgg gactgtggct gccggcatgg tgctggacat 1020
cgtgcag 1027
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtggtgg tgattgagtc t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccctcttag gtggctctt 19
<210> 4
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtatggaa cacctgcacg atgtccag 28
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caucgugcag guguuccaut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
auggaacacc ugcacgaugt t 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcgagttt gagaaggta 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcagaacgac aaaccatcc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatggtgaag gtcggagtg 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgaagttgtc atggatgacc 20

Claims (3)

1.一种与猪有腔卵泡闭锁相关的 circRNA，其特征在于，所述的circRNA为circSLC41A1，circSLC41A1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种circSLC41A1抑制剂siRNA，其特征在于，所述siRNA序列如SEQ ID NO:5和SEQIDNO:6所示。
3.权利要求1所述的circRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用，所述应用用于非疾病的检测和诊断。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110982910A (zh) * 2019-12-19 2020-04-10 华中农业大学 一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110982910A (zh) * 2019-12-19 2020-04-10 华中农业大学 一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用
CN113005095A (zh) * 2021-04-02 2021-06-22 四川农业大学 基于circ-Atp5BP调控卵巢颗粒细胞的方法
CN113817845A (zh) * 2021-10-27 2021-12-21 金陵科技学院 一种与猪有腔卵泡闭锁相关的miRNA分子及其应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
circSLC41A1 Resists Porcine Granulosa Cell Apoptosis and Follicular Atresia by Promoting SRSF1 through miR-9820-5p Sponging;Huiming Wang;International Journal of Molecular Sciences;第3卷(第23期);第1-17页 *
Genome-wide profiling of Sus scrofa circular RNAs across nine organs and three developmental stages;Guoming Liang 等;DNA Reserch;第24卷(第5期);第523-535页 *
PREDICTED: Sus scrofa solute carrier family 41 (magnesium transporter), member 1 (SLC41A1), transcript variant X3, mRNA;GenBank DataBase;GenBank DataBase;Accession No.XM-013979615.1 *
The potential biological functions of circular RNAs during the initiation of atresia in pig follicles;T Y Guo 等;Domestic Animal Endocrinology;第72卷;摘要、第6页右栏第1段、图3、第11页右栏第1页 *
环状RNA的特征及其在家禽中的研究进展;徐海冬 等;生物技术通报;第34卷(第11期);第62-75页 *

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