CN110467663B - Rspo3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明以直径为3～5和7～10mm的两种卵泡为实验材料，采用测序技术研究H3K4me3与卵巢卵泡发育相关基因表达水平的关系。通过ChIP‑Seq发现，在不同大小卵泡中RSPO3基因启动子区的H3K4me3富集程度有显著差异；通过qRT‑PCR发现，在不同大小卵泡中RSPO3基因的表达量有显著差异；通过促进或抑制母猪卵巢颗粒细胞中H3K4me3的程度发现促进H3K4me3程度可促进RSPO3基因的转录，抑制H3K4me3程度可抑制RSPO3基因的转录；通过超表达或干扰RSPO3发现RSPO3可促进母猪卵巢颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡。

Description

RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用
技术领域
本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用。
背景技术
卵巢是母畜繁育的基础，其主要功能是产生并排出卵子，此外卵巢卵泡中的颗粒细胞能够分泌性激素，促进母畜性征的发育及维持，卵巢能否健康发育关系着母畜繁殖能力的强弱及利用年限的长短。表观遗传学是指在DNA双链序列未改变的情况下，基因的表达发生改变，即未改变基因型的前提下改变表型。其中组蛋白翻译后修饰发生在核小体八聚体的各个组份上，在表观遗传研究中H3K4me3(H3组蛋白上4号赖氨酸的3甲基化，Tri-methylation of Histone H3 lysine 4)是一个具有转录活性的典型染色质标记，Santos-Rosa等研究表明，H3的4号赖氨酸甲基化可以募集核小体重塑酶和组蛋白乙酰化酶，正向调节基因的转录，且H3K4me3结合在基因上的宽度与细胞识别种类相关，H3K4me3分布情况与基因的转录水平相关。
R-脊椎蛋白3(R-spondin 3,RSPO3)全长约2,390bp，有5个外显子，开放阅读框为816bp，编码272个氨基酸，是RSPO家族中第一个被发现的基因，主要分布在细胞的内质网和高尔基体上，能够通过经典的分泌途径分泌到胞外。Aoki、Kazanskaya等人研究发现，在小鼠胚胎发育过程中，胚胎血管可以与母体血管交换气体、营养和废物，敲低RSPO3基因会导致小鼠胎儿的血管渗透能力下降，并最终造成动物死亡。此外，RSPO3基因是RSPO家族蛋白的成员，Zhang等研究表明RSPO能够激活Wnt信号通路，在哺乳动物胚胎发育等较为重要的生物学进程中均发挥重要的。已有大量研究表明Wnt/β-catenin通路异常激活能够促进致癌细胞增殖、分化和迁移，且Wnt家族的大部分成员均能够在卵巢卵泡内表达，其中卷曲蛋白受体参与胚胎和卵泡的早期发育，低密度脂蛋白相关受体主要参与排卵和黄体的生成，但目前RSPO3基因与母猪卵巢颗粒细胞生长发育的联系仍未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用，体外环境下，RSPO3基因调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡。
所述的RSPO3基因调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡为通过如下方式实现：增加RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡；或减少RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡。
所述的增加RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡为通过升高H3K4me3程度(升高H3K4me3程度能显著升高RSPO3的相对表达量)，和/或增加外源性RSPO3基因的方式实现。
所述的升高H3K4me3程度为采用H3K4me3激动剂进行。
所述的H3K4me3激动剂为H3K4me3激动剂PBIT；优选为SIGMA公司的H3K4me3激动剂PBIT。
所述的H3K4me3激动剂PBIT的有效浓度为2～4μM；优选为2μM。
所述的增加外源性RSPO3基因通过如下方法实现：将RSPO3基因连接到pcDNA3.1载体上，构建含有RSPO3基因的超表达载体；然后将含有RSPO3基因的超表达载体转染到母猪卵巢颗粒细胞中。
所述的含有RSPO3基因的超表达载体优选为通过如下方法构建得到：
(1)以猪耳DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增片段；然后将扩增片段连接到pMD18T载体上，得到重组质粒T-RSPO3；
(2)以重组质粒T-RSPO3为模板进行PCR扩增，得到目的片段；然后使用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切目的片段和pcDNA3.1载体，酶连，转化，菌液鉴定，测序鉴定，得到重组载体，即所述的含有RSPO3基因的超表达载体。
步骤(1)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
F：5′-ATGCACTTGCGACTGATTTCTTG-3′；
R：5′-CTAGTGTACAGTGCTGACTGATACC-3′。
步骤(2)中进行PCR扩增所用引物如下所示：
F：5′-GCTCGGATCCATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGTTTTTTATC-3′；
R：5′-TGCAGAATTCCTAGTGTACAGTGCTGACTGATACCGATTTCTG-3′。
所述的减少RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡为通过降低H3K4me3程度(降低H3K4me3程度能显著降低RSPO3的相对表达量)，和/或将抑制RSPO3基因表达的siRNA转染到母猪卵巢颗粒细胞的方式实现。
所述的降低H3K4me3程度为采用H3K4me3抑制剂进行。
所述的H3K4me3抑制剂为H3K4me3抑制剂BCl-121；优选为SIGMA公司的H3K4me3抑制剂BCl-121。
所述的H3K4me3抑制剂BCl-121的有效浓度为100～150μM；优选为150μM。
所述抑制RSPO3基因表达的siRNA，其靶向核苷酸序列选自如下任一序列：
RSPO3-siRNA1：5′-GCAACATGTTCAGATTACA-3′；
RSPO3-siRNA2：5′-ACAGTGCAAAGAAAGAAGT-3′；
RSPO3-siRNA3：5′-GCGAAAGGTCCAAGAGAAA-3′。
RSPO3基因作为母猪卵巢卵泡生长发育标志物的应用，测序结果显示：不同大小卵泡中RSPO3基因启动子区H3K4me3的富集程度具有显著差异，直径为3～5mm的母猪卵泡中，RSPO3基因启动子区H3K4me3的富集程度显著低于7～10mm的母猪卵泡；不同大小卵泡中RSPO3基因含量具有显著差异，3～5mm的母猪卵泡中RSPO3基因含量低于7～10mm的母猪卵泡，说明RSPO3基因参与卵泡生长发育，可以作为卵泡生长发育的标志。
所述的RSPO3基因启动子区H3K4me3的富集程度检测通过ChIP-Seq的方式实现。
所述的母猪卵泡中RSPO3基因含量检测通过qRT-PCR的方式实现。
RSPO3基因在制备调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡的药物中的应用。
所述的RSPO3基因调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡为通过如下方式实现：增加RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡；或减少RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡。
所述的增加RSPO3基因为通过升高H3K4me3程度(升高H3K4me3程度能显著升高RSPO3的相对表达量)，和/或增加外源性RSPO3基因的方式实现。
所述的降低H3K4me3程度为采用H3K4me3抑制剂进行。
所述的H3K4me3抑制剂优选为H3K4me3抑制剂PBIT。
所述的H3K4me3抑制剂PBIT的有效浓度为2～4μM；优选为2μM。
所述的减少RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡为通过降低H3K4me3程度(降低H3K4me3程度能显著降低RSPO3的相对表达量)，和/或将抑制RSPO3基因表达的siRNA转染到母猪卵巢颗粒细胞的方式实现。
所述的降低H3K4me3程度为采用H3K4me3抑制剂进行。
所述的H3K4me3抑制剂优选为H3K4me3抑制剂BCl-121。
所述的H3K4me3抑制剂BCl-121的有效浓度为100～150μM；优选为150μM。
所述抑制RSPO3基因表达的siRNA，其靶向核苷酸序列选自如下任一序列：
RSPO3-siRNA1：5′-GCAACATGTTCAGATTACA-3′；
RSPO3-siRNA2：5′-ACAGTGCAAAGAAAGAAGT-3′；
RSPO3-siRNA3：5′-GCGAAAGGTCCAAGAGAAA-3′。
本发明的验证结果如下：
1、直径为3～5和7～10mm的两种卵泡进行ChIP-Seq，发现直径为3～5的母猪卵泡中，RSPO3基因启动子区H3K4me3的富集程度显著低于7～10mm的母猪卵泡。
2、直径为3～5mm的卵泡中RSPO3相对表达量显著低于7～10mm的卵泡。
3、使用H3K4me3药物处理母猪卵巢颗粒细胞(BCl-121为H3K4me3抑制剂，DMSO-150为抑制剂对照；PBIT为H3K4me3激动剂，DMSO-2为激动剂对照)，qRT-PCR检测RSPO3的相对表达量，降低H3K4me3程度能显著降低RSPO3的相对表达量，升高H3K4me3程度能显著升高RSPO3的相对表达量(图2)。
4、设计目的基因RSPO3的引物：从NCBI上查找目的基因RSPO3(NCBI Gene ID:100155208)的序列，确定酶切位点(RSPO3基因的酶切位点是BamHI和EcoRI)，使用PrimerPremier 5.0软件进行引物设计，通过PCR特异性扩增、纯化、酶切目的片段，然后与pcDNA3.1表达载体连接，最后成功构建目的基因RSPO3的超表达载体pcDNA3.1-RSPO3。后续通过在母猪卵巢颗粒细胞中转染不同浓度(50、100、250、500和1000ng/mL)的超表达载体，qRT-PCR检测RSPO3的表达量发现，转染pcDNA3.1-RSPO3超表达载体的浓度越高，转染效率越好，且均差异显著。后续研究选择250ng/mL为pcDNA3.1-RSPO3的转染浓度。
5、合成3对干扰RSPO3小片段/对照(RSPO3-siRNA/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。由附图结果可知，转染基因干扰小片段到母猪卵巢颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好RSPO3-siRNA2小片段进行后续实验。
RSPO3-siRNA1：5′-GCAACATGTTCAGATTACA-3′；
RSPO3-siRNA2：5′-ACAGTGCAAAGAAAGAAGT-3′；
RSPO3-siRNA3：5′-GCGAAAGGTCCAAGAGAAA-3′。
6、分别转染pcDNA3.1-RSPO3或RSPO3-siRNA2到母猪卵巢颗粒细胞，利用AnnexinV-FITC法和Edu法分别检测RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞凋亡和增殖的影响。结果显示pcDNA3.1-RSPO3组的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著低于对照组pcDNA3.1，RSPO3-siRNA2组的凋亡率显著高于对照组siRNA-NC。另一部分结果显示pcDNA3.1-RSPO3组的增值率显著高于对照组pcDNA3.1，RSPO3-siRNA2组的增殖率显著低于对照组siRNA-NC。综上，RSPO3可能抑制母猪卵巢颗粒细胞的凋亡和促进增殖。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明以直径为3～5和7～10mm的两种卵泡为实验材料，采用测序技术研究H3K4me3与卵巢卵泡发育相关基因表达水平的关系：通过ChIP-Seq发现，在直径为3～5的母猪卵泡中，RSPO3基因启动子区H3K4me3的富集程度显著低于7～10mm的母猪卵泡；通过qRT-PCR发现，在不同大小卵泡中RSPO3基因的表达量有显著差异。
2、通过促进或抑制母猪卵巢颗粒细胞中H3K4me3的程度发现促进H3K4me3程度可促进RSPO3基因的转录，抑制H3K4me3程度可抑制RSPO3基因的转录。
3、本发明预测RSPO3基因的表达水平可能影响母猪卵巢颗粒细胞功能，并能够调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，调控母猪卵巢卵泡的生长发育。因此，以RSPO3为研究对象，采用了分子和细胞生物学方法研究其在母猪卵巢颗粒细胞中的应用：通过超表达或干扰RSPO3发现RSPO3可促进母猪卵巢颗粒细胞增殖，抑制凋亡。对研究卵巢卵泡闭锁机制等具有很好的应用价值。
3、本发明技术方案设计周详，结果可靠。
附图说明
图1是不同大小卵泡中RSPO3相对表达量。
图2是H3K4me3对RSPO3相对表达量的影响图。
图3是pcDNA3.1-RSPO3重组质粒双酶切电泳图。
图4是超表达载体pcDNA3.1-RSPO3效率检测图。
图5是干扰片段RSPO3-siRNA效率检测图。
图6是Edu法检测超表达或干扰RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞增殖的影响图；其中，a是Edu法检测超表达RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞增殖的影响；b是Edu法检测干扰RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞增殖的影响。
图7是Annexin V-FITC法检测超表达或干扰RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响图；其中a是Annexin V-FITC法超表达RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响；b是Annexin V-FITC法检测干扰RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
本发明中应用统计学方法，分析各实施例中3次独立实验的结果，分别计算“平均值±标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析(图中“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01)。
实施例1ChIP-Seq筛选差异基因RSPO3
(1)选择猪卵巢中直径为3～5和7～10mm的两种大小卵泡，甲醛交联整个组织，即将目标蛋白与染色质连结，分离基因组DNA，超声波将DNA打断；添加目标蛋白质的特异性抗体anti-H3K4me3(SANTA CRUZ)，形成免疫沉淀复合体；去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本。
(2)DNA样品送上海康成生物工程有限公司进行基因测序。测序基本流程：
①样品质量评估，使用Quant-iTTM dsDNA High-Sensitivity(HS)Assay Kit(Invitrogen)测定DNA样品的纯度和浓度。
②序列库准备，使用TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit(FC-121-4002，Illumina)对DNA样品进行端部修复、尾端连接和接头连接；使用AMPure XP beads筛选200～1500bp的DNA片段；使用Agilent 2100分析仪测定DNA的长度和浓度。
③使用HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit(PE-410-1001，Illumin)在测序芯片上生产DNA簇，测序。
④分析测序数据，使用Off-Line Basecaller(v1.8.0)分析图像，调用和排列碱基；并用Solexa CHASTITY进行质控，最后使用BOWTIE(v2.1.0)将读取数据匹配到猪的基因组(susscr3)。
⑤使用MACS(v1.4.2)读取测序数据的峰值，采用泊松比较寻找与蛋白差异富集的区域(P<0.05)。
⑥使用UCSC RefSeq数据库注释距离差异peak最近的基因，将转录起始位点(Transcription start site,TSS)-2～+2Kb定义为启动子区，并寻找位于启动子区的peak。
⑦使用GO和KEGG分析启动子区包含peak的基因，筛选出与繁殖性能相关的差异基因RSPO3。
实施例2RNA抽提、质量检测及反转录
(1)RNA抽提：
①样品消化：从组织样中抽提RNA，取50～100mg组织样于冰上快速剪碎或用匀浆机反复匀浆，加入Trizol(50～100mg/ml)。从细胞中抽提RNA，不需要对细胞进行消化，直接加入Trizol(10cm2/mL)。
②将组织或细胞样在冰上放置10～15min，4℃12000g离心5min，将含RNA的上清转移至新的RNase-free管。
③加入氯仿(氯仿：Trizol的体积比为1:5)，激烈震荡，室温下放置5min，4℃12,000g离心15min，将上层水相小心移至新的RNase-free管。
④加入异丙醇(异丙醇：Trizol的体积比为1:2)，轻微颠倒混匀，室温下放置10min，4℃12,000g离心15min，抽去上清。
⑤按照体积比1:1的75％乙醇-DEPC：Trizol的比例加入75％乙醇-DEPC(即75％乙醇溶液(用DEPC处理过的水配制))，轻柔吹打，清洗抽提的RNA，然后4℃12000g离心15min，抽去上清，重复此步骤2次。
⑥将RNA于室温干燥5～10min，使乙醇尽量挥发完全，同时也应防止RNA过度干燥。
⑦最后加入30μL的DEPC水溶解RNA沉淀。
(2)RNA质量检测：
①琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整程度：制备浓度为1％的琼脂糖凝胶，将2μL RNA样品与2μL Loading Buffer混匀，15V/cm电压电泳20min。
②电泳完成后，使用凝胶成像仪拍照，若RNA完整程度较好，观察条带可见28S、18S和5S小分子RNA条带。
③最后紫外分光光度计检测样品OD 260/OD 280的比值，-80℃保存RNA备用。
(3)RNA反转录，参照Takara PrimerScriptTM RT reagent kit说明书，反应体系见表1：
表1基因组RNA反转录体系
Figure BDA0002166211020000081
注：反应条件为37℃ 15min，85℃ 5s。
实施例3 qRT-PCR
本发明中基因的qRT-PCR检测采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)试剂盒(Thermo Scientific公司)。实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：
基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}
检测基因用GAPDH做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为：
qRT-PCR-RSPO3 Forward：5′-CGTCAGTATTGTGCACTGTGA-3′；
Reverse：5′-GGTGGGAGGACACAGGTTAC-3′；
qRT-PCR-GAPDH Forward：5′-GGACTCATGACCACGGTCCAT-3′；
Reverse：5′-TCAGATCCACAACCGACACGT-3′。
实施例4构建RSPO3基因超表达载体
(1)利用Primer5设计引物，引物序列如下：
F：5′-ATGCACTTGCGACTGATTTCTTG-3′；
R：5′-CTAGTGTACAGTGCTGACTGATACC-3′。
以抽提的猪耳DNA为模板扩增RSPO3基因CDS区，纯化回收扩增的片段，连接pMD18T载体(Takara)，转化、筛选及测序鉴定正确后，抽提普通质粒，命名为T-RSPO3。
(2)BioEdit软件分析发现RSPO3基因CDS区序列无BamHI和EcoRI两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体存在BamHI和EcoRI酶切位点。Primer5设计RSPO3基因CDS区引物，其上下游引物分别加上BamHI和EcoRI酶切位点序列。以T-RSPO3普通质粒为模版，PCR扩增；对目的片段回收纯化，双酶切目的片段和pcDNA3.1载体(Invitrogen，货号V79020)，连接pcDNA3.1载体、转化、筛选并测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(Magen)，命名为pcDNA3.1-RSPO3。
本发明用到的RSPO3基因超表达载体引物序列如下：
F：5′-GCTCGGATCCATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGTTTTTTATC-3′；
R：5′-TGCAGAATTCCTAGTGTACAGTGCTGACTGATACCGATTTCTG-3′。
注：下划线为保护碱基，加粗部分为酶切位点。
实施例5母猪卵巢颗粒细胞的培养
(1)本发明母猪卵巢颗粒细胞的采集自嘉禾望岗屠宰场，采集屠宰母猪卵巢保存于含1％(w/w)双抗(青霉素和链霉素)的PBS缓冲液中，低温迅速带回实验室处理。
(2)用含1％(w/w)双抗的PBS清洗卵巢数次，转移样品至细胞房。
(3)提前将超净台紫外照射细胞房超净台20min，并用75％的酒精擦拭。
(4)镊子夹取卵巢，用1mL注射器吸取卵泡液于5mL DMEM培养基，每管吸取卵泡液至9mL，800rpm离心5min，弃上清，加入预热的PBS轻柔吹打沉淀细胞，清洗两次。
(5)在75mL细胞培养瓶中培养，先在培养瓶中加入10mL DMEM完全培养基(含10％(v/v)小牛血清和1％(w/w)双抗)，再加入5mL细胞细胞悬液，轻柔地摇晃均匀。
(6)置于37℃，5％ CO2培养箱，48h后观察母猪卵巢颗粒细胞生长状况。
(7)用含预热的含1％(w/w)双抗的PBS清洗两次，再培养24h后可进行后续实验。
实施例6 H3K4me3激动剂和抑制剂的药物处理母猪卵巢颗粒细胞
(1)用胰酶消化培养的母猪卵巢颗粒细胞，放入37℃，5％ CO2培养箱3～5min，显微镜下观察到大部分细胞悬浮，立即加入等量DMEM完全培养基(同实施例5步骤(5))终止消化。
(2)收集细胞悬液800rpm离心5min，用预热的PBS清洗细胞两遍，用DMEM完全培养基重悬，将细胞悬液均匀加入6孔板中，轻柔地摇晃均匀，放入37℃，5％ CO2培养箱培养24h。
(3)观察细胞状态，当细胞汇合度达到80％左右时，分别使用150μM的H3K4me3的抑制剂BCl-121(SIGMA，货号：SML1817)及2μM的H3K4me3激动剂PBIT(SIGMA，货号：SML1058)药物处理细胞。同时设置BCl-121组的对照是使用浓度为150μM的DMSO(二甲基亚砜)溶液(即DMSO-150)，PBIT组的对照是使用浓度为2μM的DMSO溶液(即DMSO-2)。
(4)在显微镜下观察细胞状态，药物处理后的细胞置于37℃，5％ CO2培养箱中继续培养。
实施例7母猪卵巢颗粒细胞铺板和转染
(1)用胰酶消化培养的母猪卵巢颗粒细胞，放入37℃，5％ CO2培养箱3～5min，显微镜下观察到大部分细胞悬浮，立即加入等量DMEM完全培养基终止消化。
(2)收集细胞悬液800rpm离心5min，用预热的PBS清洗细胞两遍，用DMEM完全培养基重悬，将细胞悬液均匀加入6孔板中，轻柔地摇晃均匀，放入37℃，5％ CO2培养箱培养24h。
(3)观察细胞状态，当细胞汇合度达到80％左右时，即可进行后续实验。
(4)转染方法按Invitrogen公司的
Figure BDA0002166211020000101
3000试剂盒说明书进行，每组设置3个重复。
(5)转染后的细胞置于37℃，5％ CO2培养箱中继续培养。
(6)根据实验目的在转染24或48h后收集细胞。
实施例8母猪卵巢颗粒细胞增殖检测
本发明使用EdU法检测细胞增殖，参照广州市锐博生物科技有限公司Cell-LightTMEdU Apollo 567 In vitro Kit检测试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)取母猪卵巢颗粒细胞接种于48孔板，培养细胞至融合度为50～80％。
(2)制备50μM EdU培养基，即为用细胞培养基稀释按照1000:1稀释EdU溶液，每孔加入200μL 50μM EdU培养基孵育2h，PBS清洗细胞，每次3～5min。
(3)细胞固定化：向每孔加入200μL细胞固定液(用PBS稀释至80％(v/v)的丙酮)，室温孵育15～30min，PBS清洗细胞，每次3～5min。
(4)细胞透化：每孔加入200μL渗透剂(含0.5％ TritonX-100的PBS)透化细胞，透化孵育10min，PBS清洗细胞。
(5)EdU检测：每孔加入200μL的
Figure BDA0002166211020000102
染色反应液(避光配置)，避光在细胞培养中孵育30min，PBS清洗细胞。
(6)细胞再次透化：每孔加入200μL渗透剂(含0.5％ TritonX-100的PBS)透化细胞，透化孵育10min，PBS清洗细胞。
(7)DNA染色：每孔加入200μL DAPI染色液，避光室温孵育30min；
(8)荧光显微镜镜检(每组三个重复)。
实施例9母猪卵巢颗粒细胞凋亡检测
本发明使用Annexin V-FITC技术检测细胞凋亡，参照参照BioVision公司AnnexinV-FITC Apoptosis Detection Kit试剂盒说明书，具体操作步骤如下：
(1)取母猪卵巢颗粒细胞接种于6孔板，培养细胞至融合度为50～80％，用PBS溶液清洗细胞。
(2)使用不含EDTA(乙二胺四乙酸)的胰酶消化细胞，用2mL PBS溶液清洗细胞。
(3)取0.5mL细胞悬液(约5×105个细胞)，加入500μL 1×Binding Buffer。
(4)加入5μL Annexin V-FITC及室温5μL PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)，室温避光孵育5min。
(5)立即用流式细胞仪检测分析(每组3个重复)。
结果分析：
1、直径为3～5和7～10mm的两种大小卵泡进行ChIP-Seq，发现直径为3～5mm的母猪卵泡中，RSPO3基因启动子区H3K4me3的富集程度显著低于7～10mm的母猪卵泡(表2)。
表2 RSPO3基因在两个时期启动子区H3K4me3的富集程度
Refseq_name NM_001315656
基因名 RSPO3
正反义链 -
染色体位置 chr1:39787701-39789000
差异富集区长度(bp) 1300
3～5mm count 8.1
7～10mm count 18.9
差异倍数 2.3316893
P值 0.0059886
FDR 0.064711
差异富集区域 启动子(promoter)
注：a、表1中的ChIP-Seq结果，是将基因组DNA与H3K4me3蛋白结合，然后找出与H3K4me3蛋白结合的DNA，测序发现有很多片段的“count”在不同大小卵泡中有差异，也就是3～5mm卵泡中较少，7～10mm卵泡中较多。即表1中“3～5mm count”表示的是3～5mm卵泡中该片段与H3K4me3蛋白结合的DNA片段的数量；同理，“7～10mm count”表示的是7～10mm卵泡中该片段与H3K4me3蛋白结合的DNA片段的数量。
b、表1中P值＜0.01，在直径为3～5和7～10mm的两种大小的卵泡中，该区域H3K4me3的富集程度具有显著差异。
2、抽取3～5和7～10mm直径卵泡的卵泡液，抽取卵泡液RNA检测RSPO3的相对表达量。结果如图1所示，直径为3～5mm的卵泡中RSPO3相对表达量显著低于直径为7～10mm的卵泡。
3、为探究H3K4me3对RSPO3基因的影响，使用药物处理母猪卵巢颗粒细胞，实验分为四组：150μM BCl-121(H3K4me3抑制剂组)；150μM DMSO(抑制剂对照组，即DMSO-150)；2μMPBIT(H3K4me3激动剂)；2μM DMSO(激动剂对照组，即DMSO-2)。qRT-PCR检测RSPO3的相对表达量。结果显示降低H3K4me3程度能显著降低RSPO3的相对表达量，升高H3K4me3程度能显著升高RSPO3的相对表达量(图2)。
4、设计目的基因RSPO3的引物：从NCBI上查找目的基因RSPO3(NCBI Gene ID:100155208)的序列，确定酶切位点(RSPO3基因的酶切位点是BamHI和EcoRI)，使用PrimerPremier 5.0软件进行引物设计，通过PCR特异性扩增、纯化、酶切目的片段，然后与pcDNA3.1表达载体连接，最后成功构建目的基因RSPO3的超表达载体pcDNA3.1-RSPO3(图3)。后续通过在母猪卵巢颗粒细胞中转染不同浓度(50、100、250、500和1000ng/mL)的过表达载体，qRT-PCR检测RSPO3的表达量发现，转染pcDNA3.1-RSPO3过表达载体的浓度越高，转染效率越好，且均差异显著(图4)。后续研究选择250ng/mL为pcDNA3.1-RSPO3的转染浓度。
所述的卵巢卵泡来源于广州市嘉禾望岗屠宰场的健康商品母猪(杜长大三元杂交猪，下同)。
5、合成3对干扰RSPO3小片段/对照(RSPO3-siRNA/siRNA-NC)，筛选并检测其干扰效率。由附图结果可知(图5)，转染基因干扰小片段到母猪卵巢颗粒细胞中，通过qRT-PCR手段，最终筛选干扰效果较好RSPO3-siRNA2小片段进行后续实验。
RSPO3-siRNA1：5′-GCAACATGTTCAGATTACA-3′；
RSPO3-siRNA2：5′-ACAGTGCAAAGAAAGAAGT-3′；
RSPO3-siRNA3：5′-GCGAAAGGTCCAAGAGAAA-3′。
上述小干扰RNA片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；siRNA-NC对照组来自广州市锐博生物科技有限公司(siRNA-NC为该公司通用阴性对照产品)。
6、分别转染pcDNA3.1-RSPO3或RSPO3-siRNA2到母猪卵巢颗粒细胞，对应以pcDNA3.1或siRNA-NC为对照，利用Edu法和Annexin V-FITC法分别检测RSPO3对母猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响。
结果显示pcDNA3.1-RSPO3组的增殖率显著高于对照组pcDNA3.1(图6a)，RSPO3-siRNA2组的增殖率显著低于对照组siRNA-NC(图6b)。
另一部分结果显示，pcDNA3.1-RSPO3组的凋亡率(早期凋亡+晚期凋亡)显著低于对照组pcDNA3.1(图7a)，RSPO3-siRNA2组的凋亡率显著高于对照组siRNA-NC(图7b)。
综上，RSPO3能够促进母猪卵巢颗粒细胞增殖，抑制细胞凋亡。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR- RSPO3 Forward
<400> 1
cgtcagtatt gtgcactgtg a 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR- RSPO3 Reverse
<400> 2
ggtgggagga cacaggttac 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-GAPDH Forward
<400> 3
ggactcatga ccacggtcca t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-GAPDH Reverse
<400> 4
tcagatccac aaccgacacg t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F
<400> 5
atgcacttgc gactgatttc ttg 23
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R
<400> 6
ctagtgtaca gtgctgactg atacc 25
<210> 7
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 上游引物F
<400> 7
gctcggatcc atgcacttgc gactgatttc ttggtttttt atc 43
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 下游引物R
<400> 8
tgcagaattc ctagtgtaca gtgctgactg ataccgattt ctg 43
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RSPO3-siRNA1
<400> 9
gcaacatgtt cagattaca 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RSPO3-siRNA2
<400> 10
acagtgcaaa gaaagaagt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> RSPO3-siRNA3
<400> 11
gcgaaaggtc caagagaaa 19

Claims (5)

1.猪RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：体外环境下，猪RSPO3基因调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡；
所述的猪RSPO3基因调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡通过如下方式实现：增加猪RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡；或减少猪RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡；
所述的增加猪RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡通过增加外源性猪RSPO3基因的方式实现；
所述的减少RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡通过将抑制猪RSPO3基因表达的siRNA转染到母猪卵巢颗粒细胞的方式实现。
2.根据权利要求1所述的猪RSPO3基因在母猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：
所述抑制猪RSPO3基因表达的siRNA，其靶向核苷酸序列选自如下任一序列：
RSPO3- siRNA1：5′- GCAACATGTTCAGATTACA -3′；
RSPO3- siRNA2：5′- ACAGTGCAAAGAAAGAAGT -3′；
RSPO3- siRNA3：5′- GCGAAAGGTCCAAGAGAAA -3′。
3.猪RSPO3基因作为母猪卵巢卵泡生长发育标志物的应用，其特征在于：其以非疾病诊断治疗为目的。
4.猪RSPO3基因在制备调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡的药物中的应用，其特征在于：
所述的猪RSPO3基因调控母猪卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡通过如下方式实现：增加猪RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡；或减少猪RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡；
所述的增加猪RSPO3基因促进母猪卵巢颗粒细胞的增殖、抑制细胞的凋亡通过增加外源性猪RSPO3基因的方式实现；
所述的减少猪RSPO3基因抑制母猪卵巢颗粒细胞的增殖、促进细胞的凋亡通过将抑制猪RSPO3基因表达的siRNA转染到母猪卵巢颗粒细胞的方式实现。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述抑制猪RSPO3基因表达的siRNA，其靶向核苷酸序列选自如下任一序列：
RSPO3- siRNA1：5′- GCAACATGTTCAGATTACA -3′；
RSPO3- siRNA2：5′- ACAGTGCAAAGAAAGAAGT -3′；
RSPO3- siRNA3：5′- GCGAAAGGTCCAAGAGAAA -3′。
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