发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的首要目的在于提供H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用。通过生物信息学预测及ChIP-qPCR技术确定H3K27me3在FoxO1基因启动子区的H3K27me3修饰位点,再利用H3K27me3的激动剂/抑制剂改变卵巢颗粒细胞中的H3K27me3程度,确定H3K27me3调控FoxO1基因mRNA表达变化在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用
所述的应用具体是在猪卵巢颗粒细胞的周期进程、增殖、凋亡及类固醇激素分泌中的应用。
体外环境下,FoxO1基因抑制颗粒细胞分裂,延缓细胞周期进程。
体外环境下,FoxO1基因促进卵巢颗粒细胞的凋亡,抑制卵巢颗粒细胞的增殖。
体外环境下,FoxO1基因促进颗粒细胞孕酮的分泌,抑制颗粒细胞睾酮的分泌。
体外环境下,H3K27me3抑制FoxO1基因的表达。
所述的H3K27me3调控FoxO1基因表达为通过H3K27me3结合到FoxO1基因启动子区的15437948-15438065区域的位点上实现。
所述的FoxO1基因启动子序列信息可从NCBI数据库下载所得(Gene ID:397077)。
改变卵巢颗粒细胞中的H3K27me3程度,可利用H3K27me3的激动剂/抑制剂处理颗粒细胞实现。
所述的H3K27me3的激动剂优选为GSK-J4。
所述的H3K27me3的抑制剂优选为GSK-126。
所述的调控FoxO1基因表达的方式包括:构建含有FoxO1基因的超表达载体,将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞,增加FoxO1基因的表达;将抑制FoxO1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞,抑制FoxO1基因的表达。
所述的超表达载体优选为pcDNA3.1。
所述的siRNA(si-FoxO1)靶向序列为:5′-CCACCAAACACCAGTCTGA-3′。
所述的siRNA的应用环境为体外环境。
本发明的验证结果如下:
1、本发明通过ChIP-qPCR技术确定H3K27me3在FoxO1基因启动子区的H3K27me3修饰位点,H3K27me3结合于FoxO1启动子区(15437948-15438065)区域。半定量PCR电泳结果表明,Input组和实验组(Anti-H3K27me3)有到预期长度大小的电泳条带出现,阳性对照组(Anti-RNA polymerase II)有预期长度大小的电泳条带出现,阴性对照组(IgG)几乎没有条带出现(图1a);qPCR验证结果表明,实验组(Anti-H3K27me3)中FoxO1的富集丰度显著高于阴性对照组(IgG)(P<0.05)(图1b)。
2、本发明通过qRT-PCR检测到,2nM的H3K27me3激动剂(GSK-J4)处理颗粒细胞激活H3K27me3后,与对照组(GSK-J4-control)相比FoxO1基因mRNA表达量显著减少(P<0.05),6nM的H3K27me3的抑制剂(GSK-126)处理颗粒细胞抑制H3K27me3后,与对照组(GSK-126-control)相比FoxO1基因mRNA表达量极显著增加(P<0.01)(图2)。
3、本发明通过流式细胞术检测到,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比,阻滞于G0/G1期的细胞比例显著升高(P<0.05),而G2/M期的细胞比例显著降低(P<0.05)(图3);抑制FoxO1基因表达后,与对照组(NC)相比,阻滞于G0/G1期的细胞比例显著降低(P<0.05),而G2/M期的细胞比例极显著升高(P<0.01)(图4)。
4、本发明通过EdU法检测到,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)(图5);抑制FoxO1基因表达后,与对照组(NC)相比颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)(图6)。
5、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测到,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的凋亡率极显著升高(P<0.01)(图7);抑制FoxO1基因表达后,与对照组(NC)相比颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)(图8)。
6、本发明通过ELISA技术检测猪卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌情况,发现超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比,细胞上清中睾酮浓度极显著减少(p<0.01),孕酮浓度极显著增加(p<0.01)(图9);抑制FoxO1基因表达后,与对照组NC相比,细胞上清中睾酮浓度极显著增加(p<0.01),孕酮浓度极显著减少(p<0.01)(图10)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
本发明验证了卵巢颗粒细胞中H3K27me3对FoxO1基因表达的调控机制,并检测了超表达和抑制FoxO1后颗粒细胞的周期进程、增殖、凋亡、类固醇激素分泌的情况。本发明的结果显示H3K27me3结合到FoxO1基因启动子的15437948-15438065区域抑制FoxO1基因的表达,且FoxO1基因参与促进颗粒细胞的凋亡和孕酮的分泌,抑制颗粒细胞的分裂、增殖和睾酮的分泌。本发明为H3K27me3和FoxO1基因调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究积累了材料。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。应当理解的是,本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明,并非为了限定本发明,实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外,均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明,本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1 ChIP-qPCR
ChIP检测参照Thermo公司Pierce Agarose ChIP Kit(货号:26156)说明书进行,具体操作步骤如下:
(1)颗粒细胞的交联和收集
待原代猪卵巢颗粒细胞(来源于广州市白云区孔旺记屠宰场的商品母猪)密度达到70~90%时,弃培养基,在细胞培养瓶内加入用DMEM完全培养基稀释至终浓度为1%(v/v)的甲醛,混匀后室温静置10min;加入Glycine Solution至其终浓度为1×,混匀后置通风橱静置5min,弃液体,用预冷的1×PBS清洗细胞;加含1%(v/v)Halt Cocktail的预冷1×PBS,用细胞刮刮下细胞并转移至1.5mL灭菌离心管中,3000×g离心5min,弃液体。
(2)颗粒细胞裂解和消化
以细胞量为2×106个/管为例,将装有卵巢颗粒细胞沉淀的离心管置于冰上,加100μL Lysis Buffer 1,涡旋混匀15s,冰浴10min,9000×g离心3min,弃液体;加100LMNase Digestion Buffer Working Solution重悬沉淀;加0.25μL Micrococcal Nuclease(ChIP Grade)(10U/μL)涡旋混匀后于37℃水浴15min,期间每5min翻转混匀一次;加10μLMNase Stop Solution终止反应,短暂涡旋混匀后冰上静置5min,9000×g离心5min,弃液体;加50μL Lysis Buffer 2重悬沉淀,冰浴15min,每5min涡旋混匀15s,9000×g离心5min,转移上清至新的1.5mL灭菌离心管中。
(3)免疫沉淀反应
转移5μL上清液作为“Input”对照组,于-20℃保存待用;剩余45μL上清液中加450μL 1×IP Dilution Buffer,混匀后转移至spin column柱子里,并加入抗体(阳性对照:10μL Anti-RNA Polymerase II抗体(来自试剂盒);阴性对照:1~2μL Normal Rabbit IgG抗体(来自试剂盒);实验组:10μL Anti-H3K27me3抗体(购自德国Millipore公司,货号07-449),4℃摇床孵育过夜;加20μL ChIP Grade Protein A/G琼脂糖,4℃摇床1h,3000×g离心30s,弃液体;依次分别加入500μL IP Wash Buffer 1、IP Wash Buffer 2、IP WashBuffer 3,期间4℃摇床5min,3000×g离心30s,弃液体;3000×g离心1min。
(4)IP洗脱
向步骤(3)获得的沉淀中加150μL IP Elution Buffer,65℃孵育40min,每10min涡旋混匀一次;将柱子放在新的1.5mL灭菌离心管内,6000×g离心1min;加6μL 5M NaCl溶液和2μL 20mg/mL的蛋白酶K(Proteinase K),涡旋混匀后,65℃热激1.5h;往5μL Input对照组中加150μL IP Elution Buffer、6μL5M NaCl溶液和2μL 20mg/mL的蛋白酶K,涡旋混匀后,65℃热激1.5h。
(5)DNA回收
每个IP和Input管中加750μL DNA Binding Buffer,混匀后转移至DNAClean-up柱子中,10000×g离心1min,弃液体;加750μL DNA Column Wash Buffer,10000×g离心1min,弃液体,10000×g空离1min;将柱子转至新的1.5mL灭菌离心管内,加50μL DNA ElutionBuffer,10000×g离心1min,回收的DNA于-20℃保存备用。
(6)PCR检测
根据H3K27me3在FoxO1基因启动子区结合位点预测结果,设计ChIP引物验证H3K27me3蛋白是否结合于FoxO1基因启动子区(GAPDH做为阳性对照引物)。
ChIP-PCR引物信息如下:
ChIP-FoxO1 F:5′-ATACTTGGAGAATAAGAGAGGGTGA-3′;
R:5′-TCCATTTCCTCTACATGGAGCC-3′;
ChIP-GAPDH F:5′-CATGGGTGTGAACCATGAGA-3′;
R:5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。
半定量PCR电泳结果显示,Input组和实验组(Anti-H3K27me3)有到预期长度大小的电泳条带出现,阳性对照组(Anti-RNA polymerase II)有预期长度大小的电泳条带出现,阴性对照组(IgG)几乎没有条带出现(图1a);qPCR验证结果显示,实验组(Anti-H3K27me3)中FoxO1的富集丰度显著高于阴性对照组(IgG)(P<0.05)(图1b)。结果说明H3K27me3结合于FoxO1启动子区(15437948-15438065)区域。
实施例2 卵巢颗粒细胞的培养
(1)从广州市白云区孔旺记屠宰场采集健康母猪的卵巢,放入1×PBS(含1%双抗(m/v,青霉素和链霉素,下同)中,置于冰上并迅速带回实验室。
(2)用1×PBS(含1%双抗)清洗卵巢3次,迅速转入无菌培养室。
(3)在无菌培养室的超净台上,用1mL无菌一次性注射器吸取卵巢有腔卵泡中的卵泡液,加入含适量DMEM培养基的离心管中,室温下1000rpm离心5min。
(4)弃上清,加入预热的1×PBS(含1%双抗),轻柔吹打以重悬细胞沉淀,重复清洗细胞2次。
(5)配制DMEM完全培养基:89%高糖型DMEM+10%FBS(胎牛血清)+1%双抗。
(6)用完全培养基重悬细胞,接种于75mL培养瓶;置于37℃、5%CO2的培养箱中静置培养。
实施例3 H3K27me3激动剂和抑制剂处理颗粒细胞
(1)实施例2培养的细胞弃去培养基,用预热的1×PBS(含1%双抗)清洗细胞培养板3次。
(2)用DMEM完全培养基分别将药物的母液稀释成不同浓度的工作液,然后加入到对应的培养孔中。H3K27me3的激动剂为2nM/mL的GSK-J4(购自美国MedChemExpress公司,货号#1373423-53-0),对照组GSK-J4-control为2nM/mL的DMSO溶液(购自广州鼎国生物技术有限公司,货号DH105-2);H3K27me3的抑制剂为6nM/mL的GSK-126(购自美国MedChemExpress公司,货号#1346574-57-9),对照组GSK-J4-control为6nM/mL的DMSO溶液。
(3)将细胞置于37℃,5%CO2培养箱中继续培养,48h后进行后续检测实验。
实施例4 总RNA抽提及反转录
1、细胞总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书,具体操作步骤如下:
(1)将实施例3贴壁培养的颗粒细胞培养至合适密度后,弃培养基,1×PBS清洗细胞两次,再按每10cm2的细胞培养板底面积直接加入1mL TRIzol。
(2)冰上静置10min以充分裂解细胞,转移1mL裂解液至新1.5mL RNase-free EP管中,弃沉淀。
(3)往步骤(2)获得的上清中加入200μL氯仿,剧烈震荡15~30s混匀,冰上静置15min,4℃条件下12000rpm离心15min。
(4)转移上层水相至新的1.5mL RNase-free EP管中。
(5)往步骤(4)的上层水相中加入0.5mL异丙醇,轻轻地上下颠倒混匀,冰上静置10min,4℃条件下12000rpm离心10min。
(6)弃上清后于室温下沿管壁加入1mL用DEPC水稀释的75%(v/v)乙醇以洗涤RNA,4℃条件下12000rpm离心5min,弃上清。
(7)真空干燥5~10min,注意避免RNA沉淀干燥过度。
(8)加入30~50μL DEPC水以溶解RNA沉淀。
2、mRNA的反转录参照Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂说明书进行,具体操作步骤如下:
(1)每500ng步骤1中抽提的总RNA加入2μL的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂,并加入RNase Free H2O,使溶液总体系为10μL。
(2)将上述混合液进行PCR,反应程序为:37℃、15min,85℃、5s。
实施例5 qRT-PCR
将实施例4的反转录产物cDNA分别进行基因相对表达量的检测,参照ThermoScientific公司的Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X)试剂说明书进行。实验采用比较Ct值法计算目的基因的相对表达量,具体计算公式如下:
基因相对表达量=2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}
其中GAPDH作为内参基因,本发明所用到的qRT-PCR引物为:
qRT-PCR-FoxO1 F:5′-GACAGACTGGGCAGAGTAGAA-3′;
R:5′-AGCAACGATGACTTTGATAAC-3′;
qRT-PCR-GAPDH F:5′-TCGGAGTGAACGGATTTG-3′;
R:5′-TCACCCCATTTGATGTTGG-3′。
结果显示(图2),H3K27me3激动剂(GSK-J4)激活H3K27me3后,与对照组(GSK-J4-control)相比FoxO1基因mRNA表达量显著减少(P<0.05),H3K27me3的抑制剂(GSK-126)抑制H3K27me3后,与对照组(GSK-126-control)相比FoxO1基因mRNA表达量极显著增加(P<0.01)。
实施例6 构建FoxO1基因的超表达载体
(1)利用BioEdit软件分析发现FoxO1基因CDS区序列无BamH I和Xho I两种限制性内切酶酶切位点,而pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司,货号V79020)存在BamH I和Xho I酶切位点。
(2)利用primer premier 5.0软件设计FoxO1基因CDS区引物,其上下游引物分别加上BamH I和Xho I酶切位点序列,其中引物序列如下:
FoxO1-F:5′-CGGGATCCATGGCCGAAGCGCCC-3′;
FoxO1-R:5′-CCTCTCGAGTTAGCCTGACACCCAGCTATGTG-3′。
(3)以猪卵巢颗粒细胞cDNA(实施例4步骤2反转录获得)为模板,PCR扩增目的片段。PCR反应体系:0.5μL cDNA、5μL 2×Taq Plus Master Mix、0.3μL上游引物、0.3μL下游引物、Nuclease-free water将体系补至10μL。反应程序为95℃预变性3min;95℃变性30s,58℃复性30s,72℃延伸2min 21s,循环35次;72℃延伸10min,4℃保存。扩增产物经胶回收纯化、双酶切、回收后连接至pcDNA3.1(+)载体,再经转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自广州Magen公司),构建成功的重组真核表达载体,命名为pcDNA3.1-FoxO1。
实施例7 卵巢颗粒细胞的接种和转染
(1)实施例2培养的颗粒细胞汇合度达到90%左右时,倒掉培养基,用预热的1×PBS清洗细胞2次。
(2)加入0.25%(m/v)胰蛋白酶消化约5min,显微镜下观察到大部分细胞漂起后,立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例2步骤(5))终止消化。
(3)将细胞悬液转移至15mL离心管中,1000rpm离心5min,倒掉上清。
(4)1×PBS清洗细胞2次,1000rpm离心2次,每次5min。
(5)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀,均匀分到每个孔中,再用完全培养基补充体积,轻轻摇匀,放培养箱中培养24h左右。
(6)观察颗粒细胞的生长状态,待细胞汇合度达70~80%左右进行转染。
(7)将实施例6的重组真核表达载体pcDNA3.1-FoxO1(pcDNA3.1转染颗粒细胞作为对照组)转染至步骤(6)获得的颗粒细胞中,以实现在颗粒细胞中超表达FoxO1基因。转染方法按Invitrogen公司的
3000Transfection Kit试剂盒说明书进行;每组设置3个重复。
(8)将小干扰RNA片段si-FoxO1(5′-CCACCAAACACCAGTCTGA-3′)和对照组NC(货号:R0824)(均由广州市锐博生物科技有限公司合成)转染至步骤(6)获得的颗粒细胞中,以实现抑制颗粒细胞中FoxO1基因的表达。转染方法按Invitrogen公司的
3000Transfection Kit试剂盒说明书进行;每组设置3个重复。
(9)转染后的细胞置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
(10)根据实验目的在转染24~48h后收集细胞。
实施例8 颗粒细胞周期进程检测
本发明于转染48h后采用流式细胞术检测实施例7获得的细胞的周期进程,具体操作步骤如下:
(1)将细胞培养板放置在室温,用1×PBS轻轻润洗培养板内细胞,弃PBS。
(2)加入0.25%(m/v)胰蛋白酶消化约5min,显微镜下观察到大部分细胞漂起,立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例2步骤(5))终止消化。
(3)1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用预冷1×PBS清洗细胞2次。
(4)使用1mL 70%(v/v)的乙醇溶液固定细胞,4℃固定过夜。
(5)将固定好的细胞用预冷的1×PBS清洗两次,2000rpm离心5min。
(6)使用400μL的溴化乙锭轻柔重悬细胞,加入100μL RNase A,4℃避光孵育30min。
(7)用流式细胞仪检测分析(每个实验组设计至少3个重复)。
结果显示,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比,阻滞于G0/G1期的细胞比例显著升高(P<0.05),而G2/M期的细胞比例显著降低(P<0.05)(图3);抑制FoxO1基因表达后,与对照组(NC)相比,阻滞于G0/G1期的细胞比例显著降低(P<0.05),而G2/M期的细胞比例极显著升高(P<0.01)(图4)。
实施例9 颗粒细胞增殖检测
本发明于转染24h后采用EdU法检测实施例7获得的细胞增殖情况,实验参照广州市锐博生物科技有限公司的Cell-LightTM EdU Apollo 567In vitro Kit试剂盒说明书进行。采用48孔板,具体操作步骤如下:
(1)用DEME高糖培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液,制备适量50μM EdU培养基。
(2)每孔加入150μL 50μM的EdU培养基,孵育2h,弃培养基。
(3)1×PBS清洗细胞2次,每次5min。
(4)每孔加入150μL细胞固定液(含4%多聚甲醛的1×PBS),室温孵育30min,弃固定液。
(5)每孔加入150μL 2mg/mL的甘氨酸,脱色摇床孵育5min,弃甘氨酸溶液。
(6)每孔加入150μL 1×PBS,脱色摇床清洗2次,每次5min,弃PBS。
(7)每孔加入150μL的1×Apollo染色反应液,室温下避光孵育30min,弃染色反应液。
(8)加入150μL渗透剂(含0.5%Triton X的1×PBS),脱色摇床清洗3次,每次5min,弃渗透剂。
(9)用去离子水按100:1的比例稀释试剂F,制备适量1×Hoechst3342反应液,避光保存。
(10)每孔加入150μL 1×Hoechst3342反应液,室温下避光孵育30min,弃反应液。
(11)每孔加入150μL 1×PBS清洗5次,每次5min。
(12)每孔加入150μL 1×PBS保存待用。
(13)染色完成后,用荧光显微镜进行照片采集。
结果显示,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)(图5);抑制FoxO1基因表达后,与对照组(NC)相比颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)(图6)。
实施例10 颗粒细胞凋亡检测
本发明于转染48h后采用Annexin V-FITC/PI技术检测实施例7获得的细胞凋亡情况,实验参照广州科易达生物科技有限公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kitwith PI试剂盒说明书进行,具体操作步骤如下:
(1)将细胞培养板放置在室温,用1×PBS轻轻润洗培养板内细胞,弃PBS。
(2)加入0.25%(m/v)胰蛋白酶消化约5min,显微镜下观察到大部分细胞漂起,立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例2步骤(5))终止消化。
(3)1000rpm离心5min收集细胞,弃上清,用预冷1×PBS清洗细胞2次。
(4)调整每管细胞数为(0.2~1.0)×106个,加入500μL 1×Binding Buffer重悬细胞。
(4)加入5μL Annexin V-FITC,室温下避光反应15min。
(5)加入5μL PI(碘化丙啶染色液),轻轻混匀,4℃避光反应5min。
(6)立即用流式细胞仪检测分析。
结果显示,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的凋亡率极显著升高(P<0.01)(图7);抑制FoxO1基因表达后,与对照组(NC)相比颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)(图8)。
实施例11 颗粒细胞类固醇激素分泌检测
本发明于转染48h后采用ELISA法检测实施例5获得的颗粒细胞的类固醇激素分泌,实验参照上海江莱生物科技有限公司的猪睾酮酶联免疫分析试剂盒(货号JL26487)和猪孕酮酶联免疫分析试剂盒(货号JL21995)说明书进行,操作方法参照试剂盒中的说明书,具体步骤如下:
(1)设置标准品孔和样本孔,加入50μL不同浓度的标准品至标准品孔。
(2)收集细胞培养液上清,3000rpm离心20min,吸取上清。
(3)样本孔分别设待测样品孔和空白孔,吸取10μL上清加到含40μL样品稀释液的待测样品孔中,空白孔除外。
(4)用封板膜封住反应孔,于37℃孵育30min,弃液体。
(5)每孔加350μL洗涤液,静置30s,弃洗涤液,洗涤5次。
(6)每孔加入50μL酶标试剂,空白孔除外。
(7)重复步骤(4)和(5)。
(8)每孔加入显色剂A和B各50μL,37℃避光孵育15min。
(9)每孔加入50μL终止液,于15min内测定450nm波长处的OD值。
结果显示,在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后,与对照组(pcDNA3.1)相比,细胞上清中睾酮浓度极显著减少(p<0.01),孕酮浓度极显著增加(p<0.01)(图9);抑制FoxO1基因表达后,与对照组NC相比,细胞上清中睾酮浓度极显著增加(p<0.01),孕酮浓度极显著减少(p<0.01)(图10)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si-FoxO1
<400> 1
ccaccaaaca ccagtctga 19
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-FoxO1-F
<400> 2
atacttggag aataagagag ggtga 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-FoxO1-R
<400> 3
tccatttcct ctacatggag cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-GAPDH-F
<400> 4
catgggtgtg aaccatgaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-GAPDH-R
<400> 5
gtcttctggg tggcagtgat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-FoxO1-F
<400> 6
gacagactgg gcagagtaga a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-FoxO1-R
<400> 7
agcaacgatg actttgataa c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoxO1-F
<400> 8
cgggatccat ggccgaagcg ccc 23
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoxO1-R
<400> 9
cctctcgagt tagcctgaca cccagctatg tg 32