CN111849866B - H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用 - Google Patents

H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用。本发明通过研究H3K27me3对FoxO1基因表达的调控和FoxO1对卵巢颗粒细胞周期进程、增殖、凋亡及类固醇激素的分泌的影响，证明H3K27me3靶向结合FoxO1，抑制FoxO1的转录表达；激活H3K27me3抑制FoxO1基因的转录表达，抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和孕酮分泌，促进卵巢颗粒细胞的分裂、增殖和睾酮分泌；抑制H3K27me3促进FoxO1基因的转录表达，促进卵巢颗粒细胞的凋亡和孕酮分泌，抑制卵巢颗粒细胞的分裂、增殖和睾酮分泌；为H3K27me3和FoxO1基因在卵巢颗粒细胞中的表达调控机制研究积累材料。

Description

H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用
技术领域
本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
背景技术
组蛋白甲基化是一种抑制靶基因转录的表观遗传调控机制，主要发生在H3组蛋白上，有单甲基化、双甲基化以及三甲基化形式。组蛋白H3的第27位赖氨酸三甲基化(Tri-methylation of Histone H3lysine 27,H3K27me3)是一种常见的组蛋白甲基化形式，主要影响组蛋白与DNA结合的紧密程度，从而改变基因启动子的染色质状态，调控基因的转录。H3K27me3的修饰酶有甲基化转移酶EZH2和两个去甲基化转移酶KDM6A、KDM6B。H3K27me3与其调节酶通过抑制基因的转录在动物体的生长发育、代谢调节、免疫反应等多种生物学过程中发挥重要作用。
FoxO1(forkhead box O1)转录因子是FoxO家族的重要成员，该家族包含FoxO1、FoxO3A、FoxO4和FoxO6，其共同特征是具有一个长110个氨基酸的保守DNA结合结构域，结构域经折叠形成包含3个α螺旋、3个β折叠和2个翼状区的环状拓扑学结构。一些生长因子和细胞存活因子能够与细胞表面的络氨酸激酶受体结合，通过信号转导激活胞内的PI3K/AKT等信号通路，引起FoxO1蛋白磷酸化，使其滞留在细胞质中，抑制其转录因子功能的发挥。
卵巢卵泡主要由卵母细胞、颗粒细胞以及膜细胞三个部分组成，卵泡发育最为显著的形态变化特征为颗粒细胞的增殖和卵泡腔的形成。原始卵泡发育启动后，颗粒细胞的形态由扁平状转变为立方形，而且由单层增殖至数层，进而分化为包裹卵母细胞的呈放射状排列的卵丘颗粒细胞和紧贴卵泡腔周围的壁颗粒细胞。已有大量研究证实，颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素，颗粒细胞的生长启动先于卵母细胞。同时颗粒细胞也能够通过促性腺激素受体、激素、生长因子及细胞因子等调控卵泡的生长发育及闭锁。目前关于H3K27me3调控FoxO1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用。通过生物信息学预测及ChIP-qPCR技术确定H3K27me3在FoxO1基因启动子区的H3K27me3修饰位点，再利用H3K27me3的激动剂/抑制剂改变卵巢颗粒细胞中的H3K27me3程度，确定H3K27me3调控FoxO1基因mRNA表达变化在猪卵巢颗粒细胞中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用
所述的应用具体是在猪卵巢颗粒细胞的周期进程、增殖、凋亡及类固醇激素分泌中的应用。
体外环境下，FoxO1基因抑制颗粒细胞分裂，延缓细胞周期进程。
体外环境下，FoxO1基因促进卵巢颗粒细胞的凋亡，抑制卵巢颗粒细胞的增殖。
体外环境下，FoxO1基因促进颗粒细胞孕酮的分泌，抑制颗粒细胞睾酮的分泌。
体外环境下，H3K27me3抑制FoxO1基因的表达。
所述的H3K27me3调控FoxO1基因表达为通过H3K27me3结合到FoxO1基因启动子区的15437948-15438065区域的位点上实现。
所述的FoxO1基因启动子序列信息可从NCBI数据库下载所得(Gene ID:397077)。
改变卵巢颗粒细胞中的H3K27me3程度，可利用H3K27me3的激动剂/抑制剂处理颗粒细胞实现。
所述的H3K27me3的激动剂优选为GSK-J4。
所述的H3K27me3的抑制剂优选为GSK-126。
所述的调控FoxO1基因表达的方式包括：构建含有FoxO1基因的超表达载体，将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞，增加FoxO1基因的表达；将抑制FoxO1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞，抑制FoxO1基因的表达。
所述的超表达载体优选为pcDNA3.1。
所述的siRNA(si-FoxO1)靶向序列为：5′-CCACCAAACACCAGTCTGA-3′。
所述的siRNA的应用环境为体外环境。
本发明的验证结果如下：
1、本发明通过ChIP-qPCR技术确定H3K27me3在FoxO1基因启动子区的H3K27me3修饰位点，H3K27me3结合于FoxO1启动子区(15437948-15438065)区域。半定量PCR电泳结果表明，Input组和实验组(Anti-H3K27me3)有到预期长度大小的电泳条带出现，阳性对照组(Anti-RNA polymerase II)有预期长度大小的电泳条带出现，阴性对照组(IgG)几乎没有条带出现(图1a)；qPCR验证结果表明，实验组(Anti-H3K27me3)中FoxO1的富集丰度显著高于阴性对照组(IgG)(P<0.05)(图1b)。
2、本发明通过qRT-PCR检测到，2nM的H3K27me3激动剂(GSK-J4)处理颗粒细胞激活H3K27me3后，与对照组(GSK-J4-control)相比FoxO1基因mRNA表达量显著减少(P<0.05)，6nM的H3K27me3的抑制剂(GSK-126)处理颗粒细胞抑制H3K27me3后，与对照组(GSK-126-control)相比FoxO1基因mRNA表达量极显著增加(P<0.01)(图2)。
3、本发明通过流式细胞术检测到，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，阻滞于G0/G1期的细胞比例显著升高(P<0.05)，而G2/M期的细胞比例显著降低(P<0.05)(图3)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组(NC)相比，阻滞于G0/G1期的细胞比例显著降低(P<0.05)，而G2/M期的细胞比例极显著升高(P<0.01)(图4)。
4、本发明通过EdU法检测到，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)(图5)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组(NC)相比颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)(图6)。
5、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测到，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的凋亡率极显著升高(P<0.01)(图7)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组(NC)相比颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)(图8)。
6、本发明通过ELISA技术检测猪卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌情况，发现超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，细胞上清中睾酮浓度极显著减少(p<0.01)，孕酮浓度极显著增加(p<0.01)(图9)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组NC相比，细胞上清中睾酮浓度极显著增加(p<0.01)，孕酮浓度极显著减少(p<0.01)(图10)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明验证了卵巢颗粒细胞中H3K27me3对FoxO1基因表达的调控机制，并检测了超表达和抑制FoxO1后颗粒细胞的周期进程、增殖、凋亡、类固醇激素分泌的情况。本发明的结果显示H3K27me3结合到FoxO1基因启动子的15437948-15438065区域抑制FoxO1基因的表达，且FoxO1基因参与促进颗粒细胞的凋亡和孕酮的分泌，抑制颗粒细胞的分裂、增殖和睾酮的分泌。本发明为H3K27me3和FoxO1基因调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究积累了材料。
附图说明
图1是ChIP-qPCR法检测H3K27me3在FoxO1启动子区结合情况结果图；其中，a为半定量PCR电泳结果；b为qPCR验证结果。
图2是qRT-PCR法检测激活和抑制H3K27me3后FoxO1mRNA表达变化结果图。
图3是流式细胞术检测超表达FoxO1后颗粒细胞周期进程的结果图。
图4是流式细胞术检测抑制FoxO1表达后颗粒细胞周期进程的结果图。
图5是EdU法检测超表达FoxO1后颗粒细胞增殖的结果图。
图6是EdU法检测抑制FoxO1表达后颗粒细胞增殖的结果图。
图7是Annexin V-FITC法检测超表达FoxO1后颗粒细胞凋亡的结果图。
图8是Annexin V-FITC法检测抑制FoxO1表达后颗粒细胞凋亡的结果图。
图9是ELISA法检测超表达FoxO1后颗粒细胞类固醇激素分泌的结果图。
图10是ELISA法检测抑制FoxO1表达后颗粒细胞类固醇激素分泌的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1 ChIP-qPCR
ChIP检测参照Thermo公司Pierce Agarose ChIP Kit(货号：26156)说明书进行，具体操作步骤如下：
(1)颗粒细胞的交联和收集
待原代猪卵巢颗粒细胞(来源于广州市白云区孔旺记屠宰场的商品母猪)密度达到70～90％时，弃培养基，在细胞培养瓶内加入用DMEM完全培养基稀释至终浓度为1％(v/v)的甲醛，混匀后室温静置10min；加入Glycine Solution至其终浓度为1×，混匀后置通风橱静置5min，弃液体，用预冷的1×PBS清洗细胞；加含1％(v/v)Halt Cocktail的预冷1×PBS，用细胞刮刮下细胞并转移至1.5mL灭菌离心管中，3000×g离心5min，弃液体。
(2)颗粒细胞裂解和消化
以细胞量为2×106个/管为例，将装有卵巢颗粒细胞沉淀的离心管置于冰上，加100μL Lysis Buffer 1，涡旋混匀15s，冰浴10min，9000×g离心3min，弃液体；加100LMNase Digestion Buffer Working Solution重悬沉淀；加0.25μL Micrococcal Nuclease(ChIP Grade)(10U/μL)涡旋混匀后于37℃水浴15min，期间每5min翻转混匀一次；加10μLMNase Stop Solution终止反应，短暂涡旋混匀后冰上静置5min，9000×g离心5min，弃液体；加50μL Lysis Buffer 2重悬沉淀，冰浴15min，每5min涡旋混匀15s，9000×g离心5min，转移上清至新的1.5mL灭菌离心管中。
(3)免疫沉淀反应
转移5μL上清液作为“Input”对照组，于-20℃保存待用；剩余45μL上清液中加450μL 1×IP Dilution Buffer，混匀后转移至spin column柱子里，并加入抗体(阳性对照：10μL Anti-RNA Polymerase II抗体(来自试剂盒)；阴性对照：1～2μL Normal Rabbit IgG抗体(来自试剂盒)；实验组：10μL Anti-H3K27me3抗体(购自德国Millipore公司，货号07-449)，4℃摇床孵育过夜；加20μL ChIP Grade Protein A/G琼脂糖，4℃摇床1h，3000×g离心30s，弃液体；依次分别加入500μL IP Wash Buffer 1、IP Wash Buffer 2、IP WashBuffer 3，期间4℃摇床5min，3000×g离心30s，弃液体；3000×g离心1min。
(4)IP洗脱
向步骤(3)获得的沉淀中加150μL IP Elution Buffer，65℃孵育40min，每10min涡旋混匀一次；将柱子放在新的1.5mL灭菌离心管内，6000×g离心1min；加6μL 5M NaCl溶液和2μL 20mg/mL的蛋白酶K(Proteinase K)，涡旋混匀后，65℃热激1.5h；往5μL Input对照组中加150μL IP Elution Buffer、6μL5M NaCl溶液和2μL 20mg/mL的蛋白酶K，涡旋混匀后，65℃热激1.5h。
(5)DNA回收
每个IP和Input管中加750μL DNA Binding Buffer，混匀后转移至DNAClean-up柱子中，10000×g离心1min，弃液体；加750μL DNA Column Wash Buffer，10000×g离心1min，弃液体，10000×g空离1min；将柱子转至新的1.5mL灭菌离心管内，加50μL DNA ElutionBuffer，10000×g离心1min，回收的DNA于-20℃保存备用。
(6)PCR检测
根据H3K27me3在FoxO1基因启动子区结合位点预测结果，设计ChIP引物验证H3K27me3蛋白是否结合于FoxO1基因启动子区(GAPDH做为阳性对照引物)。
ChIP-PCR引物信息如下：
ChIP-FoxO1 F:5′-ATACTTGGAGAATAAGAGAGGGTGA-3′；
R:5′-TCCATTTCCTCTACATGGAGCC-3′；
ChIP-GAPDH F:5′-CATGGGTGTGAACCATGAGA-3′；
R:5′-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。
半定量PCR电泳结果显示，Input组和实验组(Anti-H3K27me3)有到预期长度大小的电泳条带出现，阳性对照组(Anti-RNA polymerase II)有预期长度大小的电泳条带出现，阴性对照组(IgG)几乎没有条带出现(图1a)；qPCR验证结果显示，实验组(Anti-H3K27me3)中FoxO1的富集丰度显著高于阴性对照组(IgG)(P<0.05)(图1b)。结果说明H3K27me3结合于FoxO1启动子区(15437948-15438065)区域。
实施例2 卵巢颗粒细胞的培养
(1)从广州市白云区孔旺记屠宰场采集健康母猪的卵巢，放入1×PBS(含1％双抗(m/v，青霉素和链霉素，下同)中，置于冰上并迅速带回实验室。
(2)用1×PBS(含1％双抗)清洗卵巢3次，迅速转入无菌培养室。
(3)在无菌培养室的超净台上，用1mL无菌一次性注射器吸取卵巢有腔卵泡中的卵泡液，加入含适量DMEM培养基的离心管中，室温下1000rpm离心5min。
(4)弃上清，加入预热的1×PBS(含1％双抗)，轻柔吹打以重悬细胞沉淀，重复清洗细胞2次。
(5)配制DMEM完全培养基：89％高糖型DMEM+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗。
(6)用完全培养基重悬细胞，接种于75mL培养瓶；置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养。
实施例3 H3K27me3激动剂和抑制剂处理颗粒细胞
(1)实施例2培养的细胞弃去培养基，用预热的1×PBS(含1％双抗)清洗细胞培养板3次。
(2)用DMEM完全培养基分别将药物的母液稀释成不同浓度的工作液，然后加入到对应的培养孔中。H3K27me3的激动剂为2nM/mL的GSK-J4(购自美国MedChemExpress公司，货号#1373423-53-0)，对照组GSK-J4-control为2nM/mL的DMSO溶液(购自广州鼎国生物技术有限公司，货号DH105-2)；H3K27me3的抑制剂为6nM/mL的GSK-126(购自美国MedChemExpress公司，货号#1346574-57-9)，对照组GSK-J4-control为6nM/mL的DMSO溶液。
(3)将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，48h后进行后续检测实验。
实施例4 总RNA抽提及反转录
1、细胞总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：
(1)将实施例3贴壁培养的颗粒细胞培养至合适密度后，弃培养基，1×PBS清洗细胞两次，再按每10cm2的细胞培养板底面积直接加入1mL TRIzol。
(2)冰上静置10min以充分裂解细胞，转移1mL裂解液至新1.5mL RNase-free EP管中，弃沉淀。
(3)往步骤(2)获得的上清中加入200μL氯仿，剧烈震荡15～30s混匀，冰上静置15min，4℃条件下12000rpm离心15min。
(4)转移上层水相至新的1.5mL RNase-free EP管中。
(5)往步骤(4)的上层水相中加入0.5mL异丙醇，轻轻地上下颠倒混匀，冰上静置10min，4℃条件下12000rpm离心10min。
(6)弃上清后于室温下沿管壁加入1mL用DEPC水稀释的75％(v/v)乙醇以洗涤RNA，4℃条件下12000rpm离心5min，弃上清。
(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度。
(8)加入30～50μL DEPC水以溶解RNA沉淀。
2、mRNA的反转录参照Takara公司的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂说明书进行，具体操作步骤如下：
(1)每500ng步骤1中抽提的总RNA加入2μL的PrimeScriptTM RT Master Mix试剂，并加入RNase Free H2O，使溶液总体系为10μL。
(2)将上述混合液进行PCR，反应程序为：37℃、15min，85℃、5s。
实施例5 qRT-PCR
将实施例4的反转录产物cDNA分别进行基因相对表达量的检测，参照ThermoScientific公司的Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X)试剂说明书进行。实验采用比较Ct值法计算目的基因的相对表达量，具体计算公式如下：
基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}
其中GAPDH作为内参基因，本发明所用到的qRT-PCR引物为：
qRT-PCR-FoxO1 F：5′-GACAGACTGGGCAGAGTAGAA-3′；
R：5′-AGCAACGATGACTTTGATAAC-3′；
qRT-PCR-GAPDH F：5′-TCGGAGTGAACGGATTTG-3′；
R：5′-TCACCCCATTTGATGTTGG-3′。
结果显示(图2)，H3K27me3激动剂(GSK-J4)激活H3K27me3后，与对照组(GSK-J4-control)相比FoxO1基因mRNA表达量显著减少(P<0.05)，H3K27me3的抑制剂(GSK-126)抑制H3K27me3后，与对照组(GSK-126-control)相比FoxO1基因mRNA表达量极显著增加(P<0.01)。
实施例6 构建FoxO1基因的超表达载体
(1)利用BioEdit软件分析发现FoxO1基因CDS区序列无BamH I和Xho I两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司，货号V79020)存在BamH I和Xho I酶切位点。
(2)利用primer premier 5.0软件设计FoxO1基因CDS区引物，其上下游引物分别加上BamH I和Xho I酶切位点序列，其中引物序列如下：
FoxO1-F：5′-CGGGATCCATGGCCGAAGCGCCC-3′；
FoxO1-R：5′-CCTCTCGAGTTAGCCTGACACCCAGCTATGTG-3′。
(3)以猪卵巢颗粒细胞cDNA(实施例4步骤2反转录获得)为模板，PCR扩增目的片段。PCR反应体系：0.5μL cDNA、5μL 2×Taq Plus Master Mix、0.3μL上游引物、0.3μL下游引物、Nuclease-free water将体系补至10μL。反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸2min 21s，循环35次；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物经胶回收纯化、双酶切、回收后连接至pcDNA3.1(+)载体，再经转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自广州Magen公司)，构建成功的重组真核表达载体，命名为pcDNA3.1-FoxO1。
实施例7 卵巢颗粒细胞的接种和转染
(1)实施例2培养的颗粒细胞汇合度达到90％左右时，倒掉培养基，用预热的1×PBS清洗细胞2次。
(2)加入0.25％(m/v)胰蛋白酶消化约5min，显微镜下观察到大部分细胞漂起后，立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例2步骤(5))终止消化。
(3)将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清。
(4)1×PBS清洗细胞2次，1000rpm离心2次，每次5min。
(5)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，再用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养24h左右。
(6)观察颗粒细胞的生长状态，待细胞汇合度达70～80％左右进行转染。
(7)将实施例6的重组真核表达载体pcDNA3.1-FoxO1(pcDNA3.1转染颗粒细胞作为对照组)转染至步骤(6)获得的颗粒细胞中，以实现在颗粒细胞中超表达FoxO1基因。转染方法按Invitrogen公司的
Figure BDA0002584791420000092
3000Transfection Kit试剂盒说明书进行；每组设置3个重复。
(8)将小干扰RNA片段si-FoxO1(5′-CCACCAAACACCAGTCTGA-3′)和对照组NC(货号：R0824)(均由广州市锐博生物科技有限公司合成)转染至步骤(6)获得的颗粒细胞中，以实现抑制颗粒细胞中FoxO1基因的表达。转染方法按Invitrogen公司的
Figure BDA0002584791420000091
3000Transfection Kit试剂盒说明书进行；每组设置3个重复。
(9)转染后的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
(10)根据实验目的在转染24～48h后收集细胞。
实施例8 颗粒细胞周期进程检测
本发明于转染48h后采用流式细胞术检测实施例7获得的细胞的周期进程，具体操作步骤如下：
(1)将细胞培养板放置在室温，用1×PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS。
(2)加入0.25％(m/v)胰蛋白酶消化约5min，显微镜下观察到大部分细胞漂起，立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例2步骤(5))终止消化。
(3)1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用预冷1×PBS清洗细胞2次。
(4)使用1mL 70％(v/v)的乙醇溶液固定细胞，4℃固定过夜。
(5)将固定好的细胞用预冷的1×PBS清洗两次，2000rpm离心5min。
(6)使用400μL的溴化乙锭轻柔重悬细胞，加入100μL RNase A，4℃避光孵育30min。
(7)用流式细胞仪检测分析(每个实验组设计至少3个重复)。
结果显示，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，阻滞于G0/G1期的细胞比例显著升高(P<0.05)，而G2/M期的细胞比例显著降低(P<0.05)(图3)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组(NC)相比，阻滞于G0/G1期的细胞比例显著降低(P<0.05)，而G2/M期的细胞比例极显著升高(P<0.01)(图4)。
实施例9 颗粒细胞增殖检测
本发明于转染24h后采用EdU法检测实施例7获得的细胞增殖情况，实验参照广州市锐博生物科技有限公司的Cell-LightTM EdU Apollo 567In vitro Kit试剂盒说明书进行。采用48孔板，具体操作步骤如下：
(1)用DEME高糖培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液，制备适量50μM EdU培养基。
(2)每孔加入150μL 50μM的EdU培养基，孵育2h，弃培养基。
(3)1×PBS清洗细胞2次，每次5min。
(4)每孔加入150μL细胞固定液(含4％多聚甲醛的1×PBS)，室温孵育30min，弃固定液。
(5)每孔加入150μL 2mg/mL的甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液。
(6)每孔加入150μL 1×PBS，脱色摇床清洗2次，每次5min，弃PBS。
(7)每孔加入150μL的1×Apollo染色反应液，室温下避光孵育30min，弃染色反应液。
(8)加入150μL渗透剂(含0.5％Triton X的1×PBS)，脱色摇床清洗3次，每次5min，弃渗透剂。
(9)用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst3342反应液，避光保存。
(10)每孔加入150μL 1×Hoechst3342反应液，室温下避光孵育30min，弃反应液。
(11)每孔加入150μL 1×PBS清洗5次，每次5min。
(12)每孔加入150μL 1×PBS保存待用。
(13)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。
结果显示，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)(图5)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组(NC)相比颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)(图6)。
实施例10 颗粒细胞凋亡检测
本发明于转染48h后采用Annexin V-FITC/PI技术检测实施例7获得的细胞凋亡情况，实验参照广州科易达生物科技有限公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kitwith PI试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：
(1)将细胞培养板放置在室温，用1×PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS。
(2)加入0.25％(m/v)胰蛋白酶消化约5min，显微镜下观察到大部分细胞漂起，立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例2步骤(5))终止消化。
(3)1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用预冷1×PBS清洗细胞2次。
(4)调整每管细胞数为(0.2～1.0)×106个，加入500μL 1×Binding Buffer重悬细胞。
(4)加入5μL Annexin V-FITC，室温下避光反应15min。
(5)加入5μL PI(碘化丙啶染色液)，轻轻混匀，4℃避光反应5min。
(6)立即用流式细胞仪检测分析。
结果显示，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比颗粒细胞的凋亡率极显著升高(P<0.01)(图7)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组(NC)相比颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)(图8)。
实施例11 颗粒细胞类固醇激素分泌检测
本发明于转染48h后采用ELISA法检测实施例5获得的颗粒细胞的类固醇激素分泌，实验参照上海江莱生物科技有限公司的猪睾酮酶联免疫分析试剂盒(货号JL26487)和猪孕酮酶联免疫分析试剂盒(货号JL21995)说明书进行，操作方法参照试剂盒中的说明书，具体步骤如下：
(1)设置标准品孔和样本孔，加入50μL不同浓度的标准品至标准品孔。
(2)收集细胞培养液上清，3000rpm离心20min，吸取上清。
(3)样本孔分别设待测样品孔和空白孔，吸取10μL上清加到含40μL样品稀释液的待测样品孔中，空白孔除外。
(4)用封板膜封住反应孔，于37℃孵育30min，弃液体。
(5)每孔加350μL洗涤液，静置30s，弃洗涤液，洗涤5次。
(6)每孔加入50μL酶标试剂，空白孔除外。
(7)重复步骤(4)和(5)。
(8)每孔加入显色剂A和B各50μL，37℃避光孵育15min。
(9)每孔加入50μL终止液，于15min内测定450nm波长处的OD值。
结果显示，在颗粒细胞内超表达FoxO1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，细胞上清中睾酮浓度极显著减少(p<0.01)，孕酮浓度极显著增加(p<0.01)(图9)；抑制FoxO1基因表达后，与对照组NC相比，细胞上清中睾酮浓度极显著增加(p<0.01)，孕酮浓度极显著减少(p<0.01)(图10)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> si-FoxO1
<400> 1
ccaccaaaca ccagtctga 19
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-FoxO1-F
<400> 2
atacttggag aataagagag ggtga 25
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-FoxO1-R
<400> 3
tccatttcct ctacatggag cc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-GAPDH-F
<400> 4
catgggtgtg aaccatgaga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> ChIP-GAPDH-R
<400> 5
gtcttctggg tggcagtgat 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-FoxO1-F
<400> 6
gacagactgg gcagagtaga a 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> qRT-PCR-FoxO1-R
<400> 7
agcaacgatg actttgataa c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoxO1-F
<400> 8
cgggatccat ggccgaagcg ccc 23
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FoxO1-R
<400> 9
cctctcgagt tagcctgaca cccagctatg tg 32

Claims (8)

1.H3K27me3调控FoxO1基因表达在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：所述的应用具体是在猪卵巢颗粒细胞的周期进程、增殖、凋亡及类固醇激素分泌中的应用；
其中，应用环境为体外环境；
所述的类固醇激素为睾酮、孕酮。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
体外环境下，FoxO1基因抑制颗粒细胞分裂，延缓细胞周期进程；
体外环境下，FoxO1基因促进卵巢颗粒细胞的凋亡，抑制卵巢颗粒细胞的增殖；
体外环境下，FoxO1基因促进颗粒细胞孕酮的分泌，抑制颗粒细胞睾酮的分泌；
体外环境下，H3K27me3抑制FoxO1基因的表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的H3K27me3调控FoxO1基因表达为通过H3K27me3结合到FoxO1基因启动子区的15437948-15438065区域的位点上实现；
所述的FoxO1基因启动子序列信息从NCBI数据库下载所得Gene ID: 397077。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：改变卵巢颗粒细胞中的H3K27me3程度，利用H3K27me3的激动剂/抑制剂处理颗粒细胞实现。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述的H3K27me3激动剂为GSK-J4；
所述的H3K27me3抑制剂为GSK-126。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的调控FoxO1基因表达的方式包括：构建含有FoxO1基因的超表达载体，将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞，增加FoxO1基因的表达；将抑制FoxO1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞，抑制FoxO1基因的表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的超表达载体为pcDNA3.1。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的siRNA靶向序列为：5′-CCACCAAACACCAGTCTGA-3′。
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