CN114875029B

CN114875029B - 一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录表达的方法

Info

Publication number: CN114875029B
Application number: CN202210605334.6A
Authority: CN
Inventors: 袁晓龙; 周小枫; 张哲�; 李加琪; 何颖婷; 潘向春; 全洪燕
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2022-05-31
Filing date: 2022-05-31
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-05-31
Also published as: CN114875029A

Abstract

本发明公开一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录表达的方法，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明以lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化以及lncRNA IFFD为研究对象，通过分析lncRNA IFFD在卵泡发育过程中的表达与甲基化水平的关联，然后利用DNMT1‑siRNA验证lncRNA IFFD启动子低甲基化促进其表达，最后找到lncRNA IFFD启动子CGI区的低甲基化招募转录因子SP1的结合，进而促进lncRNA IFFD的转录表达。本发明对研究lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化参与卵巢卵泡闭锁以及初情启动等的分子机制具有很好的应用价值。

Description

一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录表达的方法

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录表达的方法。

背景技术

研究表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR导致哺乳动物体内DNA甲基化紊乱，阻碍卵泡成熟和延缓初情启动。DNA甲基化主要是通过DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)直接修饰位于CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶残基(cytosine残基，5-mC)来调控基因转录，DNMT1负责在DNA复制过程中维持DNA甲基化。与蛋白质编码基因相似，lncRNA的表达也受到启动子利用的影响，如表观遗传调控。在多囊卵巢综合征患者中，lnc-MAP3K13-7:1通过DNMT1的下调介导CDKN1A启动子的低甲基化，进而抑制颗粒细胞(granulosa cells，GCs)的增殖和卵泡生长。综上所述，DNA甲基化可能通过调节GCs中关键lncRNAs的表达参与卵泡发育和初情期启动。

转录因子SP1是一个普遍存在并调控启动子基础活性的调控因子，有研究报道，MiR-375需要结合SP1来调控猪卵巢中雌激素的合成。大量研究表明，CG二核苷酸的高甲基化状态可能通过阻碍转录因子的结合来调控基因的表达。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性的方法。我们通过网站预测发现lncRNA IFFD启动子存在一个CpG岛，且CpG岛上预测到的SP1结合位点最多。由此我们提出假设DNA低甲基化可能通过招募SP1结合到lncRNA IFFD启动子，进而促进lncRNA IFFD的转录表达。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性的方法，包括如下步骤：

通过降低lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平来促进猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性；或通过提高lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平来降低猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性。

进一步的，通过降低lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平能招募转录因子SP1促进猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性；

进一步的，降低lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平是通过抑制DNMT1基因表达的siRNA(DNMT1-siRNA)转染到猪卵巢颗粒细胞的方式实现。

DNMT1-siRNA：5′-UACAGUUGUUGACAAACGAG-3′；

进一步的，提高lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平是通过对lncRNA IFFD启动子区进行甲基化处理。

进一步的，lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平为lncRNA IFFD启动子区中CGI(-1309/-991)的DNA甲基化水平；

进一步的，转录因子SP1结合在CGI区域-1261/-1254bp。

lncRNA IFFD在小(1～3mm)、中(3～5mm)、大卵泡(5～7mm)中的表达与DNA甲基化水平：随着卵泡不断发育增大，lncRNA IFFD的表达水平逐步降低，lncRNA IFFD启动子CGI区域的甲基化水平逐步升高。

lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化介导lncRNA IFFD转录表达的主要区域为CGI区域。

lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化通过影响转录因子SP1结合来介导lncRNAIFFD的转录表达。

转录因子SP1或转录因子SP1相关的生物材料在调控lncRNA IFFD表达中的应用；

体外环境下，增加转录因子SP1促进lncRNA IFFD表达；

所述转录因子SP1相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合；

1)含有转录因子SP1基因CDS区的表达盒；

2)含有转录因子SP1基因CDS区的重组载体，或含有1)中所述表达盒的重组载体；

3)含有转录因子SP1基因CDS区的重组细胞，或含有1)中所述表达盒的重组细胞，或含有2)所述重组载体的重组细胞。

所述的增加转录因子SP1为通过增加外源性转录因子SP1的方式实现；

所述的增加外源性SP1通过如下方法实现：将SP1连接到pcDNA3.1载体上，构建含有SP1的超表达载体；然后将含有SP1的超表达载体转染到猪卵巢颗粒细胞中。

其中，lncRNA IFFD的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

lncRNA IFFD启动子区(-2000/+0)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明的验证结果如下：

1、通过生物信息学网站预测lncRNA IFFD启动子区(-1952/+1，+1为转录起始位点)的CpG岛。由图1结果可知，lncRNA IFFD启动子区存在一个CpG岛，即CGI(BSP1，-1309/-991)。

2、我们分离了小、中以及大卵泡，利用qRT-PCR以及BSP分别检测lncRNA IFFD在各阶段卵泡中的表达和甲基化水平。qRT-PCR结果显示，随着卵泡不断发育增大，lncRNA IFFD的表达水平逐步降低。BSP结果显示，随着卵泡不断发育增大，lncRNA IFFD启动子CGI区域的甲基化水平逐步升高。综上，DNA甲基化可能参与lncRNA IFFD的表达。

3、我们分别用2μM DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR、DNMT1-siRNA、DNMT3A-siRNA及DNMT3B-siRNA/siRNA-NC处理卵巢颗粒细胞，通过qRT-PCR以及BSP分别检测lncRNA IFFD的表达和甲基化水平。qRT-PCR结果显示，5-Aza-CdR或DNMT1-siRNA能显著促进lncRNAIFFD的表达水平，但DNMT3A-siRNA及DNMT3B-siRNA对lncRNA IFFD的表达水平没有显著影响。同时，DNMT1-siRNA能降低lncRNA IFFD启动子的甲基化水平。综上，DNMT1可能是介导lncRNA IFFD表达的主要酶类。

4、我们对lncRNA IFFD启动子的CpG岛与非CpG岛进行分段扩增，lncRNA IFFD的启动子区(-1952/+92)，CGI(BSP1，-1309/-991)和NCGI(BSP2，-707/-415和BSP3，-351/-88)片段成功扩增后连接到pGL3-basic载体上获得pGL3-lnc IFFD，pGL3-BSP1，pGL3-BSP2和pGL3-BSP3重组载体。然后利用M.SssI酶或纯水分别对各载体进行甲基化或非甲基化处理。双荧光素酶分析结果显示，CGI的低甲基化显著促进lncRNA IFFD的转录活性。综上，干扰DNMT1可能通过降低CGI的甲基化促进lncRNA IFFD的转录活性。

5、我们对CGI区域进行转录因子预测，发现SP1在CGI区域的结合位点最多。然后将构建成功的SP1超表达载体(pcDNA3.1-SP1)分别与甲基化或非甲基化的pGL3-BSP1共转染进卵巢颗粒细胞，双荧光素酶分析结果显示，与甲基化的pGL3-BSP1相比，超表达SP1显著促进非甲基化的pGL3-BSP1的转录活性。此外，ChIP结果显示，与对照组相比，干扰DNMT1促进SP1在CGI区域-1261/-1254的结合。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化以及lncRNA IFFD直接或间接参与了卵泡闭锁、卵泡发育以及初情启动，本发明是以lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化以及lncRNA IFFD(见SEQ ID NO：1)为研究对象，采用了分子和细胞生物学方法研究lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化对lncRNA IFFD的转录调控。lncRNA IFFD启动子区DNA低甲基化可通过招募SP1结合在lncRNA IFFD启动子，进而促进lncRNA IFFD的转录活性。对研究lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化参与卵巢卵泡闭锁以及初情启动等的分子机制具有很好的应用价值。

(2)本发明技术方案设计周详，结果可靠。为证实lncRNA IFFD启动子区DNA甲基化对lncRNA IFFD的转录调控，本发明从多层次、多角度验证，首先在真实水平上验证，检测各生长阶段卵泡中lncRNA IFFD启动子区的甲基化与表达水平。然后在模拟水平上验证，检测通过小干扰RNA改变lncRNA IFFD启动子区甲基化后的表达情况。

附图说明

图1是lncRNA IFFD启动子CpG岛预测图。

图2是lncRNA IFFD在小、中以及大卵泡发育过程中的表达(A)与甲基化(B)情况；其中，lncRNA IFFD随着卵泡增大，其表达水平逐步降低，但是其启动子CGI区域的甲基化水平逐步升高。

图3是DNMT1-siRNA对lncRNA IFFD表达和DNA甲基化水平的影响图；其中，A：5-Aza-CdR显著促进lncRNA IFFD的表达水平；B：DNMT1-siRNA显著促进lncRNA IFFD的表达水平；C：DNMT1-siRNA降低lncRNA IFFD启动子CGI区域的甲基化水平。

图4是lncRNA IFFD启动子区各片段的不同甲基化水平对lncRNA IFFD转录活性的影响图。

图5是SP1对lncRNA IFFD转录活性的影响图；其中，A是转录因子SP1在lncRNAIFFD启动子CGI区域的结合位点预测示意图；B是超表达SP1的效率检测；C为超表达SP1显著促进非甲基化CGI的转录活性；D为ChIP验证干扰DNMT1促进SP1在CGI区域-1261/-1254的结合。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

本发明中应用统计学方法，分析各实施例中3次独立实验的结果，分别计算“平均值±标准差”，使用单因素方差分析进行差异显著性分析(图中“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01)。

实施例1构建SP1的超表达载体

(1)利用Primer5设计引物，以抽提的猪颗粒细胞的cDNA为模板扩增SP1的CDS区(Gene ID：396575)；扩增的片段经纯化回收、连接pMD18T载体(购自Takara公司)、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提普通质粒。

(2)BioEdit软件分析发现SP1基因CDS区序列无Hind III和Kpn I两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1载体存在Hind III和Kpn I酶切位点。其上下游引物分别加上HindIII和Kpn I酶切位点序列。以SP1的CDS区重组pMD18T普通质粒为模板，PCR扩增；片段经纯化回收、双酶切、连接pcDNA3.1载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自美国Magen公司)，命名为pcDNA3.1-SP1。

本发明所用到的SP1基因CDS区引物：

SP1 Forward：

Reverse：

注：黑色加粗字体部分为保护碱基，下划线为酶切位点。

实施例2卵巢颗粒细胞的培养和转染

(1)采集健康母猪卵巢，置于含1％双抗的PBS缓冲液中(冰上)，快速运回实验室处理；

(2)先在细胞房外用含2％双抗的PBS清洗卵巢3-5次，置于烧杯中，放入传递窗；

(3)酒精擦拭细胞房超净台，镊子夹取卵巢，用注射器吸取卵泡液，打入含有5mLDMEM培养液的离心管中，每管抽取卵泡液至9mL；

(4)1000rpm离心5min，弃上清，加入5mL PBS，吹打混匀，清洗两次；

(5)配制完全培养基：89％DMEM、10％血清和1％双抗，上下颠倒混匀；

(6)加5mL完全培养基重悬细胞沉淀；

(7)75mL培养瓶中先加入10mL完全培养基，再加入上述重悬液；

(8)显微镜观察后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，24h后观察颗粒细胞生长情况，等颗粒细胞长至90％左右，倒掉培养基，用预热的含1％双抗的PBS洗3遍；

(9)加入胰蛋白酶消化，放入培养箱3min左右，显微镜下观察至大部分细胞漂起，立即加入等量终止液终止消化；

(10)DMEM清洗2遍，期间1000rpm离心5min；

(11)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养；

(12)24h左右，观察细胞状态，待细胞汇合度达80％左右时准备转染；

(13)转染方法按Invitrogen公司的3000试剂盒说明书进行，每组设置3个重复；

(14)转染后的孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，转染后24h～72h，观察细胞状态，生长良好即可收集细胞。

所述的双抗为青霉素和链霉素。

实施例3 qRT-PCR

本发明中基因的qRT-PCR检测采用Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)试剂盒(Thermo Scientific公司)。实验采用比较Ct值法检测样品基因的含量，具体计算公式如下：

基因相对表达量＝2-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}

检测基因用GAPDH做内参，本发明所用到的qRT-PCR引物为：

qRT-PCR-IFFD Forward：5′-GTCGGGCGATGCTATCAGAG-3′；

Reverse：5′-GGCCTTGCTAAGCCATACCT-3′；

qRT-PCR-SP1 Forward：5′-GTTCGCTTGCCTCGTCAGC-3′；

Reverse：5′-CCTGAGAAAAGGCACCACCAT-3′；

qRT-PCR-GAPDH Forward：5′-TCACCAGGGCTGCTTTTAACT-3′；

Reverse：5′-CTTGACTGTGCCGTGGAACT-3′；

细胞的总RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体步骤如下：

(1)颗粒细胞直接加入TRIzol；

(2)室温下放置10min以充分裂解细胞，12000g离心5min，弃沉淀吸上清于新RNase-free管中；

(3)加入0.2mL氯仿(每1mL TRIzol)剧烈震荡15～30s，室温下放置5min后4℃12000g离心15min；

(4)吸取上层水相置于新RNase-free EP管中；

(5)加入0.5mL异丙醇(每1mL TRIzol)，轻轻地上下颠倒混匀后在室温放置10min，4℃12000g离心10min；

(6)弃上清后置于室温，沿管壁加入1mL 75％乙醇-DEPC(每1mL TRIzol)以洗涤RNA，4℃12000g离心5min后尽量弃上清；

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度；

(8)加入DEPC水以溶解RNA沉淀。

使用TaKaRa公司的PrimeScript^TM RT Master Mix(Perfect Real Time)cDNA反转录试剂盒反转录总RNA。

实施例4 Western Blot

(1)单层贴壁细胞(实施例2中的卵巢颗粒细胞)总蛋白的提取与定量：倒掉细胞培养液，加入适量预冷的PBS洗细胞三次以洗去培养液。6孔板细胞每孔加入100-200μL蛋白裂解液和10μL 100mM的PMSF，裂解细胞30min。收集细胞裂解液移至1.5mL离心管中，4℃14000rpm离心5min。利用BCA法测定蛋白样品浓度。

(2)SDS-PAGE电泳：每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5:1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部为止；

(3)转膜：PVDF膜甲醇预处理3～5s，放至转印液浸润30min。取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除。100V恒压60～120min；

(4)免疫印记：取出杂交膜，TBST漂洗5min，重复三次。5％脱脂奶粉溶液室温封闭90min，TBST漂洗5min，重复三次。膜用以下稀释的一抗在4℃孵育过夜：SP1(21962-1-AP，proteintech，1:10000)和Tubulin(11224-1-AP，proteintech，1:5000)。将膜用TBST清洗3次后，再用山羊抗兔(ab205718，Abcam，1:10000)或山羊抗鼠(ab6789，Abcam，1:5000)的二抗在室温下孵育2h。ECL发光液处理后，利用Odyssey Fc图像系统对蛋白条带进行可视化，最后采用ImageJ软件分析蛋白条带。

实施例5 BSP

用组织DNA试剂盒(D3396-02，Omega Bio-tek，USA)从GCs和卵泡中提取基因组DNA。按照EZ DNA甲基化金标准试剂盒(D5006，ZYMORESEARCH，California，USA)说明书的步骤，将纯化的DNA进行亚硫酸氢盐转化。以亚硫酸氢盐转化的DNA为模板，用BSP引物扩增相应片段。最后，通过QUMA网站(http://quma.cdb.riken.jp/)将测序结果与原始序列进行比较并绘制点图。每个样品需要10个克隆来计算甲基化率。

本发明所用到的BSP引物为：

BSP1 Forward：5′-AACCTCATCTGTGACTTACA-3′；

Reverse：5′-GATGTCACCATCAGAACCTC-3′；

BSP2 Forward：5′-CTCATCTTATCATTCCGAAA-3′；

Reverse：5′-AAGGCTCCATTGAATGAT-3′；

BSP3 Forward：5′-ATGCCTTCTATAGGAACA-3′；

Reverse：5′-CTCTGACCTGAACCAGCAG-3′；

实施例6 LncRNA IFFD启动子缺失片段载体构建与双荧光活性分析

(1)利用Primer5设计引物，以抽提的猪颗粒细胞的DNA为模板扩增lncRNA IFFD的启动子区(-1952/+92，具体见SEQ ID NO：2)，CGI(BSP1，-1309/-991)和NCGI(BSP2，-707/-415和BSP3，-351/-88)；扩增的片段经纯化回收、连接pMD18T载体(购自Takara公司)、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提普通质粒。BioEdit软件分析发现这些序列无MIu I和Xho I两种限制性内切酶酶切位点，而pGL3载体存在MIu I和Xho I酶切位点。其上下游引物分别加上MIu I和Xho I酶切位点序列。然后以各个重组pMD18T普通质粒为模版，用各个酶切引物进行PCR扩增；片段经纯化回收、双酶切、连接pGL3-basic载体、转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自美国Magen公司)，命名为pGL3-lncIFFD，pGL3-BSP1，pGL3-BSP2和pGL3-BSP3；其中，以pGL3-basic作为阴性对照，pGL3-control作为阳性对照。然后将这些载体与CpG转移酶M.SssI(M0226，NEW ENGLANDBiolabs,Beijing，China)在室温下孵育1h，对应的非甲基化组用纯水孵育。

本发明所用到的lncRNA IFFD启动子缺失片段引物：

pGL3-lnc IFFD Forward：

Reverse：

pGL3-BSP1 Forward：

Reverse：pGL3-BSP2Forward：/>

Reverse：

pGL3-BSP3 Forward：

Reverse：

注：黑色加粗字体部分为保护碱基，下划线为酶切位点。

(2)荧光素酶报告基因活性检测，参照Promega公司的Dual-Luciferase ReporterAssay System试剂盒，具体操作步骤如下：用PBS清洗两次，每孔细胞加入100μL的GloLysis Buffer，室温轻微振摇5min，收集细胞裂解液；将30μL细胞裂解液加入96孔板，加入75μL Dual-Luciferase Assay Reagent，混匀后在20～25℃静置15～30min。在BioTek公司Synergy 2多功能酶标仪上检测发光值，对应于萤火虫荧光素酶的表达水平；再加入75μL Stop&/>Reagent试剂，混匀后在20～25℃静置15～30min。检测发光值，对应于海肾荧光素酶的表达水平；荧火虫荧光素酶与海肾荧光素酶表达量的比值为萤火虫荧光素酶相对活性。

实施例7染色质免疫共沉淀(ChIP)

ChIP是参照Pierce^TM ChIP试剂盒(Thermofisher,Rockford,IL,USA)的说明书。步骤如下：将培养的GCs与1％甲醛室温孵育10分钟，加入甘氨酸，利用自动超声波破碎仪提取GCs的染色质片段。然后将SP1抗体和IgG抗体与GCs碎片溶液4℃孵育过夜。最后将免疫沉淀的DNA纯化用于PCR分析。

结果分析：

2、我们分离了小、中以及大卵泡，利用qRT-PCR以及BSP分别检测lncRNA IFFD在各阶段卵泡中的表达和甲基化水平。qRT-PCR结果如图2A显示，随着卵泡不断发育增大，lncRNA IFFD的表达水平逐步降低。BSP结果如图2B显示，随着卵泡不断发育增大，lncRNAIFFD启动子CGI区域的甲基化水平逐步升高。综上，DNA甲基化可能参与lncRNA IFFD的表达。

3、我们分别用2μM DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR、DNMT1-siRNA、DNMT3A-siRNA及DNMT3B-siRNA/siRNA-NC处理卵巢颗粒细胞，通过qRT-PCR以及BSP分别检测lncRNA IFFD的表达和甲基化水平。qRT-PCR结果如图3A、B显示，5-Aza-CdR或DNMT1-siRNA能显著促进lncRNA IFFD的表达水平，但DNMT3A-siRNA及DNMT3B-siRNA对lncRNA IFFD的表达水平没有显著影响。同时，如图3C显示，DNMT1-siRNA能降低lncRNA IFFD启动子的甲基化水平。综上，DNMT1可能是介导lncRNA IFFD表达的主要酶类。

DNMT1-siRNA：5′-UACAGUUGUUGACAAACGAG-3′；

DNMT3A-siRNA：5′-ACCCUUACAAAGAAGUUUACA-3′；

DNMT3B-siRNA：5′-CUCAUUUUAUCUUCUAAAACU-3′；

上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成；对照siRNA-NC来自广州市锐博生物科技有限公司。

4、我们对lncRNA IFFD启动子的CpG岛与非CpG岛进行分段扩增，lncRNA IFFD的启动子区(-1952/+92)，CGI(BSP1，-1309/-991)和NCGI(BSP2，-707/-415和BSP3，-351/-88)片段成功扩增后连接到pGL3-basic载体上获得pGL3-lnc IFFD，pGL3-BSP1，pGL3-BSP2和pGL3-BSP3重组载体。然后利用M.SssI酶或纯水分别对各载体进行甲基化(Methylated)或非甲基化(Unmethylated)处理。双荧光素酶分析结果如图4显示，CGI的低甲基化显著促进lncRNA IFFD的转录活性。综上，干扰DNMT1可能通过降低CGI的甲基化促进lncRNA IFFD的转录活性。

5、我们对CGI区域进行转录因子预测，发现SP1在CGI区域的结合位点最多。然后将构建成功的SP1超表达载体(pcDNA3.1-SP1)分别与甲基化(Methylated)或非甲基化(Unmethylated)的pGL3-BSP1共转染进卵巢颗粒细胞，双荧光素酶分析结果如图5显示，与甲基化的pGL3-BSP1相比，超表达SP1显著促进非甲基化的pGL3-BSP1的转录活性。此外，ChIP结果显示，与对照组相比，干扰DNMT1促进SP1在CGI区域-1261/-1254的结合。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录表达的方法

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 395

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lncRNA IFFD

<400> 1

acccuguaag gggacuggaa aguccagccc aaacgcucuc uugggaaagg aacaaagucc 60

cgguggguua caaccugacc cuaggaguaa aagauguuaa ggccugccau ggaaauuaaa 120

aacuuccguc gggcgaugcu aucagagagg agagaaccaa ggggguccug cugcaucucu 180

ggcucuagca gcucggacaa gaucccgaac auacuucauc acgaaaugag agaggaaaac 240

cagcaggcuu uccagguaug gcuuagcaag gccucguucc cacggcaucc accugggcuc 300

cccgcccaag gguggcaggc ggcccuagca ggaggagauc gggagcgaau gggagagcug 360

gucaggaagg ugguguaggg accaucccca aauac 395

<210> 2

<211> 2000

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lncRNA IFFD启动子区（-2000/+0）

<400> 2

tgcacaactt tgaatatacg aaaaaccgct ggatcatgca cttgaaaaga atgcatttta 60

tgttacgtga attctacctc aacaaatgat tcaccgttgc cggaggccag ctttaaatag 120

ggacacttga acttttgact cttttcccca tttcatggga tctcagttga ggcagaaagg 180

aaaacgctct ggagtctgaa gcaatagaaa catttttcat ttatcaaaaa cactctgggc 240

tttttgtcat acagtatttt acaaagaaaa atagaacgtt gttgggagaa ttccagcaat 300

ggcccccaag gggggtgttt cccacaccag catcacccac agcagagctc tgtactgaag 360

aggtttccat tagtttgaca aaaataagag tcatgagtta tacagaaatg aatacacatg 420

ggtgtgagtt tgccaactgt cttttttttt tttttttttt ttggctgcac ccatggcata 480

tggaaattcc caggccaggg atggaatcca agccccacct atgtcacagc tgaagcaacg 540

ccagttcctt aacccactgc accttaatcc acagcgacat gagctactgt agtcagattt 600

gtttaattat tcatttttgg ctctttaggg ctgtaccgca gcatatgaaa gttcccaggc 660

taggggctga agcaaagctg cagctactgg cccacaccac agccacagca acttgggatc 720

tgaacctcat ctgtgactta cacaacaatt catggtaatg ccggatcctt cacccactaa 780

gcgaggccag ggatcgaacc cgcatcctca tggatcccag tcagatttgt taccaccgag 840

ccacgacagg aattctatgt ggtcatttct taacccactg cgctgcagca ggaagccaca 900

acggtctctt aagatctttc atacacgata cgaagtacaa gtccattgac attaagtgtg 960

tgaccacagg cctggtttcg tggcaatggt agctggtggt agttatttca gggaccttcc 1020

tcggtaaaat aaaaagctag aaactacaaa cgtttcctaa attggggtgg agagaggttc 1080

tgatggtgac atccagaggc ccaagtggga cccactgctt ttaaggacac aggaattgtc 1140

tggagttctg gacttgggtc agagtggcca agaggggaca agactggatc acccagaagg 1200

ccaatgccag ctggaatgga aagttcaagg tgcagccagt accagatttg ttctcttctc 1260

cctgaaggat gtgttgctct ttcttataaa tacaggaaaa tgtgaagaga acaaaaatag 1320

cccctcatct tatcattccg aaagcaactg atgtttaaag aatagcaata tgtacacatg 1380

tcctcttcct cctaacagct acaccgtctg cccccaaacc ctgagccctg ccttctggtg 1440

tgtccctttc agtcctttcg tgggattaca gatgacagtg cacaagggag aaagagccaa 1500

aatgaaatga agagtctaat gctccacgcg ccaaatcctt taacgacatt tactggctct 1560

cctgcggcat tttactgaaa cattttttcg aagagggatg gaggtgggta aaggaaatca 1620

ttcaatggag ccttaaatat tgattataga agctttttgt aaaacgacac acattttttt 1680

caagaataaa tgccttctat aggaacaaac ctggcaaaga ggctcaaaag cccatgaaat 1740

tgggattctg cttttacaaa gccaacggga tgtaagcccg cgcgtgtctg ctgggaagta 1800

cgtgagggcc agtggcctca aggaaacttg gccatgagag gtttccactg ggcctgggag 1860

ggagcccctt gggcgaaaca ccgtacccag gaaataagga aaacagcaag cgatctgtga 1920

agaggggtga ggacctctgg caaacagcgc ctgctggttc aggtcagaga aaacccaaga 1980

gaaggagccc taaaaagagg 2000

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SP1 Forward

<400> 3

ccaagcttcc tcagctgcca ccatgagc 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SP1 Reverse

<400> 4

ggggtaccgt atggcccata tgtctcta 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-IFFD Forward

<400> 5

gtcgggcgat gctatcagag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-IFFD Reverse

<400> 6

ggccttgcta agccatacct 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-SP1 Forward

<400> 7

gttcgcttgc ctcgtcagc 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-SP1 Reverse

<400> 8

cctgagaaaa ggcaccacca t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Forward

<400> 9

tcaccagggc tgcttttaac t 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH Reverse

<400> 10

cttgactgtg ccgtggaact 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BSP1 Forward

<400> 11

aacctcatct gtgacttaca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BSP1 Reverse

<400> 12

gatgtcacca tcagaacctc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BSP2 Forward

<400> 13

ctcatcttat cattccgaaa 20

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BSP2 Reverse

<400> 14

aaggctccat tgaatgat 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BSP3 Forward

<400> 15

atgccttcta taggaaca 18

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> BSP3 Reverse

<400> 16

ctctgacctg aaccagcag 19

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-lnc IFFD Forward

<400> 17

cgacgcgtgg ccagctttaa atagggaca 29

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-lnc IFFD Reverse

<400> 18

ccctcgagct ctctgatagc atcgcccg 28

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-BSP1 Forward

<400> 19

cgacgcgtaa cctcatctgt gacttaca 28

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-BSP1 Reverse

<400> 20

ccctcgagga tgtcaccatc agaacctc 28

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-BSP2 Forward

<400> 21

cgacgcgtct catcttatca ttccgaaa 28

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-BSP2 Reverse

<400> 22

ccctcgagaa ggctccattg aatgat 26

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-BSP3 Forward

<400> 23

cgacgcgtat gccttctata ggaaca 26

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pGL3-BSP3 Reverse

<400> 24

ccctcgagct ctgacctgaa ccagcag 27

<210> 25

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNMT1-siRNA

<400> 25

uacaguuguu gacaaacgag 20

<210> 26

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNMT3A-siRNA

<400> 26

acccuuacaa agaaguuuac a 21

<210> 27

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> DNMT3B-siRNA

<400> 27

cucauuuuau cuucuaaaac u 21

Claims

1.一种调控猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：所述方法为以非疾病诊断和/或治疗为目的的方法；

通过降低lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平来促进猪卵巢颗粒细胞中lncRNAIFFD转录活性；或通过提高lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平来降低猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性；

lncRNA IFFD的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

lncRNA IFFD启动子区的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

通过降低lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平能招募转录因子SP1促进猪卵巢颗粒细胞中lncRNA IFFD转录活性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

降低lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平是通过抑制DNMT1基因表达的siRNA转染到猪卵巢颗粒细胞的方式实现。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述的抑制DNMT1基因表达的siRNA的序列如下：

DNMT1-siRNA：5′-UACAGUUGUUGACAAACGAG-3′。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

提高lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平是通过对lncRNA IFFD启动子区进行甲基化处理。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：

lncRNA IFFD启动子区的DNA甲基化水平为lncRNA IFFD启动子区中CGI的DNA甲基化水平，其中，CGI位于-1309～-991bp区域。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

转录因子SP1结合在CGI区域-1261～-1254 bp。

8.转录因子SP1或转录因子SP1相关的生物材料在调控lncRNA IFFD表达中的应用，其特征在于：所述应用的环境为体外环境；

所述转录因子SP1相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种；

1）含有转录因子SP1基因CDS区的表达盒；

2）含有转录因子SP1基因CDS区的重组载体；

3）含有转录因子SP1基因CDS区的重组细胞。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

增加转录因子SP1促进lncRNA IFFD表达。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：

2）中所述重组载体为含有1）中所述表达盒的重组载体；

3）中所述重组细胞为含有1）中所述表达盒的重组细胞。

11.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：

3）中所述重组细胞为含有2）所述重组载体的重组细胞。